CN100543139C - Hcv复合多表位转基因植物口服疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明是一种丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位转基因可食性植物疫苗。所述的HCV疫苗是将HCV复合多表位抗原基因在植物表达宿主系统中表达获得的，且所述的植物表达宿主是可食性的。本发明提供了一种高效价廉的针对不同型、不同HCV分离株都能提供交叉保护作用的有效的HCV疫苗。

Description

HCV复合多表位转基因植物口服疫苗

一、技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及到利用植物制备的可食性转基因疫苗，特别是涉及一种预防人丙型肝炎病毒感染的转基因可食性疫苗；这种重组蛋白的氨基酸序列；编码这种重组蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有时也称为“基因”)；含有该核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞。

二、背景技术

丙型肝炎是一种严重影响人类健康的传染病，极易转化为肝硬化和肝细胞癌，目前尚无理想的防治手段，是危害人类健康重要的病源之一。全世界约有1.7亿HCV的感染者，我国估计占4000万以上.所以，研制有效的丙型肝炎疫苗极为重要。

采用有效的疫苗控制和治疗丙型肝炎病毒感染是预防和治疗丙型肝炎病毒感染的理想途径，在这方面，科学家一直在进行不懈的探索。迄今为止，在世界上尚未研制出有效的丙型肝炎病毒疫苗。

HCV是单股正链RNA病毒，其基因组大约由9400个核苷酸组成，只有一个ORF，编码一个约3010aa的蛋白前体，从5′端起依次为核心蛋白C，包膜蛋白E1和E2，以及非结构蛋白NS2，NS3，NS4a，NS4b，NS5a，NS5b.HCV的一个主要特点及发展疫苗的一个首要考虑的因素就是它的高度变异性，深入的系统进化分析可将HCV分成至少6个主要的基因型和至少70个不同的亚型。不仅不同国家或地区报道的HCV序列差异很大，而且同一病例分离的HCV，由于时间不同其基因组核苷酸序列也不完全—致，各国科学家对研制有效的丙肝病毒疫苗做了很多有益的尝试，采取了如重组病毒疫苗、DNA疫苗、融合蛋白疫苗、口服疫苗等策略以及新兴的RNA干扰技术，研究的热点从核心蛋白、包膜蛋白到现在的非结构蛋白NS3和NS5.但目前HCV疫苗还没有研制成功的报道HCV的快速变异、缺乏稳定的HCV体外细胞培养系统及理想的小动物模型等问题，都是丙肝疫苗未能开发成功的主要原因。

复合多肽疫苗有着传统疫苗无法比拟的极好靶位点攻击特异性，因此可能更易激起机体的免疫反应，而且安全、价廉、多价及易于储存，被认为是疫苗市场上的新生力量。

针对HCV的高度变异性，黄建生等在HCV基因表达产物中优选了5个高度保守的T/B细胞表位，分别来自核心蛋白C(1～16，132～141)(缩写为C)，E1(317～326)，NS3(1445～1453)及NS5(2781～2788)，并加入了破伤风毒素的一个T细胞激活位点，组合成一个复合多表位抗原基因(黄建生等.丙型肝炎病毒多表位抗原在小鼠与家兔中的免疫应答。科学通报，1999；44(23)：2519-2524)。然而，此复合多表位基因中没有E2表位，特别是，他们的表达系统不是可食性植物。

王丽颖等(中国专利申请号：02122116.2)，提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白。然而，他们的表达的宿主细胞，为原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞，而不是可食性植物。

李琦涵等(中国专利申请号：01108683.1)，提供了丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗及其制备方法和应用。针对危害严重的HCV病毒，提供一种具有免疫原性的丙型肝炎疫苗。他们的表达系统，也不是可食性植物。

李轶女等进行丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE对番茄的遗传转化(丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE对番茄的遗传转化，作物学报，2003，29(3)60-3)。尽管，他们的表达系统是可食性植物，但是，他们没有采用复合多表位基因，降低了产品的免疫性。

目前，还未见将HCV复合多表位抗原基因在可食性植物中表达。转基因植物基因工程疫苗，以其独具的可食性特色，展示了其诱人的研究与开发价值和广阔的应用前景。目前，转基因植物疫苗的研究报道主要集中在少数植物上，由于烟草含有毒的生物碱，马铃薯不适合人类生食，因此，开发和利用人类喜欢的可生食的植物种如胡萝卜、白萝卜、红薯、凉薯、香蕉、西红柿等转化体系，成为研制人用转基因植物疫苗的一个热点。

Mason1992年(Mason H S，M an2Kit L am D，A rntzen C J.Exp ression of hepatitis B surfaceantigen in transgenic p lants[J].P roc N atl A cad Sci U S A，1992，89(24)：11745-11749.)提出了利用转基因植物生产可食用疫苗的概念。在短短10年左右的时间里，已经有十几种病毒或细菌的抗原基因在转基因植物中获得表达，且基本保留了其天然免疫原性，植物口服疫苗已经蓬勃发展。与传统的疫苗表达系统(如细菌系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统)相比，转基因植物生产基因工程疫苗具有以下优点：

1 成本低  植物生产疫苗简单、方便、成本低。转基因植物生产的基因工程疫苗不需严格的纯化程序，故成本较其他疫苗低得多。在获得稳定遗传的转基因植物后，扩大耕种面积就能提高疫苗的产量，它的上游生产成本较低，而能直接食用的植物疫苗不需特殊贮存条件，同时还可省去下游的加工开支。

2 植物细胞具有一套完整的真核表达系统，能进行正确的翻译后加工，表达的产物可进行糖基化、酰胺化、磷酸化、亚基正确装配等，使其表达产物与高等动物细胞表达的产物具有一致的免疫原性和生物学活性，保持了自然状态的免疫原性。

3 植物基因工程疫苗的安全性  动物细胞在生产基因工程疫苗生产过程中可能污染动物病毒，另外这些病毒对人类具有潜在的危害；而转基因植物生产的疫苗中不含有病原物，或潜在的病原物故表达产物安全可靠，无毒性和副作用，无残存DNA污染和潜在致病、致癌性。而且植物不是人类病原体的宿主，利用重组植物生产的生物药不论提纯与否，都不存在潜在的人类病原，因而是相当安全。

5 有效性。粘膜免疫是病毒性腹泻的免疫保护机制，转基因植物细胞是启动粘膜免疫的有效途径，其机制可能是植物细胞壁给抗原提供了一种生物微囊，后者可保护抗原不被消化道酶所降解[3]。

6 便于储藏运输。可以简单地方便地生产、贮藏和发放疫苗。

尽管E2糖蛋白在序列上不是很保守，但在制备疫苗时是个不能忽视的区段。具体阐述如下：

(1)E2糖蛋白的结合中和性抗体。(2)E2糖蛋白的潜在中和表位。(3)E2糖蛋白的高度可变区(HVR1)区存在有较保守的共同序列。E2蛋白中的高度可变区被普遍认为是抗体结合的靶位点。所以，应该考虑E2表位。

三、发明内容

本发明针对丙型肝炎疫苗研制中的技术难题，提出一种复合多表位抗原基因表达的HCV转基因可食性植物疫苗。

本发明根据HCV疫苗及HCV表位、决定簇的有关知识，充分考虑了HCV疫苗研究所存在的问题，特别是HCV的多变性，优选了5个高度保守的T细胞及/或B细胞表位，同时加入HBsAg上的PreS的T细胞激活表位或者破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位，以增强复合抗原的免疫原性，并将其转入可食性植物宿主系统中表达。构建了超强根部特异表达表达盒，从而大幅度提高在根部的表达量。

目的基因的选择

我们在pcx[C(1～16aa，132～141aa)、E1(317～326aa)、NS3(1445～1453aa)、NS5(2781～2788aa)]的基础上连接上包膜蛋白基因(E2)，同时加入HBsAg上的PreS的T细胞激活表位或者破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位，这样既克服了原有基因抗原性较弱的缺点，又能诱发交叉的免疫保护反应。可望诱发良好的免疫应答。具体说明如下：

针对HCV的高度变异性，在HCV基因表达产物中优选了5个具有良好免疫原性的高度保守表位，分别来自C(1～16aa，132～141aa)，E1(317～326aa)，NS3(1445～1453aa)及NS5(2781～2788aa)，这些表位在各型HCV中均高度保守，而且大都已被证实具有良好的T/B细胞激活能力，除了这些高度保守的表位序列，由于E2糖蛋白的高度可变区(HVR1)区存在有较保守的共同序列，且E2糖蛋白具有强免疫原性，能诱导结合中和性抗体。故在多表位抗原基因中添加E2(384～565aa)。

在上述多表位抗原基因中还加入HBsAg中PreS的T细胞激活表位或者破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位，这一激活表位一般具有免疫原性，用作B细胞表位的疫苗载体能增强免疫应答。因此该复合基因所表达的抗原可能对不同型、不同株的HCV提供保护作用，在理论上可能优于通过HCVcDNA表达的抗原。

整个基因的设计充分考虑到HCV本身免疫的特点，特别强调HLA限制的CIL作用对HCV疫苗免疫应答的影响。一般认为，CIL是HCV感染的一种主要的防御机制，在HCV慢性感染过程中可识别肝细胞内表达的HCV抗原，有助于机体清除HCV感染的肝细胞。因此我们在HCV基因组中优选了5个T细胞表位及一个乙型肝炎外源刺激表位，可被HLA-A2等限制的CIL所识别，为复合多肽疫苗激发有效免疫应答打下良好的基础。

目的基因获得

包膜蛋白E2基因是预防性疫苗研究的靶抗原，具有高度可变区和强免疫原性，因此在复合抗原基因序列中增加E2基因。E2(384～565aa)与不同长度的E1相比，免疫原性最强，抗体水平可达10⁵。同时在这一多表位抗原中加入HBsAg中PreS的T细胞激活表位或者破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位。这样获得的复合多表位抗原基因(命名为PCH)，即可克服单纯多表位抗原基因免疫原性弱的特点，增强复合抗原基因的免疫原性，又能诱发交叉的免疫保护反应。

植物表达载体的构建及农杆菌的转化

为了增强基因的表达，使用根部特异启动子RB7序列控制目的抗原表达的位置和强度，并将其插入到表达载体pBI121中。然后将拼接好的HCV复合抗原基因PCH克隆至具有根部特异启动子的表达载体中，使其在启动子下启动表达。植物转基因技术采用农杆菌转化技术，因为农杆菌转化是一项成熟的植物转化技术，转化效率高于基因枪转化技术和电击法。以冻融法将构建好的载体转入农杆菌LBA4404.

植物的转化及再生

植物转基因技术采用农杆菌转化技术，农杆菌转化是一项成熟的植物转化技术，转化效率及转化后的表达效率高于基因枪转化技术和电击法。采用农杆菌菌液侵染植物表达宿主系统如胡萝卜下胚轴，通过正交设计寻找最佳的转化程序，和高效快速，繁殖效率高的再生体系。

转基因植株的检测

首先进行转基因植株的PCR鉴定，初步确定基因转入与否及转化率，然后进行Southern blot检测PCR阳性植株的外源基因的整合情况，尽可能筛选出单拷贝的转基因植株，因为多拷贝外源基因转入的话容易引起基因沉默，最后采用Northern Blot在转录水平上检测外源基因的表达情况。NorthernBlot检测水平较高的植株，提取蛋白，检测蛋白提取液中目的蛋白的含量。

重组HCV植物口服疫苗的免疫应答及安全性研究

将表达HCV复合抗原基因的阳性植株免疫小鼠，检测特异性体液免疫和细胞免疫水平，观察免疫的安全性。找到最佳的免疫剂量，免疫次数。以转基因植株的块根，饲喂BALB/c小鼠，并检验不同饲喂量和饲喂次数的小鼠中的IgG应答。为HCV疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据。

本发明的制备方法主要通过以下步骤实现：

1.基因的拼接：利用化学方法合成小片段，经分步退火将这些基因片段拼接成~HCV复合多价基因。

2.通过转化、质粒抽提、酶切等方法筛选阳性重组克隆，并对基因进行序列分析鉴定。

3.表达载体的构建：将拼接好的HCV复合抗原基因PCH克隆至带有根部特异启动子RB7的表达载体pBI121中构建成pBI121-PCH重组表达载体。具体做法是将复合基因插入带有最佳增强子拷贝的超强根部特异表达盒的pBI121内部，插入位置在根部特异表达盒之后，使其在真核启动子下启动表达。

4.农杆菌的转化：以冻融法将构建好的载体转入农杆菌LBA4404.

5.植株的转化及再生：采用农杆菌菌液侵染植物表达宿主如胡萝卜下胚轴，通过正交设计寻找最佳的转化程序，和高效快速，繁殖效率高的再生体系。Southern blot检测PCR阳性植株中外源基因的整合情况。

上述方法均为现有技术中的方法，实施例中已详细描述。

本发明的创新之处在于；

(1)构建HCV复合多表位抗原基因PCH，并将其转入植物宿主系统如胡萝卜中表达，从而发展一种高效价廉的针对不同型、不同HCV分离株都能提供交叉保护作用的有效HCV疫苗。

(2)在上述复合抗原基因中加入了乙型肝炎上的一个T细胞激活位点或者破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位，以增强复合抗原的免疫原性。

(3)构建超强根部特异表达表达盒，从而大幅度提高植物宿主如胡萝卜中PCH的表达量。

本发明人工合成的复合多表位抗原基因，与单价多肽疫苗相比，可能具有更强的免疫原性，更易激起机体的免疫反应。而且本发明制备的是一种可食性转基因植物疫苗有着传统疫苗及其它非植物转基因疫苗无法比拟的极好靶位点攻击特异性，而且安全、价廉、多价及易于储存，使用方便。该复合基因所表达的抗原可望能对不同型、不同株的HCV提供保护作用，应该优于目前制备的HCV疫苗。

本发明更详细的实施方法可参见实施例。

实施例

下面结合附图及具体实施例对本发明的内容做详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

1.基因构建：根据如上所述的序列设计其具体序列如下

1)按照下列序列合成一段序列CH-1，它包含：HCV高度保守序列C(1～16aa，132～141aa)，E1(317～326aa)，NS3(1445～1453aa)及NS5(2781～2788aa)以及乙肝pre-S T细胞激活表位。将此序列插入克隆载体pUC18，并将此载体命名为pCH1.

 M   S   P  Q   A   Q  G   M   L  K   T   L  P

ATG TCT CCA CAA GCT CAG GGA ATG TTG AAG ACT CTT CCA

 A   D  P   P   P   A  S   T   Y  R   Q   S  G

GCA GAT CCT CCA CCT GCT TCT ACA TAT AGA CAG TCA GGA

 R   Q   g  p   M    T  S   T   N  P   K   P

AGA CAA GGT CCT ATG ACA TCT ACA AAT CCA AAG CCA

 Q   K   T   K   R   N  T  N   g   p   D   L

CAA AAA ACT AAG AGA AAT ACA AAC GGA CCA GAT CTT

 M  G  Y   I   P L   V  G   g   p

ATG GGA TAC ATT CCT TTG GTT GGC GGA CCA

 R   M   A   W  D    M M  M   W   g   p

AGG ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG TGG GGT CCT

 T  G  D   F   D   S  V   I   D   g   p

ACT GGA GAC TIT GAT TCT GTG ATC GAC GGA CCA

 E   L   I   T   S   C  S   S   g p

GAA CTT ATT ACA TCA TGT TCT TCA GGA CCA

2)合成扩增引物如下，两端分别添加酶切位点xbaI和EcoRI用于片段的连接：

CH1xba：5’-tctaga ATG TCT CCA CAA GCT CAG GG-3’

CHIEcoRI：5’-gaattc TGG TCC TGA AGA ACA TGA TG-3’

用上述引物扩增pCH1.获得片段，，连入T克隆载体，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，将质粒进行进行xbaI和EcoRI的双酶切，酶切产物再次进行琼脂糖电泳，并回收片断将此片断命名为CH1.

3)RT-PCR方法扩增HCVE2(384～565aa)

合成引物如下两端分别添加酶切位点EcoRI和BamHI：

E2-1：5′-gaattc gcc ggg gtg gac gcg gcg acc tc-3′

E2-2：5′-ggatcc Cca cgt gca gcc aaa cc-3′

4)以丙肝病人阳性血清总RNA提取物为起始材料，采用—步法，添加上述引物进行RT-PCR，电泳并回收片断，连入T克隆载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，将质粒进行EcoRI和BamHI双酶切。酶切产物再次进行琼脂糖电泳，并回收片断，将此片断命名为E2。

5)片段CH1与片段E2等量混合，用T4-DNA连接酶连接过夜，次日电泳，回收大片断(分子量约800bp)。将此大片断命名为CH。

6)RB7启动子序列插入Pbi121载体内部，RB7序列下游加入XbaI和BamHI酶切位点作为外源基因的克隆位点。将改造过的pBI121命名为pRB.

7)pRB用XbaI和BamHI进行双酶切，电泳，回收大片段，然后回收片段与CH片段混合，用T4-DNA连接酶连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5α。进行阳性克隆的筛选，获得到的阳性克隆命名为pCH.

8)将pCH菌株扩繁，提取质粒，然后将质粒pCH以冻融法转入农杆菌LBA4404。

9)转化植物的获得

胡萝卜种子，于70％乙醇中浸泡1min，用30％“84”溶液消毒25min，再用无菌水漂洗4～5次后，播种于不含任何激素的MS0固体培养基上。取萌发7d苗龄的无菌苗下胚轴切段(5mm长)作为培养再生植株及遗传转化的起始材料。将7d苗龄的胡萝卜无菌实生苗的下胚轴切段在愈伤组织诱导培养基(MS+2，4D0.5mg·L^-1和BA0.5mg·L^-1)上预培养96h，浸入处于指数生长期的农杆菌LBA4404/pCH悬浮液中1～8min(菌液经过离心、收集和一定比例的稀释，控制OD600值035～0.50)，随后用无菌滤纸吸去多余的菌液，在分别含有2，4D05mg·L^-1和BA0.5mg·L^-1的MS培养基上共培养72h，再转到附加头孢霉素(Cefalexin)500mgL^-1及卡那霉素(Kanamycin)20mg·L^-1的上述相同培养基上进行抑菌培养和抗性选择。每隔20天换一次培养基，诱导分化愈伤组织。产生抗性愈伤后转移到附加头孢霉素500mg·L^{- 1}、卡那霉素(Kanamycin)75mg·L^-1并添加0.2％酵母提取物的空白MS培养基进行选择培养，并诱导胚状体的发生。

由下胚轴切段诱导分化出的胚状体，长至两片子叶展开时，转移到MS空白培养基继续生长，待长至7～8cm高时，取出，经过2～3d炼苗后再将植株移栽于盛土壤的盆中，于室外自然条件下生长。

10)转基因胡萝卜的鉴定：

获得的转基因植物，提取叶片总DNA，采用CH1xba和引物E2-2引物扩增叶片总DNA，若能够扩增到80obp的片断，即初步断定此为转基因植物。

进一步采用Southem杂交鉴定那些PCR阳性植物内目的基因的拷贝数，采用pCH内的CH片段作为探针，与PCR阳性植物总DNA的pstI，HindIII，NotI(分别酶切)的酶切产物杂交。放射自显影检测目的基因拷贝数，选出单拷贝的植株。

11)重组HCV植物口服疫苗的免疫应答及安全性研究

单拷贝插入的阳性植株，移植大田，收获胡萝卜，用胡萝卜直根，检测小鼠的特异性体液免疫和细胞免疫水平，观察免疫的安全性。找到最佳的免疫剂量，免疫次数。以转基因植株的块根，饲喂BALB/c小鼠，并检验不同饲喂量和饲喂次数的小鼠中的IgG应答。

<110>青岛科技大学

<120>HCV复合多表位转基因植物口服疫苗

<160>20

<210>1

<211>181

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(114)...(121)

<400>1

Met Ala Gly Val Asp Ala Ala Thr Ser Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala

1               5                   10                  15

Ser Thr Thr Tyr Gly Leu Thr Ser Leu Phe Asn Pro Gly Ala Arg Gln

            20                  25                   30

Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr

          35                40                45

Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ser Leu

    50                55                60

Phe Tyr Thr His Arg Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ser

65                 70                 75               80

Ala Cys Arg Lys Ile Glu Ala Phe Arg Ile Gly Trp Gly Thr Leu Gln

               85                90                95

Tyr Glu Asp Asn Val Thr Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp

           100               105                110

His Tyr Pro Pro Lys Gln Cys Gly Ile Val Pro Ala Arg Pro Val Cys

       115                120              125

Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr

    130               135               140

Asp Arg Leu Gly Val Pro Thr Tyr Thr Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp

145               150                155              160

Val Phe Leu Leu Asn Ser Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ser Trp Phe Gly

               165               170               175

Cys Thr Trp Glu Phe

           180

<210>2

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(7)...(22)

<400>2

Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys

1                5                  10                  15

Thr Lys Arg Asn Thr Asn

               20

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(6)

<400>3

Thr Lys Arg Asn Thr Asn

1                5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>4

Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val

1                  5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(8)

<400>5

Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser

1                  5

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(15)

<400>6

Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro

1               5                10                15

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(10)

<400>7

Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp

1              5                 10

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>8

Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp

1              5

<210>9

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(7)...(22)

<400>9

Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys

1               5                 10                    15

Thr Lys Arg Asn Thr Asn

               20

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>10

Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val

1              5

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(8)

<400>11

Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser

1              5

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(15)

<400>12

Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro

1              5                 10                15

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(10)

<400>13

Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp

1              5

<210>14

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>14

Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp

1              5

<210>15

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(7)...(22)

<400>15

Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys

1               5                10                    15

Thr Lys Arg Asn Thr Asn

               20

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>16

Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val

1              5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(8)

<400>17

Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser

1              5

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(15)

<400>18

Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro

1              5                 10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(10)

<400>19

Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp

1              5             10

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)...(9)

<400>20

Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp

1               5

Claims (2)

1.一种丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位转基因可食性植物疫苗，其特征是将一段复合多表位抗原基因在中表达得到的，所述的一段复合多表位抗原基因是由含有5个HCV表位抗原基因和1个非HCV细胞表位组合成的复合多表位抗原基因，这6个表位是：

(1)从HCV基因组中优选的高度保守的5个T细胞及/或B细胞表位抗原基因，这5个表位分别是：C(1～16aa，132～141aa)、E1(317～326aa)、E2(384-565aa)、NS3(1445～1453aa)及NS5(2781～2788aa)；

(2)1个非HCV细胞表位，是来自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)外源刺激T细胞表位或破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表；

所述的可食性植物宿主系统属于以下所述植物中的一种：胡萝卜、白萝卜、红薯、凉薯、香蕉、番茄。

2.权利要求1所述可食性植物疫苗，其特征在于，一段复合多表位抗原基因系采用超强根部特异表达在可食性植物宿主系统中表达。