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CN114632183B - 一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用 - Google Patents

一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用 Download PDF

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CN114632183B CN202210326732.4A CN202210326732A CN114632183B CN 114632183 B CN114632183 B CN 114632183B CN 202210326732 A CN202210326732 A CN 202210326732A CN 114632183 B CN114632183 B CN 114632183B
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Abstract

本发明提供了一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用，属于生物药物技术领域。本发明以胶原蛋白为载体，以成纤维生长因子bFGF为主要活性成分制备一种用于皮肤修复的创伤蛋白海绵。所述创伤蛋白海绵不仅能修复受损皮肤，而且还能避免瘢痕组织的形成，与同类创伤修复产品相比具有较强的市场竞争力。

Description

一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢 痕形成的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用。
背景技术
皮肤创伤、烫伤是临床常见的病症，由于外因(切割伤、钝器伤、意外伤、水火烫伤、慢性皮肤溃疡等)或内因(如褥疮等)造成表皮、真皮及皮下组织损伤，常常会使患者疼痛难忍，严重者还会造成皮肤组织坏死，处理不当会引发严重的皮肤溃烂，伤口难以愈合。皮肤是人体最大的器官，是人体和外界环境之间的物理屏障，并且承担着诸多重要的生理功能，包括排汗、热感和痛觉等。一旦皮肤被破坏，就会引起机体内外环境失调，从而继发营养不良、多器官衰竭甚至死亡。
传统的创伤修复产品都有一定的局限性，比如常见的创口硅凝胶、创口喷雾等产品在使用时，对活动行为有较大的限制性，且使用流程较复杂；大多数产品仅起到消毒和隔绝外界感染、抑制细菌滋生的作用，并且起效所需的时间较长；价格高昂，疗程较长，经济水平一般或落后的民众难以负担，难以适用于各种人群，人群使用过敏率较高，有的甚至高于0.005％；容易引发安全问题，难以有效治疗各种创面的皮肤创伤，适用范围只局限于某一种或几种创面类型。最重要的是，皮肤创伤修复过程中，深达真皮或皮下组织的修复常常形成瘢痕，严重影响修复后皮肤创面的美观。因此，寻找新型促皮肤创伤修复的材料是非常重要和非常有必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种经济安全的创伤蛋白海绵，不仅能够实现皮肤修复而且还能减少瘢痕形成。
本发明提供了一种创伤蛋白海绵，包括成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白；
所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为(1～2)：(8～12)。
优选的，所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为1：10。
优选的，所述成纤维生长因子bFGF的纯度为93％以上。
优选的，所述成纤维生长因子bFGF的制备方法，包括以下步骤：构建表达成纤维生长因子bFGF的重组菌株；将所述重组菌株经发酵培养后分离纯化bFGF蛋白得到重组蛋白bFGF。
优选的，所述胶原蛋白的纯度为98.9wt％以上。
优选的，所述胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
分别用pH为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的醋酸缓冲液处理猪皮，每次处理置于55～65℃水浴1～2h，分离蛋白后，用38～42℃的温水漂洗蛋白，得到胶原蛋白。
优选的，所述水浴的温度为60℃，所述水浴的时间为1.5h。
本发明提供了所述创伤蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：
在4～8℃下向胶原蛋白溶液中添加成纤维生长因子bFGF溶液，混合，在1～3℃下静置，得到创伤蛋白海绵。
本发明提供了所述创伤蛋白海绵或所述制备方法在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用。
本发明提供了一种创伤蛋白海绵，包括成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白；所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为(1～2)：(8～12)。胶原蛋白可以改善皮肤的新陈代谢，增加局部皮肤血液循环，能够促进创伤性皮肤的炎症吸收、消散，促进皮下蛋白生成，还可以填充皮肤受损中的塌陷，修复受损皮肤；同时成纤维生长因子bFGF具有促进表皮愈合以及减少瘢痕形成的作用。此外，将成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白联合使用相对于单独使用，一方面成纤维生长因子能够匀密地粘附在创面上，缩短愈合时间；另一方面，胶原蛋白能够抵御细菌入侵，防止感染，两者相互之间起到了正反馈的积极作用。可见，本发明提供的创伤蛋白海绵适用范围广，且原料为动物来源，具有经济安全的特点。
附图说明
图1为胶原蛋白标准曲线，其中左图为传统方法制备的胶原蛋白标准曲线，右图为实施例1制备的胶原蛋白标准曲线；
图2为本发明制备的bFGF的电泳图；
图3为本发明制备的离子交换发纯化后的bFGF的SDS-PAGE电泳图；
图4为本发明制备的创伤蛋白海绵的外观形态图；
图5为分别使用灭菌水、单独使用胶原蛋白、单独使用成纤维生长因子和创伤蛋白海绵后伤口恢复情况图；
图6为分别使用灭菌水、单独使用胶原蛋白、单独使用成纤维生长因子和创伤蛋白海绵后受损皮肤真皮组织生长情况切片图。
具体实施方式
本发明提供了一种创伤蛋白海绵，包括成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白；所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为(1～2)：(8～12)。
在本发明中，所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比优选为1：10。所述成纤维生长因子bFGF的制备方法，优选包括以下步骤：构建表达成纤维生长因子bFGF的重组菌株；将所述重组菌株经发酵培养后分离纯化bFGF蛋白。所述重组菌株中成纤维生长因子bFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；所述分离纯化的依次包括Bio-Rex 70离子交换柱层析、Heparin HyperD亲和柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析。本发明制备的bFGF大大提升了成纤维生长因子bFGF的纯度，相对于传统制备bFGF方法，本发明制备的bFGF的纯度提高了58倍。本发明制备的bFGF的纯度优选为93％以上。bFGF能够促进与皮肤修护有关的细胞迅速分裂、繁殖、新生，从而推动创面的主动修复，此修复能力与其纯化率成正比，bFGF的纯化率越高，创伤蛋白海绵促进伤口愈合的功效越强。
在本发明中，所述胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：分别用pH为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的醋酸缓冲液处理猪皮，每次处理置于55～65℃水浴1～2h，分离蛋白后，用38～42℃的温水漂洗蛋白，得到胶原蛋白。所述水浴的温度优选为60℃，所述水浴的时间优选为1.5h。本发明所使用的方法可以有效减少胶原蛋白流失，使用自制冰醋酸将胶原进行限制性降解，即将末端肽切割下来，由于胶原肽链间的共价键都是通过分子末端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来，可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其特性。同时本发明提供的制备方法相对于传统物理提取胶原蛋白的方法能显著提高纯度，本发明制备的所述胶原蛋白的纯度优选为98.9wt％以上。
本发明提供了所述创伤蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：
在4～8℃下向胶原蛋白溶液中添加成纤维生长因子bFGF溶液，混合，在1～3℃下静置，得到创伤蛋白海绵。
鉴于本发明将成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白协同作用有助于修复皮肤创伤，特别是减少瘢痕的形成，本发明提供了所述创伤蛋白海绵或所述制备方法在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用。
在本发明中，所述药物优选还包括医学上可接受的辅料。所述药物中创伤蛋白海绵的质量百分含量为47％。所述药物的使用方法优选为将创伤蛋白海绵或其制备的药物覆于创伤面，每两天更换一次，直至创伤面恢复健康。
在本发明中，所述创伤蛋白海绵及其制备的药物适用于各种新鲜创面，优选包括软组织机械伤、锐器伤、激光创面、医学美容术后创面、手术创面及实质脏器术中残腔、残端的填塞、空腔脏器吻合口周围、神经损伤、软骨及肌腱损伤创面；陈旧创面包括糖尿病性溃疡、放射性溃疡、褥疮、瘘窦、粘膜溃疡和糜烂和烧冻伤面。
下面结合实施例对本发明提供的一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种胶原蛋白提取方法
1.试剂配制
36％醋酸溶液：39.18mL冰醋酸，蒸馏水定容至100mL。
NaHSO3溶液：4g NaHSO3溶解于125mL蒸馏水中。
用NaHSO3溶液调配pH为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的醋酸缓冲液，采用pH计测定。分别用以上5种不同pH值的醋酸缓冲液8.3mL对猪皮进行处理，放入60℃恒温水浴锅中水浴1.5h，期间不断搅拌，使猪皮受热均匀，用40℃蒸馏水漂洗两次以获得猪皮中的胶原蛋白。
紫外可见分光光度法测定胶原蛋白的纯度，方法如下：
往封盖的试管中加入样品5mg，加入6mol/l盐酸溶液5ml，在110℃分解24h后，蒸馏水定容到25ml，在40℃下用旋蒸除去水和盐酸，添加30ml蒸馏水溶解，吸取0.5ml测定吸光度，按标准曲线(图1中右图)算出浓度。
经过纯度测定，本发明提取的胶原蛋白的的纯度为98.9％。
对比例1
利用高压辅助的物理方法从猪皮中提取胶原蛋白，方法如下：将猪皮清洗打成匀浆，用50mmol/L乙醇溶液浸泡1h，高压功率250MPa，处理时间10min，热水处理温度70摄氏度，热水提取时间4h，离心(4000r/min)15min，浓缩干燥。
在高温条件下破坏了胶原蛋白的分子结构，使其变性析出，此方法提取的胶原蛋白纯度低(仅为52％)，转化效率低(仅为43％)。
实施例2
成纤维因子bFGF的制备和提纯方法
一.材料与方法：
1.工程菌：宿主菌为E.coliJM103，内含重组质粒pUC-bFGF；启动子为LacZ，启动子后为人bFGF的cDNA序列，在IPTC诱导下，可表达成纤维细胞生长因子，购自上海泽叶生物科技有限公司。
2.细胞：BALB/c 3T3细胞，由中国药品生物制品检定所提供。
3.仪器和设备：发酵罐，美国NBS(40L)；高速冷冻离心机，beckmanJ2-CM，超声粉碎机，美国SLS-70，蛋白监测记录仪，美国ISCOUA6
4.种子培养：培养基为1.0％胰蛋白胨、1.0％酵母提取物0.5％糖蜜、0.4％NaCl、0.25％K2HPO4，0.1％KH2PO4，pH值7.2～7.4，Amp终浓度100μg/mL。接种0.1％菌于37℃，200r/min下摇床培养6h，获1代菌，接种5％1代菌，37℃，200r/min，摇床培养8h获2代菌。
5.发酵培养：培养基为1.6％胰蛋白胨，1.6％酵母提取物，其他成分同种子培养基。在40L罐中装20L培养基，接种10％的2代菌，于37℃，pH值7.0～7.5下培养。低密度培养：不流加糖，在发酵开始加入IPTG终浓度50μg/mL通气搅拌转速在400～500r/min。高密度培养：连续不断加入5mmol/L葡萄糖溶液，并根据pH变化调节流加葡萄糖速度来控制pH，在发酵6h后加入IPTG，通气搅拌转速控制在500～600r/min发酵过程中，每隔1h取样，采用BLISA法bFGF表达量，具体为：用0.01M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)将bFGF抗原稀释成254g/mL，按100μL/孔包板，37℃3小时(或再置4℃冰箱过夜)。用重盐洗液洗涤3次，每次3分钟。待检血清用血清稀释液1：100稀释，按100μL/孔量加入，37℃孵育1小时，洗涤3次，每次3分钟。将Bio-RABG按1:400体积比稀释，按100μL/孔的量添加，于37℃下孵育30分钟，洗涤3次，每次3分钟。将AVi-HRP按1:3000体积比稀释，按100μL/孔加入，于37℃孵育30分钟，洗涤3次，每次3分钟；按100μL/孔的量加底物液，于37℃避光反应30分钟。按50μ1/孔的量加2M H2SO4，终止反应。用DG-3022型酶联免疫检测仪波长450nm测定各孔OD值。同时记录OD值。
6.以10000r/min、4℃连续离心分离，收获菌体用8倍体积含0.1mol/L NaCl，10mmol/L，EDTA的20mmol/LPB缓冲液悬浮，在4℃，超声后，离心15000r/min，30min，上清液即为粗制bFGF(目标蛋白I)。
7.纯化：
7.1Bio-Rex 70离子交换柱(XK50/30)层析：
以0.1mol/L NaC1，20mmol/L PB(pH 7.0)缓冲液平衡，用同缓冲液进行梯度洗脱(0.1～0.6mol/LNaCl)，流速为20mL/min，收集各段样品，经免疫原性测定，确定目标蛋白II。
7.2Heparin HyperD亲和柱(XK50/30)层析以含0.6mol/L NaCl的20mmol/LPB(pH9.0)缓冲液平衡，用同一缓冲液进行梯度洗脱(0.6～2.0mol/L NaCl)，流速为15mL/min，收集目标蛋白III。
7.3Sephacryl S-100凝胶过滤层析(2.6×50cm)：用20mmol/LPB(pH 7.0)缓冲液平衡、洗脱，收集目标蛋白IV，即为bFGF融合蛋白纯品。
8.纯品的检测
按《重组DNA制品质量控制要点》要求进行。
结果见图2。本实施例制备的bFGF的纯度为93％。
9.采用MTT法对bFGF的生物活性进行检测
将成纤维细胞株NIH3T3用完全培养液培养于37℃的CO2培养圈，控制CO2浓度为5％。控制细胞浓度为1ml含1.0×105～5.0×105个细胞，传代24～36小时，弃去培养瓶中的培养液，消化并收集细胞，用完全培养液配制成1ml含5.0×104～1.0×105个细胞的细胞悬液，每孔100μl接种于96孔细胞培养液中，37℃、5％CO2条件下培养24小时，吸去完全培养液，改用维持在培养液在37℃、5％CO2条件下饥饿培养24小时。
用维持培养液将脱盐后的hbFGF配制成不同浓度(2、5、10、20、50、75、100、200ng/mL)，替换原有的维持培养液，每孔100μL，阳性对照为100μl完全培养液培养细胞，阴性对照为不含hbFGF的维持培养液培养的细胞。每个浓度梯度做三个平行对照，于37℃、5％CO2条件下培养72小时，显微镜观察细胞数量。
MTT法检测：每孔加入10μL的MTT溶液，在37℃，5％CO2细胞培养箱内继续孵育4h。每孔加入100μL formanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育，直至普通光学显微镜下发现formanzan全部溶解，37℃条件下保持4h。在570nm测定吸光值，记录测定结果。
用MTT法检测hbFGF的生物活性，结果表明，极低浓度的hbFGF(2ng/mL)就能促进成纤维细胞增殖，而且随着hbFGF浓度升高，在一定范围内，促进细胞增殖的效果也随之提高，当hbFGF的浓度为10ng/mL，促进细胞增殖的效果最好，活细胞总数比不添加hbFGF的阴性对照组提高了54.1％，但是与阳性对照组相比较低，这是由于阳性对照用的是添加10％牛血清完全培养液，各种营养因子都十分重组，而实验组中仅含有hbFGF单一营养因子，但当hbFGF浓度继续上升时，其促进细胞增殖的效果有所下降，可能是由于高浓度的hbFGF会对细胞的增殖产生已经的抑制作用，通过显微镜也可看出，加入hbFGF的实验组数量明显多余仅用于维持培养液的细胞，而少于用完全培养液培养的细胞，这说明hbFGF的确能够促进纤维细胞的增殖。
对比例2
制备重组人bFGF的传统方法，如下：
(a)从细胞中分离编码人bFGF的RNA(SEQ ID NO:1，5′－gaa ttc atc gaa ggtcgt cca gct ctg ccg gag gac gg－3′)；
(b)根据该RNA合成一单链互补DNA(CDNA)，再合成相应的双链DNA；
(c)将该互补DNA插入质粒；
(d)用所得到的重组质粒转化宿主；
(e)培养得到的转化体并分离含有所需DNA的质粒；
(f)从该质粒中切下克隆化的所需DNA；
(g)在启动子下游位点将所述克隆化DNA插入载体以得到表达质粒；
(h)用所述载体转化宿主细胞以得到转化体；
(i)在培养基中培养所述的转化体并在培养液中回收所产生并积累的人bFGF。
该方法特异性低，转化效率低。本方法制备的bFGF的纯度为75％。
可见，采用采用成纤维生长因子bFGF特异性抗体进行融合蛋白表达载体和表达菌株实现提纯，特异性高，bFGF的纯化率较传统提取方法提升了58倍。
实施例3
在8℃下向胶原蛋白溶液中添加成纤维生长因子bFGF溶液，混合，使胶原蛋白和bFGF的质量比为10:1，在2℃下静置，得到创伤蛋白海绵。
创伤蛋白海绵的外观如图3所示。由图3可知，创伤蛋白海绵外观呈白色，具有一定弹性，规格为8cm×10cm。
对比例3
按照实施例3的方法利用对比例1制备的胶原蛋白和对比例2制备的bFGF制备创伤蛋白海绵。
实施例4
一种利用创伤蛋白海绵的皮肤修复方法
对小鼠仿真伤口分别使用创伤蛋白海绵、单独使用成纤维生长因子和单独使用胶原蛋白处理，每2天更换一次药物，同时还设置不进行任何处理后的伤口成长状况。覆药3、5、7、9、11天后，观察并记录伤口情况。分别对覆药3、5、7、9、11天后皮肤组织进行切片经HE染色，观察皮肤真皮组织生长情况。
伤口愈合情况见图4。由图4可知，与不经任何处理组相比，创伤蛋白海绵、单独使用成纤维生长因子bFGF和单独使用胶原蛋白处理均能有效促进伤口的修复，并且创伤蛋白海绵处理后的伤口与单独使用成纤维生长因子和单独使用胶原蛋白处理后的伤口相比愈合速度更快，并伤口未形成明显瘢痕。
受损皮肤真皮组织生长情况切片图见图5。由图5可知，皮肤真皮组织生长恢复速度由快到慢排序为创伤蛋白海绵组>bFGF组>胶原蛋白组>不经任何处理组，总体恢复情况与伤口表观恢复情况一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatcg aaggtcgtcc agctctgccg gaggacgg 38

Claims (4)

1.一种创伤蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在4~8℃下向胶原蛋白溶液中添加成纤维生长因子bFGF溶液，混合，在1~3℃下静置，得到创伤蛋白海绵；
所述创伤蛋白海绵包括成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白；
所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为（1~2）：（8~12）；
所述成纤维生长因子bFGF的纯度为93%以上；
所述胶原蛋白的纯度为98.9wt%以上；
所述胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
分别用pH为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的醋酸缓冲液处理猪皮，每次处理置于55~65℃水浴1~2h，分离蛋白后，用38~42℃的温水漂洗蛋白，得到胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述创伤蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述成纤维生长因子bFGF和胶原蛋白的质量比为1：10。
3.根据权利要求1所述创伤蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述成纤维生长因子bFGF的制备方法，包括以下步骤：
构建表达成纤维生长因子bFGF的重组菌株；将所述重组菌株经发酵培养后分离纯化bFGF蛋白得到重组蛋白bFGF。
4.根据权利要求1所述创伤蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述水浴的温度为60℃，所述水浴的时间为1.5h。
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