CN114302882A - 用于治疗输血依赖型β-地中海贫血（tdt）的膜铁转运蛋白抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通式(I)的膜铁转运蛋白抑制剂化合物用于治疗输血依赖型β‑地中海贫血的用途。

Description

用于治疗输血依赖型Β-地中海贫血（TDT）的膜铁转运蛋白抑 制剂

技术领域

本发明涉及通式(I)化合物作为膜铁转运蛋白(ferroportin)抑制剂用于治疗输血依赖型β-地中海贫血(TDT)以及与其相关的症状和病理状况的用途。

背景和现有技术

铁是几乎所有生物体的必需微量元素，并且特别是与生长和血液形成相关。在这种情况下，铁代谢的平衡主要是由老化红细胞的血红蛋白、从肝中的铁储存和十二指肠对膳食铁的吸收中铁的回收水平方面进行调节。释放的铁通过肠吸收，特别是通过特异性转运系统(DMT-1、膜铁转运蛋白)，转移到血液循环中，从而输送到适当的组织和器官(转铁蛋白(运铁蛋白，transferrin)、转铁蛋白受体(transferrin receptors))。在人体中，元素铁是非常重要的，尤其是对于氧运输、氧摄取、细胞功能如线粒体电子传递、认知功能等，并且最终对于整个能量代谢。哺乳动物生物体不能主动排出铁。铁代谢基本上由铁调素(hepcidin)通过巨噬细胞、肝细胞和肠细胞中铁的细胞释放来控制。铁调素作用于通过肠和通过胎盘的铁的吸收，并且作用于从网状内皮系统释放铁。铁调素的形成与生物体铁水平直接相关地调节，即如果向生物体供应足够的铁和氧，则形成更多的铁调素，如果铁和氧水平低，或在红细胞生成增加的情况下，则形成更少的铁调素。在小肠粘膜细胞和巨噬细胞中，铁调素结合转运蛋白(transport protein)膜铁转运蛋白(ferroportin)，该膜铁转运蛋白通常将铁从细胞内部转运到血液中。转运蛋白膜铁转运蛋白是由571个氨基酸组成的跨膜蛋白，其在肝、脾、肾、心脏、肠和胎盘中表达。特别是，膜铁转运蛋白位于肠上皮细胞的基底外侧膜中。因此，以这种方式定位的膜铁转运蛋白起到将膳食铁输出到血液中的作用。如果铁调素与膜铁转运蛋白结合，则膜铁转运蛋白被转运到细胞内部，在细胞内部发生膜铁转运蛋白的分解，使得几乎完全阻断了铁从细胞中的释放。如果膜铁转运蛋白被铁调素灭活或抑制，使得其不能输出储存在粘膜细胞中的铁，则肠中铁的吸收被阻断。铁调素的减少导致活性膜铁转运蛋白增加，从而允许储存的铁的释放增加以及膳食铁的吸收增加，从而增加血清铁水平。在病理情况下，增加的铁水平导致铁过载。

例如，器官如肝和心脏中过度的铁摄取导致铁的累积。此外，在患有神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的患者中已经观察到脑中铁的累积。循环铁的主要部分与转铁蛋白相关，转铁蛋白是一种经典的铁转运分子，其防止游离铁的存在。未与转铁蛋白(或与其他传统铁结合分子如血红素、脱铁铁蛋白、血铁黄素等)结合的铁部分统称为非转铁蛋白结合铁(NTBI)。在铁过载状态和疾病的另一方面，许多问题和病理状况起因于血浆和血清中过量水平的游离铁，即NTBI。

此类过量游离铁的一个特别有害的方面是不期望的自由基形成。特别是铁(II)离子催化活性氧(ROS)的形成(尤其通过Fenton反应)。这些ROS导致DNA、脂质、蛋白质和碳水化合物的损伤，这在细胞、组织和器官中具有深远的影响。ROS的形成是众所周知的，并且在文献中被描述为引起所谓的氧化应激。NTBI被广泛描述为表现出诱导此类具有细胞损伤毒性潜力的ROS的高倾向，其中主要器官受铁毒性的影响，包括心脏、胰腺、肾和参与造血的器官。因此，已知铁过载引起组织和器官损伤，例如心脏、肝和内分泌损伤(Patel M.等人，“Non Transferrin Bound Iron：Nature， Manifstations and Analytical Approachesfor Estimation”，Ind.J.Clin.Biochem.，2012 年，第27卷第4期，第322-332页，以及Brissot P.等人，综述“Non-transferrin bound iron： A key role in iron overloadand iron toxicity”，Biochimica et Biophysica Acta，2012年， 1820，第403-410页)。

铁过载疾病β-地中海贫血是一种遗传性贫血，由血红蛋白(Hb)的β-珠蛋白基因突变引起，从而导致红细胞(RBC)异常以及寿命缩短(RivellaS.，“Iron metabolism underconditions of ineffective erythropoiesis in beta-thalassemia.”，Blood，2019年，第 133卷第1期，第51-58页以及Taher A.T.、Weatherall D.J.和Cappellini M.D.，“Thalassaemia”，Lancet，2018年，第391卷第10116期，第155-167页)。在健康受试着中，Hb由α-和β-珠蛋白链组成，其与含铁血红素基团一起在RBC中形成α₂β₂功能性异四聚体以有效地将氧递送到组织。β-地中海贫血的主要病理生理机制是由于β-珠蛋白链合成减少，从而导致未配对的α-珠蛋白聚集体在RBC膜上累积。沉淀的α-珠蛋白聚集体包含血红素和铁，它们产生ROS，从而导致RBC寿命缩短、贫血和组织缺氧(Mettananda S.、GibbonsR.J.和HiggsD.R.，“alpha-Globin as a molecular target in the treatment of beta-thalassemia”，Blood，2015年，第125卷第24期，第3694-3701页以及Rivella S.，“beta-thalassemias：paradigmatic diseases for scientific discoveries and developmentof innovative therapies”，Haematologica，2015年，第100卷第4期，第418-430页)。作为对β-地中海贫血患者中RBC寿命缩短的补偿性应答，红细胞生成受到极大刺激，从而导致骨髓(BM)和髓外位点如脾和肝中红细胞前体(无效红细胞生成)的增殖增加和分化降低(Rivella S.，“The role of ineffective erythropoiesis in non-transfusion-dependent thalassemia”，Blood Rev.，2012年，第26卷，增刊1，第S12-15页)。β-地中海贫血中无效红细胞生成导致铁过度吸收，以支持Hb合成增加的铁需求，并导致血浆中铁浓度升高，并且最终导致器官铁过载。肝、脾、心脏和胰腺是通常受铁过载影响的组织，并且在没有治疗干预的情况下，铁过载可能导致器官损伤，如肝硬化、心力衰竭和糖尿病。

β-地中海贫血中无效红细胞生成引起铁过度吸收，这是由于对缺氧的反馈补偿性应答，这抑制了铁调素(Kattamis A.、Papassotiriou I.、Palaiologou D.、ApostolakouF.、Galani A.、Ladis V.、Sakellaropoulos N.和Papanikolaou G.，“The effects oferythropoetic activity and iron burden on hepcidin expression in patientswith alassemia major”，Haematologica，2006年，第91卷第6期，第809-812页)。由于抑制铁调素导致异常高的铁水平进一步刺激红细胞生成，贫血和铁过载以恶性循环恶化。HIF2α在连接红细胞生成和铁吸收中起主要作用，因为HIF2α刺激了促红细胞生成素(EPO)的合成和二价金属转运蛋白1(DMT1)、十二指肠细胞色素B(DCytB)和膜铁转运蛋白的产生这两者(Anderson S.A.、Nizzi C.P.、Chang Y.I.、Deck K.M.、Schmidt P.J.、Gal y B.、Damnernsawad A.、Broman A.T.、Kendziorski C.、Hentze M.W.等人，“The IRP1- HIF-2alpha axis coordinates iron and oxygen sensing with erythropoiesis and ironabsorption”，Cell Metab，2013年，第17卷第2期，第282-290页以及Schwartz A.J.、DasN.K.、Ramakrishnan S.K.、Jain C.、Jurkovic M.T.、Wu J.、Nemeth E.、Lakhal-LittletonS.、Colacino J.A.和Shah Y.M.，“Hepatic hepcidin/intestinal HIF-2alpha axismaintains iron absorption during iron deficiency and overload”，J Clin Invest，2019年，第129卷第1 期，第336-348页)。EPO刺激成红血细胞增殖并诱导红系调节因子erythroferrone (ERFE)的产生，该ERFE继而又抑制铁调素(Kautz L.、Jung G、ValoreE.V.、 Rivella S.、Nemeth E.和Ganz T.，“Identification of erythroferrone as anerythroid regulator of iron metabolism”，Nat Genet，2014年)。因此，通过诱导铁调素合成或补充铁调素模拟物来校正不平衡的铁吸收被评价为使β-地中海贫血中失调的铁代谢正常化的有吸引力的治疗方法。

实验药物如含有非天然氨基酸的缩短的铁调素衍生肽(minihepcidin)或通过抑制 Tmprss6表达增加内源性铁调素合成的寡核苷酸已被证明可校正中间型非输血依赖型β- 地中海贫血的Hbb th3/+小鼠模型中的贫血和减少铁过载(Casu C.、Oikonomidou P.R.、Chen H.、Nandi V.、Ginzburg Y.、Prasad P.、Fleming R.E.、Shah Y. M.、Valore E.V.、Nemeth E.等人，“Minihepcidin peptides as disease modifiers in mice affectedby β- thalassemia and polycythemia vera”，Blood，2016年，第128卷第2期，第265-276页以及Schmidi P.J.、Toudjarska I.、Sendamarai A.K.、Racie T.、Milstein S.、Bettencourt B. R.、Hettinger J.、Bumcrot D.和Fleming M.D.，“An RNAi therapeutictargeting Tmprss6 decreases iron overload in Hfe(-/-)mice and amelioratesanemiaand iron overload in murine beta-thalassemiα intermediα”，Blood，2013年，第121卷第7期，第1200-1208页以及Guo S.、Casu C.、Gardenghi S.、Booten S.、AghajanM.、Peralta R.、WattA.、Freier S.、 Monia B.P.和Rivella S.，“Reducing TMPRSS6ameliorates hemochromatosis and beta- thalassemia in mice”，J Clin Invest，2013年，第123卷第4期，第1531-1541页)。

将铁调素模拟肽施用给th3/+小鼠，一种非输血依赖型β-地中海贫血模型，导致无效红细胞生成的减轻、红细胞存活时间的增加和贫血的改善。在该模型中，预防由于膳食铁吸收减少而导致的铁过载证明是铁调素模拟疗法的额外益处。

另外，合成人铁调素(LJPC-401)以及铁调素肽模拟物(PTG-300)和靶向 Tmprss6的反义寡核苷酸(IONIS-TMPRSS6-L RX)已经在临床研究中进行了测试。

关于地中海贫血的治疗，必须区分地中海贫血的各种形式和表型。存在两种主要类型的地中海贫血：α-地中海贫血(alpha-地中海贫血)和β-地中海贫血(beta-地中海贫血)，它们影响血红蛋白分子的不同部分。α-地中海贫血是由编码α珠蛋白的HBA1 和/或HBA2基因中的突变(染色体16中的基因缺失)引起的，而β-地中海贫血是由编码β珠蛋白的HBB基因中的突变引起的。每个人具有这些基因中的每一者的两个拷贝，一个拷贝遗传自母亲，并且一个拷贝遗传自父亲。HBA1和/或HBA2基因中的一些或全部的丢失(缺失)导致α珠蛋白缺乏，从而导致α-地中海贫血，并且HBB基因中的突变导致β珠蛋白水平降低，从而导致β-地中海贫血。

在β-地中海贫血中，临床表型基于β珠蛋白产生损伤的程度分为三组：

·轻型β-地中海贫血(或性状)

·中间型β-地中海贫血

·重型β-地中海贫血

轻型β-地中海贫血(性状)出现在杂合子(β/β⁺或β/β⁰)中，其通常是无症状的，具有轻度至中度的小红细胞性贫血。这种表型也可以出现在β⁺/β⁺的轻度病例中。患有轻型β-地中海贫血(性状)的患者通常不需要治疗。患有轻型β-地中海贫血的人可发展成轻度贫血，或者可能根本没有该病症的体征或症状。

中间型β-地中海贫血是一种可变的临床现象，其介于重型或轻型地中海贫血之间，由2个β-地中海贫血等位基因(β⁺/β⁰或β⁺/β⁺的严重情况)的遗传引起。患有轻度至中度中间型β-地中海贫血的患者可能需要偶尔或间歇性的不频繁输血来控制疾病及其并发症。

重型β-地中海贫血(或Cooley贫血)发生在纯合子(β⁰/β⁰、β⁺/β⁺)或严重的复合杂合子(β⁰/β⁺)中，并且是由严重的β珠蛋白缺乏引起的。重型β-地中海贫血是最严重类型的β-地中海贫血。

这些患者会发展为严重贫血和骨髓机能亢进。重型β-地中海贫血在1岁至2岁出现严重贫血以及输血和吸收铁过载的症状。患者出现黄疸和下肢溃疡以及胆石症。脾肿大，通常是巨大的。可能会发展为脾隔离症，从而加速输血的正常红细胞的破坏。骨髓机能亢进引起颅骨增厚和颧骨隆起。长骨受累易发生病理性骨折并损伤生长，可能延迟或阻止青春期。在铁过载的情况下，心肌中的铁沉积可引起心力衰竭。肝铁质沉着是典型的，从而导致功能损伤和肝硬化。患有重型β-地中海贫血的患者必须定期 (终身)进行RBC输血(输血)来维持生存。

血红蛋白E(HbE)与不同形式的地中海贫血的相互作用也会导致多种临床疾病，而其与β-地中海贫血的共同遗传是称为血红蛋白Eβ-地中海贫血的病症，这是迄今为止亚洲最常见的严重β-地中海贫血的形式，并且在全球范围内约占临床严重β-地中海贫血疾病的50％(Suthat Fucharoen和David J.Weatherall，“The Hemoglobin E Thalassemias”，Cold Spring Harb Perspect Med.，2012年，第2卷第8期)。血红蛋白E (HbE)是一种非常常见的结构血红蛋白变体，在许多亚洲国家其出现频率很高。它是一种β-血红蛋白变体，以略微降低的速率产生，并且因此具有轻度形式的β-地中海贫血的表型。尽管单独的HbE不会引起任何明显的临床问题，但它与各种形式的α-和β-地中海贫血的相互作用产生了范围非常广泛的不同严重程度的临床综合征。

已经开发了基于六个独立参数(血红蛋白水平、疾病出现时的年龄、首次输血时的年龄、输血需求、脾大小、生长和发育)的评分系统，以将患者分成三个不同的严重程度类别：轻度、中度和重度，其中评分系统由六个临床标准组成，根据临床表现分数为0、0.5、1或2。总分范围为0至3.5、4至7和7.5至10的HbEβ-地中海贫血患者分别被分组为轻度、中度和重度病例。严重患者是非常贫血的并且是输血依赖型的；一些可能具有明显的生长迟缓，而轻度病例具有轻度贫血，并且通常具有正常的生长和发育(Sripichai O.等人，“A scoringsystem for the classification of β-thalassemia/Hb E disease severity”，Am JHematol，2008年，第83卷，第482-484页)。

在2012年，地中海贫血国际联盟在其指南中采用了地中海贫血临床分类的新术语，以区分

·非输血依赖型β-地中海贫血(NTDT)，和

·输血依赖型β-地中海贫血(TDT)。

地中海贫血的这种临床分类还描述于例如Viprakasit V.等人，“ClinicalClassification，Screening and Diagnosis for Thalassemia”，Hematol.Oncol.Clin.N.Am.， 2018年，第32卷，第193-211期。其中，图1示出NTDT/TDT是连续统，并且NTDT和 TDT两者都可由HbE/β-地中海贫血引起，这取决于β-等位基因的严重程度。

NTDT包括多种表型，与重型β-地中海贫血患者或严重形式的血红蛋白Eβ-地中海贫血患者不同，这些表型不需要定期输血疗法来维持生存。最常研究的形式是中间型β-地中海贫血、血红蛋白Eα-和β-地中海贫血(轻度和中度形式)和中间型α-地中海贫血(血红蛋白H病)。然而，这些患者的输血不依赖型并非没有副作用。无效红细胞生成、外周溶血和铁调素生成不足是疾病过程的标志，可能导致各种后续的病理生理包括铁过载和高凝结状态，最终导致许多严重的临床发病率，包括生长缓慢、青春期延迟、骨骼问题和/或脾肿大。

相反，TDT包括重型β-地中海贫血患者和严重形式的血红蛋白Eβ-地中海贫血患者，其中这些患者需要定期进行红细胞(RBC)输血来维持生存。TDT是β-地中海贫血的最严重形式，并且其特征在于需要定期输血，这不可避免地导致继发铁过载，铁过载定期用铁螯合疗法治疗。患有严重形式的β-地中海贫血的患者也可能经历严重的贫血、食欲不振、脸色苍白、尿色深、皮肤变黄(黄疸)以及肝或心脏扩大。定期输血和铁螯合疗法不能解决该疾病的潜在病理机制，并且与感染和不良反应的风险增加相关。此外，定期输血对患者来说是相当大的负担，并且相当大地降低了他们的生活质量。

通过应用公认的临床和血液学参数的临床评估来进行诊断和临床分类。

铁过载在重型地中海贫血和中间型地中海贫血两者中都是常见的，但在每种情况下都有不同的病因(Musallam KM等人，“Cross-talk between available guidelines forthe management of patients with beta-thalassemia major”，Acta Haematologica.，2013年，第 130卷第2期，第64-73页以及Musallam KM等人，“Iron overload in β-thalassemia intermedia：an emerging concern.Current Opinion in Hematology”，2013年，第20卷第3 期，第187-192页)。

重型地中海贫血患者定期接受RBC输血，并且没有伴随铁螯合疗法，来自这些输血的铁含量可大大增加患者体内循环和储存的铁的水平。

在中间型地中海贫血患者中，由于输血的频率低，因此输血不是铁过载的主要来源。然而，中间型地中海贫血患者由于肠对铁的吸收增加而经历铁过载，这主要由慢性贫血、无效红细胞生成和组织缺氧导致的铁调素的低血清水平驱动。

在重型地中海贫血和中间型地中海贫血患者两者中，铁过载的病理影响是广泛和全身性的，其中临床后遗症一些不同并且一些重叠(Cappellini MD等人，“Guidelines forthe Management of Transfusion Dependent Thalassaemia(TDT)”，(第3版)2014年以及Taher A等人，“Guidelines for the Management of Non Transfusion DependentThalassaemia(NTDT)”，2013年)。

重型地中海贫血患者群体和中间型地中海贫血患者群体两者都可能经历由于铁过载引起的内分泌系统破坏，并且可能发展为糖尿病、甲状腺功能减退和性腺机能减退。然而，重型地中海贫血患者通常比中间型地中海贫血患者在生命中更早经历铁过载，因此可能经历生长迟缓和青春期延迟。此外，由于铁诱发的心肌病，重型地中海贫血患者发生心力衰竭的风险增加，这种病症在中间型地中海贫血患者中发生的频率明显降低(MusallamKM，2013年)。在中间型地中海贫血患者中，观察到肝铁浓度增加和发生肝纤维化和肝衰竭之间的关联，可能导致肝细胞癌(Vichinsky E.，“Non- transfusion-dependentthalassemia and thalassemia intermedia：epidemiology，complications， andmanagement”，Current Medical Research and Opinion，2016年，第32卷第1期，第 191-204页)。

患有地中海贫血的患者的长期预后取决于该病症的类型和严重程度。例如，严重的地中海贫血可由于心力衰竭或肝并发症而导致早期死亡，而不太严重形式的地中海贫血通常不缩短寿命。如果输血良好并坚持铁螯合疗法，则重型地中海贫血患者可能活到40岁以上。大多数(71％)重型地中海贫血死亡与铁过载导致的心脏并发症有关(Galanello R、OrigaR.，“Beta-thalassemia.”，Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010年，第5卷，第11页)。

β-地中海贫血的诊断因重型地中海贫血和中间型地中海贫血而不同。重型地中海贫血患者通常在出生后6个月至24个月出现由小红细胞性贫血、轻度黄疸和肝脾肿大组成的症状。血液学发现包括血红蛋白水平低于7g/dL，MCV(平均细胞体积)在50fL和 70fL之间，和/或MCH(平均细胞血红蛋白)在12pg和20pg之间(Cappellini MD，2014 年)。

中间型地中海贫血患者通常比重型地中海贫血患者在显示较严重疾病的病例中出现更晚，介于2岁和6岁之间，而较轻的患者可能在成年后仍无症状。通常，中间型地中海贫血患者与重型地中海贫血患者相比表现出相似但较轻的症状，并且中间型地中海贫血患者通常表现出髓外造血。血液学发现包括血红蛋白水平介于7g/dL和10g/dL之间，MCV介于50fL和80fL之间，和/或MCH介于16pg和24pg之间(Cappellini MD，2014 年)。

一旦基于临床表现和血液学发现怀疑诊断，就通过遗传分析获得确认。突变特异性PCR扩增和完整β珠蛋白基因测序两者都可用(Cappellini R，2010年)。

存在铁螯合剂组中的各种药学活性药物，用于治疗铁过载或者轻度和轻度至中度β-地中海贫血表型，如轻型β-地中海贫血和中间型非输血依赖型β-地中海贫血。

另一种用于治疗或缓解严重输血依赖型β-地中海贫血的已申请上市许可的高级临床检查药剂是Luspatercept，该药剂是一种用作ActRIIB信号转导抑制剂的重组工程蛋白质，被设计成中和来自TGF-β家族的某些减慢RBC成熟的蛋白质。肠胃外施用Luspatercept。Luspatercept及其在输血依赖型地中海贫血治疗中的用途描述于例如WO2016183280中。

La Jolla Pharmaceutical的合成人铁调素LJPC-401和ProtagonistsTherapeutics公司的铁调素肽模拟物PTG-300两者都为肠胃外施用，进入了β-地中海贫血研究试验II期。

然而，药物的肠胃外施用通常需要医疗护理，这进一步增加了治疗成本，并且可能负面地影响患者依从性，并且给患者带来额外的负担。相反，口服药物施用比肠胃外施用具有优势，如患者特别是儿童施用容易，剂量和制剂高度灵活，成本效益，无菌限制和感染风险更小，注射部位反应和抗药物抗体产生。目前还没有批准用于治疗严重形式的β-地中海贫血中的贫血特别是TDT的口服药物。

考虑到患有严重形式的β-地中海贫血如TDT的患者面临严重威胁生命的情况，显然需要新的和改善的治疗选择，以提高受严重β-地中海贫血影响的患者的生存率和更好的生活质量。

J.H.Baek等人的“Ferroportin inhibition attenuates plasma iron，oxidantstress，and renal injury folowing red blood cell transfusion in guinea pigs”(Transfusion，2020年3 月，第60卷第3期，第513-523页)报告称，通过在豚鼠模型中急性红细胞输血后立即静脉内注射Vifor(国际)公司提供的小分子膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653导致血浆铁、NTBI水平、氧化应激和细胞损伤的减弱。

除了所述的用Luspatercept治疗外，迄今为止，TDT通常用定期输血(RBC输血) 进行治疗，同时用铁螯合化合物进行定期共同治疗，目的是持续清除定期输血引起的继发铁过载导致的过量铁。

用于螯合疗法的既定药物包括去铁胺(也称为去铁敏B；或

)。两种用于铁螯合疗法的新药是地拉罗司(Deferasirox，也称为

)和去铁酮(也称为

)，这两种药物已获准用于接受定期输血治疗地中海贫血患者，会导致铁过载的发展。

WO2013/086312A1描述了用于治疗铁过载的包含脱氮杂去铁硫辛(desazadesferthiocin)聚醚(DADFT-PE)类似物的口服制剂，包括通过作为潜在作用机制的铁螯合治疗患有非输血依赖型地中海贫血和输血依赖型遗传性和获得性贫血的受试者。

仅用定期输血治疗TDT并通过螯合疗法共同治疗发生的继发铁过载的缺点是持续需要定期从体内清除多余的铁，并为患者带来终生定期输血和螯合疗法的负担。此外，已知用于铁螯合疗法的既定药物表现出毒性潜力，这在长期施用中由于终身需要 TDT疗法而变得特别成问题。

然而，如本发明的实施例所示，常规螯合疗法与本发明的膜铁转运蛋白抑制剂在联合疗法中的联合被证明是新治疗地中海贫血特别是TDT的更有效的方法。

在国际申请WO2017/068089和WO2017/068090中描述了具有作为膜铁转运蛋白抑制剂活性的低分子量化合物及其通过口服施用在轻度和中度β-地中海贫血(例如中间型β-地中海贫血)中用于治疗铁过载的用途。此外，国际申请WO2018/192973涉及在 WO2017/068089和WO2017/068090中描述的选择的膜铁转运蛋白抑制剂的特定盐。在所述三个国际申请中描述的膜铁转运蛋白抑制剂与用于本发明的新医学适应症中使用的根据式(I)化合物重叠。

然而，所述文献中都没有描述所述膜铁转运蛋白抑制剂在治疗严重形式的输血依赖型β-地中海贫血(TDT)中的疗效，也没有公开有效治疗TDT或缓解与常规TDT治疗方法有关的负担的可能性。

发明目的

本发明的目的在于提供治疗严重形式的β-地中海贫血，如特别是输血依赖型β-地中海贫血(TDT)的新方法。本发明的一个具体目的可在于提供用于有效治疗TDT以及与其相关的症状和病理状况或者缓解与常规TDT治疗方法有关的负担的新型药物化合物。特别是，应提供用于治疗TDT和与其相关的症状和病理状况或者用于使用改善的施用途径(如特别是口服施用)来缓解与常规TDT治疗方法相关的负担的新型药物化合物，以简化施用、减少由肠道外施用引起的副作用、提高患者的依从性、安全的治疗费用和减少患者的治疗负担。在另一方面，本发明的目的可在于提供用于治疗TDT 和与其相关的症状和病理状况的化合物，这些化合物比基于重组工程蛋白或基因工程药物化合物的药物更容易且更便宜地制备。另一方面涉及提供通过在与铁螯合剂，特别是地拉罗司的联合疗法中施用如本文所述的口服膜铁转运蛋白抑制剂用于治疗严重形式的β-地中海贫血，如特别是TDT的新联合疗法。

具体实施方式

本发明的发明人惊奇地发现，起膜铁转运蛋白抑制剂(FpnI)作用的本文所定义的通式(I)化合物可用于治疗严重形式的β-地中海贫血，如输血依赖型β-地中海贫血，特别是包括重型β-地中海贫血和血红蛋白Eβ-地中海贫血，以及与其相关的症状和病理状况，如特别是骨髓中红细胞生成缺陷、无效红细胞生成、低血红蛋白水平/贫血、多器官功能障碍、铁过载、肝铁负荷和心脏铁过载、脸色苍白、疲劳、黄疸和脾肿大。

因此，本发明的第一方面涉及用于治疗输血依赖型β-地中海贫血(TDT)的根据下式(I)化合物以及它们的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物：

其中

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基；

n是1至3的整数；

A¹和A²独立地选自烷二基基团

R²是

-氢，或

-任选取代的烷基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环；

R3表示1个、2个或3个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-任选取代的烷基、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-卤素、

-C₁-C₃烷基，和

-卤素取代的烷基。

适应症

本发明涉及如本文所述的式(I)化合物及其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物用于治疗严重形式的β-地中海贫血，如特别是输血依赖型β-地中海贫血(TDT)，特别是包括重型β-地中海贫血和严重形式的血红蛋白Eβ-地中海贫血的新医学用途。如上所述，严重形式的β-地中海贫血和血红蛋白Eβ-地中海贫血要求患有这些疾病的患者进行定期输血/红细胞输血(RBC输血)。因此，此类严重形式的β-地中海贫血也被概括为输血依赖型B-地中海贫血(TDT)。

因此，本发明还涉及通过向有此需要的患者施用一种或多种如本文所定义的本发明的式(I)化合物中的，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，治疗严重形式的β-地中海贫血，如特别是输血依赖型β-地中海贫血(TDT)，特别是包括重型β-地中海贫血和严重形式的血红蛋白Eβ-地中海贫血的方法。

根据本发明的新用途和治疗方法包括向患有β-地中海贫血或血红蛋白Eβ-地中海贫血并需要定期输血的患者施用如本文所定义的本发明的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

特别是，根据本发明的新用途和治疗方法包括向患有重型β-地中海贫血和/或严重血红蛋白Eβ-地中海贫血的患者，更特别是向患有重型β-地中海贫血的患者施用如本文所定义的本发明的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的新用途的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”或“treating”)包括缓解输血依赖型β-地中海贫血的至少一种症状或与其相关的病理状况。与输血依赖型β-地中海贫血相关的症状或病理状况的非限制性实施例包括骨髓中红细胞生成缺陷、无效红细胞生成、血红蛋白水平不足、多器官功能障碍、铁过载、贫血、肝铁负荷和心脏铁过载、脸色苍白、疲劳、黄疸和脾肿大。

在本发明的上下文中，术语“治疗”还包括预防，例如通过在输血前或输血同时施用本发明的化合物，以预防或至少减轻输血引起的病理状况的发生。

TDT患者由于定期输血(BT)而具有严重的铁过载。在β-地中海贫血的治疗中输血疗法的主要目标是较正贫血病症并抑制红细胞生成。这被认为是在Hb水平≥9g/dL时完成的。BT引起铁调素的瞬时上调，当血红蛋白(Hb)水平降低时，铁调素回到基线值(PasrichaS.R.等人，“Transfusion suppresses erythropoiesis and increases hepcidin inadult patients with beta-thalassemia major：a longitudinal study”，Blood，2013年，第122 卷第1期，第124-133页)。根据本发明的式(I)的膜铁转运蛋白抑制剂化合物的施用有助于防止在输血间隔期间肠对铁的吸收，这有助于进一步降低TDT患者中的铁过载。

更重要的是，BT产生的非转铁蛋白结合铁(NTBI)通过巨噬细胞回收输血的RBC 单位中所含的受损红细胞而释放，并触发氧化应激、血管损伤和器官铁过载(Baek J. H.等人，“Iron accelerates hemoglobin oxidation increasing mortality in vasculardiseased guinea pigs following transfusion of stored blood”，JCI Insight，2017年，第2卷第9期)。因此，进行定期BT和铁螯合疗法的地中海贫血患者的NTBI水平升高，这与心脏病的存在相关(Piga A等人，“High nontransferrin bound iron levels and heartdisease in thalassemia major”，Am J Hematol.，2009年，第84卷第1期，第29-33页)。已经发现，作为膜铁转运蛋白抑制剂的本发明的式(I)化合物通过将铁螯合在巨噬细胞中并因此中断β-地中海贫血的恶性循环而防止这些有害作用。

本发明的发明人发现，本发明的式(I)化合物通过限制铁在形成有毒α珠蛋白聚集体方面的可用性而特别适合于治疗输血依赖型地中海贫血。还已发现本发明的式(I)化合物通过限制红细胞前体中的活性氧物类(ROS)并且从而改善患有严重形式的β-地中海贫血如TDT的患者的红细胞生成而特别适用于治疗输血依赖型地中海贫血。因此，更多具有延长寿命的RBC缓解TDT患者中的贫血并改善组织氧合。在TDT中，式(I)化合物还有效地降低了升高的NTBI水平，这有助于防止由此衍生的病理状况的发生，如心脏铁过载和因此产生的心脏病。

包含与转铁蛋白不紧密相关的所有形式的血清铁的NTBI在化学和功能上是异质的。LPI(不稳定血浆铁)代表NTBI的组分，其具有氧化还原活性和可螯合性两者，能够渗透到器官中并诱导组织铁过载。式(I)化合物具有有效降低TDT中升高的LPI水平的潜力。

可确定以下参数来评价本发明的化合物在新医学用途中的疗效：血清铁、NTBI水平、LPI(不稳定血浆铁)水平、促红细胞生成素、TSAT(转铁蛋白饱和度)、Hb (血红蛋白)、Hct(血细胞比容)、MCV(平均细胞体积)、MCH(平均细胞血红蛋白)、RDW(红细胞分布宽度)和网织红细胞数、全血计数、脾和肝重、脾和骨髓中的红细胞生成、脾和肝铁含量以及RBC膜中的α-珠蛋白聚集体。可使用本领域的常规方法，特别是通过以下更详细描述的那些方法进行测定。本发明的化合物(I)适于改善这些参数中的至少一者。

如Patel等人(2012年；如上所引用)所解释的，在正常生理条件下，转铁蛋白水平足以完全清除游离铁，从而确保不存在NTBI，并且因此正常健康个体中的NTBI水平不超过1μmol/L，并且大多数通过最常用的方法检测不到。据报道，在不存在转铁蛋白时，NTBI水平高达20μmol/L，并且在转铁蛋白不足时，发现NTBI水平高达10μmol/L。然而，如Patel等人(2012年)和Brissot等人(2012年)所述，测定在很大程度上取决于所用的应用方法和测定法，并且必须考虑到测定循环NTBI的异质化学形式所产生的技术困难。例如，Brissot等人(2012年)引用的Hider等人(2010年)已描述了具有低至0.1μM/L的可重复精度的荧光测量。根据Patel等人(2012年；表1)，临床铁过载条件中的NTBI水平升高的范围在0.25μmol/L至4.0μmol/L之间(具有不同的精度和不同的测定方法)。考虑到这一点，在本发明的意义上，如果用已知方法(例如Patel等人 (2012年)或Brissot等人(2012年)中描述的方法)可检测到，则NTBI水平被认为是升高的，优选地超过0.1μm/L。

在一个特别的方面，本发明的新治疗导致患者的NTBI水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在施用后至多72 小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时、8小时、6 小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时和0.5小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内或至多＜1周的任何时间点测定的患者的NTBI水平相比。NTBI可根据以下实施例中所述的测定法测定。

在一个特别的方面，本发明的新治疗导致患者的LPI水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在施用后至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时、8小时、6小时、5 小时、4小时、3小时、2小时、1小时和0.5小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内或至多＜1周的任何时间点测定的患者的总 LPI水平相比。LPI可根据以下实施例中所述的测定法测定。

在另一方面，本发明的发明人发现RBC中α珠蛋白聚集体的定量是本发明化合物在存在或不存在输血时疗效的重要生物标志物。通过以下实施例中所述的方法测量α珠蛋白聚集体。

沉淀的α-珠蛋白聚集体包含血红素和铁，它们产生活性氧物类(ROS)，从而导致RBC寿命缩短、贫血和组织缺氧。通过减少TDT患者RBC中的α-珠蛋白聚集体，本发明的式(I)化合物改善了红细胞生成，该红细胞生成具有减少TDT患者输血负担的潜力。本发明的化合物对供体RBC中ROS水平的影响可通过可商购的发射远红外或绿光的ROS敏感性传感器来监测，例如，如以下实施例中所述。

因此，在另一方面，本发明的新治疗导致患者的α珠蛋白聚集体水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多2周、至多3周、至多4周、至多3个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的α珠蛋白聚集体水平相比。RBC中α-珠蛋白聚集体的水平可根据以下实施例中所述的测定法测定。

在另一方面，本发明的新治疗导致患者的RBC中的ROS水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/ 或缺血事件后至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多11 天、至多12天、至多13天、至多14天、至多15天、至多16天、至多17天、至多18天、至多19天、至多20天、至多21天和至多1个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的RBC中的ROS水平相比。RBC中的ROS水平可根据以下实施例中所述的测定法测定。

如上所述，降低升高的NTBI水平和LPI水平有助于降低肝铁浓度和心肌铁浓度。

因此，在另一方面，新治疗可导致患者的肝铁浓度降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多 2周、至多3周、至多4周、至多3个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的肝铁浓度水平相比。肝铁浓度可根据以下实施例中所述的测定法测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的心肌铁浓度降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多2周、至多3周、至多4周、至多3个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的受试者的心肌铁浓度相比。心肌铁浓度可根据以下实施例中所述的测定法测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的脾大小减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多2周、至多3周、至多4周、至多3 个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的受试者的脾大小相比。脾大小可根据常规方法测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的参数Hct、MCV、MCH、RDW和网织红细胞数中的至少一者改善至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多2周、至多3周、至多4周、至多3个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的受试者的相应参数相比。所述参数可根据常规方法测定。

在另一方面，新治疗可导致红细胞应答，该红细胞应答包括患者的输血负担降低至少33％，优选至少50％。原则上，红细胞应答可包括患者的输血负担减少至少10％、15％、20％、25％、30％、33％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％。在另一方面，新治疗可导致红细胞应答，该红细胞应答包括在至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11 周、12周、13周、14周、15周、16周、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、至多18个月、至多24个月或甚至超过输血不依赖型的时间内，患者输血负担降低至少10％、15％、20％、25％、30％、33％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％。在另一方面，新治疗可导致红细胞应答，该红细胞应答包括患者的红细胞输血减少至少1个、 2个、3个、4个或更多个红细胞单位。在另一方面，新治疗可导致红细胞应答，该红细胞应答包括在至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、 13周、14周、15周、16周、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、 12个月、至多18个月、至多24个月或甚至超过红细胞单位的输血不依赖型的时间内，患者的红细胞输血降低至少1个、2个、3个、4个或更多个红细胞单位。可能的是，红细胞应答包括上述改善中的一种或多种。红细胞应答可如以下实施例中所述测定。

其中，一个单位的红细胞是指从大约200mL至500mL的捐献血液得到的一定数量的填充红细胞。通常，根据年龄、疾病的严重程度和患者的起始血液参数来调节输血。选择输血量的指南推荐例如：

个体输血体积还可以用下式计算：

(期望-实际Hb)×体重[kg]×3/输血单位的血细胞比容＝待输血的ml

根据推荐的重型地中海贫血输血方案，相当于每年每kg体重100ml至200ml纯红细胞(RBC)输血。

在另一方面，与本发明的治疗开始之前1周、2周、3周或4周、2个月、3个月、4个月、6个月、8个月、9个月、12个月、24个月内患者的输血负担相比，新治疗可导致患者的输血负担降低。

在另一方面，新治疗可实现根据本发明的新方法治疗的输血依赖型β-地中海贫血患者在治疗后至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、 13周、14周、15周、16周、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、 12个月、18个月、24个月或甚至更长时间内不需要红细胞输血，直到不依赖红细胞输血。

在另一方面，新治疗可导致患者每日铁螯合疗法的降低，例如施用给患者的一种或多种铁螯合治疗剂的剂量或频率的减少。铁螯合治疗剂的非限制性实例包括上述那些。

在另一方面，新治疗可导致患者血清铁蛋白水平减少至少5％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后至多一周、至多2周、至多3周、至多4周、至多3个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前1 周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的血清铁蛋白水平相比。血清铁蛋白水平可根据常规测定法测定。

在另一方面，新治疗可导致与一种或多种输血依赖型β-地中海贫血临床并发症相关的症状降低。输血依赖型β-地中海贫血症状的非限制性实例包括生长迟缓、脸色苍白、黄疸、肌肉组织差、膝外翻、肝脾肿大、腿溃疡、由髓外造血引起的肿块发展、由骨髓扩张引起的骨骼改变和慢性红细胞输血的临床并发症，例如乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染和人类免疫缺陷病毒感染、同种异体免疫和由于铁过载引起的器官损伤，例如肝损伤、心脏损伤和内分泌腺损伤。尽管预期式(I)化合物不直接影响生长分化因子11(GDF1 1)，但由于髓外红细胞生成降低也可能导致骨骼畸形减少。因此，本文所定义的式(I)化合物具有间接缓解这种病理状况的潜力。

在另一方面，与在本发明治疗开始前的1周、2周、3周或4周内测定的患者生活质量相比，新治疗可导致患者生活质量的改善。在治疗开始后3个月、6个月、9个月、12 个月、15个月、18个月、21个月或24个月内测定生活质量的改善。生活质量可根据以下实施例中所述的测定法测定。

用根据本发明的新治疗方法，可实现上述改善中的一种或多种。

患者组

本发明涉及如本文所述的式(I)化合物及其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物用于治疗严重形式的β-地中海贫血的新医学用途。

原则上，根据本发明的新用途中待治疗的受试者可以是任何哺乳动物，如啮齿类和灵长类，并且在优选的方面，新医学用途涉及人的治疗。患有严重β-地中海贫血并用根据本发明的新方法治疗的受试者也称为“患者”。

待治疗的受试者可以是任何年龄。本发明的优选的方面涉及儿童和青少年的治疗。因此，在本发明的优选方面，待用本文所述的新方法治疗的受试者小于18岁。更特别地，待用本文所述的新方法治疗的受试者小于16岁、小于15岁、小于14岁、小于 13岁、小于12岁、小于11岁、小于10岁、小于9岁、小于8岁、小于7岁、小于6岁或小于5岁。在本发明的另一方面，待用本文所述的新方法治疗的受试者是1岁至3岁、3岁至5岁、5岁至7岁、7岁至9岁、9岁至11岁、11岁至13岁、13岁至15岁、15岁至20岁、 20岁至25岁、25岁至30岁或大于30岁。在治疗成人的情况下，待用本文所述的新方法治疗的受试者是18岁至25岁、20岁至25岁、25岁至30岁、30岁至35岁、35岁至40岁、 40岁至45岁、45岁至50岁、50岁至55岁、55岁至60岁或大于60岁。在治疗老年患者的情况下，待用本文所述的新方法治疗的受试者是60岁至65岁、65岁至70岁、70岁至75 岁、75岁至80岁或大于80岁。

由于用本发明的式(I)的膜铁转运蛋白抑制剂化合物治疗提供的显著优点，因此特别优选治疗儿童和青少年。所述化合物可口服施用，这优于目前为止可用的药物(例如Luspatercept)的肠胃外施用。此外，本发明的口服生物可利用的膜铁转运蛋白抑制剂证明在体内具有中等的生物利用度和半衰期，并因此相对快速地被洗脱。这导致副作用较小和药物的可逆性较快，这在儿童治疗中特别重要。

患有严重形式的β-地中海贫血并待用根据本发明的新方法治疗的患者组或群体选自患有以下疾病的受试者(患者)

a)来自以下的基因型：β°/β°、β⁺/β⁺、β°/β⁺和β°/HbE，优选β⁺/β⁺、β°/β⁺和β°/HbE，和/或

b)包含两种严重血红蛋白β链突变的共同遗传的基因型。其中，“β⁰”是指与缺乏β珠蛋白亚基合成相关的等位基因。“β⁺”是指与β珠蛋白亚基合成降低相关的等位基因。“Hb”是指血红蛋白蛋白质。“HbE”或“血红蛋白E”是常规公认的术语，并且是指血红蛋白的突变形式，例如人血红蛋白。血红蛋白E包括两个α亚基和两个β亚基，其中β亚基的位置26从谷氨酸突变为赖氨酸(E26K)。“HbEβ-地中海贫血”是指血红蛋白E和β⁰等位基因的共同遗传。

在另一方面，待用本发明的新方法治疗的患者组还具有胎儿血红蛋白的遗传持续性。

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体选自NTBI水平升高的受试者(患者)。如果用上述已知方法可检测到，则NTBI水平被认为是升高的。优选地，认为NTBI水平≥0.1μM/L在TDT患者中是升高的。更优选地，根据本发明，TDT患者(“重型TD和CH”，CH＝接受螯合)中升高的 NTBI水平是超过在如deSwart等人(“Second international round robin for the quantification of serumnon-transferrin-bound iron and labile plasma iron in patients with iron-overload disorders”，Haematologica，2016年，第101卷第1期，第38-45页)所述的相应测定方法中在NTDT患者(“初始重型”或“初始中间型”)中测定的值的NTBI值，

表2：

*DCI＝可直接螯合铁

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体选自LPI水平升高的受试者(患者)。如果用上述已知方法可检测到，则LPI水平被认为是升高的。优选地，根据本发明，TDT患者(“重型TD和CH”)中升高的LPI水平是超过在如de Swart等人(“Second international round robin for the quantificationof serum non-transferrin-bound iron and labile plasma iron in patients withiron-overload disorders”，Haematologica，2016年，第101卷第1期，第38-45页)所述的相应测定方法中在NTDT患者(“初始重型”或“初始中间型”)中测定的值的LPI值，

表2：

通常，血红蛋白水平(Hb)用于对地中海贫血的严重程度和形式进行分类。患有轻度形式和轻度至中度形式的地中海贫血如轻型或中间型地中海贫血的患者的Hb水平分别维持在9g/dl至12g/dl之间或6g/dl至7g/dl之间。患有本文所述的严重形式的地中海贫血的患者，即TDT患者，通常通过连续两次测试中Hb水平＜7g/dL或血红蛋白水平≥7g/dL且也存在面部改变、骨骼骨折、髓外血细胞生成或生长迟缓的患者进行分类。 TDT患者的Hb水平可低至4g/dl至5g/dl。尽管国际指南推荐患者输血达到9g/dL至0g/dL 血红蛋白范围，其中最佳输血后范围为13g/dL至14g/dL，但是在临床实践中，通常认为高达7g/dL的Hb水平在没有定期输血的情况下是足够的，并且然后在输血时，通常的目的是使患者维持在9.5g/dL至10g/dL之间的血红蛋白水平。达到推荐的13g/dL至14g/dL 的较高Hb水平将需要过度增加输血负担。然而，所需的血液量在患者之间变化很大，并且很大程度上受患者的体重和目标血红蛋白水平的影响。

考虑到这一点，在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体可选自血红蛋白(Hb)水平低于7g/dL或血红蛋白水平≥7g/dL但也存在面部改变、骨骼骨折、髓外血细胞生成或生长迟缓的受试者(患者)。

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体可选自MCV介于50fL至70fL之间的受试者(患者)。

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体可选自MCH介于12pg至20pg的受试者(患者)。

在另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体可选自具有包括以下特征中的一种或多种的受试者(患者)：a)Hb水平低于 7g/dL或血红蛋白水平≥7g/dL以及面部改变、骨骼骨折、髓外血细胞生成或生长迟缓， b)MCV介于50fL和70fL之间，以及c)MCH介于12pg和20pg之间。

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体接受定期输血。每24周需要超过5次输血的地中海贫血患者(根据Cappellini MD等人，“The Believe Trial：Results of a Phase 3，Randomized，Double-Blind， Placebo-Controlled Study of Luspatercept in Adult Beta-ThalassemiaPatients Who Require Regular Red Blood Cell(RBC)Transfusions”，Blood，2018年)通常被认为是TDT患者，而每24周需要5次或更少输血的患者通常仍被认为是NTDT患者。然而，如上详细所述，另外的临床症状和参数也在确定TDT相对于NTDT状态中起重要作用。定期输血还意味着在至少长达两个月的时间间隔内或在更短的间隔内多于一次重复血红细胞(RBC)单位输血。间隔可以是等长的，或者可根据个体患者、疾病的过程、其严重程度和治疗应答而变化。定期输血可另外包括在后续输注时间点重复相等或不同的输血单位输血。定期输血可包括

-在不同后续时间间隔内相等RBC单位的重复输血，或

-在相等后续时间间隔内相等RBC单位的重复输血，或

-在相等后续时间间隔内不同RBC单位的重复输血，或

-在不同后续时间间隔内不同RBC单位的重复输血。

在本发明的另一方面，定期输血意指不超过3个月，优选不超过2个月的无输血期。

在本发明的另一方面，患有严重形式的β-地中海贫血并待用本发明的新方法治疗的患者组或群体选自需要定期铁螯合疗法的受试者(患者)。

需要定期进行铁螯合疗法的此类患者组或群体的特征可还在于上文所定义的特征中的一种或多种。

施用形式

在本发明的另一方面，治疗严重形式的β-地中海贫血，如输血依赖型β-地中海贫血和/或重型β-地中海贫血，包括向有此需要的患者口服施用式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物中的一种或多种，它们各自如本文任意处所述。

为此，根据本发明的式(I)化合物优选以口服施用形式的药物或药物组合物提供，包括例如丸剂、片剂(如肠溶片剂、薄膜片剂和层片剂)、口服施用的缓释制剂、贮库制剂、糖衣丸、颗粒剂、乳剂、分散体、微囊剂、微米制剂、纳米制剂、脂质体制剂、胶囊(如肠溶胶囊)、散剂、微晶制剂、撒布粉、滴剂、安瓿剂、溶液剂和口服施用的混悬剂。

在本发明的优选实施方案中，根据本发明的式(I)化合物以如上所定义的片剂或胶囊形式施用。这些可以例如作为耐酸形式或与pH依赖型涂层一起存在。

因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，以及包含它们的药物、组合物和联合制剂，在用于治疗严重形式的β-地中海贫血，如特别是口服施用形式的输血依赖型β-地中海贫血和 /或重型β-地中海贫血的药物中的用途。

给药方案

本发明的另一方面涉及用于根据本发明的用途的根据本发明的式(I)化合物，其中治疗的特征在于以下给药方案之一：

在一方面，根据本发明的式(I)化合物可以0.001mg至500mg的剂量施用给有此需要的患者，例如每天1次至4次。然而，剂量可根据患者的年龄、体重、病症、疾病的严重程度或施用的类型而增加或减少。在本发明的另一方面，式(I)化合物可以0.1mg、 0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、1.5mg、2mg、 2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、1 1mg、 12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、 140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、 190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、 240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、 290mg、295mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、 500mg的剂量施用。

优选的剂量介于0.5mg至500mg之间，更优选的介于1mg至300mg或3mg至300mg之间，更优选的介于1mg至250mg或5mg至250mg之间。

最优选的剂量为5mg、15mg、60mg、120mg或240mg。

可以每日单剂量或分成每日两次或更多次施用的亚剂量的总日剂量形式施用上述剂量。

在另一方面，可施用0.001mg/kg体重至35mg/kg体重、0.01mg/kg体重至35mg/kg体重、0.1mg/kg体重至25mg/kg体重或介于0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、2mg/kg体重、 3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、 9mg/kg体重、10mg/kg体重至最多20mg/kg体重的剂量。特别优选的剂量是120mg(对于体重＞50kg的患者)和60mg(对于体重＜50kg的患者)，在每种情况下每天一次或两次。

在另一方面，可选择上述所定义的剂量之一作为初始剂量，并且后续以1天至7天、1天至5天、优选1天至3天或每两天的重复间隔施用1次或更多次相同或不同的上述所定义的剂量。

初始剂量和后续剂量可选自以上所定义的剂量，并且根据TDT患者的需要在所提供的范围内进行调节/改变。

特别是，后续剂量的量可根据个体患者、疾病的过程和治疗应答适当地进行选择。可施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次和更多次后续剂量。

可能的是，初始剂量等于或不同于该一个或多个后续剂量。另外可能的是，后续剂量是相等的或不同的。

重复间隔可以是相同长度，或者可根据个体患者、疾病的过程和治疗应答而变化。

优选地，后续剂量的量随着后续给药次数的增加而减少。

优选地，在至少3天、至少5天、至少7天的治疗期内，每天一次施用介于3mg和300mg之间、更优选地介于5mg和250mg之间、最优选地5mg、15mg、60mg、120mg或 240mg的剂量。在另外优选的方面，每天一次施用60mg或120mg的剂量。在另外优选的方面，120mg的总日剂量通过每日两次施用60mg剂量来施用。

在另外优选的方面，240mg的总日剂量通过每日两次施用120mg剂量来施用。所述剂量证明是安全的和良好耐受的。

优选的给药方案还显示了快速的口服吸收，其中早在给药后15分钟至30分钟就可检测到水平。即使在重复给药时，吸收水平也可维持稳定，并且没有观察到严重的累积。

优选的给药方案另外证明有效降低平均血清铁水平和平均计算的转铁蛋白饱和度并偏移平均血清铁调素峰，从而表明其治疗TDT的效率。

在本发明的另一方面，根据所治疗患者的血红蛋白浓度调节初始和一个或多个后续给药。血红蛋白浓度用常规方法测定。

膜铁转运蛋白(Fpn)抑制剂化合物

本发明涉及如本文所定义的式(I)化合物的新医学用途：

其中和在整个发明中，取代基基团具有如本文任意处详细定义的含义：

任选取代的烷基优选地包括：优选地含有1个至8个，更优选地1个至6个，特别优选地1个至4个，甚至更优选地1个、2个或3个碳原子的直链或支链烷基，也表示为C₁- C₄烷基或C₁-C₃烷基。

任选取代的烷基还包括优选地含有3个至8个、更优选地5个或6个碳原子的环烷基。

含有1个至8个碳原子的烷基残基的实例包括：甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、异戊基基团、仲戊基基团、叔戊基基团、2-甲基丁基基团、正己基基团、1-甲基戊基基团、2-甲基戊基基团、3-甲基戊基基团、4-甲基戊基基团、1-乙基丁基基团、2-乙基丁基基团、3-乙基丁基基团、1，1-二甲基丁基基团、2，2-二甲基丁基基团、3，3-二甲基丁基基团、1-乙基-1-甲基丙基基团、正庚基基团、1-甲基己基基团、2-甲基己基基团、 3-甲基己基基团、4-甲基己基基团、5-甲基己基基团、1-乙基戊基基团、2-乙基戊基基团、3-乙基戊基基团、4-乙基戊基基团、1，1-二甲基戊基基团、2，2-二甲基戊基基团、 3，3-二甲基戊基基团、4，4-二甲基戊基基团、1-丙基丁基基团、正辛基基团、1-甲基庚基基团、2-甲基庚基基团、3-甲基庚基基团、4-甲基庚基基团、5-甲基庚基基团、6-甲基庚基基团、1-乙基己基基团、2-乙基己基基团、3-乙基己基基团、4-乙基己基基团、 5-乙基己基基团、1，1-二甲基己基基团、2，2-二甲基己基基团、3，3-二甲基己基基团、4，4-二甲基己基基团、5，5-二甲基己基基团、1-丙基戊基基团、2-丙基戊基基团等。含有1个至4个碳原子的那些(C₁-C₄烷基)，如特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基是优选。C₁-C₃烷基，特别是更优选的是甲基、乙基、丙基和异丙基。最优选的是C₁和C₂烷基，如甲基和乙基。

含有3个至8个碳原子的环烷基残基优选地包括：环丙基基团、环丁基基团、环戊基基团、环己基基团、环庚基基团和环辛基基团。优选的是环丙基基团、环丁基基团、环戊基基团和环己基基团。特别优选的是环丙基基团。

上述定义的任选取代的烷基的取代基优选地包括1个、2个或3个相同或不同的取代基，选自例如：如下所定义的卤素，如优选的F，如上所定义的环烷基，如优选的环丙基，如下所定义的任选取代的杂芳基，如优选的苯并咪唑基基团，如下所定义的任选取代的氨基，如优选的氨基基团或苄氧羰基氨基、羧基基团，如下所定义的氨基羰基基团，以及亚烷基基团如特别是亚甲基基团从而形成例如亚甲基取代的乙基基团 (CH₃-(C＝CH₂)-或

其中*表示键合位点)。

在本发明的意义上，卤素包括氟、氯、溴和碘，优选的是氟或氯，最优选的是氟。

被卤素取代并含有1个至8个碳原子的直链或支链烷基残基的实例包括：

氟甲基基团、二氟甲基基团、三氟甲基基团、氯甲基基团、二氯甲基基团、三氯甲基基团、溴甲基基团、二溴甲基基团、三溴甲基基团、1-氟乙基基团、1-氯乙基基团、1-溴乙基基团、2-氟乙基基团、2-氯乙基基团、2-溴乙基基团、二氟乙基基团如 1，2-二氟乙基基团、1，2-二氯乙基基团、1，2-二溴乙基基团、2，2-二氟乙基基团、2，2-二氯乙基基团、2，2-二溴乙基基团、2，2，2-三氟乙基基团、七氟乙基基团、1-氟丙基基团、 1-氯丙基基团、1-溴丙基基团、2-氟丙基基团、2-氯丙基基团、2-溴丙基基团、3-氟丙基基团、3-氯丙基基团、3-溴丙基基团、1，2-二氟丙基基团、1，2-二氯丙基基团、1，2-二溴丙基基团、2，3-二氟丙基基团、2，3-二氯丙基基团、2，3-二溴丙基基团、3，3，3-三氟丙基基团、2，2，3，3，3-五氟丙基基团、2-氟丁基基团、2-氯丁基基团、2-溴丁基基团、4-氟丁基基团、4-氯丁基基团、4-溴丁基基团、4，4，4-三氟丁基基团、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基基团、全氟丁基基团、2-氟戊基基团、2-氯戊基基团、2-溴戊基基团、5-氟戊基基团、 5-氯戊基基团、5-溴戊基基团、全氟戊基基团、2-氟己基基团、2-氯己基基团、2-溴己基基团、6-氟己基基团、6-氯己基基团、6-溴己基基团、全氟己基基团、2-氟庚基基团、2-氯庚基基团、2-溴庚基基团、7-氟庚基基团、7-氯庚基基团、7-溴庚基基团、全氟庚基基团等。尤其提及氟烷基、二氟烷基和三氟烷基，并且优选的是三氟甲基以及单氟乙基和二氟乙基。特别优选的是三氟甲基。

环烷基取代的烷基基团的实例包括上述含有1个至3个、优选1个环烷基基团的烷基残基，例如：环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、2-环丙基乙基、2- 环丁基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基、2-环丙基丙基或3-环丙基丙基、2-环丁基丙基或3-环丁基丙基、2-环戊基丙基或3-环己基丙基、2-环己基丙基或3-环己基丙基等。优选的是环丙基甲基。

杂芳基取代的烷基基团的实例包括上述含有1个至3个，优选1个(任选取代的)杂芳基基团的烷基残基，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻吩基或噁唑基基团，如吡啶-2-基-甲基、吡啶-3-基-甲基、吡啶-4-基-甲基、2-吡啶-2-基-乙基、2-吡啶-1-基-乙基、2-吡啶-3-基-乙基、哒嗪-3-基-甲基、嘧啶-2- 基-甲基、嘧啶-4-基-甲基、吡嗪-2-基-甲基、吡唑-3-基-甲基、吡唑-4-基-甲基、吡唑-5- 基-甲基、咪唑-2-基-甲基、咪唑-5-基-甲基、苯并咪唑-2-基-甲基、噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、1，3-噁唑-2-基-甲基。

优选的是被苯并咪唑基基团取代的烷基基团，如苯并咪唑-2-基-甲基和苯并咪唑-2- 基-乙基。

氨基取代的烷基残基的实例包括上述含有1个至3个、优选1个(任选取代的)如下所定义的氨基基团的烷基残基，例如氨基烷基(NH₂烷基)或单或二烷基氨基-烷基，如氨基甲基、2-氨基乙基、2-氨基丙基或3-氨基丙基、甲基氨基甲基、甲基氨基乙基、甲基氨基丙基、2-乙基氨基甲基、3-乙基氨基甲基、2-乙基氨基乙基、3-乙基氨基乙基等。优选3-氨基丙基，或可被任选取代的烷氧基羰基氨基基团取代的烷基基团，如根据下式的基团

其中R为苯基基团，形成苄氧羰基氨基丙基基团。

根据本发明的任选取代的氨基优选地包括：氨基(-NH₂)、任选取代的单或二烷基氨基(烷基-NH-、(烷基)₂N-)，其中关于“烷基”可参考上述任选取代的烷基的定义。优选的是单或二甲基氨基、单或二乙基氨基以及单丙基氨基。最优选的是氨基基团(-NH₂)和单丙基氨基。

此外，在本发明的意义上，羧基基团表示基团[-(C＝O)-OH]并且氨基羰基基团表示基团[NH₂-(C＝O)-]。

任选取代的烷氧基包括任选取代的烷基-O-基团，其中可参考烷基基团的前述定义。优选的烷氧基基团是含有至多6个碳原子的直链或支链烷氧基基团，如甲氧基基团、乙氧基基团、正丙氧基基团、异丙氧基基团、正丁氧基基团、异丁氧基基团、仲丁氧基基团、叔丁氧基基团、正戊氧基基团、异戊氧基基团、仲戊氧基基团、叔戊氧基基团、2-甲基丁氧基基团、正己氧基基团、异己氧基基团、叔己氧基基团、仲己氧基基团、2-甲基戊氧基基团、3-甲基戊氧基基团、1-乙基丁氧基基团、2-乙基丁氧基基团、1，1-二甲基丁氧基基团、2，2-二甲基丁氧基基团、3，3-二甲基丁氧基基团、1-乙基-1- 甲基丙氧基基团，以及环烷氧基基团如环戊氧基基团或环己氧基基团。优选的是甲氧基基团、乙氧基基团、正丙氧基基团和异丙氧基基团。更优选的是甲氧基和乙氧基基团。特别优选的是甲氧基基团。

在本发明中，任选取代的烷二基优选地是具有1个至6个、优选1个至4个、更优选1个、2个或3个碳原子的二价直链或支链的烷二基自由基，该烷二基自由基可任选地带有1个至3个、优选1个或2个选自卤素、羟基(-OH)、氧代基(C＝O；形成羰基或酰基基团[-(C＝O)-])和如上定义的烷基基团如优选甲基的取代基。以下可作为优选实例提及：亚甲基、乙烷-1，2-二基、乙烷-1，1-二基、丙烷-1，3-二基、丙烷-1，1-二基、丙烷-1，2- 二基、丙烷-2，2-二基、丁烷-1，4-二基、丁烷-1，2-二基、丁烷-1，3-二基、丁烷-2，3-二基、丁烷-1，1-二基、丁烷-2，2-二基、丁烷-3，3-二基、戊烷-1，5-二基等。特别优选的是亚甲基、乙烷-1，2-二基、乙烷-1，1-二基、丙烷-1，3-二基、丙烷-2，2-二基和丁烷-2，2-二基。最优选的是亚甲基、乙烷-1，2-二基和丙烷-1，3-二基。

优选取代的烷二基自由基是羟基取代的烷二基如羟基取代的乙烷二基，氧代取代的烷二基如氧代取代的亚甲基或乙烷二基自由从而形成羰基或酰基(乙酰基)基团，卤素取代的烷二基基团如被一个或两个选自F和Cl的卤素原子取代的烷二基基团优选 2，2-二氟乙烷二基，或被甲基基团取代的烷二基基团。

根据本发明，另外可能的是，具有如上所定义的直链或支链烷二基基团含义的A¹和具有如上所定义的任选取代的烷基基团含义的R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环，该环可被1个至3个如上所定义的取代基取代。因此，A¹和R²可一起来自根据下式之一的基团

其中优选(取代或未取代的)4元环，如非常特别地为基团

其中左侧键合位点表示与本发明的式(I)中X¹和X²之间的杂环 5元环的直接键合位点。右侧键合位点表示与具有本文所定义的烷二基基团含义的基团 A²的键合位点。

在本文任意处所定义的式(I)中，n具有整数1至3的含义，包括1、2或3，因此表示亚甲基基团、乙烷-1，2-二基基团或丙烷-1，3-二基基团。更优选n是1或2，并且甚至更优选地n是1，表示亚甲基基团。

在本发明中，上述式(I)的各个取代基可具有以下含义：

A)X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

从而形成根据下式的5元杂环

其中*表示与氨基羰基基团的键合位点，**表示与A¹基团的键合位点。

B)n是1、2或3的整数；优选地n是1或2，更优选地n是1。

C)R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基(如上所定义)；

优选地R¹是氢或甲基，更优选地R¹是氢。

D)R²选自

-氢，和

-任选取代的烷基(如上所定义)；

优选地^R2是氢或C₁-C₄烷基，更优选地R²是氢或甲基，甚至更优选地R²是氢。

E)R³表示1个、2个或3个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自

-卤素(如上所定义)、

-氰基、

-任选取代的烷基(如上所定义)、

-任选取代的烷氧基(如上所定义)和

-羧基基团(如上所定义)；

优选地R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-烷基(如上所定义)(其可被1个、2个或3个卤素原子(如上所定义)取代)、任选取代的烷氧基(如上所定义)和

羧基基团(如上所定义)；

更优选地R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自

-F和Cl、

-氰基、

-三氟甲基、

-甲氧基和

-羧基基团；

甚至更优选地R³为氢，表示式(I)中未取代的末端苯并咪唑基环。

F)R⁴选自

-氢、

-卤素(如上所定义)、

-C₁-C₃烷基，和

-卤素取代的烷基(如上所定义)；

优选地R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基、乙基、异丙基和

-三氟甲基；

更优选R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基，和

-三氟甲基；

更优选R⁴选自

-氢、

-Cl和

-甲基；

甚至更优选地R⁴是氢。

G)A¹是烷二基；

优选地A¹是亚甲基或乙烷-1，2-二基，更优选地A¹是乙烷-1，2-二基。

H)A²是烷二基；

优选地A²是亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

更优选地A²是亚甲基或乙烷-1，2-二基；

甚至更优选地A²是乙烷-1，2-二基。

I)或A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成如上所定义的任选取代的4元至6元环；

其中A¹和R²与它们所键合的氮原子一起优选地形成如上所定义的任选取代的4元环；

其中A¹和R²与它们所键合的氮原子一起更优选形成未取代的4元环(氮杂环丁基环)。

以下(I)化合物的取代基可特别具有以下含义：

n具有根据上述B)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)和C)至I)中定义的含义中的任一种。

R¹具有根据上述C)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)和B)和D)至I)中定义的含义中的任一种。

R²具有根据上述D)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至C)和E)至H)或I) 中定义的含义中的任一种。

R³具有根据上述E)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至C)和F)至I)中定义的含义中的任一种。

R⁴具有根据上述F)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至E)和G)至I)中定义的含义中的任一种。

A¹具有根据上述G)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至F)和H)或I)中定义的含义中的任一种。

A²具有根据上述H)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至G)和I)中定义的含义中的任一种。

R²和A¹具有如I)中定义的含义中的任一种，并且其余取代基可具有如A)至C)、E)、F)和H)中定义的含义中的任一种。

在本发明的优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1、2或3；

A¹是亚甲基或乙烷-1，2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

R²是氢或C₁-C₄烷基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元环；

R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-烷基(其可被1个、2个或3个卤素原子取代)、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基、乙基、异丙基，和

-三氟甲基。

在本发明的另一个优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1或2；

A¹是亚甲基或乙烷-1，2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

R²是氢或甲基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基可以独立地选自 -F和Cl、

-氰基、

-三氟甲基、

-甲氧基，和

-羧基；

R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基，和

-三氟甲基。

在本发明的另一个优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1；

A¹是亚甲基或乙烷-1，2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

R²是氢；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示氢，由此形成未取代的末端苯并咪唑基环；

R⁴选自

-氢、

-Cl，和

-甲基。

在本发明的另一个优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1；

A¹是亚甲基或乙烷-1，2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

R²是氢；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示氢，由此形成未取代的末端苯并咪唑基环；并且

R⁴是氢。

在另一方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中根据式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物选自如上所示的式(I)化合物，其中

n＝1；

R³＝氢；

R⁴＝氢；

A¹＝亚甲基或乙烷-1，2-二基；

A²＝亚甲基、乙烷-1，2-二基或丙烷-1，3-二基；

或A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元环，

从而形成根据式(II)或(III)化合物：

其中在式(II)和/或(III)中

l是0或1；

m是1、2或3的整数，和

X¹、X²、R¹和R²具有本文任意处对式(I)化合物所定义的含义。

优选地，在式(II)和(III)中，X¹和X²具有如A)中所定义的含义。

在式(II)中，R¹和R²优选地是氢。

在式(III)中，R¹优选地是氢，并且m优选地是2。

在本发明的另一个优选实施方案中，通式(II)化合物被定义为

X¹和X²选自N和O并且是不同的；

R¹＝氢；

R²＝氢；

1＝1；和

m＝2。

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中根据式(I)化合物以其药学上可接受的盐或溶剂合物、水合物和多晶型物的形式使用。

关于本文任意处所定义的式(I)、(II)和(III)化合物的合适的药学上可接受的盐参考国际申请WO2017/068089、WO2017/068090，并且特别是WO2018/192973。其中公开的药学上可接受的盐的定义在本文引入作为参考。

如本文所定义的用作膜铁转运蛋白抑制剂并且适合治疗严重形式的β-地中海贫血的其他化合物是WO2020/123850A1中描述的那些，其以引用方式整体并入本文。 WO2020/123850A1中所述的适用于治疗本文所定义的严重形式的β-地中海贫血的那些具体化合物可选自：

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物或根据WO2020/123850A1的化合物的药学上可接受的盐选自与酸形成的盐，这些酸选自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸。优选地，选择柠檬酸、盐酸、马来酸、磷酸和硫酸的酸。

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物的药学上可接受的盐选自单盐(1∶1盐)、三盐(1∶3盐)和特征在于化合物(I)、(II)或(III)与酸的比率为1-2∶1-3的盐；包括其溶剂合物、水合物和多晶型物。

其中，化合物(I)、(II)或(III)的盐的特征在于选择的碱∶酸的比率，即化合物(I)、(II) 或(III)：如上所定义的酸在1.0至2.0(摩尔碱)∶1.0至3.0(摩尔酸)范围。在一个具体的实施方案中，所选择的碱∶酸是1.0至2.0(摩尔碱)∶1.0至2.0(摩尔酸)。

具体的实例包括以下碱：酸的比率，即化合物(I)、(II)或(III)：如上所定义的酸：

1.0(摩尔碱)∶1.0(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶1.25(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶1.35(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶1.5(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶1.75(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶2.0(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)∶3.0(摩尔酸)；以及

2.0(摩尔碱)∶1.0(摩尔酸)。

其中，具有碱：酸为1∶1的比率的盐也称为“单盐”或“1∶1盐”。例如，单HCl盐也称为1HCl或1HCl盐。

其中，具有碱∶酸为1∶2的比率的盐也称为“二盐”或“1∶2盐”。例如，二HCl盐也称为2HCl或2HCl盐。

其中，具有碱∶酸为1∶3的比率的盐也称为“三盐”、“三合盐”或“1∶3盐”。例如，三HCl盐也称为3HCl或3HCl盐。

具有碱∶酸为1∶1.25的比率的盐也称为“1∶1.25盐”。

具有碱∶酸为1∶1.35的比率的盐也称为“1∶1.35盐”。

具有碱∶酸为1∶1.5的比率的盐也称为“1∶1.5盐”。

具有碱∶酸为1∶1.75的比率的盐也称为“1∶1.75盐”。

具有碱∶酸为2∶1的比率的盐也称为“半盐”或“2∶1盐”。

根据本发明的式(I)、(II)或(III)化合物的盐可以无定形、多晶型、结晶和/或半结晶(部分结晶)形式以及以该盐的溶剂合物形式存在。优选地，根据本发明的式(I)、(II)或(III)化合物的盐以结晶和/或半结晶(部分结晶)形式和/或其溶剂合物形式存在。

优选的盐或盐溶剂合物的结晶度可通过使用常规分析方法如尤其是通过使用各种X-射线方法来测定，这使得对盐化合物进行清楚和简单地分析。特别是，结晶度的等级可通过使用粉末X射线衍射(反射)方法或通过使用粉末X射线衍射(透射)方法 (PXRD)来测定或确认。对于具有相同化学组成的结晶固体，不同的所得晶体点阵由术语“多晶型现象”概括。关于具有特定结晶度的溶剂合物、水合物和多晶型物和盐参考国际申请WO2018/192973，其以引用方式包括在本文中。

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式 (I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式 (I)、(II)或(III)化合物选自：

在另外优选的方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的甚至更优选的方面，式(I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的另外优选的方面，式(I)、(II)或(III)化合物选自以下盐：具有下式的1：1硫酸盐

具有下式的1∶1磷酸盐

2∶1磷酸盐(半磷酸盐)

具有下式的1∶3HCl盐

以及它们的多晶型物。

如WO2017/068089、WO2017/068090和WO2018/192973中所述，式(I)化合物用作膜铁转运蛋白抑制剂。因此，关于化合物的膜铁转运蛋白抑制剂活性参考所述国际申请。

含有膜铁转运蛋白抑制剂化合物的药物

本发明的另一方面涉及含有一种或多种如本文任意处所定义的式(I)、(II)或(III)化合物的药物或药物组合物，用于如本文任意处所定义的严重形式的β-地中海贫血的新用途和治疗方法。

此类药物可另外包含一种或多种药物载体和/或一种或多种助剂和/或一种或多种溶剂。

优选地，该药物是口服剂型的形式，例如如上所定义。

优选地，药物载体和/或助剂和/或溶剂选自用于制备口服剂型的合适化合物。

所述药物组合物包含例如高达99重量％或高达90重量％或高达80重量％或高达70 重量％的本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物，其余的均由药理学可接受的载体和/或助剂和/或溶剂和/或任选的其他药学活性化合物形成。

其中，药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂是常见的药物载体、辅助物质或溶剂，包括各种有机或无机载体和/或辅助材料，因为它们通常用于药物目的，特别是用于固体药物制剂。实例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；食用香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。

液体药物制剂，例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。此外，此类液体制剂还可包含pH调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、染料和/或调味剂，例如如上所定义的。组合物可以是等渗的，即，它们可具有与血液相同的渗透压。组合物的等渗性可通过使用氯化钠和其他药学上可接受的试剂来调节，这些试剂例如葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇和其他无机或有机可溶性物质。液体组合物的粘度可通过药学上可接受的增稠剂例如甲基纤维素来调节。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。

可使用药学上可接受的防腐剂以增加液体组合物的储存寿命。苯甲醇可以是合适的，尽管也可以使用多种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇和苯扎氯铵。

联合疗法

本发明的另一个目的涉及包含本文任意处所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物中的一种或多种以及至少一种另外的药学活性化合物(“联合疗法化合物”)的药物或联合制剂，优选的另外的活性化合物，用于治疗本文所定义的严重β-地中海贫血，特别是用于治疗TDT。优选的联合疗法化合物是特别是用于预防和治疗铁过载和相关症状的化合物。最优选的联合疗法化合物是铁螯合化合物，或用于预防和治疗伴随或由铁过载和β-地中海贫血引起的任何状态、障碍或疾病的化合物。合适的联合疗法化合物可选自用于预防和治疗地中海贫血、血色素沉着症、镰状细胞病、神经退行性疾病 (如阿尔茨海默病或帕金森病)和相关症状的药学活性化合物。优选地，该至少一种另外的药学活性联合疗法化合物选自用于降低铁过载的药物(例如Tmprs6-ASO)和铁螯合剂，特别是姜黄素、SSP-004184、地夫立群、地拉罗司、去铁胺和去铁酮以及羟基尿素或用JAK2抑制剂。最优选的来自铁螯合化合物的联合疗法化合物是地拉罗司。

另外优选的联合疗法化合物可选自用于治疗β-地中海贫血的药物，如Luspatercept、LentiGlobin BB305(由Bluebird Bio公司开发的基因疗法)、合成人铁调素(LJPC-401)、铁调素肽模拟物PTG-300和靶向Tmprss6的反义寡核苷酸(IONIS- TMPRSS6-LRX)。

在另一方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和医学治疗，其中将如本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与如上所定义的联合治疗化合物中的一种或多种以固定剂量或自由剂量联合的联合疗法施用给有此需要的患者，以供顺序使用。此类联合疗法包括共同施用本发明所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与该至少一种另外的药学活性化合物(药物/联合疗法化合物)。

固定剂量联合疗法中的联合疗法包括将本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与该至少一种另外的药学活性化合物以固定剂量制剂共同施用。

自由剂量联合疗法中的联合疗法包括通过同时施用单个化合物或通过在一段时间段内顺序使用分布的单个化合物来以相应化合物的自由剂量共同施用如本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物和该至少一种另外的药学活性化合物。

在特别优选的实施方案中，联合疗法包括同时施用根据下文所述的实施例化合物编号127的口服膜铁转运蛋白抑制剂以及铁螯合剂地拉罗司。

本发明的另一实施方案涉及如上所述的联合疗法，其中膜铁转运蛋白抑制剂化合物选自WO2020/123850 A1中所述的那些化合物中的一种，特别是如上所述的其具体实例化合物中的一种。优选地，此类联合治疗包括同时施用膜铁转运蛋白抑制剂化合物和铁螯合剂地拉罗司。

附图说明

图1：Hbb^th3/+和WT小鼠的RBC中膜结合珠蛋白的TAU凝胶电泳分析。来自WT RBC的可溶性α和β血红蛋白作为参比显示(左)。通过光密度测定法对α- 珠蛋白带的信号强度进行定量(右)。指示治疗组之间的显著差异： ***p＜0.001(单因素方差分析与Bonferroni多重比较试验)。

图2：在以60mg/kg每天两次口服给药8(A)天或15(B)天后，Fpn127降低了 Hbb^th3/+小鼠成熟RBC中的ROS水平。

图3：Hbbth3/+和WT小鼠肝中的肝重(左)、所有动物中的总Fe浓度(中)以及分离的雄性(m)和雌性(f)的总Fe浓度(右)。显示了平均值±SD 的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：***p＜0.001 (单因素方差分析、Dunnett多重比较试验)。

图4：Hbbth3/+和WT小鼠脾中的相对脾重(左)、所有动物中的总Fe浓度 (中)以及分离的雄性(m)和雌性(f)的总Fe浓度(右)。显示了平均值的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：***p＜ 0.001(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。

图5：Hbb^th3/+和WT小鼠肾中的肾重(左)、所有动物中的总Fe浓度(中)以及分离的雄性和雌性的总Fe浓度(右)。显示了平均值的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜ 0.001(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。指示与 th3/+DFX+VIT-2763组相比的显著差异：#p＜0.05(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。

图6：在治疗组中Hb水平的发展。从第1天到研究结束，所有动物(左上)、雄性(M；左下)和雌性(F；右下)Hbb^th3/+小鼠的Hb。数据表示为平均值±SD。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：**p＜0.01，***p ＜0.001(双因素方差分析、Dunnett多重比较试验)。

图7：在第23天从雄性和雌性Hbb^th3/+和WT小鼠中选择血液学参数。各个值用平均值显示。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：**p＜0.01， ***p＜0.001(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。

图8：在第23天雄性和雌性Hbb^th3/+和WT小鼠血液中的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的计数。各个值用平均值显示。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001(单因素方差分析与 Dunnett多重比较试验)。

图9：在红细胞分化的不同阶段的脾细胞的流式细胞术分析。通过用抗Ter119和CD44的抗体染色来鉴定红细胞样细胞。红细胞样细胞的不同发育阶段显示为亲代Ter119+脾细胞的百分比。显示了平均值±SD的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：**p＜0.01，***p＜0.001(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。

图10：在第23天最后一次给予DFX1小时后，测定来自雄性和雌性Hbb^th3/+和WT 小鼠的血清样本中的血清铁、TSAT和EPO。显示了平均值的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p ＜0.001(单因素方差分析、Dunnett多重比较试验)。

图11：在第23天最后一次给予DFX1小时后，对所有治疗组的血浆中DFX和Fpn127的浓度进行取样。各个值用平均值显示。

图12：Hbb^th3/+和WT小鼠全血中细胞内ROS、PS暴露(膜联蛋白V结合)和线粒体的保留的流式细胞术分析。ROS阳性(左)、膜联蛋白V阳性(中)和 MitoTracker阳性(右)成熟RBC的百分比显示为平均值±SD的各个值。指示与溶媒治疗的Hbbth3/+组相比的显著差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p ＜0.001(单因素方差分析与Dunnett多重比较试验)。

图13：Fpn127对Hbbth3/+小鼠输血(BT)3h后血浆中NTBI浓度的影响。显示了各个值和平均值±SD，通过使用单向方差分析与Dunnett多重比较检验将所有治疗组与溶媒治疗的BT组进行比较来进行统计分析，*p＜0.05，n＝4 只小鼠/组。

在附图中，“VIT-2763”表示测试化合物Fpn127(实施例化合物编号127)。

实施例

通过以下实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅是解释性的，并且本领域技术人员可将具体实施例扩展至根据本发明的另外的膜铁转运蛋白抑制剂化合物。

I.膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物

关于本文所述的具体膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物编号1、2、4、40、94、 118、126、127、193、206、208和233的制备以及它们的药学上可接受的盐的制备参考国际申请WO2017/068089、WO2017/068090和WO2018/192973。

关于WO2020/123850A1中所述的具体膜铁转运蛋白抑制剂化合物的制备参考所述国际申请WO2020/123850A1中所述的制备方法。

II.药理学测定法

II.1膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物编号127在基于ROS生物标志物的TDT小鼠模型结合输血的中间型β-地中海贫血小鼠模型中的疗效

口服生物可利用的膜铁转运蛋白抑制剂，如根据实施例化合物编号127(Fpn127)的临床阶段化合物，已显示在β-地中海贫血的Hbb^th3/+小鼠模型中改善无效红细胞生成、缓解贫血并防止肝铁负荷。膜铁转运蛋白抑制剂，如临床阶段的实施例化合物编号127进一步限制了铁在红细胞前体中形成有毒α珠蛋白聚集体和活性氧物类(ROS) 的可用性，从而改善无效红细胞生成。因此，更多具有延长寿命的RBC缓解贫血并改善组织氧合。

基于此，本发明的发明人已发现，所述膜铁转运蛋白抑制剂在治疗严重形式的β-地中海贫血，特别是输血依赖型地中海贫血(TDT)中特别有效。TDT患者由于定期输血(BT)而具有严重的铁过载。BT引起铁调素的瞬时上调，当血红蛋白(Hb)水平降低时，铁调素回到基线值(Pasricha SR等人，“Transfusion suppresses erythropoiesis and increaseshepcidin in adult patients with beta-thalassemia major：alongitudinal study”，Blood，2013年，第122卷第1期，第124-133页)。在输血之间的间隔期间通过膜铁转运蛋白抑制剂防止肠对铁的吸收有助于进一步降低TDT患者的铁负荷。更重要的是，BT产生的非转铁蛋白结合铁(NTBI)通过巨噬细胞回收受损RBC而释放，并触发氧化应激和血管损伤(BaekJH等人，“Iron accelerates hemoglobin oxidation increasing mortality invascular diseased guinea pigs following transfusion of stored blood.”，JCIInsights，2017年，第2卷第9期)。而且，进行定期BT和螯合疗法的地中海贫血患者的NTBI水平升高，这与心脏病的存在相关(Piga A等人，“High nontransferrin bound iron levelsand heart disease in thalassemia major”，Am J Hematol.， 2009年，第84卷第1期，第29-33页)。

现已发现，根据本发明的口服膜铁转运蛋白抑制剂，如膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物编号127具有通过将铁螯合在巨噬细胞中并因此中断β-地中海贫血的恶性循环来防止这些有害作用的潜力。由于用膜铁转运蛋白抑制疗法在TDT患者中对血红蛋白水平、NTBI水平和LPI水平将实现有益效果，本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物具有实现降低输血RBC单位的潜力，并因此降低TDT患者的输血负担。

作为护理标准，TDT患者必然包括定期BT。使用本实施例的输血小鼠模型，可在新开发的联合输血的β-地中海贫血小鼠模型中使用生物标志物来确定本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物在治疗TDT中的有益效果。

可使用作为膜铁转运蛋白抑制剂化合物的实施例化合物编号127(Fpn127)来测试膜铁转运蛋白抑制剂的疗效。这种膜铁转运蛋白抑制剂化合物可在改良的Hbb^th3/+中间型β-地中海贫血小鼠模型中口服施用，该模型与使用生物标志物的新输血方案联合用于评价药物疗效，从而提供输血β-地中海贫血小鼠模型。其中，8周龄至12周龄的雌性和雄性Hbb^th3/+小鼠(n＝每种性别5只)分布在以下研究组中(表1)：

表1.研究组、小鼠品系和治疗方案。

Hbb^th3/+-地中海贫血小鼠；C57BL/6-野生型小鼠；BT-输血

在研究开始前，使小鼠适应铁含量＜10mg/kg的铁饮食3天。在第1天，小鼠接受在存在0.5mM⁵⁸Fe(II)SO₄、10mM抗坏血酸和1％葡萄糖时配制到饮用水中的溶媒或 Fpn127(1mg/ml)。向饮用水中补充稳定同位素⁵⁸Fe允许在研究之前或期间区分所吸收的膳食铁。溶媒组的饮用水中补充有0.5mM ⁵⁸Fe(II)SO₄、10mM抗坏血酸和1％葡萄糖。在研究期间(6周)，小鼠可随意获取食物和饮用水。另外，组3和组4的小鼠正在接受来自绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL/6供体小鼠(C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J，美国杰克逊实验室(JacksonLaboratories)，品种号004353)的RBC输血 (300μl血液)，如先前公布的(Casu C等人，“Short-term administration of JAK2 inhibitors reduces splenomegaly in mousemodels ofβ-thalassemia intermedia and major”， Haematologica，2017年)。根据Hb的水平和供体的GFP-RBC计数，组3和组4的小鼠在第14天和28天接受BT。

使用以下标准来确定另外的BT的必要性：

·如果在第14天，组3(Hbb^th3/+/溶媒/BT)的平均Hb水平接近组1(Hbb^th3/+/溶媒)的值，通过比较组1和组3的平均值，没有检测到统计学差异(t检验)，则在第 14天进行第二次BT。相同的程序适用于可能发生在第28天的第三次BT。

·如果组3中的平均Hb水平与组1中的值有统计学差异(更高)，则在第14天将不执行BT。在此类情况下，组1和组3的Hb将在第21天进行测量，并且在组1和组3 的Hb值没有统计学显著差异的情况下可进行第二次BT。

在第1天(第一次BT后)，然后每周在BT前和研究结束时，根据常规方法通过流式细胞术评价供体GFP-RBC计数。

根据常规方法在BT前每两周间隔评估一次血清铁调素，作为在BT和Hbb^th3/+小鼠铁负荷减少之间的间隔期间通过膜铁转运蛋白抑制剂防止肠对铁的吸收的指标。

在研究结束时(第42天)，使用下述方法分析小鼠的一系列血液学参数，包括血清铁、NTBI、LPI、促红细胞生成素、TSAT、Hb、全血计数、脾和肝重、脾和骨髓中的红细胞生成、脾和肝铁含量以及RBC膜中的α-珠蛋白聚集体。

作为评价膜铁转运蛋白抑制剂(例如Fpn127)疗效的特定生物标志物，在存在或不存在BT时，使用RBC中α珠蛋白聚集体的定量。沉淀的α-珠蛋白聚集体包含血红素和铁，它们产生活性氧物类(ROS)，从而导致RBC寿命缩短、贫血和组织缺氧。

II.2降低Hbb^th3/+小鼠RBC中α-珠蛋白聚集体的形成

红细胞膜相关α-珠蛋白的检测和定量：

汇集每组小鼠的新鲜EDTA-血样(来自2只小鼠/池的血液)，裂解，并提取膜脂，如前所述(Sorensen S、Rubin E、Polster H、Mohandas N、Schrier S，“The role ofmembrane skeletal-associated alpha-globin in the pathophysiology of beta-thalassemia”，Blood，1990年3月15日，第75卷第6期，第1333-1336页)。通过在氚乙酸尿素(TAU) 凝胶上电泳分离不溶性膜部分，并通过考马斯染色观察(Alter B等人，Br JHaematol，第44卷，第527页，1980年)。使用具有Multi Gauge v.3软件(GE HealthcareLife Sciences)的LAS-4000图像分析仪通过光密度测定法量化α-珠蛋白带的信号强度。

通过TAU凝胶电泳对α珠蛋白聚集体的分析显示，与溶媒治疗的Hbb^th3/+动物相比，用Fpn127治疗的Hbb^th3/+动物的RBC膜骨架制剂中毒性α珠蛋白/血红素聚集体的水平以剂量依赖性显著降低(图1)。

II.3降低Hbb^th3/+小鼠中ROS⁺RBC的比例

膜铁转运蛋白抑制剂例如Fpn127对供体GFP-RBC中ROS水平的影响可通过可商购的发射远红外的ROS-敏感性传感器来监测。

在不存在BT时，截至口服给予化合物的第8天，Fpn127降低了Hbb^th3/+小鼠的RBC 中的ROS水平(图2A)。在治疗15天后ROS水平进一步降低(图2B)。这些数据表明，本发明的膜铁转运蛋白抑制剂，如Fpn127，对Hbb^th3/+小鼠的红细胞生成具有相对快速的影响，并因此RBC中的ROs水平可用作合适的生物标志物，以评价膜铁转运蛋白抑制剂在与本文所述的BT联合的新型Hbb^th3/+小鼠模型中的疗效。

II.4Fpn127对Hbb^th3/+小鼠中NTBI和LPI水平的影响

如上所述，由于膜铁转运蛋白介导的铁从巨噬细胞回收受损RBC的输出，TDT中的BT导致血浆NTBI水平升高(Piga A.等人，Am J Hematol.，2009年)。本发明的膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127与BT联合给药具有降低血浆NTBI(和LPI)水平和相关副作用的潜力。

Fpn127防止Hbb^th3/+小鼠中由BT产生的非转铁蛋白结合铁(NTBI)的释放。

为了确定输血(BT)后Hbbth3/+小鼠(B6.129P2-Hbb-b1tm1Unc Hbb- b2tm1Unc/J，#002683)中NTBI产生的动力学，进行了试验性实验。将Hbbth3/+的野生型(WT)同窝仔用作输血供体。通过眼眶后途径从终末麻醉的WT小鼠中收集3只至5 只雌性小鼠的外周血，并将七份血液与一份14％柠檬酸-磷酸-葡萄糖腺嘌呤混合并储存在4℃直至输血(24小时或15天)。输血前将供体血液预热至37℃。12周龄的Hbbth3/+ 小鼠接受120mg/kg体重的Fpn127或溶媒(ddH₂O中0.5％甲基纤维素)的单次口服给药。给药后三十分钟，通过尾静脉注射给小鼠进行0.2ml WT血的输血。一组经溶媒治疗的未接受BT的Hbbth3/+小鼠用作非输血对照。在BT后3h从终末麻醉的小鼠收集血液。

NTBI是通过基于Fe-次氮基三乙酸酯(NTA)的测定法在鼠血浆样本中测量的，该测定法改编自Gosriwatana I等人1999年发表的方案(Quantification of non-transferrin—bound iron in the presence of unsaturated transterrin，Gosriwatana I、Loreal O、Lu S、 Brissot P、Porter J、Hider RC，Quantification ofnon-transferrin-bound iron in the presence of unsaturated transferrin，AnalBiochem.，1999年9月10日，第273卷第2期，第212-220 页)。首先，制备800mM次氮基三乙酸(NTA)三钠(Sigma，72565)的溶液和 800mM NTA二钠(Sigma，N0128)的溶液，然后将它们混合在一起，得到pH 7.0的溶液。其次，将90μL血浆样本(在肝素中制备)与10μL 800mM NTA溶液在室温下温育 30分钟。在温育期间，NTA螯合未结合蛋白质的铁(NTBI)，形成Fe-NTA复合物，而不干扰转铁蛋白结合的铁。同时，用0.5ml 10mM NTA(800mM NTA溶液的1∶80稀释液)预冲洗离心过滤器(Amicon Ultracel 10kda，Merck UFC501096)，并在10’000g下离心10分钟，随后两步用去离子水冲洗，并且每步在10’000g下离心10分钟。在温育后，将样本转移到过滤器中，并且在4℃时10’000g下离心1h。进行基于比色测定的Fe- NTA测量，制备60mM红菲绕啉二磺酸(BDA，Sigma，146617)和120mM巯基乙酸 (TGA，Sigma，T6750-100m1)，然后以1∶1的比例混合在一起。通过在去离子水中连续稀释Fe-NTA 10mM储备溶液(50μM至10μM至5μM至2.5μM至1.25μM至0.625μM至 0μM)获得标准曲线。预先通过将2mmol(0.550g)NTA三钠(Sigma，72565)和 1mmol(0.270g)六水合氯化铁(III)(Sigma，31234)在100ml 1mM HCl中混合来制备 Fe-NTA储备溶液。在96孔板中将60μL超滤样本或60μL铁标准品与30μL BDA-TGA溶液混合。在室温下温育30分钟后，在酶标仪(Biotec)中在537nm处测量样本。

与仅给予溶媒的未输血的对照动物相比，输血的Hbb^th3/+小鼠在输血后3h血浆中显示更高的NTBI水平(图13)。有趣的是，Fpn127的施用防止了输血后循环中NTBI的增加，这表明膜铁转运蛋白的抑制可能保护Hbb^th3/+小鼠免受输血诱导的铁过载。

在另外的试验设置中，在用溶媒或本发明的膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127治疗6周的Hbb^th3/+小鼠中研究了在不存在BT时Hbb^th3/+小鼠的NTBI水平。使用先前描述的次氮基三乙酸酯-NTBI方法(NTA-NTBI)(Singh S、Hider RC、Porter JB，“A direct method forquantification of non-transferrin-bound iron”，Anal Biochem.，1990年5月1 日，第186卷第2期，第320-323页)并稍作修改。

简言之，将0.02mL 800mM NTA(pH5.7)加入到0.18mL小鼠血清池中，并允许在 22℃下静置30分钟。使用Whatman Vectaspin超速离心装置(30kDa)在12320g下对溶液进行超滤，并将超滤液(0.02mL)直接注射到用5％乙腈和3mM去铁酮(DFP)的 5mM MOPS(pH 7.8)溶液平衡的高效液相色谱柱(ChromSpher-ODS，5μM， 100×3mM，装有适当保护柱的玻璃柱)上。然后NTA-铁复合物交换形成DFP-铁复合物，由Waters996光电二极管阵列在460nm处检测到。使用在80mM NTA中制备的标准铁浓度进样来生成标准曲线。用2μM铁处理用于处理样本和制备标准品的800mM NTA 溶液，以将污染试剂的背景铁归一化。这意味着零标准给出正信号，因为它包含作为 NTA-复合物添加的背景铁。当血清中存在不饱和转铁蛋白时，这种另外的背景铁可被提供给空转铁蛋白位点，从而导致背景信号的损失并产生负的NTBI值。

NTBI也使用替代的方法(CP851珠-NTBI)测定，如Garbowski MW、Ma Y、Fucharoen、Srichairatanakool S、Hider R、Porter JB，“Clinical and methodologicalfactors affecting non-transferrin-bound iron values using a novel fluorescentbead assay”， Transl Res.，2016年中所述的测定法。该测定法的标准如下制备：用MilliQ水将由 100mM NTA和18mM原子吸收标准铁溶液制备的1mM铁-NTA复合物(1∶2.5摩尔比)稀释至介于0μM至100μM之间的最终浓度。对于标准曲线，将120μL探针标记的珠悬浮液与20μL已知浓度的缓冲NTA-铁溶液在室温下温育20分钟，随后加入20μL来自野生型小鼠的对照血清(不含游离铁)和40μL最终浓度为2％的低聚甲醛(MOPS中10％)。在通过流式细胞术进行荧光测量之前，将密封的96孔板中的悬浮液在37℃下振荡温育16 小时。对于未知铁浓度的血清样本，将140μL量的珠与20μL血清样本温育20分钟，随后加入最终浓度为2％的40μL低聚甲醛。将可螯合荧光珠与作为对照的野生型小鼠血清混合，以建立100％的荧光，并相应计算可螯合荧光珠与Hbb^th3/+小鼠血清的相对荧光。在 Beckman Coulter FC500流式细胞仪上进行测量，并在FlowJo软件上进行分析。门控基于未处理的珠群体的点图。记录10,000个事件的中值荧光，并针对珠自身荧光进行校正。用可变斜率S形剂量应答函数拟合标准曲线。

包含与转铁蛋白不紧密相关的所有形式的血清铁的NTBI在化学和功能上是异质的。LPI代表NTBI的组分，其具有氧化还原活性和可螯合性两者，能够渗透到器官中并诱导组织铁过载。LPI(Esposito BP1、BreuerW、Sirankapracha P、Pootrakul P、 Hershko C、Cabantchik ZI，“Labile plasma iron in iron overload：redox activity andsusceptibility to chelation”，Blood，2003年)测定法测量给定样本产生ROS的铁比容量，并且被认为是参与病理性铁过载的最相关的活性铁物类之一。

FeROS^TM LPI试剂盒(Aferrix有限公司)用于测定在存在或不存在BT时用本发明的溶媒或膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127治疗6周的Hbb^th3/+小鼠的血清中的LPI。

已经发现接受BT的Hbb^th3/+小鼠中的NTBI和LPI水平可作为翻译标志物，以评价口服膜铁转运蛋白抑制剂疗法的效率。

该模型也可用于优化设计TDT患者的膜铁转运蛋白抑制剂(例如Fpn127)的给药方案。于是，可使用输血(BT)和口服膜铁转运蛋白抑制剂施用的联合来建立用于 TDT的最佳联合疗法。

利用上述模型和实施例，可证明口服施用的膜铁转运蛋白抑制剂在改善输血负担和改善输血依赖型β-地中海贫血的有害副作用中的能力。

III.RBC中α珠蛋白聚集体的测定

在存在1mM EDTA时用冰冷DPBS洗涤血样三次，并在冰冷低渗裂解缓冲液(5mM 磷酸钠，pH 7.6，含有完全超蛋白酶抑制剂，Roche)中裂解。收集可溶性Hb作为凝胶上的标准。通过重悬于低渗裂解缓冲液中并以21’000×g离心将红细胞影另外洗涤三次。在50mM硼酸钠pH 8、1mM EDTA、0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich)和蛋白酶抑制剂中提取膜脂。在30′000×g离心最后30min后，完全去除上清液，并将对应于膜细胞骨架的Triton不溶性沉淀快速冷冻。将TAU聚丙烯酰胺凝胶(12％丙烯酰胺/0.08％双丙烯酰胺(60∶0.4％丙烯酰胺/双丙烯酰胺，Bio-Rad Laboratories))、5％乙酸、6M尿素(两者都来自Sigma-Aldrich)和1％Triton X-100在SE660高标准双冷却垂直电泳装置 (Hoefer)中浇铸和运行。聚合后，凝胶在5％乙酸中在140V下预电泳3.5小时，其中阳极位于顶部，并且然后在200V下再电泳3小时，其中凝胶上覆有清除剂溶液(1M半胱胺(Sigma-Aldrich)，2.5M尿素，5％乙酸)。将膜细胞骨架溶解在100μl TAU样本缓冲液(6M尿素、5％乙酸、5％β-巯基乙醇和0.02％派洛宁Y(两者都来自Sigma- Aldrich))中，并且每孔上样20μl。将样本在200V恒定电流下电泳过夜，并且凝胶用考马斯亮蓝G-250染色。

IV.输血负担

根据本发明的方法治疗的受试者的输血负担可通过确定患者的输血需求来评价，例如通过常规和临床公认的评估通过红细胞输血的所需量和/或频率。

V.铁水平

铁水平，例如肝或心肌铁水平可使用一种或多种常规测定法来测定。例如，铁水平(例如，肝铁浓度或心肌铁浓度)可通过磁共振成像来测定。

VI.血清铁蛋白水平测定

血清铁蛋白水平可使用一种或多种常规测定法来测定。

VII.红细胞应答

可使用以下算法计算实现应答的受试者的红细胞应答的持续时间：

应答的第一天＝显示应答的第一个12周间隔的第一天。

应答的最后一天＝显示应答的最后连续129周间隔的最后一天。

最后评估的日期＝仍然在用药的受试者的最后就诊日期或停止治疗的受试者的停止日期。

红细胞应答的持续时间可如下计算，这取决于反应是否在最后评估日期之前结束：

1.如果受试者的应答没有持续到治疗期结束，则应答的持续时间不被审查并且计算为：

应答持续时间＝应答的最后一天-应答的第一天+1；

2.如果受试者在治疗期结束时继续显示红细胞应答，则应答的结束日期经审查并且应答的持续时间计算为：

应答持续时间＝最后应答评估的日期-应答的第一天+1。

第一红细胞应答的时间可如下计算：

从研究药物第一次给药到应答开始的第一天的天数将使用下式计算：

应答时间＝应答的第一天-第一研究药物的天数+1。

VIII.血红蛋白测定

血红蛋白水平可使用一种或多种常规测定法来测定。

IX.生活质量

可使用简表(36)健康调查(SF-26)和/或癌症疗法的功能评估-贫血(FACT- An)来评价生活质量，例如WO2016/183280中所述。

X.膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653(实施例化合物编号40)在豚鼠中在红细胞输血 后减轻血浆铁、氧化剂应激和肾损伤的疗效

本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物在治疗TDT中的疗效已经另外通过J.H.Baek等人(“Ferroportin inhibition attenuates plasma iron，oxidant stress，and renalinjury following red blood cell transfusion in guinea pigs”，Transfusion，2020年3月，第60卷第3 期，第513-523页)的结果证实。

所述实验是通过静脉内施用对应于本发明的实施例化合物编号40的小分子膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653进行的，并且进一步证实了本发明的发现。

通过给予膜铁转运蛋白抑制剂，显著改善了换血后的NTBI和Hb水平。

而且，通过给予膜铁转运蛋白抑制剂可降低输血后肾中的总铁。评估了循环Hb对肾铁负荷的贡献以及随后对氧化应激和细胞损伤的影响，从而揭示了给予输血豚鼠的膜铁转运蛋白抑制剂显著降低了血浆肌酐＞0.3mg/dL的变化的发生，该变化用作早期急性肾损伤(AKI)的指示。

实验细节和研究条件以及具体研究结果可以从上述论文得出。

XI.在β-地中海贫血小鼠模型中用膜铁转运蛋白抑制剂实施例化合物编号127 (Fpn127)和地拉罗司的联合疗法

XI.1前言

如上所述，通过螯合疗法来控制铁过载已成为β-地中海贫血常规治疗的主要焦点，并且特别是在其严重形式如TDT的治疗中。然而，铁螯合不靶向潜在的疾病机制。通过诱导铁调素合成或补充铁调素模拟物来校正不平衡的铁吸收已显示使β-地中海贫血中失调的铁代谢正常化(Casu C等人，Blood，2018年)。膜铁转运蛋白抑制剂化合物编号127(Fpn抑制剂编号127；Fpn127)对铁可用性的限制已被显示可缓解中间型β-地中海贫血Hbb^th3/+小鼠模型中的贫血和铁稳态失调(Manolova V等人，“Oral ferroportin inhibitorameliorates ineffective erythropoiesis in a model ofβ-thalassemia”， JCI，2019年)。由于许多β-地中海贫血患者都在进行螯合治疗，因此本发明的发明人研究了同时使用常规铁螯合剂地拉罗司(DFX)和Fpn127是否在中间型β-地中海贫血的Hbb^th3/+小鼠模型中引起任何治疗学相互作用及其在本发明的相应联合疗法中的潜力。

XI.2小鼠模型测试系统的选择

杂合Hbb^th3/+小鼠在特征为无效红细胞生成、贫血、脾肿大和器官铁过载的患者中显示与输血非依赖型β-地中海贫血密切相关的表型。使用诱导内源性铁调素或铁调素激动剂的实验药物使用Hbb^th3/+小鼠模型的几项已发表的研究表明，通过抑制Fpn结合铁螯合进行的铁限制是降低铁过载和改善Th3/+小鼠贫血的有效方法(Schmidt PJ等人，Am.J.Hemato1.，2015年；Casu C等人，Haematologica，2015年；以及Casu C等人， Blood，2016年)。因此，Hbb^th3/+小鼠目前代表了测试β-地中海贫血新型疗法的最佳可用动物模型，这可另外作为甚至更严重形式如TDT相应有效性的指标。

XI.3研究设置

本研究的目的是测试单独的铁螯合剂DFX以30mg/kg每天一次(QD)施用或与Fpn127联合以120mg/kg QD施用3周的并存使用是否会在中间型β-地中海贫血小鼠模型(Hbb^th3/+，B6，129P--b1tm1Unc-b2tm1Unc/J，Jackson Laboratories，品种号002683) 中引起任何治疗学相互作用。这些小鼠具有β主要Hb基因和β次要Hb基因两者的定向缺失(YangB等人，PNAS，1995年)。

Hbb^th3/+小鼠用低铁饮食(lid)喂养18h，并在给予DFX后3h开始每天使用接受标准饮食(sd)6h。在研究第23天(给药第17天)最后一次予DFX后1h使动物安乐死。收集血液和器官(脾、肝和肾)以分析化合物对血清参数的影响。

该研究完全符合动物保护法。

将试验化合物Fpn127以3×HCl盐的形式施用，以15.24mg/mL溶解在0.5％甲基纤维素(MC)中，以10mg/kg的体积为动物提供120mg/kg Fpn127游离碱的给药。

DFX由Ontario Chemicals公司(目录号D1063)提供，并以3mg/mL溶解于30％Kolliphor中，以提供30mg/kg的动物剂量。

EL购自Sigma-Aldrich(目录号C5135，批号BCBV8968)，并且30％Kolliphor(w/v)溶液在Milli-Q纯净水中制备。

单独的DFX每日给药30mg/kg耐受良好，持续3周(无WE)，并在降低Hbb^th3/+小鼠的肝铁方面显示出良好的疗效。因此，在该联合研究中，选择30mg/kg作为DFX的最大剂量。选择喂养方案以防止螯合剂与胃肠道中的膳食铁(给药后3小时的lid)接触。引入对sd的有限享用(6h)以便改善模型的动态范围，因为在之前的喂食lid的研究中观察到在整个研究期间的自发性肝去铁。口服施用Fpn127在啮齿类中具有约2小时的相对短的半衰期。大鼠100mg/kg的单口服给药导致血清铁降低至少8h。在慢性设置中，建立每天两次60mg/kg的剂量，并且在几项研究中显示一致的疗效。在该研究中，两种化合物都需要口服给药，因此我们选择每天一次120mg/kg Fpn127的单口服给药，以保持口服施用的次数最少。由于它们的半衰期适中，因此预计不会在测试剂量下累积每种化合物。

表2.治疗组的概述。每组使用雄性(m)和雌性(f)小鼠。

*溶媒是Milli-Q纯净水中30％Kolliphor和Milli-Q纯净水中0.5％甲基纤维素

**DFX和Fpn127间隔3h给药

***WT是从th3/+育种中作为育种同窝仔获得的C57BL/6J小鼠

基因型	治疗	频率	小鼠性别	动物编号
					th3/+	溶媒/溶媒*	QD	6m/6f	1-12
th3/+	DFX 30mg/kg	QD	6m/6f	13-24
					th3/+	DFX 30mg/kg+Fpn127 120mg/kg<sup>**</sup>	QD+QD	7m/6f	25-37
th3/+	Fpn127 120mg/kg	QD	6m/6f	38-49
					WT***	溶媒/溶媒*	QD	5m/5f	50-59

XI.4小鼠治疗

表3.治疗组和应用剂量、浓度和时间表。

*溶媒是Milli-Q纯净水中30％Kolliphor和Milli-Q纯净水中0.5％甲基纤维素

**DFX和Fpn127间隔3h给药

***WT是从th3/+育种中作为育种同窝仔获得的C57BL/6J小鼠

在换到lid后一天，通过尾静脉切开取血样以测定基线Hb水平。使用

装置测量Hb。在给药前第8天、15天和22天早晨也测量Hb。在23天的研究期间，动物以 30％Kolliphor中30mg/kg DFX、0.5％MC中120mg/kg Fpn127或两者同时口服QD给药，总共17次给药。30％Kolliphor和0.5％MC作为溶媒给药。在黑暗周期(活动期)开始时在9：00施用DFX给药，随后享用lid 3h。然后，给予小鼠Fpn127(或0.5％MC)，并在换回lid之前给小鼠享用sd 6h时间。在WE时，暂停给药，并且让小鼠随意享用lid。

在应用前立即通过涡旋混合所有悬浮液/溶液。使用连接到合适注射器的球状针头 (目录号191300，Provet，Lyssach，Switzerland)以10mL/kg进行口服管饲。所有剂量都在几秒钟内以推注的形式应用。

XI.5系列观察

临床观察和死亡率

在工作目的研究期间，实验者每天检查动物和它们的笼。在实验阶段期间，每周对动物最少称重一次，并根据其临床症状评分：BW，一般行为和活动，毛发、眼和鼻的外观。当出现在单独的评分表上时记录临床观察。

体重

在第-1天的实验阶段开始前记录一次BW。在实验阶段期间，每周记录1次至2次个体的BW，以计算给药体积并监测体重减轻。

血红蛋白

在第1天、8天、15天和22天测量Hb。在实验开始日(第1天)和此后每周在第一次每日给药前的早晨实验阶段期间测定个体的Hb值。通过尾静脉切开取血样，并使用

DM201 Hb光度计测量Hb。

安乐死和器官取样

在研究结束时(第23天)，使用异氟醚对动物进行终末前麻醉，并通过眶后出血将血液收集到BD Microtainer管(目录号365967和365975)中。随后通过颈椎脱臼对个体动物实施安乐死。

在最后的研究日(第23天)，收集脾、肝和肾，并在液氮中速冻用于进一步分析，如下所述。记录脾、肝和肾的湿重。

组织铁

在Vifor(国际)公司St.Gallen的分析开发组中，通过ICP-OES测定脾、肝和肾中总Fe的含量。

血液学和红细胞生成

在内部的自动血细胞分析仪(ProCyte

IDEXX Laboratories)上对新鲜EDTA血液进行全血计数。

使用PE偶联的大鼠抗小鼠CD71(转铁蛋白受体-1，eBioscience，目录号12-0711)、APC偶联的大鼠抗小鼠Ter119(红细胞谱系标志物，eBioscience，目录号17- 5921)和APC-Cy7偶联的大鼠抗小鼠CD44(在发育中的红细胞样细胞表面逐渐减少的粘附分子，BioLegend目录号103028)抗体，通过流式细胞术(CANTOII血细胞计数器，BD Biosciences)鉴定雌性小鼠脾脏中红细胞样细胞分化的不同阶段。使用

软件(FlowJo有限责任公司，版本10.1)分析数据。

血清参数

在第23天(研究结束)在给药后1小时，通过眼眶后出血将血液从终末前麻醉小鼠收集到BD Microtainer管(目录号365967和365975)中，用于测定血清铁、转铁蛋白、促红细胞生成素和化合物暴露。随后通过颈椎脱臼对麻醉的动物实施安乐死。

使用MULTIGENT铁测定法一式三份测定血清铁水平(Abbott Diagnostics，目录号6K95)。根据制造商的说明书(Abcam，目录号ab157724)，使用小鼠特异性ELISA 重复测量血清转铁蛋白(Tf)。转铁蛋白饱和度(TSAT)使用下式计算：

根据制造商的说明书(R&D Systems，目录号DY959)，使用小鼠特异性DuoSetELISA测量血清EPO。在GVK Biosciences(Hyderabad，IN)测量Fpn127和DFX的血浆浓度。

细胞内ROS、线粒体和PS暴露的流式细胞术分析

在第22天尾静脉切开外周血中，用指示剂氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(CM-H2DCFDA，Invitrogen)检测ROS，线粒体的存在用MitoTracker Deep Red FM(Invitrogen)来检测，并且PS暴露使用膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(Invitrogen) 在用Ter119和CD71抗体标记的成熟RBC中检测。

对于所有分析，在CANTOII血细胞计数器(BD Biosciences)上分析细胞，并使用

软件(FlowJo有限责任公司，10.2版)分析数据。

XI.6数据管理

体重

记录各个值。在记录的当天计算每组BW的平均值±SD(以克为单位)。BW以图形方式表示。

组织铁

记录器官的个体湿重。在肝、脾和肾中测量总Fe的各个值。计算总Fe含量和浓度的各个值。计算每组肝、脾和肾中总Fe浓度和含量的平均值±SD。器官重量和总Fe浓度以图形方式表示。

血红蛋白

记录各个值。在测量当天，计算每组Hb水平的平均值±SD(以g/L为单位)。Hb水平以图形方式表示。

血液学和红细胞生成

记录血液参数的各个值。计算每组的平均值±SD。选定的血液学参数以图形方式表示。

单独记录雌性小鼠脾中红细胞分化阶段的分数。计算每组中每个分数的平均值±SD，并以图形方式表示。

血清参数

从重复测量计算血清铁的个体平均值。根据重复测量确定Tf和EPO水平。根据Tf和血清铁水平计算TSAT。计算每组血清铁、TSAT和EPO的平均值±SD。血清铁、TSAT 和EPO的数据以图形方式表示。

细胞内ROS、线粒体和PS暴露的流式细胞术分析

单独记录ROS、线粒体和膜联蛋白V染色呈阳性的红细胞样细胞的百分比。计算每组的平均值±SD，并以图形方式表示。

XI.7统计分析

使用双因素方差分析对BW数据和Hb进行统计分析，并对时间过程影响进行重复测量。在观察到显著影响的地方，使用Dunnett多重比较试验进行事后试验。用单因素方差分析与Dunnetts多重比较试验进行所有其他参数的分析，如对应的图例所示。为了分别分析雄性和雌性，进行单因素方差分析与Dunnetts多重比较试验。P值＜0.05被认为是统计学显著的。用Prism软件(GraphPad Prism版本8.1.2，San Diego California USA)进行统计学分析。

XI.8结果

临床观察、评分和死亡率

Fpn127和DFX QD给药通常耐受良好，并且在研究的23天期间没有观察到临床症状。动物7(Hbb^th3/+溶媒)从第14天到第17天失去＞20％的BW，并且由于动物福利原因被处死。最可能的是，该动物在口服管饲期间受伤，并且在食物摄取中变得衰弱。动物7被排除在所有进一步分析之外。

体重

小鼠的平均BW汇总于表4中：

第1天的BW为：24.5g±1.4g(th3/+溶媒雄性)；19.3g±1.6g(th3/+溶媒雌性)；23.7g±1.3g(th3/+DFX雄性)；19.2g±1.3g(th3/+DFX雌性)；24.7g±1.1g (th3/+DFX+Fpn127雄性)；20.0g±0.8g(th3/+DFX+Fpn127雌性)；25.1g±1.0g (th3/+Fpn127雄性)；19.4g±1.0g(th3/+Fpn127雌性)；24.4g±0.8g(WT溶媒雄性)；以及20.5g±1.1g(WT溶媒雌性)。在23天期间，所有组中的BW略有增加或保持恒定(表4)。没有生长在很大程度上可归因于本研究中使用的动物的年龄。总之，与溶媒治疗的Hbb^th3/+小鼠(雄性和雌性)或WT小鼠相比，在研究期间Hbb^th3/+小鼠在每天一次Fpn127治疗后对BW没有影响(最后一次的BW在处死前一天d22取得)。与溶媒治疗的Hbb^th3/+小鼠相比，在研究结束时，单独用DFX或与Fpn127联合治疗雄性导致了轻微但显著较低的BW。

组织铁

在研究结束时评估肝重。与WT小鼠(1053mg±169mg)相比，th3/+小鼠 (1176mg±196mg)的肝重没有差异。当与溶媒治疗的Hbbth3/+小鼠相比时，用DFX、 Fpn127或这两种QD治疗的Hbbth3/+小鼠对肝重没有影响(表5；图3)。

与WT小鼠(88.2μg/g±25.7μg/g)相比，th3/+小鼠(348.2μg/g±75Aμg/g)中总肝铁浓度(μg/g)强烈升高(表5，图3)。与溶媒治疗的th3/+小鼠相比，单独用DFX或与 Fpn127联合治疗显著降低了总肝铁浓度(图3，中图)：348.2μg/g±75.4μg/g(th3/+溶媒)；196.3μg/g±62.5μg/g(th3/+DFX)；以及178.91μg/g±54.4μg/g (th3/+DFX+Fpn127)。单独的DFX和与Fpn127联合的疗效是相当的。如前所示，单独的Fpn127对肝铁浓度没有影响：332.2μg/g±75.2μg/g(th3/+Fpn127)。

在研究结束时(d23)评估脾重并将其归一化为BW。与WT动物(0.28％±0.06％) 相比，Hbbth3/+动物的相对脾重(1.94％±0.36％)(以体重百分比表示)显著较高(图 4，表6)。单独用Fpn127或与DFX联合治疗Hbbth3/+小鼠显著降低了th3/+动物的相对脾重，而DFX单独没有显示影响(图4，表6)：1.94％±0.36％(th3/+溶媒)； 1.98％±0.26％(th3/+DFX)；0.92％±0.13％(th3/+DFX+Fpn127)；以及0.99％±0.18％ (th3/+Fpn127)。

与WT小鼠(596.9μg/g±164.4μg/g)相比，Hbbth3/+小鼠(1664.0μg/g±185.6μg/g) 中总脾铁浓度(μg/g)强烈升高(表6，图4)。与溶媒治疗的th3/+小鼠相比，未观察到DFX单独对总脾铁浓度的治疗影响，而用Fpn127单独或与DFX联合治疗显著增加了 th3/+小鼠的脾铁浓度(表6，图4)：1664.0μg/g±185.6μg/g(th3/+溶媒)； 1553.0μg/g±144.7μg/g(th3/+DFX)；3051.0μg/g±258.4μg/g(th3/+DFX+Fpn127)； 2738.0μg/g±300.8μg/g(th3/+Fpn127)；596.9μg/g±164.4μg/g(WT溶媒)。未观察到脾铁浓度的性别差异(图4，下图)。用Fpn127治疗的th3/+小鼠中脾铁浓度的增加与脾重的降低和脾巨噬细胞中膜铁转运蛋白抑制导致的铁保留有关。

在研究结束时评估肾重。与WT小鼠(286g±34g)相比，Hbbth3/+小鼠 (297g±55g)的肾重没有差异(图5)。当与溶媒治疗的Hbbth3/+小鼠相比时，用 DFX、Fpn127或这两种化合物治疗的Hbbth3/+小鼠对肾重没有影响(表7；图5，上图)。

与WT小鼠(75.3μg/g±6.5μg/g)相比，Hbbth3/+小鼠(155.5μg/g±42.9μg/g)中总肾铁浓度(μg/g)显著升高(表7)。与溶媒治疗的Hbbth3/+小鼠相比，所有治疗显著降低了总肾铁浓度(图5，中图)：155.5μg/g±42.9μg/g(th3/+溶媒)；125.1μg/g±22.2μg/g(th3/+DFX)；96.6μg/g±12.8μg/g(th3/+DFX+Fpn127)； 126.7μg/g±23.6μg/g(th3/+Fpn127)；以及75.3μg/g±6.5μg/g(WT溶媒)。令人惊讶的是，与单独的DFX或Fpn127相比，DFX与Fpn127的联合导致肝铁浓度的更大降低(分别为p＝0.02和p＝0.01)。这种相加作用可能是由于DFX去除了铁和Fpn127防止了肾脏中进一步的铁过载。未观察到肾铁浓度的性别差异(图5，下图)。

血红蛋白

在第1天给药前，然后每周(第8天、15天、22天)测量全血中Hb浓度。在一天的第一次给药之前采集血样。与给药前(第1天)的WT动物相比，Hbbth3/+动物显示显著降低的Hb水平(图6，表8)：83g/L±3g/L(th3/+溶媒雄性)；90g/L±3g/L(th3/+溶媒雌性)；82g/L±3g/L(th3/+DFX雄性)；86g/L±2g/L(th3/+DFX雌性)；86g/L±6g/L (th3/+DFX+Fpn127雄性)；87g/L±3g/L(th3/+DFX+Fpn127雌性)；85g/L±6g/L (th3/+Fpn127雄性)；85g/L±4g/L(th3/+Fpn127雌性)；153g/L±3g/L(WT溶媒雄性)；以及154g/L±5g/L(WT溶媒雌性)。在研究持续时间期间，在单独用Fpn127或与DFX联合治疗的Hbbth3/+动物中，Hb水平随时间而增加(图6)。单独的DFX仅在第 8天导致Hb水平的瞬时增加。未观察到显著的性别差异。

血液学和红细胞生成

在研究的最后一天(第23天)采集的全血样本中测定血液学参数。在所有测试的血液学参数上Hbbth3/+小鼠与WT小鼠显著不同(表9)。单独的DFX不能改善RBC指数，如RBC计数、血细胞比容、RDW和网织红细胞计数。在单独用Fpn127或与DFX联合治疗的Hbbth3/+小鼠中所有这些参数均显著改善，从而反映了红细胞生成效率改善 (表9，图7)。

单独用Fpn127或与DFX联合治疗的Hbb^th3/+小鼠的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数降低至与WT类似的水平。然而，单独的DFX没有显著改变Hbb^th3/+小鼠的总白细胞和淋巴细胞计数(表9，图8)。有趣的是，单独用DFX治疗Hbb^th3/+小鼠导致中性粒细胞计数显著增加，从而表明潜在的炎症应答。单核细胞数不受任何治疗的影响(数据未显示)。

在β-地中海贫血中，红细胞前体的分化受限和细胞凋亡增加导致骨髓和脾中的髓外红细胞生成和红细胞扩增。先前已表明Fpn127降低了未成熟红细胞样细胞的比例，同时增加了Hbbth3/+小鼠BM和脾中的成熟RBC。因此，Hbbth3/+小鼠脾中红细胞样祖细胞的百分比较高并且成熟RBC的百分比较低(图9，表10)。单独的DFX不能逆转这种表型。相反，在用Fpn127单独或与DFX联合治疗的Hbbth3/+小鼠中，未成熟红细胞样细胞的百分比显著降低，同时RBC百分比增加(图9，表10)，从而表明无效红细胞生成降低和分化增加。

总之，单独的铁螯合不能改善Hbbth3/+小鼠的血液学参数，而Fpn127在存在或不存在DFX时改善了红细胞生成。

血清参数

在第23天给予DFX(最后一天没有给予Fpn127)1小时后终止研究，并且收集血清和血浆用于分析血清铁、Tf、计算的TSAT、EPO和化合物血浆暴露。

与溶媒治疗的th3/+动物和WT动物相比，在单独用Fpn127(最后一次给药在20小时前给予)或与DFX联合给药的Hbbth3/+动物中血清铁显著降低，而在单独用DFX治疗的小鼠中未观察到变化(图10，左图，表11)：28.7±5.8μM(th3/+溶媒)； 30.8μM±5.9μM(th3/+DFX)；23.1μM±3.5μM(th3/+DFX+Fpn127)；19.9μM±3.3μM (th3/+Fpn127)；以及29.9μM±2.8μM(WT)溶媒。在最后一次给予Fpn127后约20h， Hbbth3/+小鼠血清铁的降低是出乎意料的，因为与之前的研究一样，在C57BL/6WT小鼠中，给予120mg/kg Fpn127达20h，血清铁恢复到基线水平。一种可能性是与WT小鼠相比，Hbbth/3+小鼠中Fpn127的血浆暴露在20h时不同。需要使用Hbbth3/+和WT小鼠的 PKPD研究来解决该问题。未观察到性别差异。

溶媒治疗的Hbbth3/+动物的TSAT显著低于WT动物。TSAT水平大部分反映了血清铁水平，并且在单独用Fpn127治疗的Hbbth3/+小鼠中显著降低，并且显示了与DFX联合的趋势(图10，中图，表11)。与血清铁没有变化一致，单独的DFX不影响TSAT。

与WT组的EPO值相比，所有Hbb^th3/+组的血清EPO值都是高度可变的。如前所示，与WT动物(1470pg/mL±566pg/mL)相比，溶媒治疗的Hbb^th3/+动物的EPO水平显著升高(7144pg/mL±3216pg/mL)。单独用Fpn127或与DFX联合治疗降低了Hbb^th3/+动物的 EPO水平，而单独的DFX未达到统计显著性(表11；图10，下图)： 7144pg/mL±3216pg/mL(th3/+溶媒)；5277pg/mL±1710pg/mL(th3/+DFX)； 4460pg/mL±1330pg/mL(th3/+DFX+Fpn127)；3938pg/mL±1167pg/mL (th3/+Fpn127)；和1470pg/mL±566pg/mL(WT溶媒)。

在第23天给予DFX 1小时后收集血浆，用于通过LC-MS/MS测定化合物浓度。DFX 的血浆暴露在单独用DFX或与Fpn127联合给药的动物中类似(图11，表12)。类似地，Fpn127的血浆暴露在存在或不存在DFX时是相当的。如所预期的，Fpn127的血浆水平低，因为在最后一次给予Fpn127后约20h对血浆进行取样。

细胞内ROS、PS暴露和线粒体的流式细胞术分析

在β-地中海贫血中，Hb的α-和β-珠蛋白链的不平衡合成导致半色素形成，即含有游离血红素和铁的不溶性α-珠蛋白聚集体，从而导致活性氧物类(ROS)形成和RBC的细胞凋亡。使用荧光指示剂CM-H2DCFDA对血液中ROS进行流式细胞术分析显示，与单独用溶媒或单独用DFX治疗的Hbbth3/+小鼠相比，单独的Fpn127或与DFX联合显著降低了产生ROS的RBC的比例(表13，图12，上图)。

来自地中海贫血的患者和小鼠的RBC质膜具有受损的磷脂和蛋白质组织，从而导致PS暴露于外膜，这导致细胞凋亡。单独用Fpn127治疗显著降低了PS阳性RBC的比例，如膜联蛋白V染色所示(表13，图12，中图)。单独的DFX对PS暴露没有影响，而DFX与Fpn127联合显示了减少PS暴露的非显著趋势。

RBC通过糖酵解产生能量，并且在健康个体的网织红细胞成熟时通过线粒体自噬清除线粒体(Zhang J，Autophagy，2009年)。然而，在地中海贫血中，线粒体自噬不完全，并且成熟的RBC包含由于氧化磷酸化而产生ROS的线粒体。与溶媒治疗和DFX 治疗的Hbbth3/+小鼠相比，单独用Fpn127或与DFX联合治疗的Hbbth3/+小鼠具有较少的含有线粒体的RBC(表13，图12，下图)，从而表明仅Fpn127导致RBC成熟改善。

总之，DFX不能改善RBC在氧化应激、细胞凋亡和成熟方面的功能，而单独用Fpn127或与DFX联合治疗导致RBC质量改善。

表13.在研究结束时全血中标志物阳性成熟RBC的百分比(终末前第22天)。数据表示为每个治疗组的指定动物数的平均值±SD。与th3/+溶媒组的统计学显著差异由粗体值表示。

XI.9结论

DFX(30mg/kg)、Fpn127(120mg/kg)和两种化合物的联合给药17天对雄性和雌性Hbbth3/+小鼠的BW无显著影响，并且耐受良好。

相对于肝、脾和肾中的高铁含量和十二指肠中增加的Fpn表达，地中海贫血小鼠吸收过量的铁是由于铁调素水平不足(Gardenghi S等人，Blood，2007年)。用溶媒、 DFX、Fpn127或两者联合治疗的Hbb^th3/+小鼠器官中的总铁含量通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)分析。

与溶媒治疗的小鼠相比，单独用DFX或与Fpn127联合给药的Hbb^th3/+小鼠肝中的总铁浓度显著降低。如前所示，单独的Fpn127不能降低肝铁浓度。

与溶媒治疗的小鼠相比，所有化合物治疗的小鼠中Hbb^th3/+小鼠肾中的总铁浓度显著降低。出乎意料的是，Fpn127和DFX的联合比单独使用任一种治疗在降低肾铁浓度方面更有效。这些数据清楚地证明Fpn127不干扰螯合治疗，并且Fpn127和DFX的联合疗法通过将肾铁浓度降低到低于单独任一种治疗的水平而具有令人惊讶的协同作用。

尽管单独的DFX施用成功地降低了器官铁浓度，但它未能改善红细胞生成的参数，如脾重(图4)、Hb(图6)、RBC和网织红细胞计数、血细胞比容(图7)和血清 EPO(图10)。在单独用Fpn127或与DFX联合治疗的Hbbth3/+小鼠中所有这些参数均显著改善，从而证明了红细胞生成效率改善。与这些结果一致，在接受Fpn127的所有组的脾中红细胞前体的扩增显著降低(图9)，而单独的DFX没有影响。

特别是，与溶媒治疗的小鼠相比，单独的Fpn127或与DFX联合显著增加了Hbb^th3/+小鼠的Hb水平。与溶媒治疗的小鼠相比，给予Fpn127或联合的小鼠中Hb水平的变化到研究结束时分别达到13g/L和18g/L。单独用Fpn127或与DFX联合治疗Hbb^th3/+小鼠增加了RBC计数、血细胞比容(HCT)并降低了网织红细胞数和RBC分布宽度(RDW)，从而反映了红细胞生成改善。单独用DFX治疗不能改善红细胞生成。另外，Fpn127单独和与DFX联合将Hbb^th3/+小鼠血液中的白细胞计数校正到WT小鼠的正常水平，而单独的DFX没有显示影响。

Hbb^th3/+小鼠髓外红细胞生成导致脾中红细胞前体的过度增殖，从而导致脾肿大。单独用Fpn127或与DFX联合治疗Hbb^th3/+小鼠导致脾重的显著降低，而单独的DFX显示没有影响。还通过分析脾中分化红细胞前体的百分比来研究红细胞生成，如通过 Ter1 19/CD44标志物所鉴定并通过流式细胞术分析。与单独用Fpn127或与DFX联合治疗的溶媒治疗的Hbb^th3/+小鼠相比，在存在和不存在DFX时Fpn127显著降低的Hbb^th3/+小鼠脾中早期红细胞前体原成红血细胞、嗜碱性成红血细胞、多色成红血细胞和正色成红血细胞的百分比并增加的成熟RBC的百分比与溶媒组相比显著降低。单独用DFX治疗也显示了血清EPO水平降低的趋势，但未达到统计显著性。

另外，仅在存在Fpn127时，Hbbth3/+小鼠外周血中升高的白细胞数显著降低，从而表明Fpn127降低β-地中海贫血炎症的潜力。

Hb的α-和β-珠蛋白链的不平衡合成导致形成含有游离血红素和铁的不溶性α-珠蛋白聚集体，从而导致ROS形成和晚期红细胞样祖细胞的细胞凋亡。如在先前的研究中一致显示的，Fpn127显著减少了ROS阳性RBC的百分比，降低了含有线粒体的成熟RBC 的比例，并降低了RBC上的细胞凋亡信号(磷脂酰丝氨酸，PS)。

单独用Fpn127或联合治疗也改善了成熟RBC的质量，即其减少了细胞内ROS产生、减少了PS暴露并减少了线粒体的保留(图12)。DFX在任何方面都没有改善RBC 质量。

用DFX的联合治疗不干扰Fpn127对RBC表型的有益效果，而单独的DFX没有影响。

综上所述，该研究显示尽管Fpn被Fpn127抑制，但DFX诱导的铁从肝的排泄仍能完成。此外，单独的Fpn127或与DFX一起施用在改善th3/+小鼠贫血、红细胞生成并降低脾大小方面显示类似的疗效。

于是，这些结果清楚地显示(i)Fpn127不干扰铁螯合以及(ii)Fpn127对红细胞生成的积极影响不受铁螯合疗法的影响。因此，口服膜铁转运蛋白抑制剂Fpn127和铁螯合剂DFX的共同施用是可行的，并且可能提供逆转已建立的铁过载并改善β-地中海贫血中红细胞生成的优势。铁螯合与Fpn127的联合提供了逆转β-地中海贫血的Hbb^th3/+模型中已建立的铁过载并改善红细胞生成的优势。

这些数据支持用本发明的膜铁转运蛋白抑制剂与常规铁螯合疗法的联合疗法的疗效，例如地拉罗司在β-地中海贫血的治疗中，如特别是其严重形式，如在TDT中。

Claims (16)

1.用于治疗输血依赖型β-地中海贫血的根据式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物：

其中

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基；

n是1至3的整数；

A¹和A²独立地选自烷二基基团

R²是

-氢，或

-任选取代的烷基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环；

R³表示1个、2个或3个任选的取代基，所述取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-任选取代的烷基、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-卤素、

-C₁-C₃-烷基，和

-卤素取代的烷基。

2.根据权利要求1所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述治疗包括将一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物施用给患有β-地中海贫血和/或血红蛋白Eβ-地中海贫血并需要定期输血的患者。

3.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述患者患有重型β-地中海贫血和/或严重血红蛋白Eβ-地中海贫血。

4.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中患有β-地中海贫血并需要定期输血的所述患者的特征在于

a)来自以下的基因型：β°/β°、β⁺/β⁺、β°/β⁺和β°/HbE，或

b)包含两种严重血红蛋白β链突变的共同遗传的基因型，

以及任选地另外具有胎儿血红蛋白的遗传持续性。

5.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中患有β-地中海贫血并需要定期输血的所述患者的特征在于

a)显示可检测到的NTBI水平，和/或

b)Hb水平低于7g/dL，和/或

c)MCV介于50fL至70 10fL之间，和/或

d)MCH介于12pg至20pg之间。

6.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中定期输血包括

a)在不同后续时间间隔内重复相等红细胞(RBC)单位的输血，或

b)在相等后续时间间隔内重复相等RBC单位的输血，或

c)在相等后续时间间隔内重复不同RBC单位的输血，或

d)在不同后续时间间隔内重复不同RBC单位的输血。

7.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中定期输血意指每24周超过5次输血。

8.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述治疗包括将一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物口服施用给有此需要的患者。

9.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述治疗包括向有此需要的患者施用5mg、15mg、60mg、120mg或240mg的剂量；优选地，对于体重＞50kg的患者，剂量为120mg，并且对于体重＜50kg的患者，剂量为60mg，每天一次或两次。

10.根据前述权利要求中任一项所述用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中在式(I)中

n＝1；

R³＝氢；

R⁴＝氢；

A¹＝亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²＝亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

或A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元环，从而形成根据式(II)或(III)化合物：

其中在式(II)和(III)中

l是0或1；

m是1、2或3的整数，并且

X¹、X²和R¹具有权利要求1中所定义的含义。

11.根据前述权利要求中任一项所述用途的化合物，所述化合物是与来自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸的酸的药学上可接受的盐的形式，

优选地与来自柠檬酸、盐酸、马来酸、磷酸和硫酸的酸形成的盐的形式；

以及它们的溶剂合物、水合物和多晶型物。

12.根据前述权利要求中任一项所述用途的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述式(I)化合物选自：

优选地，所述式(I)化合物选自：

13.根据前述权利要求中任一项所述用途的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述式(I)化合物选自：

或选自以下的盐：

具有下式的1:1硫酸盐

具有下式的1:1磷酸盐

具有下式的1:3HCl盐

以及它们的多晶型物。

14.一种药物，所述药物包含根据前述权利要求中任一项所定义的用途的一种或多种根据前述权利要求1和10至13中任一项所定义的化合物，其中所述药物另外包含一种或多种药物载体和/或助剂和/或溶剂，和/或一种或多种另外的药学活性化合物。

15.根据前述权利要求中任一项所定义的用于治疗输血依赖型β-地中海贫血的联合疗法的用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述联合疗法包括将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，与一种或多种其他另外的药学活性化合物共同施用，

其中所述联合疗法的共同施用能够通过将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，与一种或多种其他另外的药学活性化合物以固定剂量制剂共同施用而以固定剂量联合疗法进行，或

其中所述联合疗法的共同施用能够通过同时施用单个化合物或通过在一段时间内顺序使用所施用的所述单个化合物，通过将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，以及所述一种或多种其他另外的药学活性化合物以相应化合物的自由剂量共同施用而以自由剂量联合疗法进行。

16.根据权利要求15所述联合疗法用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述式(I)化合物选自：

并且所述另外的药学活性化合物是铁螯合剂地拉罗司。

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