CN114304335A - 一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用，包括以下步骤：A、将新鲜石斛叶清洗，然后烘干磨粉，向得到的粉状产物中加水进行调浆，得到石斛叶浆；B、加热石斛叶浆进行灭菌处理，灭菌完成并冷却后接种发酵，接种发酵所用的微生物为植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的复合；C、发酵完成后，得到的石斛叶进行超声波辅助提取，然后再离心处理得到石斛叶提取物。本发明筛选出的植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉对石斛叶进行复合发酵，提取物中多糖、黄酮等活性物质含量升高，且抗氧化性显著提高；同时，采用冷冻干燥技术既保留了产品营养活性成分，也提高了产品溶解性及口感，为石斛叶综合利用提供了科学依据。

Description

一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用

技术领域

本发明涉及发酵茶制备技术领域，特别涉及一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale Kimura et Migo.)为兰科石斛属珍稀药用植物，在我国民间享有“救命仙草”的美誉。野生铁皮石斛不耐寒，喜好温暖湿润气候，在我国，药用铁皮石斛最初主要分布在福建、浙江、广东、云南等省的一些丹霞地貌区域，丹霞地貌是铁皮石斛的第一主要生境。

作为中药品种铁皮石斛的基原植物收载于《中国药典》2010年版，其味甘、性微寒，具有生津养胃和润肺益肾的功效。含有石斛多糖、石斛碱、酚类、黄酮类和氨基酸等活性成分，现代药理学研究表明铁皮石斛具有降血压、提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老和降血脂等药用价值，被广泛用于化妆品、保健品、普通食品中。在《中国药典》中铁皮石斛均以全草为药用部分，但在大部分情况下人们均以石斛茎入药或者制成其他产品，在叶和花的利用上造成了一定的浪费。近年来，石斛的大量种植，人们对石斛的研究也越来越丰富，研究范围也越来越广泛。近年来，大多学者在植物化学及其药理实验等方面研究发现，在同株植物中，90％以上的植株器官之间存在关联性，如成分种类相对一致，功能特性效果一致等。石斛叶中的主要活性成分为多糖(茎>叶>花)、黄酮类和酚类(花>叶>茎)、生物碱(茎上段>叶>茎中段，1年生≥2年生≥野生型)、氨基酸(必需氨基酸总量茎>叶>花、必需氨基酸占比叶>茎>花)，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用。但目前对石斛的叶研究及加工都较少，叶部利用率较低。

中国专利CN112042781A公开了一种铁皮石斛保健茶的制备方法，其工艺大致为：将铁皮石斛的叶和茎打浆获得茶浆，杀菌后接入生茶茶菌菌膜和纳豆菌，在28-30℃的无菌避光环境下进行有氧发酵，得到发酵茶浆，发酵茶浆经喷雾干燥后即得。该专利技术避免了传统茶叶在制备过程中需要进行摊晾、萎凋等造成营养成分散失的问题，但该专利技术未给出获得的铁皮石斛保健茶中活性成分多糖和黄酮的含量，同时，采取喷雾干燥会因温度过高而导致铁皮石斛中众多活性物质失活等问题，而且也没有针对石斛叶进行专门研究及加工，参考价值有限。

中国专利CN112006143A公开了一种高多糖含量的美藤果叶石斛叶康普茶及其制备方法，其工艺大致为：取美藤果叶和铁皮石斛叶，经揉捻后进行发酵，发酵后烘干得干燥物，干燥物煮沸后得混合培养液；将植物乳杆菌、乳酸芽孢杆菌DU-106以及酿酒酵母冻干粉进行复配得到菌粉，将菌粉加入混合培养液中，培养后过滤杀菌，即得。该专利技术制备为液体饮料，不方便运输，且保质期受限。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用，本发明筛选出的植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉对石斛叶进行复合发酵，通过超声辅助提取，提取物中多糖、黄酮等活性物质含量升高，且抗氧化性显著提高；同时，采用冷冻干燥技术既保留了产品营养活性成分，也提高了产品溶解性及口感，可为石斛叶综合利用提供科学依据，克服了现有技术中的不足。

本发明采用的技术方案如下：一种发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将新鲜石斛叶清洗，然后烘干磨粉，向得到的粉状产物中加水进行调浆，得到石斛叶浆；

B、加热石斛叶浆进行灭菌处理，灭菌完成并冷却后接种发酵，接种发酵所用的微生物为植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的复合；

C、发酵完成后，得到的石斛叶进行超声波辅助提取，然后再离心处理得到石斛叶提取物。

进一步，所述植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的质量比例为1：(1-2)：(1-2)：(1-2)。具体可以为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC194165、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.43、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC 2041和米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 2011。当然，其还可以选择其他菌种，例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus)CICC 6091、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)CICC 6233、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)CICC 32845、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CICC 22459中的一种或多种，但这些菌种的使用效果没有本发明进行试验筛选的复合菌种使用效果好。

作为优选，所述植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的质量比例为1：2：1：2。

进一步，所述石斛叶浆的发酵条件为：料料液比为1:5-25，发酵温度为28-38℃，发酵时间为24-120h，发酵液中微生物菌种接种量为石斛叶浆体积的6-10％。

作为优选，所述石斛叶浆的发酵条件为：料料液比为1:10，发酵温度为32-35℃，发酵时间为46-48h，发酵液中微生物菌种接种量为石斛叶浆体积的8-9％。

进一步，超声波辅助提取的提取条件为：超声时间28-30min，超声温度62-65℃。

作为优选，超声波提取后的离心条件为：转速4000r/min，离心10min。

本发明还包括应用该方法制备石斛茶的方法，具体包括一种铁皮石斛叶速溶茶的制备方法，包括以下步骤：

S1、按照上述方法制备得到石斛叶提取物，待用；

S2、按照一定比例将生茶和石斛叶提取物混合浓缩，冷冻干燥后即得。

进一步，石斛叶提取物与生茶的质量比为1：1－5。

进一步，在冷冻干燥前先进行预冻处理，预冻条件为：－80℃下冷藏24－48h，然后再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥处理的条件为：－40－(－50)℃下冷冻24－26h。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、目前研究者大多关注石斛茎的开发与利用，研究其有效活性成分，常常将石斛叶作为废弃物丢弃，既污染环境还占用土地，由于同株植物存在其90％同源性，石斛叶中也存在较多活性成分，本发明利用石斛叶在未使用辅助原料的情况下，对石斛叶进行发酵提取，在发酵阶段，本发明通过筛选试验得到了一种有利于获得的更多活性成分的复合菌种(单一菌种活性成分富集效果不显著)，本发明通过控制菌种间的质量比例，克服了菌种间在同一发酵条件下发酵效果相差较大的问题，同时，通过研究发酵工艺及参数对复合菌种的影响，经过实验总结分析，得到了一套适合该复合菌种的发酵工艺及参数，使得复合菌种尽可能朝最有利的方向发展，使石斛叶提取物中的多糖和黄酮的含量均得到了提高，提高了石斛叶的利用效率，得到的石斛提取物可直接应用于食品、药品及保健品等领域，拓宽了石斛叶的应用领域；

2、采用本发明的富集方法得到的石斛叶提取物中，多糖、黄酮等有效成分含量较高，其多糖含量不低于35％，黄酮含量不低于2.8％，具有较好的溶解性，能充分发挥其抗氧化等作用，同时，采用微生物发酵既富集增加了有效成分，又降解了一部分影响产品口感质量的成分，采用超声辅助提取技术在增加提取率和保留活性成分的同时，还避免了溶剂残留，提高了发酵提取物的品质；

3、利用本发明发酵得到的石斛提取物与生茶按特定比例复配后，所得产品的口感被改善，通过发酵+冷冻干燥+生茶复配的方式，降低了石斛中一部分影响产品口感质量的成分，得到的铁皮石斛叶速溶茶不仅口感俱佳，其在一定程度上还具有抗氧化、抑菌等保健作用，为石斛叶综合利用提供了科学依据。

附图说明

图1为石斛叶发酵工及超声波辅助提取石斛叶活性成分工艺路线图；

图2为石斛叶速溶茶制备工艺路线图；

图3为菌种种类对多糖含量、黄酮含量的影响图；

图4为不同菌种比例对多糖含量、黄酮含量的影响图；

图5为发酵工艺对多糖含量、黄酮含量的影响图；

图6为超声温度对多糖含量、黄酮含量的影响图；

图7为超声时间对多糖含量、黄酮含量的影响图；

图8为石斛发酵液抗氧化能力测定情况图；

图9为石斛叶发酵液与石斛提取液抗氧化性对比情况图；

图10为石斛叶速溶茶粉研制工艺对感官评分的影响图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

石斛叶发酵工艺

菌种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus)CICC 6091、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)CICC 6233、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 194165、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)CICC 32845、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CICC 22459、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.43、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC 2041和米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 2011。

(1)菌种活化

细菌活化：取菌种接种于200mL灭菌营养肉汤培养基中，于28℃在恒温培养箱中培养24h得到一代菌悬液；按12％的接种量将一代菌悬液接种于营养肉汤培养基中，28℃恒温培养18h得二代菌悬液；重复上述步骤28℃恒湿培养12h，进行第三次活化得到三代活化菌悬液，4℃冰箱储存备用。

乳酸菌活化：取菌种接种于200mL灭菌MRS肉汤培养基中，于37℃在恒温培养箱中培养24h得到一代菌悬液；按12％的接种量将一代菌悬液接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养18h得二代菌悬液；重复上述步骤37℃恒湿培养12h，进行第三次活化得到三代活化菌悬液，4℃冰箱储存备用。

真菌的活化：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基，30℃恒温培养箱培养6d，使菌种充分活化。

(2)菌种及比例筛选

通过对石斛叶发酵液的粗多糖含量和黄酮测定进行菌种筛选，筛选能够对石斛叶进行良好发酵的菌种。

(3)石斛叶发酵工艺筛选

以石斛叶发酵液中粗多糖得率、黄酮含量为指标，利用筛选的4株菌按(植物乳杆菌：酿酒酵母：黑曲霉和：米曲霉＝1:2:1:2)对石斛叶进行发酵，考察料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25g/mL)不同发酵温度(28℃、30℃、33℃、35℃、38℃)、发酵时间(24h、48h、72h、96h、120h)、菌种接种量(按石斛浆体积的6％、7％、8％、9％、10％)对发酵液中多糖及黄酮含量的影响。

发酵前后石斛叶中多糖含量、黄酮含量分析。

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，黄酮含量测定方法如下：

①芦丁标准曲线的绘制

吸取一定体积的芦丁样品并将其配置为0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80mg/mL质量浓度的标准溶液。取1mL标准溶液，4mL浓度为50％的乙醇溶液、0.4mL 5％的NaNO₂溶液，加入到准备好的5个10mL容量瓶中，然后将其充分混匀。静置6min后，向容量瓶中加入0.4mL 10％的Al(NO₃)₃溶液，充分振荡并摇匀。然后将其充分混匀。静置6min后，向容量瓶中加入0.4mL 10％的Al(NO₃)₃溶液，充分振荡并摇匀。同时，以50％乙醇溶液为对照组，绘制不同的芦丁质量浓度X(mg/mL)和吸光度Y对应的标准曲线，并通过线性回归得到其回归曲线方程：Y＝1.1563X+0.0009，R2＝0.9998。

②石斛叶总黄酮的测定

将1mL提取液(发酵液经超声波提取后进行离心的上清液)放入10mL容量瓶中，根据以上方法测定，并根据下式计算石斛叶的总黄酮得率。

式中：A为石斛叶总黄酮得率，mg/g；C为总黄酮质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；N为稀释倍数；M为原料质量，g。

石斛叶的发酵工艺包括以下步骤：

S1、将新鲜石斛叶清洗，然后于55-65℃下烘干磨粉，向得到的粉状产物中加水进行调浆，得到石斛叶浆；

S2、加热石斛叶浆至121℃进行灭菌处理，灭菌10min后，待其冷却，然后再接种发酵；

C、发酵完成后，得到的石斛叶进行超声波辅助提取，然后再离心处理得到石斛叶提取物。

实施例2

超声波辅助提取石斛叶活性成分提取工艺

以石斛叶发酵液中粗多糖、黄酮得率为指标，考察超声时间(10min、20min、30min、40min、50min)，超声温度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)对石斛叶多糖及黄酮含量的影响。工艺路线如图1所示。

超声波提取后的离心条件如下：4000r/min离心10min。将上清液与石斛叶提取液(水提)进行抗氧化性对比；

①羟自由基清除能力测定：反应体系中加入0.2mL 9mmol/L FeSO₄和0.2mL9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，然后加入离心后的经超声波提取的石斛叶发酵液0.2mL，最后加入0.2mL 8.8mmol/L H₂O₂启动反应。37℃条件下保温30min，以纯水为参比液，在510nm测定吸光值。

·OH清除率(％)＝[(A₀-(A₁-A₂))/A₂]×100％

式中：A0——空白对照吸光度，A1——样品吸光度；A2——不加显色剂H₂O₂超声波提取的石斛叶发酵液的吸光度。

②总抗氧化能力测定。吸取离心后的经超声波提取的石斛叶发酵液0.5mL，加入ABTS·+稀释工作液3.8mL，室温下反应6min，于734nm测定吸光度，纯水替代经超声波提取的石斛叶发酵液作为空白，纯水代替ABTS·+稀释工作液进行调零。

ABTS·自由基清除率(％)＝[(s-sb)/(c-cb)]×100％；

式中：s——ABTS·自由基清除能力吸光度,sb——样品干扰试验吸光度(调零)，c——ABTS·工作液吸光度，cb——纯水吸光度(调零)。

还原力测定：取1mL不同浓度(0.5、1、1.5、2、3、4mg/mL)的多糖溶液于试管中，加入0.2mL磷酸盐缓冲液(0.2，pH＝6.6，PBS)，0.5mL 1％铁氰化钾，混匀，50℃水浴20min。取出迅速冷却，加入1mL 10％TCA，混匀，4000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL1％FeCl₃。在700nm波长测定吸光值，以蒸馏水调零。

空白组：用1mL蒸馏水代替多糖溶液。

对照组：用0.5ml蒸馏水代替铁氰化钾溶液。

按以下公式计算：还原力＝(A_样品-A_对照)-A_空白

Fe²⁺螯合力的测定：取1mL不同浓度(0.5、1、1.5、2、3、4mg/mL)的多糖样品溶液，加入0.1mL 2mmol/L FeCl₂，3.7mL蒸馏水，混合放置5min。加入0.2m L5mmol/L的Ferrozine，室温放10min，于562nm波长测吸光值。

空白组：用蒸馏水代替多糖样品溶液。

对照组：用蒸馏水代替FeCl₂。

按以下公式计算：Fe²⁺螯合力(％)＝{A_空白-(A_样品-A_对照)}/A_空白×100％

实施例4石斛叶速溶茶粉研制

以感官评分为指标，考察石斛叶发酵物与生茶(固形物含量)配比(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)、冷冻温度(-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃)、冷冻时间(12h、18h、24h、30h、36h)、对速溶茶粉的影响。

组织10位具有一定专业知识的人员经培训组成感官评定小组，分别从香气(25分)、色泽(25分)、滋味(25分)及组织状态(25分)4个方面对石斛叶速溶茶粉进行评分，感官评分标准见表1。

表1感官评分标准

结果分析

菌种筛选及比例确定

发酵的核心环节，是发酵菌种的筛选。不同的微生物具有不同的酶分泌系统和次级代谢产物，因此，筛选出好的发酵菌种，是发酵的关键环节。图3可以看出，每种菌种发酵产生的活性物质多糖及黄酮含量不同，相对含量接近的为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CICC 194165、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.43、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC 2041和米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 2011。植物乳杆菌能增加发酵底物的风味物质以及改变其结构组成；霉菌可分泌多种消化酶，促进养分被吸收利用，增加发酵效应；酿酒酵母能分解糖来为机体活动提供能源物质，促进其活性物质合成。为了获得更多的活性物质多糖和黄酮含量，将该四种菌种复配并进行混菌发酵，混菌发酵的效果以及菌种不同比例的发酵效果如图4所示。在图4中，从整体上来看，混菌发酵的效果并不是单一菌种发酵效果的叠加，也没有产生增效的结果，但可以使得活性物质多糖及黄酮含量比较协调统一，两者含量差距较小，总体呈现出上升的趋势，由此说明，单一菌种效果均在局限性，将其菌种复配发酵，能使多种活性物质相互转化，使其效果达到最佳。另外，通过考察菌种间的混合比例得到，当植物乳杆菌含量过高时，活性物质多糖及黄酮含量均呈现下降的趋势，因此，植物乳杆菌含量不宜过高，而且，当黑曲霉含量过高时，也会导致活性物质多糖及黄酮的含量下降，由于米曲霉与黑曲霉共属霉菌，两者具有协同作用，且米曲霉米作为食品工业中常用的酶，可将淀粉和蛋白质分解成糖和氨基酸，促进成分转化，因此占比相对较大。由图4得到，当该四种菌种的质量比例为1:2:1:2时，活性物质多糖及黄酮含量最高，以此作为优选质量比例。

石斛叶发酵工艺筛选

由图5可以看出，以石斛叶发酵液中粗多糖得率以及黄酮含量为指标，利用筛选的4株菌按(植物乳杆菌：酿酒酵母：黑曲霉：米曲霉＝1:2:1:2)对石斛叶进行发酵，发酵前后石斛叶中多糖及黄酮含量均有一定程度的提升，说明发酵条件影响其活性物质富集，同时，当料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25(单位g/mL)时，多糖含量最高值在料液比为1:15，当发酵温度为28℃、30℃、33℃、35℃、38℃时，多糖含量最高值在发酵温度为30℃，当发酵时间为24h、48h、72h、96h、120h时，多糖含量最高值在发酵时间为48h，当菌种接种量为石斛浆体积的6％、7％、8％、9％、10％时，多糖含量最高值在菌种接种量为8％，综合各条件参数对多糖含量的影响情况，得到最适宜的条件参数，其最适发酵温度为35℃，发酵时间为48h，菌种接种量为石斛叶体积的8％。

超声波辅助提取石斛叶活性成分提取工艺单因素实验

由图6-图8可以看出，以石斛叶发酵液中粗多糖得率为指标，最适超声时间为30min，超声温度50℃。

发酵液抗氧化活性确定如图8所示，由图8可知，发酵液具有较强的抗氧化活性，能够清除羟自由基、ABTS自由基和还原力等，且存在浓度剂量依赖关系，随着浓度的增加，抗氧化能力持续加大。

石斛叶发酵液与石斛叶提取物抗氧化性对比

由图9可以看出，将石斛发酵液与石斛叶提取物进行抗氧化性对比，发现其发酵液抗氧化性皆高于水提物，由此可得，通过微生物发酵可以刺激木质部细胞壁破裂，导致众多活性成分充分释放，从而使抗氧化性增加。

石斛叶速溶茶粉制备单因素实验

由图10以感官评分为指标，考察石斛生茶粉制备工艺研究。因采取喷雾干燥会因温度过高而导致众多活性物质失活等问题，故使用冷冻干燥技术进行干燥处理。将生茶与石斛发酵产物进行复配，使其口感奇特，并且增加其产品的营养价值及功能成分。在图10中，当石斛与生茶比例为1:2时，感官评分最高，并且于-40℃冷冻干燥24h得到的茶粉评价最高,综合之下，采用上述工艺参数能够得到一款活性物质多，且具有浓郁的石斛味以及清香的生茶味的茶粉，本发明因利用了冷冻干燥技术，故最大程度保留其产品风味及功能特性，具有较大的市场潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将新鲜石斛叶清洗，然后烘干磨粉，向得到的粉状产物中加水进行调浆，得到石斛叶浆；

B、加热石斛叶浆进行灭菌处理，灭菌完成并冷却后接种发酵，接种发酵所用的微生物为植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的复合；

C、发酵完成后，得到的石斛叶进行超声波辅助提取，然后再离心处理得到石斛叶提取物。

2.如权利要求1所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的质量比例为1：(1-2)：(1-2)：(1-2)。

3.如权利要求2所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的质量比例为1：2：1：2。

4.如权利要求2所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，所述石斛叶浆的发酵条件为：料料液比为1:5-25，发酵温度为28-38℃，发酵时间为24-120h，发酵液中微生物菌种接种量为石斛叶浆体积的6-10％。

5.如权利要求4所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，所述石斛叶浆的发酵条件为：料料液比为1:10，发酵温度为32-35℃，发酵时间为46-48h，发酵液中微生物菌种接种量为石斛叶浆体积的8-9％。

6.如权利要求4所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，超声波辅助提取的提取条件为：超声时间28-30min，超声温度62-65℃。

7.如权利要求6所述的发酵富集石斛叶活性成分的方法，其特征在于，超声波提取后的离心条件为：转速4000r/min，离心10min。

8.一种铁皮石斛叶速溶茶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、按照权利要求1－7任一所述的方法制备得到石斛叶提取物，待用；

S2、按照一定比例将生茶和石斛叶提取物混合浓缩，冷冻干燥后即得。

9.如权利要求8所述的铁皮石斛叶速溶茶的制备方法，其特征在于，石斛叶提取物与生茶的质量比为1：1－5。

10.如权利要求9所述的铁皮石斛叶速溶茶的制备方法，其特征在于，在冷冻干燥前先进行预冻处理，预冻条件为：－80℃下冷藏24－48h，然后再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥处理的条件为：－40－(－50)℃下冷冻24－26h。

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