CN114277031A

CN114277031A - hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用

Info

Publication number: CN114277031A
Application number: CN202210090118.2A
Authority: CN
Inventors: 张允斌; 张倩
Original assignee: Shanghai Newren Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Newren Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了一种hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用，属于癌症诊断领域。hsa_circ_0006420环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明得到一个新的hsa_circ_0006420环状RNA基因，胶质瘤肿瘤组织以及患者血液样本中的hsa_circ_0006420环状RNA表达显著升高，可应用于胶质瘤诊断、替莫唑胺治疗后响应以及患者生存期预测。

Description

hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用

技术领域

本发明属于癌症诊断技术领域，具体涉及一种hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是成年人最为频发的脑肿瘤疾病，占颅内肿瘤的40.49％。从确诊开始，脑胶质瘤患者平均生存寿命不超过五年。目前而言胶质瘤的诊断和治疗方法虽处于不断改进阶段，但是胶质瘤患者生存率并没有明显提高。胶质瘤诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为中晚期，手术后的生存率不容乐观。因此，寻找胶质瘤早期诊断标志物对患者进行“早发现，早治疗”，以及提高胶质瘤患者的生存期，并相应地选择合理的后续治疗方案，是神经科学领域亟待解决的研究任务。

CircRNA是近年来发现的非编码RNA家族重要成员，其形成没有极性和聚腺苷酸尾的环化结构，由于circRNA分子呈封闭环状结构，具有更高的核酸酶稳定性，不受RNA外切酶影响，不易降解，这使得它们成为临床应用新型生物标记具有很大的优势。高通量测序和生物信息学方法揭示了circRNA在真核生物中广泛表达。研究发现大多数circRNA参与一些肿瘤的发生发展，在病理条件下以组织特异性异常表达。研究发现circRNA在肿瘤发生发展中发挥关键作用，其作用机制上主要包括方面：(1)circRNA作为miRNA的吸附物(sponge)，通过吸附miRNA调控其靶基因和下游通路的表达，进而影响胶质瘤的发生发展；(2)circRNA通过翻译成肽段或者蛋白发挥作用；(3)通过结合母基因(host gene)DNA序列介导母基因mRNA的转录调控，这些特性使得circRNA成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点和潜在标志物。

发明内容

本发明针对现有胶质瘤诊断的缺陷，提供一种用于胶质瘤诊断和预后评估的新靶标，即hsa_circ_0006420环状RNA基因，并提供该靶标的新应用，特别是在其检测试剂、胶质瘤诊断、肿瘤药物对胶质瘤的治疗效果以及胶质瘤预后评估中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种hsa_circ_0006420环状RNA基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

hsa_circ_0006420环状RNA分子是由AEBP2基因的第2和3号外显子首位相接连接而成的环状RNA分子(AEBP2基因全长79,021nt，共由9个外显子组成。hsa_circ_0006420环状RNA全长序列为：

CATAAGCAGTACTATAATGGATGTAGACAGCACAATTTCCAGTGGGCGTTCAACTCCAGCAATGATGAATGGACAAGGAAGCACTACTTCTTCAAGCAAAAATATTGCCTATAATTGTTGTTGGGACCAGTGCCAGGCTTGCTTCAACTCTAGCCCAGATCTGGCAGATCACATCCGTTCCATACATGTAGATGGTCAGCGAGGAGGGGTATTTGTTTGCTTATGGAAAGGTTGTAAAGTATATAACACTCCATCTACCAGTCAAAGTTGGTTACAAAGGCATATGCTGACACACAGTGGAGACAAACCTTTCAAG(SEQ ID NO.1)

第二方面，本发明提供一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的检测引物，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示，所述检测引物可用于制备胶质瘤诊断或预后评估试剂盒。

正向引物(Primer F)的核苷酸序列为TCTGGCAGATCACATCCGTT(SEQ ID NO.2)；

反向引物(Primer R)的核苷酸序列为GAACGCCCACTGGAAATTGT(SEQ ID NO.3)。

在具体的应用中，还包括内参GAPDH的正向引物和反向引物：

内参GAPDH Primer F:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQ ID NO.4)；

内参GAPDH Primer R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQ ID NO.5)。

第三方面，本发明提供一种hsa_circ_0006420环状RNA基因作为分子标志物在制备用于诊断胶质瘤的试剂盒中的应用。

第四方面，本发明一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂在制备用于胶质瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂选自：对hsa_circ_0006420环状RNA基因具有检测特异性的探针、基因芯片或如SEQ IDNO.2～3所示的检测引物；

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR试剂。

其中，RNA提取试剂为trizol试剂；

将RNA逆转录成cDNA的逆转录反应体系如下：

逆转录反应体系的反应条件为：37℃、10min，42℃、20min，85℃、5min，4℃、2min。

所述荧光定量PCR试剂包括：

cDNA	1μL
		上游引物(10μM)	0.2μL
下游引物(10μM)	0.2μL
		2X PCR Master Mix	10μL
RNA free ddH2O	补足至20μL

优选地，荧光定量PCR反应条件为：95℃、5分钟变性；95℃、10秒，60℃35秒；35个循环。

第五方面，本发明提供一种用于胶质瘤诊断或胶质瘤预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.2～3所示检测引物。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述试剂盒还包括荧光定量PCR试剂。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述荧光定量PCR试剂总量为20μL包括：1μL的cDNA、0.2μL、10μM的如SEQ ID NO.2所示的检测引物、0.2μL、10μM的如SEQ ID NO.3所示的检测引物、10μL的2X PCR Master Mix。

第六方面，本发明提供一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂在制备用于评估抗肿瘤药物对胶质瘤治疗效果的试剂盒中的应用；

优选地，所述抗肿瘤药物为替莫唑胺。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

发明人研究发现，hsa_circ_0006420环状RNA基因在胶质瘤肿瘤组织与癌旁组织样本中具有差异表达，且通过荧光定量PCR发现，与正常组织相比，胶质瘤肿瘤组织以及患者血液样本中的hsa_circ_0006420环状RNA表达显著升高。由此表明，hsa_circ_0006420环状RNA基因可以作为胶质瘤的的诊断标志物。hsa_circ_0006420的表达量可用于胶质瘤早期诊断；特别是hsa_circ_0006420表现出可预测患者预后以及替莫唑胺治疗效果的表现。这些结果说明hsa_circ_0006420可应用于胶质瘤诊断、替莫唑胺治疗后响应以及患者生存期预测。

说明书附图

图1为实施例1中hsa_circ_0006420环状RNA的鉴定；

图2为实施例2中hsa_circ_0006420环状RNA在胶质瘤组织以及患者血浆中表达显著升高；

图3为实施例2中hsa_circ_0006420环状RNA用于胶质瘤患者诊断表现；

图4为实施例3中hsa_circ_0006420环状RNA用于胶质瘤患者替莫唑胺治疗响应预测表现；

图5为实施例4中hsa_circ_0006420环状RNA用于胶质瘤患者预后预测表现。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1hsa_circ_0006420的鉴定

1.RNA提取(Trizol方法)

(1)肿瘤组织以及血浆加入1ml trizol；

(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡10秒，室温静置10min；

(3)4℃下，12,000g离心10min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；

(4)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

(5)4℃下，12,000g离心15min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；

(6)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

(7)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。

2.基因组DNA去除

去除总RNA中的基因组DNA的残留，采用DNA消化酶，具体反应体系和条件如下,反应液总体积为10μL，如下组分组成：

RNA	6μL(3μg)
		DNase I	1μL
10X buffer	1μL
		RNA free H2O	2μL

反应液中于37℃消化40min后，85℃3min灭活DNA消化酶。

3.RNA逆转录成CDNA

将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下：

总RNA	2μg
		随机引物	0.5μL
2X RT Mix	5μL
		RT Enzyme Mix	1μL
RNA free ddH2O	补足至10μL

反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

4.设计反向扩增PCR引物扩增hsa_circ_0006420接口及侧翼序列DNA测序验证

根据Circbase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向PCR扩增引物，扩增hsa_circ_0006420的接口及侧翼序列引物序列为：

引物扩增环状RNA hsa_circ_0006420部分序列的大小为316p；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNA hsa_circ_0006420的环化接口两侧的部分序列，经1.5％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0006420分子是由AEBP2基因的第2和3号外显子首位相接连接而成的环状RNA分子(AEBP2基因全长79,021nt,共由9个外显子组成)(图1)。RNA hsa_circ_0006420全长序列为：

CATAAGCAGTACTATAATGGATGTAGACAGCACAATTTCCAGTGGGCGTTCAACTCCAGCAATGATGAATGGACAAGGAAGCACTACTTCTTCAAGCAAAAATATTGCCTATAATTGTTGTTGGGACCAGTGCCAGGCTTGCTTCAACTCTAGCCCAGATCTGGCAGATCACATCCGTTCCATACATGTAGATGGTCAGCGAGGAGGGGTATTTGTTTGCTTATGGAAAGGTTGTAAAGTATATAACACTCCATCTACCAGTCAAAGTTGGTTACAAAGGCATATGCTGACACACAGTGGAGACAAACCTTTCAAG(SEQ ID NO.1)。

实施例2

hsa_circ_0006420的荧光定量PCR检测用于胶质瘤诊断

荧光定量PCR扩增检测环状RNA hsa_circ_0006420分子在组织与血浆表达情况的方法为：按照实施例1所述方法提取总RNA，并用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA，将RNA逆转录成cDNA；最后采用荧光定量PCR扩增进行检测，荧光定量PCR的引物序列如SEQID NO.2～5所示。扩增环状hsa_circ_0006420环化接口区域序列的大小为200bp。

荧光定量PCR扩增检测环状RNA hsa_circ_0006420分子在组织与血浆的表达情况反应体系及反应条件如下：

荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；35个循环。荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0006420在组织与血浆中的表达。

结果发现hsa_circ_0006420在胶质瘤组织和胶质瘤患者血浆中表达显著升高(图2)，且具有良好的胶质瘤诊断预测效果：AUC＝0.8048(组织)和0.8160(血浆)(图3)，说明hsa_circ_0006420可作为胶质瘤诊断预测标志物。

实施例3

hsa_circ_0006420的荧光定量PCR检测用于胶质瘤的替莫唑胺治疗预测

对接受替莫唑胺治疗的胶质瘤患者进行入组，预先首先收集血浆样本(每例患者5ml血液，离心分层后留取血浆共1.5ml)于-80℃冰箱冻存。临床上随访跟踪患者对替莫唑胺治疗的响应效果，并根据治疗效果分为响应组(R，响应组，疾病稳定或部分稳定)和非响应组(NR，非响应组，疾病进展)。在进行年龄、性别等临床基线参数进行配对以排除其它临床参数影响后，对响应组(R)和非响应组(NR)每组取25例血浆进行荧光定量PCR检测，进行两组hsa_circ_0006420的表达差异比较和统计分析。

基于本实施例2所述环状RNA hsa_circ_0006420成熟序列设计设计荧光定量PCR的引物，并对胶质瘤患者接受替莫唑胺后的血浆样本进行检测，并分析hsa_circ_0006420在替莫唑胺响应与不响应之间的表达以及用于预测替莫唑胺治疗响应的预测效果，结果发现hsa_circ_0006420在替莫唑胺治疗不响应组表达显著升高，且预测效果较好：AUC＝0.7664(图4)。

实施例4

hsa_circ_0006420的荧光定量PCR检测用于胶质瘤患者预后预测

对胶质瘤患者首先收集血浆样本(每例患者5ml血液，离心分层后留取血浆共1.5ml)于-80℃冰箱冻存，基于本实施例2所述环状RNA hsa_circ_0006420成熟序列设计设计荧光定量PCR的引物，并对胶质瘤患者的血浆样本进行检测，临床上长期随访患者生存状态，基于hsa_circ_0006420的表达水平分析hsa_circ_0006420作为胶质瘤患者预后标志物的表现，通过Kaplan-Meier生存曲线和LogRank计算危险比(Hazard Ratio)，并进行统计分析，以评估hsa_circ_0006420用于胶质瘤预后预测的表现。

结果发现hsa_circ_0006420高表达的胶质瘤患者预后显著更差(图5)，logRankHR＝2.039，P＝0.0046。本发明的荧光定量PCR检测方法能够理想的检测环状RNA hsa_circ_0006420在生物体中的表达情况。

综上所述，本发明提供的这种hsa_circ_0006420环状RNA在胶质瘤患者的胶质瘤肿瘤组织以及患者血液样本中中表达量显著升高。发明人通过荧光定量PCR发现，hsa_circ_0006420在替莫唑胺治疗不响应组表达显著升高，且预测效果较好；同时还发现，荧光定量PCR检测方法能够理想的检测环状RNA hsa_circ_0006420在生物体中的表达情况，发现hsa_circ_0006420高表达的胶质瘤患者预后显著较差。这些结果说明hsa_circ_0006420可应用于胶质瘤诊断、替莫唑胺治疗后响应以及患者生存期预测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海纽仁生物医药科技有限公司

<120> hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 316

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cataagcagt actataatgg atgtagacag cacaatttcc agtgggcgtt caactccagc 60

aatgatgaat ggacaaggaa gcactacttc ttcaagcaaa aatattgcct ataattgttg 120

ttgggaccag tgccaggctt gcttcaactc tagcccagat ctggcagatc acatccgttc 180

catacatgta gatggtcagc gaggaggggt atttgtttgc ttatggaaag gttgtaaagt 240

atataacact ccatctacca gtcaaagttg gttacaaagg catatgctga cacacagtgg 300

agacaaacct ttcaag 316

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctggcagat cacatccgtt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaacgcccac tggaaattgt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.一种hsa_circ_0006420环状RNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的检测引物，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示，所述检测引物可用于制备胶质瘤诊断或预后评估试剂盒。

3.一种hsa_circ_0006420环状RNA基因作为分子标志物在制备用于诊断胶质瘤的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂在制备用于胶质瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂选自：对hsa_circ_0006420环状RNA基因具有检测特异性的探针、基因芯片或如SEQID NO.2～3所示的检测引物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR试剂。

7.一种用于胶质瘤诊断或胶质瘤预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的检测引物。

8.根据权利要求7所述的用于胶质瘤诊断或胶质瘤预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光定量PCR试剂。

9.根据权利要求8所述的用于胶质瘤诊断或胶质瘤预后评估的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂总量为20μL包括：1μL的cDNA、0.2μL、10μM的如SEQ ID NO.2所示的检测引物、0.2μL、10μM的如SEQ ID NO.3所示的检测引物、10μL的2X PCR Master Mix。

10.一种用于检测hsa_circ_0006420环状RNA基因的试剂在制备用于评估抗肿瘤药物对胶质瘤治疗效果的试剂盒中的应用；

优选地，所述抗肿瘤药物为替莫唑胺。