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CN114107141B - 高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法 - Google Patents

高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生产L‑脯氨酸的谷氨酸棒杆菌，以及利用该菌株生产L‑脯氨酸的方法。本发明构建的生产L‑脯氨酸的谷氨酸棒杆菌，其中脯氨酸脱氢酶/吡咯‑5‑羧酸脱氢酶PutA失活，谷氨酸激酶ProB、谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶ProA、吡咯‑5‑羧酸脱氢酶ProC、丙酮酸羧化酶Pyc、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶GapN、L‑脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE活性增强，L‑谷氨酸外排蛋白MscCG失活，得到的菌株的L‑脯氨酸产量、转化率和生产强度较出发菌株显著提升，可降低L‑脯氨酸的生产成本。

Description

高产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产L-脯氨酸的方法
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌，以及利用该菌株生产L-脯氨酸及其衍生物的方法。
背景技术
L-脯氨酸，是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。L-脯氨酸的生产方法主要有化学法和发酵法，由于化学提取法污染严重成本高，已逐渐失去市场，微生物发酵法由于具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业应用最广泛的方法。目前，常用的工业发酵菌株有棒杆菌和埃希氏菌，常用的埃希氏菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，常用的棒杆菌如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，短杆菌如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentus)，以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。而由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株用来生产氨基酸等产品。
在棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ-谷氨酰激酶(Glutamate-5-kinase，ProB)、谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase，ProA)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(Pyrroline-5-carboxylic acid reductase，ProC)催化后生产L-脯氨酸。现有技术主要通过对L-脯氨酸合成途径的关键酶ProA、ProB的遗传改造生产L-脯氨酸，如CN101084312A报道了谷氨酸棒杆菌来源的ProB蛋白的149位突变可以解除L-脯氨酸的反馈抑制，提高工程菌株L-脯氨酸的产量。然而，目前工程菌株的L-脯氨酸产量较低。因此，仍然需要构建更高效的工程菌株，以便提高L-脯氨酸的产量，降低生产成本。
发明内容
为克服现有技术中的问题，本发明通过对L-脯氨酸合成途径进行了一系列的遗传改造，包括引入过表达proBV150N突变体及proA和proC基因，敲除putA基因，过表达gdh基因、pyc基因、gapN基因、thrE基因、serE基因，并敲除mscCG基因后，获得的重组谷氨酸棒杆菌，其中过表达通过特定的强启动子实现，最终菌株的L-脯氨酸产量、转化率和生产强度较出发菌株显著提升。在此基础上完成本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种高产L-脯氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述菌株中存在如下特征：
a)脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA失活；且
b)谷氨酸激酶ProB活性增强；且
c)谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA活性增强；且
d)吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC活性增强；且
e)谷氨酸脱氢酶Gdh活性增强；且
f)丙酮酸羧化酶Pyc活性增强；且
g)甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN活性增强；且
h)L-脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE活性增强；且
i)L-谷氨酸外排蛋白MscCG失活
在一个具体的实施方式中，脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA、L-谷氨酸外排蛋白MscCG的失活是通过敲除部分或完全编码基因实现的；谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、谷氨酸脱氢酶Gdh、丙酮酸羧化酶Pyc、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN、L-脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE的活性增强是通过强启动子替换野生型启动子实现的。
在进一步优选的实施方式中，所述菌株中存在以下变化：
a)谷氨酸激酶ProB的150位缬氨酸被天冬酰胺取代；
b)谷氨酸激酶ProB编码基因、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA编码基因、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC编码基因位于一个操纵子上，且所述操纵子的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。
c)甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
d)谷氨酸脱氢酶Gdh编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中的任一个所示。
e)丙酮酸羧化酶Pyc编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8中的任一个所示。
f)L-脯氨酸外排蛋白ThrE和SerE编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在另一优选例中，所述谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株。
在本发明的第二方面，提供一种生产L-脯氨酸的方法，所述方法包括：培养前面所述的生产菌株，使之生产L-脯氨酸。进一步地，所述方法还包括从发酵液中分离L-脯氨酸的步骤。
本发明还提供了一种工程菌株在生产L-脯氨酸中的用途。
本发明的有益效果在于，经过对谷氨酸棒杆菌的一系列组合遗传改造，获得了可高产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌，其L-脯氨酸产量、转化率和生产强度较出发菌株显著提升。因此，在实践上可用于细菌发酵生产L-脯氨酸，便于推广应用，具备重要的工业应用价值。本发明为构建L-脯氨酸生产菌株提供了新的思路，为本领域技术构建更高产的L-脯氨酸生产菌株具有借鉴意义。
附图说明
图1PRO18和PRO19菌株的5L罐发酵产脯氨酸。其中，A为PRO18，B为PRO19。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本文所用的选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
本文所用的术语“野生型的”、“天然存在的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文所用的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
本文所用的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
本文所用的术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
本发明的术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
本发明所用的术语“失活”指的是通过修饰使得蛋白在微生物中的细胞内活性与自然状态的蛋白质活性相比有所下降。不仅包括由于蛋白质自身活性的减弱而带来的比原始功能更低的效果，也包括但不限于如下方法的修饰：删除部分或全部编码基因、基因阅读框移码突变、弱化转录或翻译强度、或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子。本发明的术语“降低或消失”、“减弱”、“失活”、可相互替换。
本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。
本文所用的术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
本文所用的术语“活性增强”指的是通过修饰使得蛋白在微生物中的细胞内的活性与自然状态的蛋白质活性相比有所提高。不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何抑制的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。
本文中的术语“生产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌”意指可以生产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌，包括野生型细菌菌株以及通过遗传改造获得的衍生细菌菌株。例如，适用于本发明的宿主细胞包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株。
本文中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本文的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、插入人工拷贝的proBV150NAC操纵子和阻断L-脯氨酸降解提高L-脯氨酸产量
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Gene ID:2830649)基础上解除γ-谷氨酰激酶ProB的L-脯氨酸反馈抑制的SLCgP54(CN112111469B，ProB引入V150N突变)菌株为出发菌株，本发明定义为PRO-1菌株。同时，发明人前期对谷氨酸棒杆菌内源丙酮酸羧化酶基因pyc启动子进行了突变，获得了一系列启动活性显著提高的启动子突变体，其中Ppyc-20(序列如SEQ IDNO：8所示)是活性最强的启动子，表达强度较野生型启动子提高16.1倍。
本发明进一步通过增强L-脯氨酸合成途径三个关键酶ProB、ProA和ProC的表达来增强L-脯氨酸合成，同时阻断L-脯氨酸降解途径，以实现提高L-脯氨酸产量。然而采用质粒方式增强表达容易造成代谢负担及易发生质粒丢失，基因组上的proB、proA和proC又分别处于不同的复杂操纵子中，难以直接改造其启动子等强化目标基因的表达。因此，本发明尝试采用强启动子将proB、proA和proC基因以操纵子形式直接插入降解基因处，即在基因组上用Ppyc-20启动子表达解除反馈抑制的谷氨酸激酶proBV150N(proB基因编号为Cgl2356)、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA(基因编号为Cgl2354)和吡咯-5-羧酸脱氢酶proC(基因编号为Cgl0410)的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA(基因编号为Cgl0099)基因上，获得L-脯氨酸生产菌PRO-2。
一、构建L-脯氨酸生产菌PRO-2
采用CRISPR/Cas9双质粒基因组编辑系统构建PRO-2菌株，具体构建如下：
1)构建提供重组模板的编辑质粒pEC-2。首先在pEC-XK99E质粒上构建包含proBV150N、proA和proC的质粒。以PRO-1菌株基因组为模板，分别以proB-1/2、proA-1/2和proC-1/2为引物扩增proBV150N、proA和proC的片段；同时以pEC-1/2为引物扩增pEC-XK99E的骨架。以上5个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-proBV150NproAproC质粒。为了进一步构建将人工拷贝的proBV150NAC操纵子整合至putA基因上的重组载体pEC-2，以PRO-1菌株基因组为模板，分别以putA-1/2和putA-3/4为引物扩增putA基因的上下游同源臂；以Ppyc-20-1/2为引物，以包含Ppyc-20启动子的基因组或质粒为模板，扩增Ppyc-20启动子片段；以pEC-proBV150NproAproC质粒为模板，以proBV150NAC-1/2为引物扩增proBV150NAC和rnnB终止子片段；同时以pEC-3/4为引物扩增pEC-XK99E的骨架。上述4个PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组载体pEC-2。
2)构建靶向切割的编辑质粒pCas9gRNA-8。将putA-F2/putA-R2进行变性退火，得到带有粘性末端的DNA双链产物，再与pCas9gRNA-ccdB质粒进行Golden gate克隆(
Figure BDA0003219203460000082
Golden Gate组装试剂盒，#E1601)，获得pCas9gRNA-8质粒，该质粒表达Cas9蛋白和靶向putA基因的sgRNA。
3)制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，同时电转化1-2μg pCas9gRNA-8和1-2μg pEC-2质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加15μg/mL卡那霉素、5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。以putA-C1/C2为引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行pCas9gRNA-8和pEC-2质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆分别对点3种平板(TSB+5μg/mL氯霉素、TSB+25μg/mL卡那霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素和卡那霉素抗性平板不长，而TSB平板可以长的菌即为丢失两个质粒后的突变体，即PRO-2菌株。TSB培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；余量为水；pH7.2。固体培养基补充15g/L琼脂粉。以上所用引物序列如表1所示。
表1
Figure BDA0003219203460000081
Figure BDA0003219203460000091
二、PRO-2菌株的L-脯氨酸产量评价
采用24孔板评价PRO-2菌株的L-脯氨酸产量：首先将PRO-2菌株和PRO-1对照菌株分别接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.1，30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测OD600(酶标仪检测)和L-脯氨酸产量。
发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L，余量为水；pH7.2。
L-脯氨酸的检测方法：水配制的1g/L的L-脯氨酸标准品(Sigma-Aldrich，P0380)或发酵液上清，用3％(W/V)磺基水杨酸稀释到合适浓度；取1mL稀释液，加入1mL酸合茚三酮(1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL 6M H3PO4中，70℃加热溶解)和1mL冰醋酸，100℃沸水浴反应45min；冷却后测定OD520。采用0-100mg/L浓度的L-脯氨酸标准品绘制标准曲线(脯氨酸浓度(mg/L)＝(OD520-0.0416)/0.0324)，根据标准曲线及稀释倍数计算样品的L-脯氨酸浓度。
结果如表2所示，插入人工拷贝的proBV150NAC操纵子和阻断L-脯氨酸降解可以导致L-脯氨酸产量提高76％。
表2PRO-2的L-脯氨酸产量评价
菌株 OD<sub>600</sub> L-脯氨酸产量(g/L)
PRO-1 14.6±1.5 3.3±0.4
PRO-2 9.8±0.8 5.8±0.5
实施例2、增强谷氨酸脱氢酶gdh基因的表达提高L-脯氨酸产量
L-谷氨酸是L-脯氨酸合成的前体，为了谷氨酸脱氢酶的活性进而增强谷氨酸前体供应来提高L-脯氨酸产量，本发明采用基因自身的增强活性启动子突变直接在染色体原位改造来实现目标基因的表达增强，即表达强度提高的启动子突变体增强谷氨酸脱氢酶gdh(基因编号为Cgl2079)基因的表达来实现。发明人前期对谷氨酸棒杆菌内源谷氨酸脱氢酶gdh启动子进行了突变，获得了一系列启动活性显著提高的启动子突变体，其中Pgdh-16、Pgdh-23、Pgdh-26、Pgdh-29启动子突变体(序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4所示)，表达强度分别较野生型启动子提高5.3、9.2、13.3、46.4倍。
一、构建增强谷氨酸脱氢酶gdh基因表达的菌株
采用CRISPR/Cas9单质粒基因组编辑系统构建菌株，具体构建如下：1)构建编辑质粒。以gdh-UF和gdh-DR为引物，以包含Pgdh-16、Pgdh-23、Pgdh-26、Pgdh-29启动子突变(如CN113201535A)及突变区侧翼序列的质粒为模板，分别扩增Pgdh-16、Pgdh-23、Pgdh-26、Pgdh-29启动子(序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示)突变区及上下游各约500bp的同源臂；分别以Cas-1和Cas-2、Cas-3和CasgRNA-gdh2、gRNA-gdh2和gRNA-2为引物，以pCas9gRNA-ccdB为模板，扩增2个质粒骨架片段及1个gRNA片段。上述4个启动子突变区的同源臂分别与3个质粒骨架片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组质粒pCas9gRNA-11、pCas9gRNA-12、pCas9gRNA-13、pCas9gRNA-14。
2)PRO-2菌株的gdh启动子区提前将序列ACACTGCCATAATTGAACGT GAG突变为CCACTCGGATAATTGAACGTGAG，为在启动子上引入目标突变提供可用的PAM位点。将提前引入PAM的PRO-2菌株制备感受态细胞，分别电转化1-2μg pCas9gRNA-11、pCas9gRNA-12、pCas9gRNA-13、pCas9gRNA-14质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。以gdh-C1/C2为引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆分别对点2种平板(TSB+5μg/mL氯霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素抗性平板不长，而TSB平板可以生长的菌即为丢失质粒后的突变体，即PRO-4、PRO-5、PRO-6、PRO-7菌株。
表3
Figure BDA0003219203460000111
二、增强谷氨酸脱氢酶gdh基因表达菌株的产量评价
实验方法同实施例1，结果如表3所示，PRO-4、PRO-5、PRO-6、PRO-7菌株的产量相对于PRO-2分别提高31％、31％、34％和22％，表明gdh的启动子突变增强其表达可进一步提高L-脯氨酸产量。
表3增强谷氨酸脱氢酶gdh基因表达菌株的L-脯氨酸产量
菌株 OD<sub>600</sub> L-脯氨酸产量(g/L)
PRO-2 9.8±0.8 5.8±0.5
PRO-4 11.7±0.3 7.6±0.4
PRO-5 10.7±0.4 7.6±0.6
PRO-6 11.0±0.2 7.8±0.2
PRO-7 11.2±0.3 7.1±0.1
实施例3、增强丙酮酸羧化酶pyc基因的表达提高L-脯氨酸产量
为了增强丙酮酸羧化酶的活性进而强化草酰乙酸供应来提高L-脯氨酸产量，本发明采用基因自身的增强活性启动子突变直接在染色体原位改造来实现目标基因的表达增强，即提高表达强度的启动子突变体增强丙酮酸羧化酶pyc(Cgl0689)基因的表达来实现。发明人前期对谷氨酸棒杆菌内源丙酮酸羧化酶pyc启动子进行了突变，获得了一系列启动活性显著提高的启动子突变体，其中Ppyc-13、Ppyc-16、Ppyc-20启动子(序列如SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8所示)，表达强度分别较野生型启动子提高8.9、12.1、16.1倍。
一、构建增强丙酮酸羧化酶pyc基因表达的菌株
采用CRISPR/Cas9单质粒基因组编辑系统构建菌株，具体构建如下：1)构建编辑质粒。分别以pyc-UF/UR13和pyc-DF13/DR、pyc-UF/UR16和pyc-DF16/DR、pyc-UF/UR20和pyc-DF20/DR为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别扩增Ppyc-13、Ppyc-16、Ppyc-20启动子(序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示)突变区及上下游各约500bp的同源臂；分别以Cas-1和Cas-2、Cas-3和CasgRNA-pyc、gRNA-pyc和gRNA-2为引物，以pCas9gRNA-ccdB为模板，扩增2个质粒骨架片段及1个gRNA片段。上述3个启动子突变区的同源臂片段，分别与质粒骨架片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组质粒pCas9gRNA-17、pCas9gRNA-18、pCas9gRNA-19。
2)将PRO-6菌株制备感受态细胞，分别电转化1-2μg pCas9gRNA-17、pCas9gRNA-18、pCas9gRNA-19质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。以pyc-C1/C2为引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆菌分别对点2种平板(TSB+5μg/mL氯霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素抗性平板不长，而TSB平板可以生长的菌即为丢失质粒后的突变体，即PRO-10、PRO-11、PRO-12菌株。以上所用引物序列如表6所示。
表6
Figure BDA0003219203460000131
二、增强丙酮酸羧化酶pyc基因表达菌株的产量评价
实验方法同实施例1，结果如表5所示，PRO-10、PRO-11、PRO-12菌株的产量相对于PRO-6分别提高3％、10％和8％，表明pyc的启动子突变增强其表达可以进一步提高L-脯氨酸产量。
表5增强丙酮酸羧化酶pyc基因表达菌株的L-脯氨酸产量
菌株 OD<sub>600</sub> L-脯氨酸产量(g/L)
PRO-6 11.2±0.5 7.2±0.2
PRO-10 11.9±0.3 7.4±0.4
PRO-11 12.8±0.5 7.9±0.3
PRO-12 12.3±0.4 7.8±0.2
实施例4、表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因提高L-脯氨酸产量
为了通过强化NADPH的供应来提高L-脯氨酸产量，本发明采用强启动子在基因组水平过表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN来强化NADPH的合成，即在基因组Cgl2334基因下游插入采用谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体表达变异链球菌(Streptococcus mutans)来源的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN(NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的表达框。发明人前期对谷氨酸棒杆菌内源丙酮酸羧化酶pyc启动子进行了突变，获得了一系列启动活性显著提高的启动子突变体，其中Ppyc-13启动子(序列如SEQ ID NO：6所示)表达强度较野生型启动子提高8.9倍。
一、构建表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN的菌株
采用CRISPR/Cas9双质粒基因组编辑系统构建菌株，具体构建如下：
1)构建提供重组模板的编辑质粒。分别以gapN-UF/gapN-UR、gapN-DF/gapN-DR为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别扩增插入位置上下游的同源臂；以Ppyc-1/2为引物，以包含Ppyc-1启动子的质粒为模板，扩增Ppyc-1启动子片段(序列如SEQ IDNO：5所示)；以rrnB-1/2为引物，以pEC-XK99E质粒为模板，扩增rnnB终止子片段；同时以pEC-1/6为引物扩增pEC-XK99E的骨架。上述5个PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组载体pEC-3。
2)构建靶向切割的编辑质粒pCas9gRNA-20。将gapN-F/gapN-R进行变性退火，得到带有粘性末端的DNA双链产物，再与pCas9gRNA-ccdB质粒进行Golden gate克隆(
Figure BDA0003219203460000141
Golden Gate组装试剂盒，#E1601)，获得pCas9gRNA-20质粒，该质粒表达Cas9蛋白和靶向插入位置的sgRNA。
3)将PRO-11制备感受态细胞，分别同时电转化1-2μg pCas9gRNA-8和1-2μg pEC-3质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加15μg/mL卡那霉素、5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。以gapN-C1/C2为引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行2个质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆分别对点3种平板(TSB+5μg/mL氯霉素、TSB+25μg/mL卡那霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素和卡那霉素抗性平板不长，而TSB平板可以长的菌即为丢失2个质粒后的突变体，即PRO-13菌株。以上所用引物序列如表6所示。
表6
Figure BDA0003219203460000151
二、表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN菌株的产量评价
实验方法同实施例1，结果如表7所示，PRO-13菌株的产量相对于PRO-11提高29％，表明表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN可以进一步提高L-脯氨酸产量。
表7表达NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN菌株的L-脯氨酸产量
菌株 OD<sub>600</sub> L-脯氨酸产量(g/L)
PRO-11 12.7±0.6 7.9±0.1
PRO-13 13.6±0.1 9.0±0.3
实施例5、增强L-脯氨酸外排蛋白的表达提高L-脯氨酸产量
发明人前期将谷氨酸棒杆菌ATCC13869全基因组规模的蛋白质序列在TransportDB数据库进行膜转运蛋白预测，获得全基因组规模的397个膜转运蛋白；再基于CRISPRi系统构建397个膜转运蛋白基因的抑制质粒，将抑制库质粒和对照质粒分别导入一个L-脯氨酸生产菌SZCgP1(谷氨酸棒杆菌ATCC13869引入proB基因的G149D突变，密码子从GGT突变为GAT)，获得抑制库菌株；最后通过96孔板发酵评价所有菌株的L-脯氨酸比产率，抑制后L-脯氨酸比产率下降的基因即为可能的L-脯氨酸外排蛋白基因。基于以上筛选，发明人筛选到thrE(Cgl2622，已有文献证实为L-苏氨酸、L-丝氨酸外排蛋白)基因抑制后，L-脯氨酸比产率下降明显，结合其他功能验证鉴定可以外排L-脯氨酸。此外，现有文献报道谷氨酸棒杆菌氨基酸外排蛋白SerE也可以外排L-苏氨酸、L-丝氨酸(Zhang X,Gao Y，Chen Z，et al.High-yield production of L-serine through a novel identified exportercombined with synthetic pathway in Corynebacterium glutamicum.Microb CellFact.2020；19(1):115.)，发明人经研究分析推测该外排蛋白也可以外排L-脯氨酸。通过在基因组Cgl1180和Cgl1181基因间隔区插入组成型强表达的Ptrc启动子(序列如SEQ ID NO：9)表达thrE(基因编号为Cgl2622)的表达框，在基因组Cgl2830和Cgl2831基因间隔区插入组成型Ptrc启动子表达serE(基因编号为Cgl0605)的表达框，以期提高L-脯氨酸的产率。
一、构建增强L-脯氨酸外排蛋白表达的菌株
采用CRISPR/Cas9双质粒基因组编辑系统构建菌株，具体构建如下：
1)构建提供重组模板的编辑质粒。首先构建包含Ptrc启动子表达谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸外排蛋白基因thrE和serE的表达框质粒。在pEC-XK99E质粒的衍生质粒pEC-ccdB上过表达thrE和serE，采用Bsa I酶切pEC-ccdB质粒，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以thrE-1/thrE-2和serE-1/serE-2扩增thrE和serE基因片段，以上2个基因片段分别与骨架通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-thrE和pEC-serE质粒。分别以thrE-UF/thrE-UR和thrE-DF/thrE-DR、serE-UF/serE-UR和serE-DF/serE-DR为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别扩增thrE和serE插入位置上下游的同源臂；以TS-F/TS-R为引物，分别以pEC-thrE和pEC-serE质粒为模板，分别扩增组成型Ptrc启动子表达谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸外排蛋白基因thrE和serE的表达框片段；同时以pEC-1/6引物扩增pEC-XK99E的骨架。上述对应的4个PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组载体pEC-9和pEC-10。
2)构建靶向切割的编辑质粒pCas9gRNA-24和pCas9gRNA-27。将thrE-F/thrE-R、serE-F/serE-R进行变性退火，分别得到带有粘性末端的DNA双链产物，再与pCas9gRNA-ccdB质粒进行Golden gate克隆(
Figure BDA0003219203460000172
Golden Gate组装试剂盒，#E1601)，获得pCas9gRNA-24和pCas9gRNA-27质粒，该质粒表达Cas9蛋白和靶向插入位置的sgRNA。
3)将PRO-13菌株制备感受态细胞，分别同时电转化1-2μg pCas9gRNA-24和1-2μgpEC-9、1-2μg pCas9gRNA-27和1-2μg pEC-10质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加15μg/mL卡那霉素、5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。分别采用thrE-C1/C2和serE-C1/C2引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行2个质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆菌分别对点3种平板(TSB+5μg/mL氯霉素、TSB+25μg/mL卡那霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素和卡那霉素抗性平板不长，而TSB平板可以长的菌即为丢失2个质粒后的突变体，即PRO-18和PRO-20菌株。以上所用引物序列如表8所示。
表8
Figure BDA0003219203460000171
Figure BDA0003219203460000181
二、增强L-脯氨酸外排蛋白表达菌株的产量评价
实验方法同实施例1，结果如表9所示，PRO-18和PRO-20菌株的产量相对于PRO-13分别提高78％和24％，表明增强L-脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE的表达均可以提高L-脯氨酸产量。此外，PRO-18和PRO-20菌株的产量相对于出发菌株PRO-1分别提高了376％和230％，效果十分显著。
表9增强L-脯氨酸外排蛋白表达菌株的产量
Figure BDA0003219203460000182
Figure BDA0003219203460000191
实施例6、敲除L-谷氨酸外排蛋白基因提高L-脯氨酸产量
L-谷氨酸是L-脯氨酸合成的前体，本发明通过敲除L-谷氨酸的外排蛋白基因mscCG(基因编号为Cgl1270)以减少L-谷氨酸的外排，进而提高L-脯氨酸产量。
一、构建敲除L-谷氨酸外排蛋白基因的菌株
采用CRISPR/Cas9单质粒基因组编辑系统构建菌株，具体构建如下：
1)构建编辑质粒。分别以mscCG-UF/mscCG-UR和mscCG-DF/mscCG-DR为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别扩增mscCG敲除的上下游的同源臂；以pCas9gRNA-ccdB质粒为模板，分别以cas9-1/cas9-2、cas9-3/CasgRNA-mscCG、gRNA-mscCG/gRNA-2为引物，扩增3个质粒骨架片段，同时引入20bp的gRNA靶DNA结合区；以上5个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pCas9gRNA-25质粒。
2)将PRO-18菌株制备感受态细胞，电转化1-2μg pCas9gRNA-25质粒，电击条件为2500V和5ms，立即加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃热击6min，30℃孵育3h，涂布添加15μg/mL卡那霉素、5μg/mL氯霉素和0.05mM IPTG的TSB平板，30℃培养至长出单克隆。分别采用thrE-C1/C2和serE-C1/C2引物扩增验证突变体并结合测序结果，获得正确的突变体。对正确的突变体克隆，进行2个质粒的丢失，具体如下：在无抗性的TSB液体培养基30℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆分别对点3种平板(TSB+5μg/mL氯霉素、TSB+25μg/mL卡那霉素和TSB)，30℃培养24h，所获得的氯霉素和卡那霉素抗性平板不长，而TSB平板可以长的菌即为丢失2个质粒后的突变体，即PRO-19菌株。以上所用引物序列如表8所示。
表8
Figure BDA0003219203460000192
Figure BDA0003219203460000201
二、敲除L-谷氨酸外排蛋白菌株的产量评价
采用5L发酵罐评价PRO-18和PRO-19菌株的L-脯氨酸生产性能。种子培养基为TSB。发酵培养基成份为：初始葡萄糖，50g/L；玉米浆干粉，10g/L；大豆蛋白胨，10g/L；牛骨蛋白胨，10g/L；硫酸铵，30g/L；KH2PO4，6g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；MnSO4·H2O，0.03g/L；生物素，45μg/L；维生素B2，45μg/L；消泡剂，0.5g/L；余量为水。150mL的TSB培养基，30℃过夜培养的种子液，接入2L(种子培养液计入发酵培养基的体积)的发酵培养基，控制温度32℃，pH7.0(氨水调节)，溶氧30％，葡萄糖浓度降至20g/L时流加葡萄糖控制葡萄糖浓度5-20g/L。OD600采用分光光度计检测，L-脯氨酸的检测参照实施例1，葡萄糖和L-谷氨酸采用SBA生物传感仪检测。结果如图1所示，PRO-19菌株发酵49h的L-脯氨酸产量达142g/L，从葡萄糖到L-脯氨酸的转化率为0.31g/g，L-脯氨酸的生产强度为2.9g/L/h，副产物L-谷氨酸产量只有12g/L；PRO-18菌株发酵49h的L-脯氨酸产量达98g/L，从葡萄糖到L-脯氨酸的转化率为0.23g/g，L-脯氨酸的生产强度为2.0g/L/h，副产物L-谷氨酸产量达77g/L。以上结果表明敲除L-谷氨酸外排蛋白后菌株的产量、转化率和生产强度相对于PRO-18分别提高44.9％、34.8％、45.0％。
目前，文献报道L-脯氨酸发酵生产的最高水平为120g/L，从葡萄糖到L-脯氨酸的转化率为0.2g/g，L-脯氨酸的生产强度为1.58g/L/h(J.Zhang，F.Qian，F.Dong，Q.Wang，J.Yang,Y.Jiang,S.Yang,De novo engineering of Corynebacterium glutamicum forL-proline production.ACS Synth.Biol.9,1897–1906(2020).)。本发明构建谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸生产菌的产量、转化率和生产强度均显著高于文献报道水平，表明组合以上增强合成途径关键酶、前体供应关键酶、NADPH合成关键酶和L-脯氨酸外排蛋白活性的改造可以大幅提高L-脯氨酸的综合生产水平。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 高产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产L-脯氨酸的方法
<130>
<160> 108
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 799
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgtcagtatgcctttctgttatggcgttattgtggcacatcgcggtgggaaacaagccaggtggcctgtgtaaataaggctccaaatgggaatccatgaggagactctttagttaaaatctctagccttagtgtttcaagtctaacggtcgcccaattgaggagtgggtccatggcatatacggctatcgaaaaggtcggaaagtgcccgaatgtgcgttgttctagctagcctcgggagctctaggagatcgtgaaaaacgggtcaaatttctccgatgtagcgcctataaaagtcgtaccaattccatttgagggcgctcaattgtggccaggttatataaccagtcagtcaactggtctcattcgctggtcggatgaatttaattaaagaagagacttcatgcagttaccgcgcgttttggcgatacaaaattgataaacctaaagaaattttcaaacaattttaattctttgttgtgatatctgtgcgacactcgtataattgaacgtgagcatttaccagcctaaatgcccgcagtgagttaagtctcaaagcaagaagttgctctttagggcatccgtagtttaaaactattaaccgttaggtatgacaagccggttgatgtgaacgcagtttttaaaagtttcaggatcagatttttcacaggcattttgctccagcaaacgcctaggatgtacatggtgccctcaatgggaaccaccaacatcactaaatggcccaggtacacactttaaaatcgtgcgcgcatgcagccgagatgggaacgaggaaatc 799
<210> 2
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<400> 2
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<212> DNA
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<210> 4
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<210> 6
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cttttactttcaccagcgtttctg 24
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<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 43
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cctgatgcggtattttctccgcatctaaagcgttcctgaccaag 44
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 108
ttctactcgtgcagaggtgtggac 24

Claims (6)

1.一种产L-脯氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中包括以下特征：
a)脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA失活；且
b)谷氨酸激酶ProB活性增强；且
c)谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA活性增强；且
d)吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC活性增强；且
e)谷氨酸脱氢酶Gdh活性增强；且
f)丙酮酸羧化酶Pyc活性增强；且
g)甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN活性增强；且
h)L-脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE活性增强；且
i)L-谷氨酸外排蛋白MscCG失活；
所述脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA、L-谷氨酸外排蛋白MscCG的失活是通过敲除部分或完全编码基因实现的；
所述谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、谷氨酸脱氢酶Gdh、丙酮酸羧化酶Pyc、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN、L-脯氨酸外排蛋白ThrE或SerE的活性增强是通过强启动子替换野生型启动子实现的，且所述谷氨酸激酶ProB的150位缬氨酸被天冬酰胺取代。
2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，
a)所述谷氨酸激酶ProB编码基因、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA编码基因、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC编码基因位于一个操纵子上，且所述操纵子的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示；
b)所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
c)所述谷氨酸脱氢酶Gdh编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中的任一个所示；
d)所述丙酮酸羧化酶Pyc编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8中的任一个所示；
e)所述L-脯氨酸外排蛋白ThrE和SerE编码基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
3.如权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌的出发菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067或这些菌株的衍生菌株。
4.一种生产L-脯氨酸的方法，所述方法包括：培养权利要求1-3任一项所述的谷氨酸棒杆菌，使之生产L-脯氨酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括从培养产生的发酵液中分离L-脯氨酸的步骤。
6.如权利要求1-3任一项所述的谷氨酸棒杆菌在生产L-脯氨酸中的用途。
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