[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN114096280A - 用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体 - Google Patents

用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体 Download PDF

Info

Publication number
CN114096280A
CN114096280A CN202080049384.XA CN202080049384A CN114096280A CN 114096280 A CN114096280 A CN 114096280A CN 202080049384 A CN202080049384 A CN 202080049384A CN 114096280 A CN114096280 A CN 114096280A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
therapeutic construct
therapeutic
cell
inhibitor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080049384.XA
Other languages
English (en)
Inventor
W·扬塔塞
M·雷达
W·恩加麦克赫德达库
N·H·黄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oregon Health Science University
PDX Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Oregon Health Science University
PDX Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oregon Health Science University, PDX Pharmaceuticals Inc filed Critical Oregon Health Science University
Publication of CN114096280A publication Critical patent/CN114096280A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A61K47/6823—Double chain ricin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/143—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文公开了包含递送颗粒、至少一种有丝分裂激酶抑制剂以及至少一种免疫检查点抑制剂的治疗构建体。还公开了包含有丝分裂激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂以及化学连接子的治疗构建体。这些治疗构建体通过治疗效果和免疫效果两者使癌症死亡，并且在正反馈循环中促进将更多治疗药物靶向递送到存活的癌细胞。所述治疗构建体增强了游离药物的治疗指数并且可以在瘤内或全身使用。此策略可以治疗广泛的癌症类型，并且特别适用于没有明显受体的癌症以靶向癌症递送在其它方面有毒的治疗药物。

Description

用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治 疗构建体
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是根据国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权R44CA217534在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开涉及用于免疫疗法治疗的组合物和方法。基于有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的共同递送描述了治疗构建体。与用于广泛癌症治疗的游离药物对应物相比，这些治疗构建体具有更高的治疗指数和/或更好地触发适应性抗癌免疫。
背景技术
免疫检查点抑制剂，如针对PD-L1、PD-1以及CTLA-4的抗体，已经在临床上示出了有前途的结果，从而获得了FDA对治疗许多癌症类型的快速批准通道。然而，虽然对免疫检查点阻断做出应答的患者可能示出了强健且持久的应答，但仅总患者中的少数患者做出应答，并且即使对于具有高PD-L1表达的患者，应答率仍然低于50％(雷克(Reck)等人,新英格兰医学杂志(NEJM)375(19):1823-1833,2016)。此外，许多初始应答者将产生耐药性并最终复发(金肯斯(Jenkins)等人,英国癌症杂志(Brit J Canc.)118:9,2018)。
虽然在一般情况下免疫检查点阻断与化疗相比毒性较不严重且较不明显，但由免疫疗法引起的自身免疫性病症令人担忧(托库特(Tocut)等人,自身免疫评论(Autoimmunity Rev)17(6):610-616,2018)。这些抗体的全身分布可以引起异常且不受控制的免疫应答，从而导致免疫相关的副作用(irAE)(雷诺兹(Reynolds)等人,临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)36(16_增刊):3096,2018)。虽然通常是可控的，但由于irAE导致的治疗中断时有发生，并且在一些情况下，irAE可能是致命的。
为了改善癌症治疗结果，研究调查了化疗与免疫检查点抑制剂的组合使用。例如，一项临床试验研究了白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel，abraxane)与PD-L1抗体(阿特珠单抗(atezolizumab))的组合作为转移性TNBC的游离药剂(施密德(Schmid)等人,新英格兰医学杂志379(22):2108-2021,2018)。对于临床前研究，已经报道了用于共同递送多西他赛(docetaxel)和PD-L1抗体(徐(Xu)等人,国际纳米医学杂志(Inter J Nanomed.)14:17-32,2018)或多柔比星(doxorubicin)和PD-L1抗体(艾玛米(Emami)等人,分子制药学(MolPharm)16(3):1184-1199,2019)的纳米颗粒。然而，有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的共同递送从未被报道为游离剂或在颗粒上或与化学连接子共同递送。
有丝分裂激酶抑制剂具有通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡来杀死癌细胞的单药剂效力。与杀死任何快速分裂细胞的化学治疗药物不同，有丝分裂激酶抑制剂被认为是靶向疗法，并且应该比化学治疗药物对癌细胞更具特异性。
然而，目前有丝分裂激酶抑制剂(如PLK1小分子抑制剂)的主要限制包含实体瘤生物利用度低和对其它快速分裂细胞，特别是对造血前体细胞的毒副作用(杰特森(Gjertsen)和斯科夫斯基(Schoffski),白血病(Leukemia)29(1):11-19,2015)。PLK1抑制剂需要具有长的半衰期，以获得足够的肿瘤生物利用度。这导致血液和骨髓中的造血前体细胞的暴露时间更长，从而导致中性粒细胞减少症(低中性粒细胞)和血小板减少症(低血小板)的剂量限制性毒性(德布劳德(de Braud)等人,肿瘤学年鉴(Annals of Oncol.)/欧洲肿瘤协会(EMSO)26(11):2341-2346,2015；斯科夫斯基等人,欧洲癌症杂志(Euro JCanc.)48(2):179-186,2012；林(Lin)等人,英国癌症杂志110(10):2434-2440,2014；弗洛斯特(Frost)等人,当前肿瘤学(Curr Oncol.)19(1):e28-35,2012)。这突出了将有丝分裂激酶抑制剂靶向递送到癌细胞而不是非靶细胞的需要。
此外，PLK1抑制剂还可以抑制其它PLK家族成员PLK2和PLK3，这可能进一步导致毒副作用(莱布(Raab)等人,自然通讯(Nat.Comm.)2:395,2011)。在所有PLK1抑制剂中，沃拉色替(Volasertib)(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))已经示出了最有前途的正在进行的III期临床试验，但仅适用于急性髓性白血病(血癌)(杰特森和斯科夫斯基,白血病29(1):11-19,2015)，但由于剂量不足(例如，受毒性限制)，III期试验的结果并不乐观。抑制PLK1用于癌症疗法仍然是一项临床挑战。
此外，先前的研究阐明了PLK1与调节癌症进展和免疫逃避的许多基因之间的广泛相互作用(兹图尼(Zitouni)等人,分子细胞生物学自然综述(Nat Rev Mol Cell Biol)15(7):433-452,2014；张(Zhang)等人,BMC癌症(BMC Cancer)17(1):861,2017；刘(Liu)等人,转化肿瘤学(Translational Oncol.)10(1):22-23,2016；傅(Fu)和温(Wen),癌症(Cancers)9(10),2017)，这强调了单独使用PLK1抑制剂的单一疗法可能无效。如在各种PLK1抑制剂的临床试验中示出的，单独的有丝分裂激酶抑制剂也具有相当大的毒性。
发明内容
本文描述了基于有丝分裂激酶抑制剂(或有丝分裂抑制剂)和检查点抑制剂的共同递送开发新型治疗构建体。这些治疗构建体比游离药物对应物具有更大的治疗指数，并且可用于广泛的癌症治疗。
用于改善应答、提高治疗功效和管理免疫检查点阻断和有丝分裂激酶抑制剂的毒性的策略对于治疗癌症而言是非常必要的。免疫检查点抑制剂和有丝分裂激酶抑制剂的单一药剂(即治疗构建体)递送将共同定位治疗效果以实现协同作用，同时降低药物的全身毒性。
有丝分裂抑制剂和有丝分裂激酶抑制剂具有通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡来杀死癌细胞的单一药剂效力。
癌细胞通过有丝分裂抑制避免死亡的机制是上调免疫检查点以避免免疫介导的细胞杀伤并因此保持免疫不可见(图1A)。因此，通过将有丝分裂抑制剂与免疫检查点抑制剂组合，在有丝分裂抑制剂中存活的细胞可能被免疫细胞(即细胞毒性CD8+T细胞)攻击以产生免疫应答(图1B)。
本文描述了用于共同递送至少一种有丝分裂抑制剂或有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂的工程化颗粒(治疗构建体)。本文提供的数据说明了在治疗构建体上递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂如何能够提高疗效并降低毒性(通过在说明性肺转移模型中将剂量减少5倍)。
工程化颗粒上的免疫检查点抑制剂不仅使T细胞能够攻击癌细胞，而且还可以充当存活癌细胞的归巢靶剂。
数据还表明，所提供的治疗构建体不仅可以杀死癌细胞，而且还可以触发减缓远隔肿瘤(例如，转移)发展的适应性抗肿瘤应答。
有丝分裂激酶抑制剂可以属于小分子抑制剂、基于抗体的药物或寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸)类。
治疗构建体可以局部或瘤内施用于例如容易接近的肿瘤，如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌和淋巴瘤；或全身性地用于其它癌症，如肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肾癌、血癌、胃癌、结肠癌、罕见癌症和转移癌。
工程化治疗构建体的直径可以在纳米或微米范围内，并且可以由能够装载治疗剂/佐剂货物并将其递送到靶位点(癌细胞、免疫细胞、细胞外基质等)并允许其具有所期望的功能的任何材料(例如，脂质、有机材料、无机材料、聚合物以及混合物或其组合)制成。
佐剂可以任选地在相同的治疗构建体上共同递送以加强抗肿瘤T细胞库，以便增强治疗效果。有丝分裂激酶抑制剂将杀死癌细胞，从而导致抗原释放，佐剂将模拟危险信号以激活模式识别受体，以便刺激免疫细胞，并且免疫检查点抑制剂将移除肿瘤细胞对免疫细胞施加的刹车。以此方式，单一药剂治疗可以克服癌细胞逃避免疫应答的各种策略，以提供持续的癌细胞杀伤效果。
任选地，示例治疗构建体还含有一或多种归巢剂(抗体、适体、配体、肽等)，所述一或多种归巢剂使所述示例治疗构建体能够优先地递送到靶癌细胞或各种免疫细胞类型(例如，DC、巨噬细胞、单核细胞、T细胞)和/或被所述靶癌细胞和/或各种免疫细胞类型吸收。
本文所提供的治疗构建体可以单独使用或与标准治疗组合使用，所述标准治疗包含但不限于化疗、外科手术、靶向疗法和放射疗法。
可替代地，其它靶向治疗剂(例如，靶向其它癌蛋白的小分子抑制剂或抗体，或医用放射性同位素)可以作为治疗活性剂直接装载在所述治疗构建体上/中。
对于局部递送，所述治疗构建体可以任选地被调配成局部或微针调配物。
本文提供了治疗构建体，其包含：递送系统；至少一种有丝分裂抑制剂或有丝分裂激酶抑制剂，所述至少一种有丝分裂抑制剂或有丝分裂激酶抑制剂与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内；以及至少一种免疫检查点抑制剂，所述至少一种免疫检查点抑制剂与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内。在所述治疗构建体的此实施例的实例中，所述递送系统包含脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机或有机纳米颗粒或微粒或其混合物。在所提供的治疗构建体的特定实施例中，采用流体动力学尺寸为5nm到999nm(例如，约80nm到约200nm、约90nm到约130nm；或小于150nm)的纳米颗粒，如在水溶液(如PBS、Tris缓冲液或水)中测量的。在又其它实例中，所述治疗构建体是流体动力学尺寸为1微米到1000微米的微粒。在一些实施例中，所述递送系统的尺寸为约5nm到约200nm、约5nm到约90nm、约5nm到约20nm、约30nm到约100nm、约30nm到约80nm、约30nm到约60nm、约40nm到约80nm、约70nm到约90nm、或约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm或约100nm。
在一些实施例中，所述治疗构建体进一步包含佐剂。在一些实施例中，所述治疗构建体不包含肿瘤特异性抗原。
本文还提供了包含免疫检查点抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂以及连接所述免疫检查点抑制剂和所述有丝分裂激酶抑制剂的化学连接子的治疗构建体。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。在一些实施例中，所述有丝分裂激酶抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。在一些实施例中，所述治疗构建体是抗体-寡核苷酸缀合物、小分子-寡核苷酸缀合物或小分子-小分子缀合物。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是抗体(例如，针对PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4的抗体)。在一些实施例中，所述有丝分裂激酶抑制剂是小分子抑制剂，如PLK1(例如，GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替)、Chk1激酶(例如，LY2603618、普瑞色替(prexasertib)或AZD7762)、RHA解旋酶A(例如，YK-4-279)、细胞周期蛋白依赖性激酶1/2(例如，AZ703)、极光激酶A(例如，阿利色替(alisertib))的抑制剂。在一些实施例中，所述有丝分裂激酶抑制剂是寡核苷酸，如针对有丝分裂激酶基因的siRNA或反义寡核苷酸(例如，针对PLK1的siRNA，如siPLK1)。
还提供了包含至少一种如本文所述的治疗构建体的组合物。任选地，此类组合物进一步包括至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
另一个实施例是一种治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的受试者(例如，人类受试者)施用有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物以减轻所述癌症的一或多种症状。
还提供了治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所提供的治疗药物接触。
还提供了治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物接触。
还提供了治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使细胞离体与治疗有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物接触。
在任何基于细胞的实施例中，可设想到，在一些情况下，所述细胞是癌细胞。在其它情况下，所述细胞不是癌细胞。在各个实施例中，所述细胞是免疫细胞。任选地，在任何基于细胞的实施例中，所述细胞可以来自人类受试者，或者来自另一哺乳动物受试者。
又另一个实施例是一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含至少一种所提供的治疗构建体。
还提供了增强抗癌疗法在有需要的受试者(如人类受试者)中的效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物；以及至少一种抗癌剂(例如，化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂)。任选地，所述治疗构建体或组合物以及所述抗癌疗法依次或同时施用。
又另一个实施例是一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者(如人类受试者)中的放射疗法效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物；以及至少一种放射疗法。任选地，所述治疗构建体或组合物以及所述放射疗法依次或同时施用。
如本文所使用的，在抗癌疗法的治疗效果的背景下，术语“增强”是指抗癌疗法(例如，用抗癌剂、放射疗法或检查点免疫疗法治疗)的治疗效果的增加高于在没有本发明的治疗构建体的情况下施用抗癌疗法时通常获得的那些治疗效果。当通过抗癌疗法获得的治疗效果的强度和/或程度加速和/或增加时，表现出“治疗效果的增加”。其还包含延长治疗益处的持续时间。当与本发明提供的治疗构建体共同施用时，其还可以表现出在需要获得相同益处和/或效果时较低剂量的抗癌疗法，当单独施用时，其还表现出较高剂量的抗癌疗法。增强效果优选地但不一定产生对急性症状的治疗，对于所述急性症状，单独的抗癌疗法无效或治疗效果较差。与单独施用抗癌疗法相比，当本发明的治疗构建体与抗癌疗法共同施用时，在治疗效果增加至少10％(例如，至少25％、至少50％、至少75％或至少100％)时实现增强。
附图说明
图1A-1B：治疗构建体活性的中心假说。(图1A)有丝分裂抑制(例如，通过PLK1抑制剂或siRNA)杀死癌症并释放抗原，但也增加了存活细胞中的检查点(例如，PD-L1)表达，这抑制了对存活细胞的抗癌免疫应答。(图1B)将有丝分裂抑制剂和免疫检查点抑制剂(例如，在治疗构建体上)组合引起对癌症的协同治疗。
图2A-2D：针对有丝分裂调节剂PLK1(siPLK1)的siRNA对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(A549和H460)的影响。(图2A)48小时PLK1 mRNA敲低(HPRT用作管家基因)和(图2B)在50nM siRNA剂量下的72小时PLK1蛋白减少。(图2C)在30nM siRNA剂量下的4天细胞活力。(图2D)处理后72小时A549中G2/M期的细胞周期停滞增加。抗体(西妥昔单抗(cetuximab))缀合的NP用于递送在50nM下的siPLK1(C-siPLK1-NP)或乱序siRNA对照(C-siSCR-NP)，在10nM下的siRNABI 2536(PLK1抑制剂)被用作药物基准。数据表示为独立重复的平均值±SD(每个样品10,000个事件)；****P<0.0001对未经处理的对照。除非另有说明，“NP”表示如在恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料(Advanced Functional Materials),25(18):2646-2659,2015和美国专利申请公开第2017/0173169号中所述的涂覆有交联PEI和PEG的介孔二氧化硅纳米颗粒。
图3A-3C：siRNA对PLK1的敲低诱导PD-L1表达。(图3A)用PLK1 siRNA(siPLK1)或乱序siRNA(siSCR)处理48小时后A549(人NSCLC)中的PLK1和PD-L1 mRNA表达相对于HPRT管家基因归一化。数据表示为一式三份的平均值±SD；****P<0.0001。(图3B)在处理后72小时通过流式细胞术评估的A549(图2B)和LLC-JSP(小鼠NSCLC，图3C)的PD-L1表面表达(每个样品10,000个事件)。小鼠siPLK1序列GUGGGCGUGGUACCAUCUGUU(SEQ ID NO:1)；人siPLK1序列UAUUCAUUCUUCUUGAUCCGG(SEQ ID NO:2)。
图4A-4C：有丝分裂激酶抑制剂对以下的治疗效果：(A)LLC-JSP细胞的3天活力；(B)如通过流式细胞术测定的，用500ng/ml沃拉色替、阿利色替或AZD7762处理后存活细胞的PD-L1表达水平；以及(C)其定量。
图5A-5C：用PD-L1抑制剂和PLK1抑制剂作为游离药物增强癌症治疗。(图5A)在C57BL/6小鼠右胁腹注射200K LLC-JSP细胞。在肿瘤接种后第8天，将小鼠分组(n＝7-8只)并接受腹膜内处理对照媒剂(PBS和HCl/生理盐水)、PLK1抑制剂沃拉色替(20mg/kg)、小鼠PD-L1抗体(200μg每只小鼠，BioXCell)或PLK1抑制剂与PD-L1抗体的组合。每5天施用一次处理，共3个剂量。(图5B)小鼠的肿瘤生长。(图5C)卡普兰-迈耶存活曲线(Kaplan-MeierSurvival curve)。数据表示为平均值±SEM；***P<0.001，****P<0.0001。
图6A-6D：将PLK1抑制剂沃拉色替(iPLK1-NP)纳米颗粒递送到小鼠NSCLC细胞。(图6A)iPLK1-NP的合成示意图。(图6B)用Zetasizer测量的NP(无抑制剂)和iPLK1-NP的流体动力学尺寸。(图6C)用沃拉色替(在1％DMSO/PBS中)、iPLK1-NP(在PBS中)或1％DMSO/PBS处理4天的LLC-JSP细胞的活力。数据表示为4个独立样品的平均值±SD；****P<0.0001。(图6D)用PBS或iPLK1-NP(42μg/ml NP，210ng/ml沃拉色替)处理3天的LLC-JSP细胞的PD-L1表面表达。
图7A-7E：用于共同递送PLK1抑制剂(iPLK1)和PD-L1抗体(p-iPLK1-NP)的纳米颗粒。(图7A)含有4wt.％PD-L1抗体和0.5wt.％PLK1抑制剂的p-iPLK1-NP的示意图和(图7B)流体动力学尺寸。(图7C)用iPLK1-NP或p-iPLK1-NP处理的LLC-JSP细胞的5天细胞活力。数据表示为4个独立样品的平均值±SD；ns-不显著。在LLC-JSP细胞与规定的各种处理一起温育2小时(图7D)和2天(图7E)后，通过流式细胞术评估的PD-L1表面表达。剂量：游离PD-L1抗体(50μg/ml)、iPLK1-NP(含有50μg/ml沃拉色替的NP)和p-iPLK1-NP(含有50μg/ml沃拉色替和2μg/ml PD-L1抗体的NP)。图7D和7E的左侧：代表性直方图，右侧：中值强度(RFU)。数据表示为独立重复的平均值±SD(每个样品10,000个事件)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。除非另有说明，装载百分比按整个应用中纳米颗粒的重量计。
图8A-8E：p-iPLK1-NP引发抗肿瘤免疫效应。(图8A)向C57BL/6小鼠的右胁腹注射100K LLC-JSP细胞并且向其左胁腹注射40K细胞。在肿瘤接种后第12天，小鼠接受对右侧(局部)肿瘤的生理盐水、p-NP、iPLK1-NP或p-iPLK1-NP的瘤内处理。0.5mg NP含有4wt.％的PD-L1抗体和0.5wt.％的PLK1抑制剂，每剂量50μl，总共3个剂量。(图8B)局部肿瘤生长。(图8C)个体小鼠的远隔(未经处理)肿瘤生长。(图8D)卡普兰-迈耶存活曲线。(图8E)如在(图8A)中所描述的，向小鼠注射肿瘤并接受生理盐水或p-iPLK1-NP的处理。最后一次处理后一天，采集肿瘤以用流量评估肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)(每个样品50,000个事件)。数据表示为平均值±SEM；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图9A-9C：p-iPLK1-NP提高了荷转移性肺肿瘤的小鼠的存活率。(图9A)向C57BL/6小鼠静脉内注射200K LLC-JSP细胞，所述细胞在肺中产生肿瘤。3天后，向小鼠随机分配生理盐水、游离药物(12.5μg沃拉色替和100μg PD-L1抗体)或p-iPLK1-NP(含有2.5μg沃拉色替和20μg PD-L1)的全身性处理中，总共4个剂量。(图9B)卡普兰-迈耶存活曲线。*P<0.05，**P<0.01(对数秩Mantel-Cox检验)。(图9C)第一次处理后的小鼠体重变化。
图10：p-iPLK1-NP的功效依赖于CD8+T细胞。向C57BL/6小鼠静脉内注射200K LLC-JSP细胞。3天后，用生理盐水、p-iPLK1-NP(静脉内，含有2.5μg沃拉色替和20μg PD-L1)或p-iPLK1-NP+抗CD8(200μg，每周两次)处理小鼠。(A)卡普兰-迈耶存活曲线。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(对数秩Mantel-Cox检验)。
图11A-11C：p-iPLK1-NP的靶向和治疗特异性。(A)p-iPLK1-NP处理4天后4T1细胞的PD-L1表达。采集细胞(对照和经p-iPLK1-NP处理的)并与用染料-siRNA标记的p-iPLK1-NP一起温育1小时。(B)p-iPLK1-NP的细胞摄取。(C)用p-iPLK1-NP处理的鼠类癌细胞(LLC-JSP、4T1、B16-F10)和鼠类骨髓源性树突细胞(BMDC)的细胞活力。
图12A和12B.PLK1的抑制降低了STAT3的磷酸化。蛋白质印迹示出了在A549和H460NSCLC细胞系中处理(50nM siRNA)3天后PLK1、PI3Ka、磷酸化STAT3(Tyr705)、磷酸化AKT(Ser473)和β-肌动蛋白的蛋白表达。图12B示出NP还可以递送针对PD-L1(siPDL1)的siRNA，从而使LLC-JSP细胞中的PD-L1蛋白表达(如通过流式细胞术测量的)有效敲低。用含有针对PD-L1(siPDL1)的30nM siRNA或在2wt.％siRNA下的30nM乱序siRNA(siSCR)的NP处理细胞。在处理后72小时，采集细胞并通过流式细胞术评估PD-L1蛋白表达。RFU＝相对荧光单位。
图13：如卡普兰-迈耶存活曲线所示，将CpG添加到p-iPLK1-NP增强治疗益处。向C57BL/6小鼠的右胁腹注射100K LLC-JSP细胞并且向其左胁腹注射40K细胞。在肿瘤接种后第12天，小鼠接受对右侧(局部)肿瘤的生理盐水、p-NP、iPLK1-NP、p-iPLK1-NP或p-iPLK1-NP-CpG的瘤内处理。每3天施用50μl的0.5mg NP(2.5μg iPLK1、20μg PD-L1抗体、20μgCpG)，总共3个剂量。
图14A-14C：阿利色替(极光激酶A抑制剂)和PD-L1抗体的抗体药物缀合物(ADC)。(A)PD-L1-抗体阿利色替缀合物(ADC)的合成方案。(B)ADC与等效剂量的游离阿利色替对LLC-JSP细胞活力的治疗效果(2天)。使用前，将游离阿利色替溶解在DMSO中。(C)PD-L1对LLC-JSP细胞活力的影响。
图15：在使用和不使用微针滚轮预处理的猪皮上的局部siRNA-NP。在有或没有用微针滚轮对皮肤进行预处理的情况下，在Aquaphor中局部应用Dy677-siSCR-NP处理猪皮持续一小时的荧光图像。siRNA信号用箭头表示。也用Hoechst 33342对组织的细胞核进行染色。
图16：在有和没有微针滚轮预处理的小鼠中的局部siRNA-NP/Tween-Aquaphor。在有或没有用微针滚轮对皮肤进行预处理的情况下，在Tween/Aquaphor中局部应用Dy677-siSCR-NP处理小鼠皮肤持续1.5小时的荧光图像。siRNA信号用箭头表示。也用Hoechst33342对组织的细胞核进行染色。
图17A和17B.有微针滚轮的局部siRNA-NP对注射siRNA-NP的EGFR敲低功效。在Tween/Aquaphor中通过微针滚轮应用(A)用siEGFR-NP或siSCR-NP进行一次局部处理后3天或在盐水(B)中进行一次siEGFR-NP或siSCR-NP注射后3天采集小鼠皮肤。固定皮肤组织并用荧光标记的EGFR抗体对其进行染色，以进行EGFR信号定量。每个病状处理4-8张图像(20×)，并且每组3只动物。
图18：含有装载有Dy677-siRNA的NP的基于葡聚糖的微针。
序列表的引用
本文所述的核酸序列使用如在37C.F.R.§1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写示出。每个核酸序列仅示出了一条链，但互补链被理解为包含在适当的实施例中。在2020年7月13日或前后创建的文件大小为1KB、标题为“51127-005WO2_序列表_07.13.20_ST25.txt”的计算机可读文本文件含有本申请的序列表并特此以全文引用的方式并入。
SEQ ID NO:1是小鼠siPLK1序列：GUGGGCGUGGUACCAUCUGUU
SEQ ID NO:2是人siPLK1序列：UAUUCAUUCUUCUUGAUCCGG
SEQ ID NO:3是乱序siSCR序列：UUAGUCGACAUGUAAACCA
具体实施方式
本文所述的用于癌症治疗的治疗方法利用工程化颗粒或化学连接子来共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂以产生将两类药物定位在用于癌症疗法的相同细胞中的治疗构建体。
在向癌细胞瘤内或全身施用所提供的治疗构建体后，有丝分裂激酶抑制剂将使癌症进入细胞周期停滞，从而导致程序性细胞死亡，并增加存活癌细胞的免疫检查点表达(例如，PD-L1)。因此，免疫检查点抑制剂(例如，针对PD-L1的抗体)将增强构建体向存活细胞的靶向递送，并使细胞毒性T细胞能够攻击癌症。
由于有丝分裂激酶抑制剂可以上调PD-L1受体，因此此策略可以治疗广泛的癌症类型，并且特别适用于没有明显受体的癌症以靶向递送在其它方面有毒的治疗药物，如有丝分裂激酶抑制剂。
癌细胞死亡也会释放肿瘤抗原并与检查点抑制一起可以触发适应性免疫以攻击癌症或预防癌症扩散或复发。任选地，可以将佐剂添加到治疗构建体中以增加抗肿瘤免疫应答。
本发明利用新发现的癌症生物学和免疫学以及工程化颗粒来创建新的药物候选物以提高疗效，同时与游离药物对应物相比降低毒性。
在某些实施例中，递送媒剂包含：用于药物装载的MSNP核(例如，约50nm)，所述MSNP核涂覆有用于寡聚物装载和内体逃逸的可生物还原的交联阳离子聚合物，例如聚乙烯亚胺(PEI)；以及稳定剂，例如聚乙二醇(PEG)，所述稳定剂可以预防纳米颗粒聚集，保护寡核苷酸货物免受血液酶降解(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)并屏蔽PEI的电荷，从而增强安全性。将寡核苷酸(siRNA和/或CpG)最后装载在构建体上，在室温下在PBS中混合几分钟(例如，5分钟)；所述寡核苷酸以非寡核苷酸序列依赖性方式与PEI静电结合，并在PEG层下保护其免受酶促降解(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。所得纳米颗粒(NP)在MSNP尺寸、PEI和PEG分子量和组合物、PEI交联条件(以增强缓冲能力并降低电荷)、寡核苷酸和(任选地)抗体装载方面对siRNA递送功效进行高度优化(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-2659,2015)。在窄尺寸分布的情况下，siRNA-NP的这一实施例的刚性MSNP核尺寸为50nm(通过TEM)，并且流体动力学尺寸(具有聚合物涂层的NP)为100nm。其由13.5wt.％PEI、18.2wt.％PEG组成，并且可以装载2-4wt.％的siRNA或高达10wt.％的CpG寡核苷酸。药物(例如，紫杉烷)可以以0.5-3wt.％装载在MSNP核中或聚合物上。此段落中的所有值均按纳米颗粒的重量计。还参见美国专利公开2017/0173169。
在某些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。在一些实施例中，所述有丝分裂激酶抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。在一些实施例中，所述治疗构建体是抗体-寡核苷酸缀合物(维纳,J.(Wiener,J.)等人，科学报告(Scientific Reports),10,1457,2020)、小分子-寡核苷酸缀合物(维可J.(Winkler J.),治疗递送(Therapeutic delivery),4(7),791–809,2013)或小分子-小分子缀合物。
本文提供了治疗构建体，其包含：递送系统；至少一种有丝分裂抑制剂或有丝分裂激酶抑制剂，所述至少一种有丝分裂抑制剂或有丝分裂激酶抑制剂与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内；以及至少一种免疫检查点抑制剂，所述至少一种免疫检查点抑制剂与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内。在所述治疗构建体的此实施例的实例中，所述递送系统包含脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机或有机纳米颗粒或微粒或其混合物。例如，在各个实例中，所述递送媒剂包含以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支化和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、磷酸钙、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银纳米颗粒、碳纳米颗粒、铁纳米颗粒和/或经修饰的胶束。
在所提供的治疗构建体实施例的实例中，所述有丝分裂激酶抑制剂和/或免疫检查点抑制剂包含寡核苷酸(例如，siRNA或反义寡核苷酸)、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
在治疗构建体的实例中，所述有丝分裂激酶抑制剂包含以下中的至少一种的抑制剂：polo样激酶(PLK)、极光激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、HASPIN、单极纺锤体1激酶(Mps1)或NimA相关激酶(NEK)。在各个实施例中，所述有丝分裂激酶抑制剂包含以下中的一或多种：GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727(沃拉色替)、Chk 1激酶抑制剂LY2603618、普瑞色替、AZD7762、AU14022、YK-4-279或AZ703。
在各个实施例中，所述有丝分裂抑制剂包含以下中的一或多种：依托泊苷(etoposide)、长春瑞滨(vinorelbine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、多柔比星、雌莫司汀(estramustine)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、多西他赛、紫杉醇(paclitaxel)和卡巴他赛(cabazitaxel)。
在各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂包含针对PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4中的一或多种的siRNA、抑制剂或抗体。举例来说，所述治疗剂是选自针对PD-L1、PD-1或CTLA-4的抗体的免疫检查点抑制剂。在又更多实例中，所述免疫检查点抑制剂包含以下中的至少一种：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)或斯巴达珠单抗(spartalizumab)(PDR001)。
本文提供的治疗构建体可以任选地进一步包含佐剂。具体地，可设想到，与所提供的治疗构建体一起使用的示例佐剂表现出免疫刺激活性。举例来说，在所提供的治疗构建体的实施例中有用的佐剂包含以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNATLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNATLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。在特定实例中，佐剂化合物包含CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、poly IC、poly ICLC、dSLIM或EnanDIM。
在一些实施例中，所述治疗构建体不包含肿瘤特异性抗原。
还提供了包含至少一种如本文所述的治疗构建体的组合物。任选地，此类组合物进一步包括至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
另一个实施例是一种治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的受试者(例如，人类受试者)施用有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物以减轻所述癌症的一或多种症状。
还提供了治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所提供的治疗药物接触。
还提供了治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与治疗有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物接触。
还提供了包含使细胞离体与治疗有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物接触的方法。
在任何基于细胞的实施例中，可设想到，在一些情况下，所述细胞是癌细胞。在其它情况下，所述细胞不是癌细胞。在各个实施例中，所述细胞是免疫细胞。任选地，在任何基于细胞的实施例中，所述细胞可以来自人类受试者，或者来自另一哺乳动物受试者。
又另一个实施例是一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含至少一种所提供的治疗构建体。在此实施例的各个实例中，所述过度增殖性疾病包含癌症、初癌或癌症转移中的一或多种。在这些方法的实例中，所述过度增殖性疾病包含以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、结肠癌或肝癌。
在任何所提供的治疗受试者的方法中，可设想到可以通过多种方法施用。例如，在治疗方法的实例中，施用包含以下中一或多项：注射到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处注射；局部输注到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处局部输注；对所述受试者进行全身注射；对所述受试者进行全身输注；或局部应用于所述受试者。在其它实例中，施用包含微针应用。
还提供了增强抗癌疗法在有需要的受试者(如人类受试者)中的效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物；以及至少一种抗癌剂(例如，化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂)。任选地，所述治疗构建体或组合物以及所述抗癌疗法依次或同时施用。
又另一个实施例是一种增强在被诊断为患有瘤变的受试者(如人类受试者)中的放射疗法效果的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用以下：有效量的所提供的治疗构建体或含有此类治疗构建体的组合物；以及至少一种放射疗法。任选地，所述治疗构建体或组合物以及所述放射疗法依次或同时施用。
本文还提供了一种包含本文所述的治疗构建体和至少一种抗癌剂的试剂盒。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
现在用另外的细节和选项描述本公开的各方面以支持本公开的教导，如下：(I)治疗构建体；(II)有丝分裂激酶和其抑制剂；(III)免疫检查点抑制剂；(IV)任选的另外的组分；(V)递送系统；(VI)抗体；(VII)药物组合物和施用调配物；(VIII)示范性使用方法；(IX)试剂盒；(X)示范性实施例；以及(XI)实例。
(I)治疗构建体
本文描述了一类新型治疗药物(具体地为“治疗构建体”)，所述治疗药物包含工程化颗粒，所述工程化颗粒将至少两种活性剂共同递送到癌细胞，所述至少两种活性剂包含至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂。本文还公开了治疗构建体，所述治疗构建体包含免疫检查点抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂以及连接两者(抗体药物缀合物)，例如，如本文所述的那些中的任一者的化学连接子。活性剂(例如，有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂)的比率可以为例如约1-20(例如，约2-8、约4-6、约2、约4或约6)。有丝分裂激酶抑制剂可以以治疗构建体的0.01wt.％到99.9wt.％(例如，0.01到1wt.％、1到5wt.％、1到10wt.％、1到20wt.％、10到30wt.％、10到40wt.％、10到50wt.％、25到75wt.％、40到60wt.％、50到75wt.％、50到80wt.％、75到90wt.％、75到95wt.％或75到99.9)存在，并且免疫检查点抑制剂可以以0.01wt.％到99.9wt.％(例如，0.01到1wt.％、1到5wt.％、1到10wt.％、1到20wt.％、10到30wt.％、10到40wt.％、10到50wt.％、25到75wt.％、40到60wt.％、50到75wt.％、50到80wt.％、75到90wt.％、75到95wt.％或75到99.9wt.％)存在。这些治疗构建体将实现功效所需的剂量减少例如约五倍，从而允许将药物一起给予而不会达到其剂量限制毒性。这些治疗构建体产生增强局部(经治疗的)和远隔(未经治疗的)部位(例如，转移)的肿瘤抑制和发展以及经治疗的受试者的存活率的适应性免疫。一旦用所述治疗构建体治疗，癌症就会经历程序性细胞死亡，而存活细胞过表达免疫检查点分子，如PD-L1。这使得能够以前馈方式将构建体更多靶向递送到在其它方面可能不会显著表达用于靶向递送的受体的剩余癌症。治疗构建体也适用于广泛的癌症类型，因为在所有将在有丝分裂激酶抑制后过表达免疫检查点分子(如PD-L1)的癌症中都发现了有丝分裂激酶。
在一些实例中，所述化学连接子可以包含以下中的一或多种：肼二硫化物；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯；3-(吡啶-2-基二磺酰基)丙酸全氟苯酯；3-甲基-3-(吡啶-2-基二磺酰基)丁酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯；Gly-Phe-Leu-Gly；Ala-Leu-Ala-Leu；Val-Cit；Phe-Lys；Val-Ala；Ala-Phe-Lys；Phe-Lys；(Gly)n，其中n为1-20；β-葡糖苷酸连接子；马来酰亚胺己酰基；N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯；4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸；二溴马来酰亚胺；对氨基苯甲酸；4-硝基苯酚；乙酸；甲酸；N-琥珀酰亚胺4-马来酰亚胺丁酸酯；N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺；N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺；N-琥珀酰亚胺3-马来酰亚胺丙酸酯；N-(3-马来酰亚胺丙酰氧基)琥珀酰亚胺；5-马来酰亚胺戊酸-NHS；分子量为100-10000Da的线性、支化或多臂聚乙二醇；炔丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯；焦磷酸酯；琥珀酰亚胺-4-叠氮基丁酸酯；N-羟基琥珀酰亚胺4-叠氮基苯甲酸酯；1-(4-甲酰基苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-酸叔丁酯；或其残基。在一些实施例中，所述化学连接子包含N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯或其残基(例如，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯)。在一些实施例中，所述化学连接子包含分子量为100-10000Da的聚乙二醇(例如，线性聚乙二醇)或其残基。
此策略将具有许多关键特征；其是有效的、由于所需剂量较低(相对于游离药物对应物)而安全的、因为其训练和利用身体免疫细胞来攻击具有记忆效应的癌症而持久的、适用于多种类型的癌症，并且可以局部地给予容易接近的肿瘤，也可以全身性地给予更深的肿瘤和转移性肿瘤。
应当理解，治疗构建体(例如，有丝分裂抑制剂、有丝分裂激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、递送媒剂或递送媒剂的任何组分)中的每种组分的量可以根据实施例而变化。举例来说，任何单独组分可以占治疗构建体的0.001重量％到80重量％、0.01重量％到75重量％、0.5到50重量％、0.5到10重量％、0.5到5重量％、1到10重量％或2到4重量％。
(II)有丝分裂激酶和其抑制剂
癌症的特征为不受控制的细胞繁殖。有丝分裂是细胞周期中的一个阶段，在此阶段期间，一系列复杂的事件确保染色体分离成两个子细胞的保真度。包含紫杉烷和长春花生物碱的若干个目前癌症疗法用于抑制有丝分裂机制。有丝分裂进程在很大程度上受蛋白酶解和有丝分裂激酶介导的磷酸化事件的调节。极光激酶家族成员(例如，极光激酶A、极光激酶B、极光激酶C)通过调节中心体分离、纺锤体动力学、纺锤体组装检查点、染色体排列和胞质分裂来调节有丝分裂进程(杜特尔特(Dutertre)等人，致癌基因(Oncogene)21:6175,2002；伯德尼克(Berdnik)等人,当代生物学(Curr.Biol.)12:640,2002)。极光激酶的过表达和/或扩增与包含结肠和乳腺在内的若干肿瘤类型的肿瘤发生有关(Warner等人，分子癌症疗法(Mol.Cancer Ther.)2:589,2003；比绍夫(Bischoff)等人，欧洲分子生物学组织(EMBO)17:3062,1998；森(Sen)等人，癌症研究(Cancer Res.)94:1320,2002)。此外，肿瘤细胞中的极光激酶抑制导致有丝分裂停滞和细胞凋亡，表明这些激酶是癌症疗法的重要靶标(迪茨费德(Ditchfield),细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)161:267,2003；哈林顿(Harrington)等人，自然医学(Nat Med)10(3):262-267,2004)。
有丝分裂激酶：在特定实施例中，有丝分裂激酶包含细胞增殖所必需的丝氨酸/苏氨酸激酶的极光激酶家族中的激酶(比绍夫和普洛曼(Plowman),细胞生物学趋势(Trendsin Cell Biology)9:454-459,1999；吉耶(Giet)和普瑞让(Prigent),细胞科学杂志(JCell Science)112:3591-3601,1999；尼格(Nigg),自然综述：分子细胞生物学(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.)2:21-32,2001；亚当斯(Adams)等人,细胞生物学趋势11:49-54,2001)。自1997年发现以来，哺乳动物极光激酶家族就与肿瘤发生密切相关。对此最有说服力的证据是极光激酶-A的过表达会转化啮齿动物成纤维细胞(比绍夫等人,欧洲分子生物学学会会刊(EMBO J.)17:3052-3065,1998)。因此，极光激酶家族的抑制剂有可能阻断所有肿瘤类型的生长。
三个已知的哺乳动物家族成员，极光激酶-A(“1”)、B(“2”)和C(“3”)是负责染色体分离、有丝分裂纺锤体功能和胞质分裂的高度同源蛋白质。其在激酶结构域所在的C端区高度保守，并在N端结构域中示出了序列差异(自然综述：癌症(Nat.Rev.Cancer),5:42-49,2005)。极光激酶在静息细胞中的表达很低或检测不到，在循环细胞的G2和有丝分裂期期间表达和活性达到峰值。在哺乳动物细胞中，所提出的极光激酶的底物包含组蛋白H3(一种参与染色体浓缩的蛋白质)和CENP-A、肌球蛋白II调节轻链、蛋白磷酸酶1、TPX2，所有这些都是细胞分裂所必需的。
极光激酶B在G2晚期与末期之间表达。其位于内部着丝粒区和纺锤体中间区中。其调节染色体在中期板处的朝向并纠正错误的动粒-微管相互作用。其使组蛋白H3磷酸化，这使组蛋白与DNA相互作用。这对于接下来的染色体浓缩很重要。极光激酶C示出了与极光激酶B的高度序列同源性，并在减数分裂中发挥作用。
如本文所使用的，术语“极光激酶A”是指参与有丝分裂进程的丝氨酸/苏氨酸激酶。极光激酶A也称为AIK、ARK1、AURA、BTAK、STK6、STK7、STK15、AURORA2、MGC34538和AURKA。在细胞分裂中发挥作用的多种细胞蛋白是极光激酶A磷酸化的底物，包含TPX-2、XIEg5(在爪蟾中)和D-TACC(在果蝇中)。极光激酶A本身也是自身磷酸化的底物，例如在Thr288处。在一些情况下，极光激酶A是人极光激酶A。
在特定实施例中，有丝分裂激酶包含Polo样激酶(“PLK”)。PLK，包含polo样激酶1(“PLK1”)、polo样激酶2(“PLK2”)、polo样激酶3(“PLK3”)和polo样激酶4(“PLK4”)，参与有丝分裂期间有丝分裂纺锤体的形成和变化以及CDK/细胞周期蛋白复合物的激活(斯特雷哈特(Strebhardt)和乌尔里奇(Ullrich),自然综述：癌症6(4):321,2006)。Plk在肿瘤中过表达，并且过表达与不良预后和较低总体存活率相关。因此，PLK抑制剂已经被开发为癌症药物疗法。
在特定实施例中，有丝分裂激酶包含细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)。CDK是真核细胞周期事件的定时和协调的调节剂(奴伯里(Norbury)和乐斯(Nurse),生物化学年度评论(Annu.Rev.Biochem.)61:441-470,1992；谢尔(Sher),科学(Science)274:1672-1677,1996)。如此，CDK、其调节剂以及其底物是许多人类癌症中基因变异的靶标(坎布(Kamb)等人,科学264:436-440,1994；奴铂瑞(Nobori)等人,自然(Nature)368:753-756,1994；斯普鲁克(Spruck)等人,自然370:183-184,1994；亨特(Hunter)和派因斯(Pines),细胞(Cell)66:1071-1074,1991；科奥马西(Keyomarsi)和帕迪(Pardee),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90:1112-1116,1993；王(Wang),自然369:669-671,1994)。细胞周期蛋白依赖性激酶家族的成员包含Cdk2和Cdk4。两者都活跃于细胞周期的G1期，并且调节进入G1/S期转变。在一种途径中，这些激酶调节成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化。底物磷酸化释放E2F转录因子，所述E2F转录因子进而调节进入S期所需基因的表达。因此，抑制这些激酶会阻止细胞进入S期和下游增殖事件。
在特定实施例中，有丝分裂激酶包含单极纺锤体1(MPS1)激酶。MPS1激酶，也称为TTK，是一种双丝氨酸/苏氨酸激酶，所述双丝氨酸/苏氨酸激酶控制染色体排列并影响作为纺锤体组装检查点(SAC)的关键调节剂的动粒-微管相互作用的稳定性。SAC对于适当的染色体排列和分离至关重要。MPS1仅在增殖细胞中表达，并在有丝分裂期间磷酸化后被激活，其中必需的SAC蛋白，如Mad1(有丝分裂停滞缺陷蛋白1)和Mad2(有丝分裂停滞缺陷蛋白2)的适当动粒募集需要MPS1。MPS1也在广泛类型的人类肿瘤中过表达，并且是肿瘤细胞增殖所必需的。
在特定实施例中，有丝分裂激酶包含Nek((从未在有丝分裂基因a中)相关激酶)2。Nek2是定位于中心体并通过使包含C-Nap1(核小体组装蛋白-1)、小根蛋白和Nlp(ninein样蛋白)的底物磷酸化来调节纺锤体极组织和分离的丝氨酸/苏氨酸激酶。除了其中心体作用外，Nek2还与染色质浓缩和纺锤体检查点控制有关。Nek2表达和活性以细胞周期依赖性方式受到严格调控。表达水平在G1中较低并且在S/G2中增加。Nek2在癌细胞中异常表达。
在特定实施例中，有丝分裂激酶包含Wee1激酶。Wee1激酶是一种有丝分裂抑制剂并且维持G2-细胞周期检查点停滞以进行有丝分裂前DNA修复。Wee1在如晚期肝癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、精原细胞瘤和成胶质细胞瘤等癌症中过表达，并且其表达与套细胞淋巴瘤患者存活率相关。
本领域普通技术人员将理解如何访问有丝分裂激酶的代表性序列，所述代表性序列可在公共序列数据库中容易获得。下表提供了样品序列信息：
Figure BDA0003457831070000171
Figure BDA0003457831070000181
有丝分裂激酶抑制剂：有丝分裂激酶抑制剂的实例包含以下的抑制剂：PLK1(例如，GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727或沃拉色替)、PLK2、PLK3、PLK4、极光激酶1/2(例如，阿利色替)、CDK1/2、CHK1/2(例如，AZD7762、普瑞色替)、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN(施米特(Schmit)等人,分子癌症疗法6(7):1920-31,2007)。这些有丝分裂激酶可以用小分子抑制剂、寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸)和/或抗体靶向，所有这些都在本申请中被考虑。
非特异性极光激酶A抑制剂包含：MLN8054(马萨诸塞州剑桥千禧制药公司(Millennium Pharmaceuticals,Cambridge,MA)；琼斯(Jones)等人,美国临床肿瘤学会年度会会议(Proc Am Soc Clin Oncol Annu Meet)25:3577,2007)；MK-0457(VX-680；哈林顿(Harrington)等人，自然医学(Nat Med)10(3):262-267,2004)；SU6668(苏瑾(Sugen)；拉帕纳(Lapenna)和焦尔达诺(Giordano),自然综述：药物发现(Nature Rev Drug Discovery)8:547-566,2009和补充信息)；以及ZM447439，一种基于喹唑啉支架的抑制剂(格德勒(Girdler)等人,细胞学杂志(J.Cell Sci.),119,3664-3675,2006)。
在特定实施例中，极光激酶A的选择性抑制剂包含：例如在US 2008/0045501、US7,572,784、WO 2005/111039、WO 2008/021038、US 7,718,648、WO 2008/063525、US 2008/0167292、US 8,026,246、WO 2010/134965、US 2010/0310651、WO 2011/014248、US 2011/0039826和US 2011/0245234中所公开的化合物；4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5H-嘧啶并[5,4-(i][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠；KW-2449(协和发酵公司(Kyowa Hakko))、ENMD-2076(ENMD-981693；创远达公司(EntreMed))；以及MK-5108(威泰克斯(Vertex)/默克公司(Merck))。
其它极光激酶抑制剂包含：橙皮苷(Hesperidin)(豪夫(Hauf)等人,分子生物学杂志(J Cell Biol)161(2):281-294,2003)；AZD1152(喹唑啉前药，活性代谢物是AZD-1152-HQPA；英国剑桥阿斯利康公司(AstraZeneca,Cambridge,UK)；薛伦斯(Schellens)等人,临床肿瘤学杂志24:122s,2006；杨(Yang)等人,血液(Blood)110(6):2034-2040,2007)；MLN8237(阿利色替，极光激酶A的选择性、竞争性和可逆小分子抑制剂；马萨诸塞州剑桥千禧制药公司；戈尔根(Gorgun)等人,血液115(25):5202-5213,2010；弗莱伯格(Friedberg)等人,临床肿瘤学杂志32(1):44-50,2014)；CYC-116(环载脂蛋白1(Cyclapolin 1)；英国剑桥Cycacel有限公司(Cyclacel Ltd.,Cambridge,UK)；泰勒(Taylor)和彼得斯(Peters),细胞生物学当前观点(Curr Opin Cell Biol)20:77-84,2008)；AS-703569(R-763；加利福尼亚州旧金山Rigel制药公司(Rigel Pharmaceuticals,San Francisco,CA))；AT9283(Astex；霍华德(Howard)等人,医药化学杂志(J Med Chem)52(2):379-388,2009)；PHA-739358(3-氨基吡唑衍生物；内尔维亚诺医药科学公司(Nerviano Medical Sciences)；卡尔皮内利(Carpinelli)等人,分子癌症疗法6(12):3158-3168,2007)；PHA-680632(索奇尼(Soncini)等人,临床癌症研究(Clin Cancer Res)12(13):4080-4089,2006)；SNS-314(加利福尼亚州旧金山Sunesis制药公司(Sunesis Pharmaceuticals,San Francisco,CA；拉帕纳和焦尔达诺,自然综述：药物发现8:547-566,2009和补充信息)；以及PF-3814735(巴塔查里亚(Bhattacharya)等人,美国癌症研究学会(Am Assoc Canc Res)68(9)增刊LB-147,2008)。在高奇尺(Gautschi)等人,临床癌症研究14(6):1639-48,2008中进行综述。WO 01/21596描述了抑制极光激酶2的喹唑啉衍生物。多于30种小分子极光激酶抑制剂处于临床前和临床开发的不同阶段(拉帕纳和焦尔达诺,自然综述：药物发现8:547-566,2009和补充信息；科拉雷迪(Kollareddy)等人,新药临床试验(Invest New Drugs)30(6):2411-2432,2012)。
细胞周期抑制剂JNJ-7706621示出了对若干细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和极光激酶的有效抑制，并且选择性地阻断各种来源的肿瘤细胞的增殖。JNJ-7706621在低浓度下会减缓细胞的生长并且在高浓度下会诱导细胞毒性。JNJ-7706621对细胞的处理示出了细胞周期G1期的延迟进展和在G2-M期处的细胞周期停滞(伊曼纽尔(Emanuel)等人,癌症研究65:9038-9046,2005)。
例如在EP1244668、EP1507780、EP153976、EP1590341、EP1615926、WO 03/63764、US6,107,305、US 6,413,974、WO 1999/02162、WO 2000/12486、WO 2000/39101、WO 2001/14375、WO 2002/10162、WO 2002/04429、WO 2002/096888和WO 2003/7076437中描述了CDK抑制剂。文献中已经报道了许多腺苷δ'-三磷酸(ATP)竞争性小有机分子以及肽作为CDK抑制剂以潜在治疗癌症。
也在以下中描述了小分子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂：哥拉布(Glab)等人,FEBS快报(FEBS Lett.)353:207-211,1994；北川(Kitagawa)等人,致癌基因8:2425-2432,1993；洛斯维茨(Losiewicz)等人,生物化学与生物物理学研究通信(Biochem.Biophys.Res.Commun.)201:589-595,1994；卡尔松(Carlson)等人,癌症研究,56:2973-2978,1996；凯兰(Kelland),调研药物专家评论(Expert Opin.Invest.Drugs)9:2903-2911,2000；森德罗维茨(Senderowicz),新药临床试验17:313-320,1999；以及瓦西列夫(Vassilev)等人,美国国家科学院院刊(PNAS)103(28):10660-10665,2006。在特定实施例中，CDK抑制剂可以包含：弗拉平度(flavopiridol)(森德罗维茨,新药临床试验17(3):313-320,1999)；奥罗莫星(olomoucine)(维斯利(Vesely)等人,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)224:771-786,1994)；劳斯考文汀(roscovitine)(梅耶尔(Meijer)等人,欧洲生物化学杂志243:527-536,1997)；CDKi-277(加利福尼亚州千橡市安进公司(Amgen,Thousand Oaks,CA)；佩顿(Payton)等人,癌症研究66:4299–4308,2006)；RO-3306(瓦西列夫等人,美国国家科学院院刊103(28):10660-10665,2006)；普维兰诺A(purvalanol A)(维莱布(Villerbu)等人,国际癌症杂志(Int.J.Cancer)97:761–769,2002)；NU6140(佩纳蒂(Pennati)等人,分子癌症疗法4:1328–1337,2005)；s-CR8(贝塔耶夫(Bettayeb)等人,致癌基因27:5797-5807,2008)；N-&-N1(GP0210；法国奥尔良绿色制药有限公司(GreenpharmaS.A.S.,Orleans,France)；贝塔耶夫等人,分子癌症疗法7:2713–2724,2008)；AZ703(英国剑桥阿斯利康公司；拜思(Byth)等人,分子癌症疗法5:655-664,2006)；JNJ-7706621(新泽西州新不伦瑞克强生公司(Johnson&Johnson,New Brunswick,NJ)；伊曼纽尔(Emanuel)等人,癌症研究,65:9038-9046,2005；RGB-286199(德国普拉内格GPC生物科技股份有限公司(GPC Biotech AG,Planegg,Germany)；王等人,美国癌症研究协会会议记录(Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.)46,摘要.4428,2005)；以及SNS-032(加利福尼亚州旧金山Sunesis制药公司；钟(Choong)等人,生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)18:5763-5765,2008；范(Fan)等人,生物有机化学与医药化学快报18:6236-6239,2008)。
Polo样激酶抑制剂包含：伪枝藻素(Scytonemin)(史蒂文森(Stevenson)等人,炎症研究(Inflamm Res)51:112-114,2002)；渥曼青霉素(Wortmannin)(刘等人,化学生物学(Chem Biol)12:99-107,2005)；ON-01910(或ON 01910.Na；多靶点静脉内细胞周期抑制剂；宾夕法尼亚州纽顿市Onconova治疗公司(Onconova Therapeutics Inc.,Newtown,PA)；古米雷迪(Gumireddy)等人,癌细胞(Cancer Cell)7:275-286,2005)；BI-2536(PLK1的ATP竞争性抑制剂；德国殷格翰勃林格殷格翰公司；斯泰格迈尔(Steegmaier)等人,当代生物学(Current Biology)17:316-322,2007)；BI 6727(PLK的二氢蝶啶酮衍生物抑制剂；德国殷格翰勃林格殷格翰公司；鲁道夫(Rudolph)等人,临床癌症研究15(9):3094-3102,2009)；GSK-61364(或GSK-461364A；PLK1的选择性静脉内噻吩酰胺抑制剂；拉克尔(Laquerre)等人,一种有效且选择性的Polo样激酶1(Plk1)抑制剂(GSK461364)诱导癌细胞的细胞周期停滞和生长抑制(A potent and selective Polo-like kinase 1(Plk1)inhibitor(GSK461364)induces cell cycle arrest and growth inhibition of cancer cell),于2007年4月14-18日在加利福尼亚州洛杉矶举行的第98届美国癌症研究协会年会上发表)；HMN-214(PLK1的口服二苯乙烯衍生物抑制剂；活性剂HMN-176的前药；日本京都日本新药株式会社(Nippon Shinyaku Co.Ltd,Kyoto,Japan)；嘉兰(Garland)等人,临床癌症研究12:5182-5189,2006)；ZK-噻唑啉酮(TAL；PLK1的ATP竞争性抑制剂；德国柏林拜耳先灵医药股份有限公司(Bayer Schering Pharma AG,Berlin,Germany)；珊塔玛亚(Santamaria)等人,细胞分子生物学(Mol Biol Cell)18:4024-4036,2007)；NMS-1(一种可口服选择性PLK1抑制剂；意大利米兰内尔维亚诺医药科学公司(Nerviano Medical Sciences,Milano,Italy)；贝利亚(Beria)等人,吡唑喹唑啉衍生物作为有效口服Plk-1特异性抑制剂的抗肿瘤活性(Antitumoral activity of pyrazoloquinazoline derivatives as potent oralPlk-1 specific inhibitors),于2008年10月21-24日在瑞士日内瓦举行的第20届欧洲癌症研究与治疗组织-国家癌症研究所-美国癌症研究协会分子靶标和癌症治疗研讨会上发表)；CYC-800(苯并噻唑-3-氧化物衍生物选择性PLK1抑制剂；英国剑桥Cycacel有限公司；麦金尼斯(McInnes)等人,医药化学当前论题(Curr Top Med Chem)5:181-197,2005)；DAP-81(靶向PLK的二氨基嘧啶衍生物；纽约洛克菲勒大学(Rockefeller University,NewYork)；彼得斯等人,自然化学生物学(Nat Chem Biol)2:618-626,2006)；LC-445(PLK3的特异性非ATP竞争性变构抑制剂；马里兰州日尔曼镇阿瓦隆制药公司(AvalonPharmaceuticals,Germantown,MD)；霍里根等人,Polo样激酶3的小分子变构抑制剂诱导细胞凋亡并破坏癌细胞中有丝分裂纺锤体的完整性(Asmall molecule allostericinhibitor of Polo-like kinase 3induces apoptosis and disrupts the integrityof the mitotic spindle apparatus in cancer cells),于2008年10月21-24日在瑞士日内瓦举行的第20届欧洲癌症研究与治疗组织-国家癌症研究所-美国癌症研究协会分子靶标和癌症治疗研讨会上发表)；三寸侬(centrinone)(LCR-263)和三寸侬-B(LCR-323)(PLK4抑制剂；王(Wong)等人,科学348(6239):1155-1160,2015)。在斯科夫斯基,肿瘤学者(TheOncologist)14:559-570,2009中描述了Plk抑制剂。
MPS1激酶抑制剂包含：NMS-P715(吡唑-喹唑啉；哥伦布(Colombo)等人,癌症研究70(24):10255-10264,2010)；Mps-1-IN-1和Mps1-IN-2(维亚特科夫斯基(Kwiatkowski)等人,自然化学生物学6(5):359-368 2010；Mps-1-IN-3(巴霍斯(Bakhos)等人,JNCI：国家癌症研究所杂志(JNCI:Journal of the National Cancer Institute)105(17):1322-1331,2013)；以及MPI-0479605(塔蒂夫(Tardif)等人,分子癌症疗法10(12):2267-2275,2011。
在特定实施例中，有丝分裂激酶抑制剂包含Nek2的氨基吡嗪抑制剂(惠里根(Whelligan)等人,药物化学杂志53:7682-7698,2010)。
Wee1激酶抑制剂包含：PD0166285(吡啶-嘧啶衍生物，其是WEE1的非选择性抑制剂)；PD0407824(吡咯-咔唑衍生物，其是一种更具选择性的WEE1抑制剂)；WEE1抑制剂II(吡咯并咔唑衍生物)；以及4-(2-苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]-咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮(PHCD)。德威特哈默尔(De Witt Hamer)等人,(2011)临床癌症研究；17(13):4200-4207；帕尔默(Palmer)等人,(2006)药物化学杂志49:4896-4911。
术语“[靶蛋白]的抑制剂”或“[靶蛋白]抑制剂”用于表示能够与靶蛋白相互作用并抑制其活性(如酶活性)的化合物。例如，抑制靶激酶酶活性意指降低所述靶激酶使底物肽或蛋白质磷酸化的能力。在各个实施例中，激酶活性的此类降低为至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在各个实施例中，降低靶激酶的激酶酶活性(或另一靶标的活性)所需的激酶抑制剂(或另一抑制剂)的浓度小于约1μΜ、小于约500nM、小于约100nM或小于约50nM。在实施例中，抑制靶标(如靶激酶)的酶活性所需的浓度低于抑制其它激酶或在同一家族或共享活性中的其它蛋白质的酶活性所需的抑制剂的浓度。在各个实施例中，降低靶蛋白的酶活性所需的抑制剂的浓度是降低其它蛋白质，具体地是其它类似蛋白质(如其它激酶)的酶活性所需的抑制剂浓度的至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/20、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/500或至少约1/1000。抑制剂还可以使用寡核苷酸(例如siRNA，反义)诱导靶蛋白或对靶蛋白进行编码的mRNA的减少为原始mRNA和/或蛋白质水平的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少90％。
在特定实施例中，抑制有丝分裂激酶(如PLK1)可以通过减少例如磷酸化的STAT3或其它免疫抑制途径来调节免疫抑制肿瘤微环境，由此有利于抗肿瘤免疫应答。
(III)免疫检查点抑制剂
检查点抑制剂疗法是最近发展的一种癌症免疫疗法形式。所述疗法靶向免疫检查点，即刺激或抑制其作用的免疫系统的关键调节剂，肿瘤可以利用所述关键调节剂来保护免疫系统免受攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能(帕多尔(Pardoll),自然综述：癌症12(4):252-264,2012)。第一种靶向免疫检查点的抗癌药物是伊匹单抗，一种2011年在美国批准的CTLA-4阻断剂(卡梅伦(Cameron)等人,药物(Drugs)71(8):1093-1104,2011)。还参见韦德(Wieder)等人,过敏和临床免疫学杂志(J AllergyClin Immunol.)142(5):1403-1414,2018。
免疫检查点抑制剂通过治疗免疫系统间接地治疗癌症。免疫检查点抑制剂抑制免疫检查点分子的正常免疫抑制功能，例如通过下调检查点分子的表达或通过与其结合并阻断正常受体/配体相互作用。由于免疫检查点分子会阻止免疫系统对抗原的应答，因此免疫检查点分子的抑制剂会降低此免疫抑制作用并增强免疫应答。在免疫检查点中发挥作用的分子包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性死亡1T细胞受体(PD-1)。
CTLA-4、PD-1以及其配体是CD28-B7共信号分子家族的成员，所述成员在T细胞和其它细胞功能的所有阶段都发挥着重要作用。PD-1受体在经激活的T细胞(和B细胞)的表面上表达，并且在正常情况下，与其在抗原呈递细胞(如树突细胞或巨噬细胞)的表面上表达的配体(PD-L1和PD-L2)结合。此相互作用向T细胞发送信号，并且基本上关闭T细胞或抑制T细胞。癌细胞通过驱动在其表面上PD-L1的高水平表达来利用此系统。这使得癌细胞能够获得对PD-1途径的控制，并关闭可能进入肿瘤微环境的表达PD-1的T细胞，从而抑制抗癌免疫应答。免疫疗法伊匹单抗，一种靶向T细胞表面上的CTLA-4的单克隆抗体，已经被批准用于治疗黑色素瘤。针对程序性死亡-1(PD-1)T细胞受体或其配体(PD-L1或PD-L2)的各种新型靶向免疫疗法也可能被证明是有效的。另外的免疫检查点靶标也可能被证明是有效的，如T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、各种B7配体、BTLA、腺苷A2A受体(A2AR)等。
目前批准的免疫检查点抑制剂靶标包含CTLA-4、PD-1和PD-L1。PD-1是与PD-L1(PD-1配体1或CD274)相互作用的跨膜程序性细胞死亡1蛋白(也称为PDCD1和CD279)。细胞表面上的PD-L1与免疫细胞表面上的PD-1结合，这抑制免疫细胞活性。关键PD-L1功能是调节T细胞活性(布特(Butte)等人,免疫(Immunity)27(11)；111-122,2007；卡瓦克兹(Karwacz)等人,EMBO分子医学(EMBO Mol.Med.)3(10:581-592,2011)。癌症介导的细胞表面PD-L1上调似乎可能抑制可能以其它方式攻击癌细胞的T细胞。与PD-1或PD-L1结合并因此阻断相互作用的抗体可能允许T细胞攻击肿瘤(斯因(Syn)等人,柳叶刀肿瘤学(TheLancet Oncology)18(12):e731-e741,2017)。
在免疫系统中，排斥与自我耐受之间的关键平衡是通过一系列精调的共同调节的受体-配体相互作用维持的。最近的注意力集中在程序性死亡(PD)-1/PD-1配体(PD-L1，B7-H1)途径作为肿瘤免疫耐受的关键介体。在生理条件下，抑制性PD-1受体在包含T、B和NK细胞的经激活的免疫效应细胞上表达。通过与通常在抗原呈递细胞(APC)上表达的配体PD-L1和PD-L2的相互作用，炎性过程期间的外周组织中的免疫效应活性是自限性的。这种抑制系统是在清除病毒和细菌细胞内感染期间保护健康组织和未经感染细胞的基础。然而，许多人类癌症已经被示出表达PD-1配体，因此在肿瘤微环境(TME)中局部诱导免疫耐受并促进肿瘤细胞逃逸免疫攻击。已经假设两种促进PD-L1在肿瘤细胞上表达的一般机制。在一些肿瘤中，异常信号传导途径可以组成性地上调PD-L1表达，这种现象被称为“先天免疫抵抗”；在其它情况下，PD-L1的表达是一种在抗肿瘤免疫应答(“适应性免疫抵抗”)期间响应于在TME中产生的炎性细胞因子发生的适应性机制。这些PD-L1表达的机制并不相互排斥，即肿瘤细胞上的组成型PD-L1表达可能被细胞因子，如干扰素-γ(IFN-g)进一步上调。
治疗前肿瘤细胞的PD-L1表达与抗PD-1单一疗法(例如，纳武单抗(百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)；OPDIVOTM)、派姆单抗(默克公司(Merck)；
Figure BDA0003457831070000241
))和抗PD-L1疗法(例如，MPDL3280A(基因泰克(Genentech)/罗氏(Roche)))的应答高度相关。另外的检查点抑制剂包含：伊匹单抗和曲美木单抗(其靶向CTLA-4)；阿特珠单抗(基因泰克/罗氏；Tecentreq)、阿维鲁单抗(默克公司；Bavencio)和德瓦鲁单抗(Medimune/Strazeneca；Imfinzi)(其靶向对PD-L1)；以及西米普利单抗(REGN-2810)、纳武单抗、派姆单抗和匹地利珠单抗(其靶向PD-1)。斯巴达珠单抗(PDR001；诺华公司(Novartis))作为PD-1抑制剂也在研发中。
包含癌症治疗的PD-1阻断治疗的方法是本领域众所周知的。参见例如WO 2016/201425、US 2019/0275705，克维斯堡(Kvistborg)等人(科学转化医学(Science TranslMed.)6(254):254ra128,2014)、邹(Zou)等人(科学转化医学8(328):328rv4,2016)以及樱井(Sakuishi)等人,实验医学杂志(J Exp Med.)207(10):2187-2194,2010)。
PD-1阻断剂包含那些用于治疗癌症(即抑制肿瘤细胞的生长或存活)的药物。可以使用抗体或抗PD-1药剂或其它检查点抑制剂抑制其生长的癌症包含通常对免疫疗法有应答的癌症，但也包含迄今为止尚未与免疫疗法相关的癌症。用于治疗的癌症的实例包含黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。本文所述的治疗适用于显示与活检或外科手术材料中存在肿瘤浸润淋巴细胞相关的无病存活率和总体存活率提高的恶性肿瘤，例如黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、肾癌、胃/食管癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌。已知此类癌症亚型易于受到T淋巴细胞的免疫控制。此外，所提供的技术可用于治疗难治性或复发性恶性肿瘤，所述恶性肿瘤的生长可以使用PD-1或其它检查点阻断治疗进行抑制。具体地，癌症包含以PD-1和/或其配体PD-L1和/或PD-L2在被测组织样品中的升高的表达为特征的那些癌症，包含：卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌、胃癌、食道癌和黑色素瘤。癌症还包含与病毒持续感染相关的癌症，如人类免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)、已知与例如卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、宫颈癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌和口腔癌等因果相关的人乳头瘤病毒。
PD-1/PD-L1途径是开发用于癌症治疗的抗体治疗的经充分验证的靶标。抗PD-1抗体也可以用于慢性病毒感染。在急性病毒感染后产生的记忆CD8+T细胞是高度功能性的并且构成保护性免疫的重要组分。相比之下，慢性感染的特征通常为病毒特异性T-细胞应答的不同程度的功能性损伤(耗竭)，并且这种缺陷是宿主无法消除持久性病原体的主要原因。尽管在感染的初期过程中最初产生了功能性效应T细胞，但其在慢性感染的过程中逐渐失去功能。巴伯(Barber)等人(自然439:682-687,2006)示出感染有LCMV实验室毒株的小鼠会发展为慢性感染，从而导致血液和其它组织中的病毒水平高。这些小鼠最初产生了强烈的T细胞应答，但最终在T细胞衰竭时死于感染。作者发现，慢性感染小鼠中效应T细胞的数量和功能的下降可以通过注射阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用的抗体来逆转。
在特定实施例中，免疫检查点分子包含CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD160、B7-H3(CD276)、BTLA(CD272)、IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)、腺苷A2A受体(A2AR)和C10ORF54。
术语“免疫检查点蛋白”或“免疫检查点分子”是指由T细胞表达并且调大信号(刺激性检查点分子)或调低信号(抑制性检查点分子)的分子。免疫检查点分子在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如帕多尔(Pardoll),癌症自然评论(Nature Rev Cancer)12:252-264,2012；梅尔曼(Mellman)等人,自然480:480-489,2011)。抑制性检查点分子的实例包含A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD277、IDO、KIR、PD-1、LAG-3、TIM-3和VISTA。腺苷A2A受体(A2AR)被认为是癌症疗法的重要检查点，因为肿瘤微环境中腺苷水平相对较高，其通过激活A2AR导致负免疫反馈循环。B7-H3，也称为CD276，最初被认为是一种共刺激分子，但现在被认为是共抑制分子。B7-H4，也称为VTCN1，由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达，并在肿瘤逃逸中发挥作用。B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，也称为CD272，是HVEM(疱疹病毒进入介体)的配体。在人CD8+T细胞从原初到效应细胞表型的分化期间，BTLA的细胞表面表达逐渐下调；然而，肿瘤特异性人CD8+T细胞表达高水平的BTLA。CTLA-4，也称为CD152，在调节性T(Treg)细胞上过表达，并且用于控制T细胞增殖。IDO是色氨酸到犬尿氨酸代谢途径中的调节先天免疫和适应性免疫的色氨酸分解代谢酶。已知IDO抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞，产生并激活Treg和髓源性抑制细胞，并且促进肿瘤血管生成。另一个重要分子是TDO，即色氨酸2,3-双加氧酶，其是色氨酸到犬尿氨酸代谢途径中的关键酶(普拉滕(Platten)等人,免疫学前沿(Front Immunol.)5:673,2014)。KIR是NK细胞上MHC I类分子的受体。LAG-3通过对Treg的作用以及对CD8+T细胞的直接效应来抑制免疫应答。PD-1，即程序性死亡1(PD-1)受体具有两个配体——PD-L1和PD-L2。此检查点是黑色素瘤药物
Figure BDA0003457831070000261
(派姆单抗，新泽西州凯尼尔沃斯默克公司(Merck&Co.,Kenilworth,NJ))的靶标，所述药物于2014年9月获得FDA批准。靶向PD-1的一个优势是其可以恢复肿瘤微环境中的免疫功能。TIM-3在经激活的人CD4+T细胞上表达并且调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3通过在与其配体——半乳糖凝素-9相互作用时触发细胞死亡充当Th1/Tel功能的负调节剂。T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)主要在造血细胞上表达，使得在肿瘤内的白细胞上的VISTA的一致表达可能允许VISTA阻断在广泛范围的实体瘤中有效。
术语“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫抑制检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包含功能降低和完全阻断。在特定实施例中，免疫检查点抑制剂是特异性地识别免疫检查点蛋白的抗体。在特定实施例中，免疫检查点抑制剂包含肽、抗体、核酸分子和小分子。在特定实施例中，施用免疫检查点抑制剂以增强受试者中CD8+T细胞，具体地是受试者的肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖、迁移、持久性和/或细胞毒性活性。
免疫检查点抑制剂包含(直接或间接)抑制CTLA-4、PD-1、PD-L1等中的至少一种的药剂。用于本公开的方法中的合适的抗CTLA-4治疗剂包含抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、伊匹单抗、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4adnectins、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、抑制共刺激途径的CTLA-4抑制剂、WO 2001/014424中所公开的抗体、WO 2004/035607中所公开的抗体、US 2005/0201994中所公开的抗体以及EP1212422B1中所公开的抗体。在以下中描述了另外的抗CTLA-4抗体：US 5,811,097；US 5,855,887；US 6,051,227；US 6,984,720；WO 01/14424；WO 00/37504；US 2002/0039581；以及US 2002/086014。可以用于本公开的方法中的其它抗CTLA-4抗体包含例如在以下中所公开的那些抗体：WO 98/42752；US6,682,736；US 6,207,156；赫维茨(Hurwitz)等人,美国国家科学院院刊,95(17):10067-10071,1998；卡马乔(Camacho)等人,临床肿瘤学杂志,22(145):摘要,第2505期,2004(抗体CP-675206)；莫克尔(Mokyr)等人,癌症研究58:5301-5304,1998；US 5,977,318；US 6,682,736；US 7,109,003；以及US 7,132,281。
用于本公开的方法中的合适的抗PD-1和抗PD-L1治疗剂包含抗PD-1和抗PD-L1抗体、人抗PD-1和抗PD-L1抗体、小鼠抗PD-1和抗PD-L1抗体、哺乳动物抗PD-1和抗PD-L1抗体、人源化抗PD-1和抗PD-L1抗体、单克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、多克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、嵌合抗PD-1和抗PD-L1抗体。在特定实施例中，抗PD-1治疗剂包含纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680(英国剑桥阿斯利康公司)以及其组合。在特定实施例中，抗PD-L1治疗剂包含阿特珠单抗、BMS-936559(纽约州纽约市百时美施贵宝)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)以及其组合。
在托帕利安(Topalian)等人,(癌细胞27:450-461,2015)中描述了合适的抗PD-1和抗PD-L1抗体。
在特定实施例中，免疫检查点抑制剂可以包含经修饰的配体或反义核酸分子，如设计为抑制特定免疫检查点分子的siRNA。在特定实施例中，siRNA阻止免疫检查点分子的翻译，从而阻止蛋白质的表达。考虑到许多免疫检查点分子的基因组序列是已知的，本领域普通技术人员将能够使用常规方法来设计合适的抑制性反义核酸分子。
在某些实施例中，检查点抑制剂可以是siRNA、小分子抑制剂或针对(特异于)有益于癌症治疗的免疫检查点分子的抗体。此类靶标包含PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、B7-H3、VISTA、A2AR和IDO(凯尔(Khair)等人,免疫学前沿,10:453,2019)。
本领域普通技术人员将理解如何访问此类靶标的代表性序列，所述代表性序列可在公共序列数据库中容易获得。下表提供了样品序列信息：
Figure BDA0003457831070000281
(IV)任选的另外的组分
除了有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂之外，本文提供的治疗构建体可以任选地含有一或多种任选的组分或与一或多种任选的组分一起施用。这些任选的组分包含佐剂、治疗性寡核苷酸、另外的抗癌剂和靶向部分。
佐剂
本文提供的治疗构建体任选地可以包含至少一种佐剂组分，所述至少一种佐剂组分包含在递送媒剂内或以其它方式与递送媒剂相关联。治疗构建体实施例不限于特定类型的佐剂，尽管本文提供了具体实例。
通常，佐剂是任何物质，其混合到疫苗组合物中会增加或以其它方式修饰对(癌症)抗原的免疫应答。佐剂增加对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少。例如，体液免疫的增加典型地表现为针对抗原产生的抗体的效价显著增加，而T细胞活性的增加典型地表现为抗原特异性T细胞增殖、靶细胞死亡或细胞因子分泌增加。佐剂还可以例如通过将初次体液或Th2应答变为初次细胞或Th1应答而改变免疫应答。
合适的佐剂包含但不限于结合TLR的DNA取代基，如CpG寡核苷酸(例如，ISS 1018；Amplivax；CpG ODN 7909、CpG ODN 1826、CpG ODN D19、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpGODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395、ODN M362和SD-101)；含有CpG序列的DNA TLR激动剂(例如，dSLIM)、非CpG DNA TLR激动剂(例如，EnanDIM)和阳离子肽缀合的CpG寡核苷酸(例如，IC30、IC31)；RNA TLR激动剂(例如，Poly I:C和Poly-ICLC)；铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝和硫酸铝钾)；抗CD40抗体(例如，CP-870,893)；细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；小分子TLR激动剂(例如，咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特或3M-052)；融合蛋白(例如，ImuFact IMP321、CyaA和ONTAK)；基于油或表面活性剂的佐剂，如MF59、Montanide IMS 1312、Montanide ISA206、Montanide ISA 50V和Montanide ISA-51；植物提取物，如源自皂苷的QS21刺激元(美国马萨诸塞州伍斯特阿奎拉生物技术公司)；分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物，如脂多糖(例如，单磷酰基脂质A、OM-174、OM-197-MP-EC或Pam3Cys)；呫吨酮衍生物(例如，瓦德美赞)；其混合物(例如，AS-15)；以及其它专有佐剂，如里比公司的Detox、Quil或Superfos。先前已经描述了若干种免疫佐剂(例如，对树突细胞具有特异性的MF59以及其制剂)(杜普伊(Dupuis)等人,细胞免疫学(Cell Immunol.)186(1):18-27,1998；艾莉森(Allison),生物标准化进展(Dev BiolStand.)；92:3-11,1998)。细胞因子也可以用作佐剂。已经将若干细胞因子直接与影响树突细胞向淋巴组织的迁移(例如，TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利第5,849,589号)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(加布里洛维奇(Gabrilovich)等人,侧重于肿瘤免疫学的免疫疗法杂志(J ImmunotherEmphasis Tumor Immunol.)(6):414-418,1996)相联系。Toll样受体(TLR)或激活TLR的药剂也可以用作佐剂，并且是模式识别受体(PRR)家族的重要成员，所述PRR识别许多微生物共享的保守基序，被称为“病原体相关的分子模式(PAMPS)”。
在一些实施例中，佐剂包含CpG寡核苷酸。据报道，CpG免疫刺激性寡核苷酸也可以增强疫苗环境中佐剂的效果。不受任何特定机械理论的束缚，CpG寡核苷酸至少部分地经由Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)通过激活先天性(非适应性)免疫系统而起作用。CpG触发的TLR9激活增强了对多种多样抗原的抗原特异性体液和细胞应答，包含预防性疫苗和治疗性疫苗两者中的肽或蛋白抗原、活病毒或灭活病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及多糖缀合物。更重要的是，其增强了树突细胞的成熟和分化，从而导致TH1细胞的激活增强和强大的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生，即使在不存在CD4 T细胞帮助的情况下也是如此。即使在不存在如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA)等通常促进TH2偏倚的疫苗佐剂的情况下，由TLR9刺激诱导的TH1偏倚也得以维持。CpG寡核苷酸在与其它佐剂一起调配或共同施用时或在如微粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似调配物等调配物中示出了甚至更高的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这对于诱导强烈应答尤其必要。其还加速了免疫应答并使抗原剂量降低两个数量级，在一些实验中，在没有CpG的情况下对全剂量疫苗产生相当的抗体应答(克里格(Krieg),自然评论药物发现(Nature Reviews，Drug Discovery),5:471-484,2006)。美国专利第6,406,705号描述了CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原的组合使用以诱导抗原特异性免疫应答。可商购获得的CpG TLR9激动剂是Mologen(德国柏林(Berlin,GERMANY))的dSLIM(双茎环免疫调节剂)。也可以使用其它TLR结合分子，如结合RNA的TLR 7、TLR 8和/或TLR9。
根据本发明的实施例，呫吨酮衍生物，例如瓦德美赞或AsA404(也称为5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA))也可以用作佐剂。可替代地，此类衍生物也可以例如通过全身或瘤内递送与本发明的疫苗并行施用，以刺激肿瘤部位处的免疫。在不受理论束缚的情况下，据信此类呫吨酮衍生物通过经由IFN基因ISTING受体的刺激物刺激干扰素(IFN)产生而起作用(参见例如康伦(Conlon)等人,免疫学杂志(J Immunology),190:5216-5225,2013；以及吉姆(Kim)等人,美国化学学会化学生物学杂志(ACS Chem Biol),8:1396-1401,2013)。其它有用佐剂的实例包含但不限于经化学修饰的CpG(例如，CpR、Idera)、Poly(I:C)(例如，polyi:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA以及可以在治疗上起作用和/或作为佐剂起作用的免疫活性小分子和抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗(bevacizumab)、CelebrexTM、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉非尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、、AZD2171、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)和SC58175。本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下容易地确定在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度。另外的佐剂包含集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
Poly-ICLC是一种合成制备的双链RNA，其由平均长度为约5000个核苷酸的polyl和polyC链组成，已经通过添加聚赖氨酸和羧甲基纤维素使其对血清核酸酶的热变性和水解具有稳定性。所述化合物激活TLR3和MDA5的RNA解旋酶结构域，这两个都是PAMP家族的成员，从而导致DC和自然杀伤(NK)细胞激活并产生I型干扰素、细胞因子和趋化因子的“天然混合物”。此外，poly-ICLC通过两个IFN诱导型核酶系统，即2'5'-OAS和Pl/eIF2a激酶(也称为PKR(4-6))以及RIG-I解旋酶和MDA5发挥更直接、更广泛的宿主靶向抗感染和可能的抗肿瘤作用。
可以与治疗构建体相关的免疫佐剂的实例包含TLR配体、C型凝集素受体配体、NOD样受体配体、RLR配体和RAGE配体。TLR配体可以包含脂多糖(LPS)及其衍生物以及脂质A及其衍生物，包含但不限于单磷酰基脂质A(MPL)、吡葡亚硝脲基(glycopyranosyl)脂质A、PET-脂质A和3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A。在一个特定实施例中，免疫佐剂是MPL。在另一个实施例中，免疫佐剂是LPS。TLR配体还可以包含但不限于TLR3配体(例如，聚肌-聚胞苷酸(poly(I:C))、TLR7配体(例如，咪喹莫特和瑞喹莫特)和TLR9配体。
如本文所使用的，术语“结合TLR的DNA取代基”是指能够与toll样受体(“TLR”，包含至少一种脱氧核糖核酸)结合的取代基或部分。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是核酸。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含至少一种核酸类似物。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含至少一种具有替代主链的核酸类似物(例如，磷酸二酯衍生物(例如，氨基磷酸酯、膦酸二酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰乙酸、膦酰甲酸、甲基膦酸酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺)、肽核酸主链、LNA或键)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基中的所有核苷酸糖都是脱氧核糖(例如，所有核苷酸都是DNA)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基由DNA组成。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是具有选自磷酸二酯和磷酸二酯衍生物(例如，氨基磷酸酯、膦酸二酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰乙酸、膦酰甲酸、甲基膦酸酯、硼膦酸酯、O-甲基亚磷酰胺或其组合)的核苷酸间键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基由具有选自磷酸二酯和硫代磷酸酯的核苷酸间键的DNA组成。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是具有选自磷酸二酯和二硫代磷酸酯的主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含磷酸二酯主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含硫代磷酸酯主链键的DNA。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是包含二硫代磷酸酯主链键的DNA。在实施例中，与其它TLR相比，结合TLR的DNA取代基优先地结合TLR9。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR9。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR3。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR7。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合TLR8。在实施例中，结合TLR的DNA取代基特异性地结合细胞亚区室(例如，内体)相关的TLR(例如，TLR3、TLR7、TLR8或TLR9)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含或者是富含G的寡核苷酸。在实施例中，结合TLR的DNA取代基包含CpG基序，其中C和G是核苷酸并且p是连接C和G的磷酸酯。在实施例中，CpG基序是未甲基化的。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是A类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是B类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基是C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在实施例中，结合TLR的DNA取代基(例如，结合TLR9的DNA取代基)由具有A、G、C或T碱基和磷酸二酯键和/或磷酸二酯衍生物键(例如，硫代磷酸酯键)的脱氧核糖核酸组成。
短语“CpG基序”是指通过磷酸二酯核苷酸间键或磷酸二酯衍生物核苷酸间键与3'G核苷酸连接的5'C核苷酸。在实施例中，CpG基序包含磷酸二酯核苷酸间键。在实施例中，CpG基序包含磷酸二酯衍生物核苷酸间键。
如本文所使用的，术语“A类CpG ODN(Class A CpG ODN)”或“A类CpG ODN(A-classCpG ODN)”或“D型CpG ODN”或“A类CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代以下：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含在5'、3'或两端处的一或多个poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；或者连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，A类CpG ODN包含在5'、3'或两端处的poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；以及连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。A类CpG ODN的实例包含ODN D19、ODN 1585、ODN 2216和ODN 2336。
术语“B类CpG ODN(Class B CpG ODN)”或“B类CpG ODN(B-class CpG ODN)”或“K型CpG ODN”或“B类CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代以下：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含一或多个包含CpG基序的6聚体基序；连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，B类CpG ODN包含6聚体基序的一或多个拷贝，所述6聚体基序包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。在实施例中，B类CpG ODN包含一个包含CpG基序的6聚体基序。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的两个拷贝。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的三个拷贝。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的四个拷贝。B类CpG ODN的实例包含ODN 1668、ODN 1826、ODN2006和ODN 2007。
术语“C类CpG ODN(Class C CpG ODN)”或“C类CpG ODN(C-class CpG ODN)”或“C型CpG DNA序列”根据其在生物学和化学科学中的共同含义使用并且指代包含回文序列的寡脱氧核苷酸，所述回文序列包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物(硫代磷酸酯)。C类CpG ODN的实例包含ODN 2395和ODN M362。
治疗性寡核苷酸：
任选地，所提供的治疗构建体可以含有一或多种治疗性寡核苷酸。可以使用不同类型的治疗性寡核苷酸，并且所述治疗性寡核苷酸非穷尽地包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶、适体、DNA、mRNA、sgRNA(用于CRISPR)和CRISPR-cas9元件。换句话说，可以使用任何核苷酸链，只要其可以特异性地调节(干扰或增强)某些基因和蛋白质的作用或合成。每个特定寡核苷酸可以具有单个或多个靶标。本发明所关注的基因/蛋白质靶标的实例包含(本文其它地方论述的)免疫检查点、转录因子、磷酸酶、激酶等。特异性靶标包含但不限于STAT3、TGF-β、CD47、NOX1-5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、生存素、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、角蛋白K6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、弗林蛋白酶、KSP、eiF-4E、p53、β-连环蛋白、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、p65以及如上文所提及的有丝分裂激酶(例如，PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、CDK1、CDK2、CHK1、CHK2、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN、极光激酶A)。治疗性寡核苷酸还可以含有靶向两个基因的两条链(如针对BCL2和AKT1的siRNA、针对AR和MYC的siRNA)。其还可以含有免疫刺激序列/元件，所述免疫刺激序列/元件因此可以同时增强免疫应答并调节靶基因的表达。其还可以被设计为靶向上述具有突变的基因。
在某些实施例中，治疗构建体包含作为活性剂的介导RNA干扰的寡核苷酸。RNA干扰是一种由双链RNA(dsRNA)触发并且能够下调与dsRNA同源的基因的转录的高度保守的机制。dsRNA首先由Dicer加工成21-23个核苷酸的短双链体，称为短干扰RNA(siRNA)。并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其能够通过切割靶mRNA来介导基因沉默。“siRNA”或“小干扰核糖核酸”是指在生理条件下沿着互补区杂交的两条核糖核苷酸链。siRNA分子包括与靶基因的mRNA区基本上相同的双链区。与靶基因的对应序列具有100％同一性的区是合适的。此状态被称为“全互补”。然而，与靶基因的对应区相比，所述区也可以含有一个、两个或三个错配，这取决于被靶向的mRNA区的长度，并且如此可能不全互补。用于分析和鉴定具有足够序列同一性以有效抑制特异性靶序列表达的siRNA的方法是本领域已知的。合适的mRNA靶区将是编码区。非翻译区也是合适的，如5'-UTR、3'-UTR和剪接点，只要所述区是mRNA靶标所独有的并且不针对mRNA poly A尾。
在一些实施例中，在涉及RNA干扰的方法和系统中利用包封在治疗构建体内或与治疗构建体相关联的siRNA。此类实施例不限于特定大小或类型的siRNA分子。与靶标互补的siRNA区的长度例如可以为15个核苷酸到100个核苷酸、18个核苷酸到25个核苷酸、20个核苷酸到23个核苷酸或超过15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸或18个核苷酸。在与对应靶区存在错配的情况下，互补区的长度通常需要稍长一些。
在某些实施例中，可设想到，使用本文公开的治疗构建体的siRNA递送方法(例如，通过将siRNA装载在治疗构建体上)可以用于抑制任何所关注的基因的产生。具体靶标包含但不限于STAT3、TGF-β、CD47、NOX1-5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、生存素、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、角蛋白K6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、弗林蛋白酶、KSP、eiF-4E、p53、β-连环蛋白、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、p65以及如上文所提及的有丝分裂激酶，这些基因被称为癌症和其它疾病的驱动基因。此外，具体地，可设想到，siRNA可以针对变体或突变基因，而不是野生型基因。
本领域普通技术人员将理解如何访问这些靶标的代表性序列，所述代表性序列可在公共序列数据库中容易获得。下表提供了样品序列信息：
Figure BDA0003457831070000341
Figure BDA0003457831070000351
Figure BDA0003457831070000361
Figure BDA0003457831070000371
Figure BDA0003457831070000381
此类实施例不限于在体外和/或体内评估siRNA的递送特性的特定方式。在一些实施例中，用显像剂(例如，荧光染料FITC、RITC、CyTM染料、
Figure BDA0003457831070000382
染料、Alexa
Figure BDA0003457831070000383
染料或镧系元素探针)或放射性示踪剂标记siRNA分子允许在器官水平上可视化siRNA分子的生物分布以及还有细胞内递送曲线。在一些实施例中，RT-PCR和蛋白质印迹分别用于在mRNA水平和蛋白质水平上分析靶蛋白。
在某些实施例中，本发明提供了用于抑制细胞中的靶基因的方法，所述方法包含将能够通过RNA干扰抑制靶基因的siRNA引入到(与治疗构建体相关的)所述细胞中，其中所述siRNA包括彼此互补的两条RNA链，其中所述siRNA被装载到治疗构建体上。在一些实施例中，siRNA在3'有义链上被胆固醇修饰。在一些实施例中，细胞在人或动物受试者(例如，马、狗、猫或其它家养动物、农场动物或其它患有癌症的动物)体内。
微RNA(miRNA)或miRNA模拟物是短的非编码RNA，所述非编码RNA可以通过3'-UTR元件靶向并基本上沉默蛋白编码基因。miRNA在众多生物过程中的重要作用已经被确立，但缺乏对复杂疾病中的miRNA功能的综合分析。miRNA最初被转录为初级miRNA(pri-miRNA)，所述初级miRNA然后被核RNAse Drosha和Pasha切割以产生前体-miRNA(pre-miRNA)。这些前体由细胞质RNAse III dicer进一步加工以形成短双链miR-miR*双链体，然后将其中的一条链(miR)整合到包含酶dicer和Argonaute(Ago)的RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。成熟的miRNA(约17-24nt)将RISC引导到位于靶基因的3'UTR内的特异性靶位点。一旦与靶位点结合，miRNA就会通过mRNA衰变、翻译抑制和/或隔离进入处理小体(P小体)中来遏制翻译(欧拉利奥(Eulalio)等人,细胞(Cell),132:9-14,2008；贝姆-安斯曼特(Behm-Ansmant)等人,冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.),71:523-530,2006；朱(Chu)和拉娜(Rana),公共科学图书馆·生物学(Plos.Biology.),4:e210,2006)。最近的估计发现超过60％的蛋白编码基因携带3'-UTR miRNA靶位点(弗里德曼(Friedman)等人,基因组研究(Genome Res.),19:92-105,2009)。在这方面，miRNA充当各种过程的关键调节剂，如早期发育(莱因哈特(Reinhart)等人，自然(Nature),403:901-906,2000)、细胞增殖和细胞死亡(布伦内克(Brennecke)等人,细胞,113(1):25-36,2003)、细胞凋亡和脂肪代谢(徐(Xu)等人,当代生物学(Curr.Biol.),13(9):790-795,2003)和细胞分化(陈(Chen)等人,分子微生物学(Mol.Microbiol.),53843-856,2004；Dostie等人,RNA协会的RNA-A出版物(RNA-A Publication of the RNA Society),9:180-186,2003)。此外，对慢性淋巴细胞白血病(卡林(Calin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),105:5166-5171,2008)、结肠腺癌(迈克尔(Michael)等人，分子癌症研究(Mol.Cancer Res.),1:882-891,2003)、伯基特淋巴瘤(梅茨勒(Metzler)等人,基因、染色体和癌症(GenesChromosomes Cancer),39:167-169,2004)、心脏病(赵(Zhao)等人,细胞,129:303-317,2007)和病毒感染(费弗尔(Pfeffer)等人,科学,304:734-736,2004)中miRNA表达的研究表明miRNA与多种疾病之间的重要联系。
迄今为止观察到的miRNA的长度为大约21-22个核苷酸，并且其来自较长的前体，所述前体由非蛋白质编码基因转录而来。在卡林顿(Carrington)和安布罗斯(Ambros)(科学,301(5631):336-338,2003)中进行综述。前体形成在自互补区中相互折叠的结构；然后其被动物中的核酸酶Dicer(或植物中的DCL1)加工。miRNA分子通过与其靶标精确或不精确的碱基配对来中断翻译。在一些实施例中，miRNA可以用作所提供的在治疗上或施用于受试者(如人类患者)以治疗疾病(例如，癌症)的治疗构建体的组分；可替代地，在一些实施例中，与miRNA互补的核酸可以在体内在治疗上施用于受试者或者在体外使用以产生期望的治疗性miRNA(例如，miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124或miRNA-138)。以此方式，互补核酸可以用作模板以产生期望的治疗性miRNA(例如，miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124或miRNA-138)。
另外的抗癌剂：
短语“抗癌剂”按照其普通一般含义使用，并且是指具有抗肿瘤性质或抑制细胞生长或增殖的能力的组合物(例如，化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是靶向治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有效用的药剂。在一些实施例中，抗癌剂是由FDA或除美国以外国家的类似监管机构批准的用于治疗癌症的药剂。
抗癌剂的实例包含但不限于：MEK(例如MEK1、MEK2或MEK1和MEK2)抑制剂(例如，XL518、CI-1040、PD035901、司美替尼(selumetinib)/AZD6244、GSK1120212/曲美替尼(trametinib)、GDC-0973、ARRY-162、ARRY-300、AZD8330、PD0325901、U0126、PD98059、TAK-733、PD318088、AS703026、BAY 869766、PD184352、SB239063、BAY43-9006)；烷化剂，如氮芥(例如，甲氯乙胺(mechloroethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、乌拉莫司汀(uramustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、马法兰(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide))、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺和噻替哌(thiotepa))、烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)和海普舒凡(hepsulfam))、亚硝基脲(nitrosourea)(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司丁(lomusitne)、司莫司汀(semustine)和链脲佐菌素(streptozocin))和三氮烯(例如，达卡巴嗪(decarbazine))；抗代谢物，如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、亚叶酸(leucovorin)、雷替曲塞(raltitrexed)和培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxouridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、卡培他滨(capecitabine)和吉西他滨(gemcitabine))和嘌呤类似物(例如，巯嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、喷司他丁(pentostatin)、氟达拉滨(fludarabine)和5-硫唑嘌呤(azathioprine))；植物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛和高三尖杉酯碱(homoharringtonine))；拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱衍生物(例如，伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan))、安吖啶(amsacrine)和表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)(例如，依托泊苷(etoposide)(VP16)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)和替尼泊苷(teniposide))；抗生素，如蒽二酮(例如，米托蒽醌)、蒽环类药物(如多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)和盐酸氟柔红霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride))、链霉菌源性抗生素或其衍生物(例如，放线菌素(dactinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、格尔德霉素(geldanamycin)、普卡霉素(plicamycin)和17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG；坦螺旋霉素(tanespimycin))、氯法齐明(clofazimine)和β内酰胺衍生物；铂类化合物(例如，顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin))；经取代的脲(例如，羟基脲(hydroxyurea))；甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(mitotane)和氨鲁米特(aminoglutethimide))；血管生成抑制酶(例如，L-天冬酰胺酶和精氨酸脱亚胺酶)；PI3K抑制剂(例如，渥曼青霉素(wortmannin)和LY294002)；mTOR抑制剂(例如，舍曲林(sertraline))；DNA甲基转移酶抑制剂(例如，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)；反义寡核苷酸；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂(例如，脱氧腺苷和雷公藤甲素)；BCR/ABL拮抗剂；bFGF抑制剂；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；硝酸镓；明胶酶抑制剂；谷胱甘肽抑制剂(例如，依他硝唑(etanidazole))；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；白血病抑制因子；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；MIF抑制剂；错配的双链RNA；分枝杆菌细胞壁提取物；一氧化氮调节剂；磷酸酶抑制剂；纤溶酶原活化物抑制剂；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；核酶；信号转导抑制剂/调节剂(例如，伊曲康唑(itraconazole))；单链抗原结合蛋白；干细胞抑制剂；干细胞分离抑制剂；溶基质素抑制剂；合成糖胺聚糖；端粒酶抑制剂；促甲状腺激素；翻译抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)，如戈舍瑞林(goserelin)和亮丙瑞林(leuprolide/leuprorelin)；类固醇，如肾上腺皮质类固醇(例如，强的松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone))；孕酮(例如，己酸羟孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸甲羟孕酮)；抗黄体素(antiprogestrogen)(例如，米非司酮(mifepristone))；雌激素(例如，己烯雌酚(di-ethlystilbestrol)和乙炔雌二醇(ethinyl estradiol))；抗雌激素，如芳香酶抑制剂(例如，依西美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、来曲唑(letrozole)、喷托唑(pentrozole)和阿那曲唑(anastrozole))、选择性雌激素受体调节剂(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、他莫昔芬甲碘化物(tamoxifen methiodide)、帕诺米芬(panomifene)和氯米芬(clomifene)类似物)；雄激素(例如，丙酸睾酮(testosterone propionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone))；抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、非那雄胺(finasteride)和比卡鲁胺(bicalutamide))；免疫刺激剂，如左旋咪唑(levamisole)、白介素(例如，白介素-2)和干扰素/干扰素激动剂(例如，α-干扰素)；单克隆抗体，如抗CD20(例如，利妥昔单抗)、抗HER2(例如，曲妥珠单抗)、抗CD52、抗CD25(例如，达利珠单抗(daclizumab))、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)；免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-卡奇霉素(calicheamicin)缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)缀合物等)；放射免疫治疗剂(例如，与111In、90Y或131I等缀合的抗CD20单克隆抗体)；他汀类药物(例如，西立伐他汀(cerivastatin)和匹伐他汀(pitavastatin))；5-T1B受体激动剂(例如，5-壬基氧基色胺)；BRAF激酶抑制剂(例如，维莫非尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib))；酪氨酸激酶抑制剂，如EGFR、HER2、KDR、FLT4、EphB4和Src中的一或多种的抑制剂(例如，吉非替尼(gefitinib)(IressaTM)、厄洛替尼(erlotinib)(TarcevaTM)、西妥昔单抗(ErbituxTM)、拉帕替尼片(lapatinib)(TykerbTM)、帕尼单抗(panitumumab)(VectibixTM)、凡德他尼(vandetanib)(CaprelsaTM)、阿法替尼(afatinib)/BIBW2992、CI-1033/卡奈替尼(canertinib)、来那替尼(neratinib)/HKI-272、CP-724714、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、AG-1478、达克替尼(dacomitinib)/PF299804、OSI-420/去甲基厄洛替尼(desmethyl erlotinib)、AZD8931、ARRY-380、AEE788、培利替尼(pelitinib)/EKB-569、CUDC-101、WZ8040、WZ4002、WZ3146、AG-490、XL647、PD153035、BMS-599626、索拉非尼(sorafenib)、伊马替尼(imatinib)
Figure BDA0003457831070000421
舒尼替尼(sunitinib)和达沙替尼(dasatinib))；免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4、抗PD1/L1抗体)；PLK1抑制剂(GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727)、有丝分裂激酶抑制剂等或其混合物(例如，亮丙瑞林+雌激素+孕酮)。
此外，本文所述的治疗构建体可以与常规免疫治疗剂共同施用，所述常规免疫治疗剂包含但不限于免疫刺激剂(例如，卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素等)、治疗性单克隆抗体(例如，抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)、免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-刺孢霉素缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等)、免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4、抗PD-1、抗PD-L1抗体)和放射免疫疗法(例如，与111In、90Y或131I等缀合的抗CD20单克隆抗体)。这些免疫治疗剂也可以直接装载到治疗构建体上，以增强其治疗效果、降低毒性并缩短施用时间。
在另一个实施例中，本文所述的治疗构建体可以与常规放射治疗剂共同施用，所述常规放射治疗剂包含但不限于放射性核素，如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At和212Bi。这些放射治疗剂也可以直接装载到治疗构建体上，以增强治疗效果、降低毒性并缩短施用时间。
靶向部分
可以将一或多个靶向部分(也称为靶向分子)装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。在实施例中，靶向部分展示在递送媒剂的外表面上。此类靶向部分可能特别有利于全身递送。
示范性靶分子包含与和器官、组织、细胞或细胞外基质或特定类型的肿瘤或受感染细胞相关的一或多个靶标结合的蛋白质、肽、配体、核酸、脂质、糖类或多糖。可以通过选择具有适当亲和力和特异性的靶向分子来调节递送媒剂所靶向的特异性程度。例如，抗体是非常特异的。这些可以是多克隆、单克隆片段、重组或单链，其中许多是可商购获得的或者使用标准技术容易地获得的。T细胞特异性分子、抗原和靶向肿瘤的分子可以与治疗构建体的表面结合。靶向分子可以与存在于颗粒表面上的一或多个PEG链的末端缀合。
在一些实施例中，靶向部分是特异性地识别细胞或肿瘤标志物的抗体或其抗原结合片段(例如，单链可变片段)，所述细胞或肿瘤标志物仅或大量存在于靶细胞，如恶性细胞(例如，肿瘤抗原)上。可以用于将治疗构建体引导到所关注的细胞和组织的合适的靶向分子以及将靶分子与纳米颗粒缀合的方法是本领域已知的。
参见例如鲁奥斯拉蒂(Ruoslahti)等人(癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer)2:83-90,2002)。在某些情况下，治疗剂可能对癌症和免疫细胞两者都有毒性，从而导致功效欠佳。因此，在某些实施例中，治疗构建体可以与靶向部分缀合以富集至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂仅向癌细胞的递送。实例非排他性地包含针对在癌细胞上过表达的HER2、EGFR、PD-L1等的抗体。在一些实施例中，治疗构建体可以与靶向部分缀合以富集至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂仅向免疫细胞的递送。
靶向分子还可以包含神经纤毛蛋白和内皮靶向分子、整合素、选择素、粘附分子、靶向骨的分子，如唑来膦酸和阿仑膦酸(例如以靶向转移到骨的癌症)、基质和靶向成纤维细胞的分子。
在一些实施例中，靶向部分将治疗构建体靶向抗原呈递细胞(APC)以及具体地被称为树突细胞的APC亚类。树突细胞表达许多可以介导内吞作用的细胞表面受体。在一些实施例中，治疗构建体增强DC的活性以加工肿瘤抗原。可以执行到DC的靶向递送。将外源性抗原靶向系统分布的抗原呈递细胞上的内化表面分子可促进颗粒的吸收，并且可以克服疗法中的主要限速步骤。
靶向树突细胞的分子包含识别并结合树突细胞表面上展示的表位的单克隆或多克隆抗体或其片段。靶向树突细胞的分子还包含与树突细胞上的细胞表面受体结合的配体。一种此类受体，即凝集素DEC-205，已经被用于体外和小鼠体内，以将体液(基于抗体)和细胞(CD8 T细胞)应答两者增强2-4个数量级(哈维格(Hawiger)等人,实验医学杂志(J.Exp.Med.),194(6):769-79,2001；博尼法兹(Bonifaz)等人,实验医学杂志,196(12):1627-38 2002；博尼法兹等人,实验医学杂志,199(6):815-24,2004)。在这些报告中，抗原与抗DEC205重链融合，并且使用重组抗体分子进行免疫。
包含甘露糖特异性凝集素(甘露糖受体)和IgG Fc受体的多种其它内吞受体也已经以此方式靶向，其中抗原呈递效率类似地增强。可以靶向的其它合适的受体包含但不限于DC-SIGN、33D1、SIGLEC-H、DCIR、CD11c、热休克蛋白受体和清道夫受体。这些受体的靶向部分可以附着于治疗构建体，以便其优先吸收到表达这些受体的免疫细胞中。实例是甘露糖附着于治疗构建体，以靶向递送到具有高水平甘露糖受体的巨噬细胞和DC。
可能被靶向的其它受体包含toll样受体(TLR)。TLR识别并结合病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP靶向树突细胞表面上的TLR并在内部发出信号，由此潜在地增加DC抗原摄取、成熟和T细胞刺激能力。与颗粒表面缀合或共包封的PAMP包含未甲基化的CpG DNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂阿拉伯甘露聚糖(细菌)、酵母聚糖(酵母)、支原体脂蛋白，如MALP-2(细菌)、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷-胞苷)酸(细菌)、脂磷壁酸(细菌)或咪唑并喹啉(合成的)。
可以使用本领域已知的多种方法将靶向分子与递送媒剂共价结合。在优选的实施例中，靶向部分通过聚乙二醇化或生物素-亲和素桥附着于递送媒剂。
CD40激动剂：在特定实施例中，靶向部分靶向CD40。所述部分可以是CD40激动剂。细胞表面分子CD40是肿瘤坏死因子受体超家族的一员并且通过免疫、造血、血管、上皮和其它细胞(包含多种肿瘤细胞)广泛表达。作为癌症疗法的潜在靶标，CD40可以通过免疫激活的间接作用和对肿瘤的直接细胞毒性作用介导肿瘤衰退，从而导致CD40激动剂的“二合一”作用机制。CD40激动剂是本领域已知的并且在旺达黑德(Vonderheide)(临床癌症研究(Clin Cancer Res),13(4):1083-1088,2007)中有综述。示范性激动剂包含重组CD40L(重组人三聚体)、CD-870、893(全人IgG2 mAb)、SGN-40(人源化IgG1)和HCD122(全人IgG1mAb)。在T细胞介导的免疫的鼠类模型中，可溶性激动性CD40抗体已经被证明可以取代CD4+淋巴细胞提供的T细胞帮助(卡利尔(Khalil)等人,癌症疗法的最新进展(Update CancerTher.)2:61-65,2007)。
整合素配体：在另一个实施例中，靶向部分是整合素的配体。研究表明，整合素在肿瘤细胞表面上过度表达，并且因此可以用作区分肿瘤细胞与正常细胞的标志物。某些整合素还通过细胞外途径激活TGF-β。在潜伏的TGF-β从肿瘤细胞中释放出来后，其与肿瘤细胞表面上的整合素结合，从而导致潜伏的TGF-β激活。肿瘤微环境中增加的TGF-β浓度支持免疫抑制并将调节性T细胞募集到肿瘤环境。
RGD肽可以提供双重功能：其不仅是典型的靶向整合素的配体(鲁奥斯拉蒂等人,细胞与发育生物学年度评论(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.),12:697-715,1996)，而且也可以用作免疫危险信号，从而激活APC(阿尔廷切克(Altincicek)等人,生物化学杂志(BiolChem.)390,1303-11,2009)。因此，在优选的实施例中，RGD肽被装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。
识别p53抗原的T细胞受体：在特定实施例中，靶向部分是在人MHC的背景下识别p53抗原的T细胞受体(TCR)。源自细菌、真核或酵母细胞的T细胞受体重组蛋白包含由α、β链或γ/δ链(α/βTCR或γ/ΔTCR)构成的T细胞受体。
IL-15/IL-15Rα：在另一个实施例中，靶向部分是IL-15/IL-15Rα复合物。白介素-15(IL-15)是与IL-2共享某些受体亚基并且因此具有一些重叠的作用机制的细胞因子。IL-15由树突细胞表达，并且为自然杀伤(NK)细胞的增殖和致敏提供关键信号。因此，IL-15/IL-15Rα复合物可以用于将纳米微粒组合物靶向到例如自然杀伤(NK)细胞。
(V)递送系统
本文所提供的治疗构建体的实施例对于用于共同递送至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂的递送系统是不可知的。因此，在各个实施例中，递送系统可以使用或基于任何类型的已知或待开发的微粒递送媒剂。这些包含纳米颗粒、富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支化和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、磷酸钙颗粒、铝盐颗粒、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、基于脂质的纳米颗粒、脂质复合物、聚合物纳米颗粒、多聚复合物、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、玻璃和聚合物微球和纳米球、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、银纳米颗粒、碳纳米颗粒、铁纳米颗粒、多孔和无孔二氧化硅纳米颗粒和经修饰的胶束。也可以使用由若干类材料组成的混合颗粒。可以使用纳米和微米尺寸的颗粒。治疗剂、佐剂和任何另外的化合物可以通过任何合适的方式与递送剂包含在一起，例如装载到递送系统中、附着于递送系统的表面、偶联到递送系统、围封在递送系统内或包含在递送系统内。此类药剂可以被包封、共价结合或非共价结合(例如，通过静电、疏水、范得华(van derWaals)或化合物特异性相互作用(如核酸碱基配对、配体-受体、抗体-抗原、生物素-亲和素等))。
在一些实施例中，递送系统包含介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)，如在美国专利公开第US2017/0172923号或第2017/0173169号中描述的那些纳米颗粒，其中MSNP特此通过引用并入本文。
在一些实施例中，介孔纳米颗粒(或不同的纳米颗粒)的平均粒径为约5nm到约200nm、约5nm到约90nm、约5nm到约20nm、约30nm到约100nm、约30nm到约80nm、约30nm到约60nm、约40nm到约80nm、约70nm到约90nm、或约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm或约100nm。在一些实施例中，介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有阳离子聚合物或其它化合物。阳离子聚合物可以使用任何合适的方式与纳米颗粒的表面结合。在一些实施例中，阳离子聚合物通过静电相互作用与纳米颗粒结合。阳离子聚合物可以是任何带正电荷的聚合物，如但不限于PEI、聚酰胺-胺、聚(烯丙胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、壳聚糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)、聚(L-赖氨酸)、二乙基氨基乙基-葡聚糖、聚-(N-乙基-乙烯吡啶溴化铵)、聚(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙二醇)-共-聚(三甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯氯化物)。其它阳离子聚合物对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在例如由布兰德鲁普(Brandrup)、E.H.伊默古特(E.H.Immergut)和E.A.格拉库(E.A.Grukle)编辑的聚合物手册(Polymer Handbook),第4版,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,2003)中找到。
阳离子聚合物可以是线性的或支化的。在一些实施例中，阳离子聚合物的尺寸的范围可以为约500Da到25kDa并且可以是支化的或线性的。例如，平均尺寸为1.8kDa到10kDa的支化PEI可以装载到纳米颗粒核上。阳离子聚合物与纳米颗粒的比率可以根据期望的结果而变化。阳离子聚合物可以以纳米构建体的1到50wt.％存在，例如5到40wt.％、10到30wt.％、20到30wt.％、5到15wt.％、5到20wt.％、5到25wt.％、5到30wt.％、10到20wt.％、10到25wt.％或25到40wt.％，例如约5wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、30wt.％或35wt.％。在一些实施例中，阳离子聚合物以10到20wt.％存在。
在一些实施例中，阳离子聚合物例如与预涂覆在纳米颗粒上或在纳米颗粒上涂覆后的可裂解的二硫键交联。在一些实施例中，在与纳米颗粒(例如，MSNP)结合之后，所附着的阳离子聚合物使用例如DSP(二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DTSSP(3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)和DTBP(二甲基3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯)交联。交联可以在溶液中不存在或存在游离阳离子聚合物的情况下发生。在其它实施例中，阳离子聚合物未交联。
稳定剂可以与MSNP(或不同的纳米颗粒)和/或阳离子聚合物例如通过任何合适的方式缀合。在一些实施例中，稳定剂与涂覆在纳米颗粒(例如，MSNP)上的交联阳离子聚合物的胺或其它反应基缀合。示范性稳定剂包含但不限于PEG、葡聚糖、聚唾液酸、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺或其组合。
稳定剂可以具有多个化学反应基，例如用于附着于纳米颗粒、阳离子聚合物和/或其它组分。例如，反应性稳定剂，例如PEG衍生物，可以具有两个亲电子部分，如含有迈克尔(Michael)受体和活化酯两者的马来酰亚胺-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-PEG-NHS)。与本发明的组合物和方法结合使用的稳定剂(例如，PEG)的分子量的范围通常在500Da-40kDa之间，例如2-10kDa。稳定剂可以以纳米构建体的1到50wt.％存在，例如，5到30wt.％、10到20wt.％、10到25wt.％、5到15wt.％、5到20wt.％、5到25wt.％或1到10wt.％，例如约5wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、35wt.％、40wt.％或45wt.％。
如本文所使用的，“平均粒径”通常是指颗粒群中颗粒的统计平均粒径(直径)。基本上球形的颗粒的直径可以指代物理或流体动力学直径。非球形颗粒的直径可以优先地指代流体动力学直径。如本文所使用的，非球形颗粒的直径可以指代颗粒表面上两点之间的最大线性距离。平均流体动力学粒径可以使用本领域已知的方法(如动态光散射)测量。
“单分散”和“均匀尺寸分布”在本文中可互换使用并且描述纳米颗粒或微粒的群体，其中所有颗粒的尺寸相同或几乎相同。如本文所使用的，单分散分布是指其中90％的分布位于中值粒径的15％以内、更优选地位于中值粒径的10％以内、最优选地位于中值粒径的5％以内的颗粒分布。
如本文所使用的，“纳米颗粒”通常是指直径为约5nm到但不包含约1微米，优选地20nm到约1微米的颗粒。颗粒可以具有任何形状。具有球形形状的纳米颗粒通常被称为“纳米球”。本发明不限于用于与被配置用于治疗或预防癌症和相关过度增殖性病症的至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂复合的特定类型或种类的纳米颗粒。
纳米颗粒的实例包含富勒烯(也称为C60、C70、C76、C80、C84)、内嵌金属富勒烯(EMI)(在其富勒烯笼内含有另外的原子、离子或簇)、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯(TNTEME，在碳笼内的三金属氮化物模板中形成的高对称四原子分子簇内嵌体)、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚(具有内部金属富勒烯和/或其它内部化学结构的纳米管)、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质颗粒脂质体、脂质复合物、聚合物纳米颗粒、多聚复合物、纳米壳、树枝状大分子、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、佐剂颗粒(例如，病毒体或其它病毒样颗粒)和纤维素纳米颗粒。其它示范性纳米颗粒包含玻璃和聚合物微球和纳米球、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、碳纳米颗粒和铁纳米颗粒。
在一些实施例中，纳米颗粒是经修饰的胶束。在这些实施例中，经修饰的胶束包括被修饰为含有疏水聚合物嵌段的多元醇聚合物。如本公开中所使用的，术语“疏水聚合物嵌段”表示其本身将是疏水的聚合物的一段。如本文所使用的，术语“胶束”是指分散在液体中的分子的聚集体。呈水溶液形式的典型胶束与和周围溶剂接触的亲水“头部”区形成聚集体，从而将疏水单尾区隔离在胶束中心。在一些实施例中，头部区可以是例如多元醇聚合物的表面区，而尾部区可以是例如多元醇聚合物的疏水聚合物嵌段区。
除了纳米级之外，本发明进一步涵盖使用微米级的颗粒。在使用微粒的情况下，优选的是约1-50微米的相对较小的微粒。为便于讨论，本文所使用的“纳米颗粒”涵盖真正的纳米颗粒(尺寸为约1nm到约1000nm)、微粒(例如，约1微米到约50微米)或两者。
纳米颗粒的实例包含例如但不限于顺磁纳米颗粒、超顺磁纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯类材料、无机纳米管、树枝状大分子、具有共价连接的金属螯合物的树枝状大分子、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些实施例中，纳米颗粒是金属纳米颗粒(例如，金、钯、铂、银、铜、镍、钴、铱或其两种或更多种的合金的纳米颗粒)。纳米颗粒可以包含核或核和壳，如核壳纳米颗粒一样。也可以使用由若干类材料组成的混合颗粒。
公开了含治疗构建体的组合物，所述含治疗构建体的组合物包含至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂，所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂和所述至少一种免疫检查点抑制剂各自装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。与在溶液中将一或多种活性剂递送到靶细胞相比，纳米微粒组合物提供了许多优点。例如，纳米微粒组合物在纳米颗粒上或纳米颗粒中呈现局部浓度的一或多种活性剂，从而在纳米颗粒遇到靶细胞时使亲合力增加。纳米微粒组合物还可以充当具有可调释放动力学的活性剂的贮库，所述释放动力学可以延长数天以延长一或多种药剂的有效全身半衰期和功效。
通常，将两种或更多种活性剂(包含至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂)装载到递送媒剂中、附着于递送媒剂的表面和/或围封在递送媒剂内。两种或更多种活性剂中的每一种活性剂的相对浓度和其在递送媒剂上或递送媒剂内的位置可以在组合物的制造期间被操纵以适应将被靶细胞接收的优选剂量和呈递。将两种或更多种活性剂装载到同一递送媒剂中或同一递送媒剂上允许将这两种或更多种活性剂同时呈递给靶细胞或同一肿瘤微环境或以其它方面预定的顺序呈递给靶细胞。
递送媒剂可以是例如纳米脂质凝胶、聚合物颗粒、二氧化硅颗粒、脂质体或多层囊泡。在某些实施例中，微粒递送媒剂是纳米级组合物，例如10nm到但不包含约1微米。然而，应当理解，在一些实施例中并且对于一些用途，颗粒可以更小或更大(例如，微粒等)。尽管本文公开的示例治疗构建体可以被称为纳米颗粒组合物，但应理解，在一些实施例中并且对于一些用途，微粒组合物可以稍大于纳米颗粒。例如，微粒组合物也可以介于约1微米到约1000微米之间。此类组合物可以被称为微粒组合物。
在治疗癌症的实施例中，期望颗粒具有适合于进入肿瘤微环境的尺寸。在特定实施例中，颗粒的尺寸适合于通过增强的渗透性和滞留(EPR)效应进入肿瘤微环境和/或肿瘤细胞。EPR是指某些尺寸的分子(例如，本文所讨论的微粒组合物)倾向于在肿瘤组织中比在正常组织中累积更多的特性。因此，在用于治疗癌症的组合物中，递送媒剂优选地在约25nm到约500nm的范围内(包含端值)，更优选地在约30nm到约300nm的范围内(包含端值)。
纳米脂质凝胶：纳米脂质凝胶是核壳纳米微粒，所述核壳纳米微粒将脂质体和基于聚合物的颗粒两者的优点组合以持续递送活性剂。在这些实施例和应用中的一些中，与常规纳米颗粒组合物相比，纳米脂质凝胶可以表现出增加的装载效率、增加的缓释和改善的大分子和分子组合的治疗功效。
通常，纳米脂质凝胶的外壳保护货物，并提供生物相容性以及用靶向分子进行官能化的表面。外壳将组分包封起来，因此所述组分在期望时(例如，响应于环境条件或刺激)才会暴露出来，从而产生单分散、可重复的颗粒群并介导内化为期望的细胞类型。可以是树枝状大分子或其它聚合物的内核具有与外壳分离和另外的功能。例如，内壳允许药物、疫苗或显像剂的二次沉积；增加具有不同物化特性的组分到颗粒中的装载；允许从颗粒中可调释放内容物；通过破坏内体来增加DNA/RNA、药物和/或蛋白质的胞质可用性，所有这些都会导致增强的药物作用、抗原呈递和转染/沉默。
纳米脂质凝胶具有含有一或多种主分子的聚合物基质核。聚合物基质优选地为水凝胶，如含有一或多个聚(环氧烷烃)片段(如聚乙二醇)和一或多个脂肪族聚酯片段(如聚乳酸)的交联嵌段共聚物。一或多个货物分子分散在聚合物基质内或与聚合物基质共价结合。水凝胶核被脂质体壳包围。
纳米脂质凝胶可以被构造成并入各种活性剂，所述活性剂随后可以以受控方式释放。活性剂可以分散在水凝胶基质内、分散在脂质体壳内、共价附着于脂质体壳以及其组合。可以在纳米脂质凝胶内的这些位置中的每个位置处选择性地并入活性剂。此外，可以独立调整这些位置中的每个位置中的活性剂的释放速率。由于这些位置中的每个位置都具有不同的特性，包含尺寸和疏水性/亲水性，因此在这些位置中的每个位置处独立并入的化学实体在尺寸和组成方面可能会有显著差异。例如，纳米脂质凝胶可以装载有一或多种分散在聚合物基质内的化合物以及至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂。可以装载的纳米脂质凝胶同时提供持续释放在化学组成和分子量方面差异很大的药剂。
纳米脂质凝胶通常呈球形，其中平均粒径的范围介于约50nm与约1000nm之间，更优选地介于约75nm与约300nm之间，最优选地介于约90nm与约200nm之间。在某些实施例中，纳米脂质凝胶的平均粒径介于约100nm与约140nm之间。颗粒可以是非球形的。
根据存在于纳米脂质凝胶的脂质体壳中的脂质的性质，可以制备具有正、负或接近中性表面电荷的纳米脂质凝胶。在某些实施例中，纳米脂质凝胶具有接近中性的表面电荷。在某些实施例中，纳米脂质凝胶的ζ电位介于约10mV与约-10mV之间，更优选地介于约5mV与约-5mV之间，更优选地介于约3mV与约-3mV之间，最优选地介于约2mV与约-2mV之间。
疏水性活性剂(如蛋白质)可以共价连接到纳米脂质凝胶的表面，而亲水性活性剂可以共价连接到纳米脂质凝胶的表面或分散在脂质体壳内。在某些实施离中，脂质体壳包含一或多种聚乙二醇化脂质。在这些情况下，一或多种活性剂可以与存在于脂质体壳表面上的一或多种PEG链的末端缀合。
在另一个实施例中，脂质被修饰以包含亲和素部分，如果期望的话，使生物素化靶向部分、可检测标记或其它活性剂能够与其偶联。
在特定实施例中，一或多种活性剂通过连接基团共价连接到纳米脂质凝胶的表面，所述连接基团响应于外部化学或物理刺激(如环境pH值的变化)而裂解，以在期望的生理位置处触发活性剂的释放。
核：纳米脂质凝胶核由聚合物基质形成。基质可以包含如下文更详细地讨论的一或多种主分子。纳米脂质凝胶核可以进一步包含一或多种活性剂。活性剂可以与主分子复合，用聚合物基质或其组合分散。
纳米脂质凝胶的聚合物基质可以由一或多种聚合物或共聚物形成。通过改变聚合物基质的组成和形态，可以实现多种控释特性，从而允许在延长的时间段内递送中等恒定剂量的一或多种活性剂。
聚合物基质可以由不可生物降解的或可生物降解的聚合物形成；然而，优选地，聚合物基质是可生物降解的。聚合物基质可以被选择成在范围为从一天到一年、更优选地七天到26周、更优选地七天到20周、最优选地七天到16周的时间段内降解。可生物降解的交联剂可以用于增加聚合物的分子量，所述聚合物在交联剂降解后可作为小片段从体内清除。
通常，合成聚合物是优选的，尽管可以使用天然聚合物。代表性聚合物包含：聚(羟基酸)，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)；聚羟基链烷酸酯，如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚(乙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包含合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酰胺酯；其它生物相容性聚酯；聚(二噁烷酮)；聚(亚烷基烷基化物)；亲水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸酯；聚(马来酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；聚(环氧烷烃)，如聚乙二醇(PEG)；衍生化纤维素，如烷基纤维素(例如，甲基纤维素)、羟烷基纤维素(例如，羟丙基纤维素)、纤维素醚、纤维素酯、硝酸纤维素、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸或其共聚物或衍生物，包含酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)(在本文中统称为“聚丙烯酸”)以及其衍生物、共聚物和共混物。
如本文所使用的，“衍生物”包含对本领域技术人员常规制备的上述聚合物主链具有取代、添加化学基团和其它修饰的聚合物。天然聚合物，包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶、醇溶蛋白(如玉米醇溶蛋白)和多糖(如海藻酸和果胶)，也可以并入到聚合物基质中。虽然多种聚合物可以用于形成聚合物基质，但所得聚合物基质通常将是水凝胶。在某些情况下，当聚合物基质含有天然聚合物时，天然聚合物是通过水解降解的生物聚合物，如聚羟基链烷酸酯。
聚合物基质可以任选地含有一或多种可交联聚合物。优选地，可交联聚合物含有一或多个可光聚合基团，从而允许在纳米脂质凝胶形成之后交联聚合物基质。合适的可光聚合基团的实例包含乙烯基、丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基和丙烯酰胺基。当存在时，可光聚合基团可以被并入到可交联聚合物的主链内、可交联聚合物的一或多个侧链内、可交联聚合物的一或多个末端处或其组合。
聚合物基质可以由具有多种分子量的聚合物形成，以便形成具有包含药物释放速率在内的对特定应用最佳的特性的纳米脂质凝胶。通常，构成聚合物基质的聚合物的平均分子量的范围介于约500Da与50kDa之间。在聚合物基质由不可交联聚合物形成的情况下，聚合物的平均分子量的范围通常介于约1kDa与约50kDa之间，更优选地介于约1kDa与约70kDa之间，最优选地介于约5kDa与约50kDa之间。在聚合物基质由可交联聚合物形成的情况下，聚合物的较低平均分子量的范围通常介于约500Da与约25kDa之间，更优选地介于约1kDa与约10kDa之间，最优选地介于约3kDa与约6kDa之间。在特定实施例中，聚合物基质由平均分子量为约5kDa的可交联聚合物形成。
在一些实施例中，聚合物基质由聚(环氧烷烃)聚合物或含有一或多个聚(环氧烷烃)片段的嵌段共聚物形成。聚(环氧烷烃)聚合物或聚(环氧烷烃)聚合物片段可以含有8到500个重复单元，更优选地40到300个重复单元，最优选地50到150个重复单元。合适的聚(环氧烷烃)包含聚乙二醇(也称为聚氧乙烯或PEG)、聚丙烯1,2-乙二醇、聚(环氧丙烷)、聚丙烯1,3-乙二醇以及其共聚物。
在一些实施例中，聚合物基质由脂肪族聚酯或含有一或多个脂肪族聚酯片段的嵌段共聚物形成。优选地，聚酯或聚酯片段是聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)PGA或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
在一些实施例中，聚合物基质由含有一或多个聚(环氧烷烃)片段、一或多个脂肪族聚酯片段以及任选地一或多个可光聚合基团的嵌段共聚物形成。在这些情况下，所述一或多个聚(环氧烷烃)片段使聚合物具有必要的亲水性，使得所得聚合物基质形成合适的水凝胶，而聚酯片段提供具有可调疏水性/亲水性和/或期望的体内降解特性的聚合物基质。
聚酯片段的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(在纯PGA的情况下)到几个月(在纯PLA的情况下)不等，并且可以通过改变聚酯片段中PLA与PGA的比率容易地操纵。此外，如PEG等聚(环氧烷烃)和如PGA、PLA和PLGA等脂肪族聚酯已经被证实可以安全用于人类；这些材料已经在包含药物递送系统的人体临床应用中使用超过30年。
在某些实施例中，聚合物基质由三嵌段共聚物形成，所述三嵌段共聚物含有中心聚(环氧烷烃)片段、附着于中心聚(环氧烷烃)片段的任一端的相邻脂肪族聚酯片段以及一或多个可光聚合基团。优选地，中心聚(环氧烷烃)片段是PEG，并且脂肪族聚酯片段是PGA、PLA或PLGA。
通常，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量大于相邻聚酯片段的平均分子量。在某些实施例中，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少三倍，更优选地是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少五倍，最优选地是相邻聚酯片段之一的平均分子量的至少十倍。
在一些情况下，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量的范围介于约500Da与约10,000Da之间，更优选地介于约1,000Da与约7,000Da之间，最优选地介于约2,500Da与约5,000Da之间。在特定实施例中，中心聚(环氧烷烃)片段的平均分子量为约4,000Da。通常，每个相邻聚酯片段的平均分子量的范围介于约100Da与约3,500Da之间，更优选地介于约100Da与约1,000Da之间，最优选地介于约100Da与约500Da之间。
天然聚合物的实例包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶和醇溶谷蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)以及多糖(如海藻酸)、纤维素衍生物和聚羟基链烷酸酯(例如，聚羟基丁酸酯)。在生产期间，可以通过使用如与聚乙二醇(PEG)共聚的聚(丙交酯-共-乙交酯)等聚合物来调整微粒在体内的稳定性。如果PEG暴露在外表面上，由于PEG的亲水性，其可能会增加这些材料循环的时间。
不可生物降解的聚合物的实例包含乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物以及其混合物。
基质也可以由凝胶型聚合物，如通过传统的离子胶凝技术生产的海藻酸制备。聚合物首先溶解在水溶液中，与硫酸钡或一些生物活性剂混合，并且然后通过液滴形成装置挤出，在一些情况下，所述液滴形成装置采用氮气流来中断液滴。缓慢搅拌(大约100-170RPM)的离子硬化浴位于挤出装置下方以捕获形成的微滴。使微粒在浴中温育二十到三十分钟，以允许有足够的时间发生胶凝。通过使用各种尺寸的挤出机或改变氮气或聚合物溶液的流速来控制微粒尺寸。壳聚糖微粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并与三聚磷酸盐交联来制备。羧甲基纤维素(CMC)微粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并用铅离子沉淀微粒来制备。在带负电荷的聚合物(例如，海藻酸、CMC)的情况下，不同分子量的带正电荷的配体(例如，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)可以离子连接。
也许最广泛使用的是脂肪族聚酯，具体地是疏水性聚(乳酸)(PLA)、更亲水性聚(乙醇酸)PGA以及其共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。这些聚合物的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(PGA)到几个月(PLA)不等，并且通过改变PLA与PGA的比率容易地操纵。其次，PLGA以及其均聚物PGA和PLA的生理相容性已经被证实可安全用于人类；这些材料在包含药物递送系统在内的各种人类临床应用中已有30多年的历史。PLGA纳米颗粒可以以通过被动或主动靶向改善药物的药代动力学和靶组织的生物分布的多种方式调配。微粒被设计成在数天到数周时间段内释放待包封或附着的分子。影响释放持续时间的因素包含周围介质的pH值(由于PLGA的酸催化水解，pH 5及以下的释放速率更高)和聚合物组成。脂肪族聚酯的疏水性不同，并且所述疏水性进而影响降解速率。具体而言，疏水性聚(乳酸)(PLA)、更亲水性聚(乙醇酸)PGA以及其共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)具有不同的释放速率。这些聚合物的降解速率以及通常是对应的药物释放速率可以从几天(PGA)到几个月(PLA)不等，并且通过改变PLA与PGA的比率容易地操纵。
壳组分：纳米脂质凝胶包含由一或多个同心脂质单层或脂质双层构成的脂质体壳。壳可以进一步包含一或多种活性剂、靶向分子或其组合。
纳米脂质凝胶包含由一或多个同心脂质单层或脂质双层构成的脂质体壳。脂质体壳的组成可以变化以影响一或多种活性剂在体内的释放速率。如果期望的话，脂质也可以共价交联以改变在体内的药物释放。
脂质壳可以由单个脂质双层(单层)或若干同心脂质双层(多层)形成。脂质壳可以由单一脂质形成；然而，在优选的实施例中，脂质壳由多于一种脂质的组合形成。脂质在生理pH值下可以是中性、阴离子或阳离子的。
合适的中性和阴离子脂质包含固醇和脂质，如胆固醇、磷脂、溶血脂、溶血磷脂和鞘脂。中性和阴离子脂质包含但不限于：磷脂酰胆碱(PC)(如鸡蛋PC、大豆PC)，包含1,2-二酰基-丙三基-3-磷酸胆碱；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(PI)；糖脂；磷酸鞘酯，如鞘磷脂；神经鞘糖脂类(也称为1-神经酰胺基糖苷)，如神经酰胺半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂；脂肪酸、含有羧酸基的固醇，如胆固醇或其衍生物；以及1,2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺，包含1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺或1,2-二油酰基甘油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。也适合的是这些脂质的天然(例如，组织源性L-α-磷脂酰：蛋黄、心脏、脑、肝脏、大豆)和/或合成的(例如，饱和和不饱和的1,2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱、1-酰基-2-酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱、1,2-二庚酰基-SN-丙三基-3-磷酸胆碱)衍生物。
合适的阳离子脂质包含N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，也称为TAP脂质，例如甲基硫酸盐。合适的TAP脂质包含但不限于DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)和DSTAP(二硬脂酰基-)。其它合适的阳离子脂质包含：二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二酰基氧基-3-三甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N-二甲基胺(DODAP)、1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷、二十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-[N--(N',N'-二甲基氨基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油酰基氧基-N-(2-(精胺甲酰胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵基三氟乙酸酯(DOSPA)、β-丙氨酰胆固醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、diC14-脒、N-叔丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基氨基-丙脒、N-(α-三甲基氨基乙酰基)二十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG)、二十四癸酰基-N-(三甲基氨基-乙酰基)二乙醇胺氯化物、1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精基)-丙酰胺(DOSPER)和N,N,N',N'-四甲基-,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁烷二铵碘化物、1-[2-(酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，如1-[2-(9(Z)-十八癸烯酰基氧基))乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物(DOTIM)和1-[2-(十六烷酰基氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)以及在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷氧基丙基季铵衍生物，例如1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-Hpe)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、1,2-二棕榈酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)和1,2-二甾基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)。
其它合适的脂质包含上述中性、阴离子和阳离子脂质的聚乙二醇化衍生物。将一或多种聚乙二醇化脂质衍生物并入到脂质壳中可以产生纳米脂质凝胶，所述纳米脂质凝胶在其表面上显示聚乙二醇链。与其表面缺少PEG链的纳米脂质凝胶相比，所得纳米脂质凝胶在体内可以具有更高的稳定性和循环时间。合适的聚乙二醇化脂质的实例包含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，包含DSPE PEG(2000MW)和DSPE PEG(5000MW)、二棕榈酰基-丙三基-琥珀酸酯聚乙二醇(DPGS-PEG)、硬脂酰-聚乙二醇和胆甾醇基-聚乙二醇。
在某些实施例中，脂质壳由多于一种脂质的组合形成。在某些实施例中，脂质壳由至少三种脂质的混合物形成。在特定实施例中，脂质壳由磷脂酰胆碱(PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)和胆固醇的混合物形成。
在一些实施例中，脂质壳由一或多种聚乙二醇化磷脂和一或多种另外的脂质或固醇的混合物形成。在某些情况下，所述一或多种聚乙二醇化脂质与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比的范围为约1:1到约1:6，更优选地约1:2到约1:6，最优选地约1:3到约1:5。在特定实施例中，所述一或多种聚乙二醇化脂质与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比为约1:4。
在一些实施例中，脂质壳由一或多种磷脂和一或多种另外的脂质或固醇的混合物形成。在某些情况下，所述一或多种磷脂与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比的范围为约1:1到约6:1，更优选地约2:1到约6:1，最优选地约3:1到约5:1。在特定实施例中，所述一或多种磷脂与所述一或多种另外的脂质或固醇的摩尔比为约4:1。
在优选的实施例中，脂质壳由磷脂(如磷脂酰胆碱(PC))、聚乙二醇化磷脂(如1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG))和胆固醇的混合物形成。在特定实施例中，脂质壳由磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)和胆固醇的混合物以3:1:1的摩尔比形成。
聚合物颗粒：递送媒剂也可以是聚合物颗粒，例如微米或纳米颗粒。颗粒可以是可生物降解的或不可生物降解的。上文关于纳米脂质凝胶的聚合物基质组分讨论了可以用于制造聚合物颗粒的示范性聚合物。
优选的可生物降解的聚合物的实例包含羟基酸(如乳酸和乙醇酸)的聚合物以及与PEG的共聚物、聚酐、聚(原)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、其共混物和共聚物。在优选的实施例中，颗粒由一或多种聚酯构成。
例如，颗粒可以含有以下聚酯中的一或多种：均聚物，所述均聚物包含：乙醇酸单元，本文称为“PGA”；以及乳酸单元，如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”；以及己内酯单元，如聚(ε-己内酯)，在本文中统称为“PCL”；以及共聚物，所述共聚物包含乳酸和乙醇酸单元，如由乳酸:乙醇酸的比率表征的各种形式的聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在本文统称为“PLGA”；以及聚丙烯酸酯及其衍生物。示范性聚合物还包含聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在本文中统称为“聚乙二醇化聚合物”。在某些实施例中，PEG区可以与聚合物共价相关以通过可切割接头产生“聚乙二醇化聚合物”。也可以使用海藻酸聚合物。
在一些实施例中，颗粒由PLGA构成。PLGA是一种安全的、经FDA批准的聚合物。PLGA颗粒是有利的，因为其可以保护活性剂(即包封剂)，促进延长释放，并且可以添加靶向部分。
颗粒可以含有一或多种聚合物缀合物，所述一或多种聚合物缀合物含有聚合物与靶向部分、可检测标记或其它活性剂之间的端对端键。例如，经修饰的聚合物可以是PLGA-PEG-膦酸酯。在另一个实例中，颗粒被修饰以包含亲和素部分和生物素化靶向部分、可检测标记或其它可以与其偶联的活性剂。
优选的天然聚合物的实例包含蛋白质，如白蛋白、胶原蛋白、明胶和醇溶谷蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)以及多糖(如海藻酸)、纤维素衍生物和聚羟基链烷酸酯(例如，聚羟基丁酸酯)。在生产期间，可以通过使用如与聚乙二醇(PEG)共聚的聚(丙交酯-共-乙交酯)等聚合物来调整颗粒在体内的稳定性。如果PEG暴露在外表面上，由于PEG的亲水性，其可能会增加这些材料循环的时间。
不可生物降解的聚合物的实例包含乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物以及其混合物。
纳米脂质凝胶：纳米脂质凝胶是一种结合脂质体和基于聚合物的颗粒两者的优点以持续递送核酸、蛋白质和/或小分子的纳米颗粒。纳米脂质凝胶可以呈球形、盘状、棒或其它具有不同纵横比的几何形状的形式。纳米球可以更大，即微粒。纳米脂质凝胶通常由合成或天然聚合物形成，所述聚合物能够通过远程装载来包封药剂，并且可以调节特性以促进不同的释放速率。释放速率通过改变聚合物与脂质的比率(从0.05到5.0，更优选地从0.5到1.5)来调节。
纳米脂质凝胶被设计成在形成之前、期间或之后装载有药剂，并且随后充当药剂的控释媒剂。纳米脂质凝胶可以装载有多于一种药剂，使得随后实现多种药剂的控释。
纳米脂质凝胶在形成期间和/或在形成之后通过在存在药剂的情况下纳米脂质凝胶的再水合过程而装载有至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂。例如，纳米脂质凝胶装载有用作有丝分裂激酶抑制剂的分子，并且此后纳米脂质凝胶在形成之后并入一或多种免疫检查点抑制剂(反之亦然)，以共同递送和一起释放两种抑制剂。
聚合物纳米颗粒
乳化法：在一些实施例中，使用乳化溶剂蒸发方法制备聚合物纳米颗粒。例如，将聚合物材料溶解在与水不混溶的有机溶剂中并与药物溶液或药物溶液的组合混合。与水不混溶的有机溶剂可以是但不限于以下中的一或多种：氯仿、二氯甲烷和酰基乙酸酯。所述药剂可以溶解在以下中的一或多种中，但不限于以下中的一或多种：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈和二甲基亚砜(DMSO)。然后将水溶液添加到所得混合物溶液中以通过乳化产生乳化溶液。乳化技术可以是但不限于探针超声处理或通过均质器均质化。肽或荧光团或药物可以与颗粒的聚合物基质的表面相关、包封在颗粒的聚合物基质中、被颗粒的聚合物基质包围和/或分布在整个颗粒的聚合物基质中。
纳米沉淀法：在另一个实施例中，使用纳米沉淀方法或微流体装置制备聚合物纳米颗粒。聚合物材料在水溶性有机溶剂中与药物或药物组合混合。然后将所得混合物溶液添加到水溶液中以产生纳米颗粒溶液。
示范性制备方法：可以使用多种方法由不同聚合物制造颗粒，所述方法可以基于包含颗粒的聚合物组合物在内的标准进行选择，所述药剂根据本领域已知的方法装载到所述颗粒中或与所述颗粒相关。下文提供了示范性方法。
溶剂蒸发：在此方法中，将聚合物溶解在如二氯甲烷等挥发性有机溶剂中。将(可溶的或分散为细颗粒的)药物添加到溶液中，并将混合物悬浮于含有如聚(乙烯醇)的表面活性剂的水溶液中。搅拌所得乳液，直到大部分有机溶剂蒸发，从而留下固体颗粒。用水洗涤所得颗粒并在冻干机中干燥过夜。通过此方法，可以获得具有不同尺寸(0.5-1000微米)和形态的颗粒。此方法适用于相对稳定的聚合物，如聚酯和聚苯乙烯。
然而，不稳定的聚合物(如聚酐)可能会在制造过程中由于水的存在而降解。对于这些聚合物，在完全无水有机溶剂中进行的以下两种方法更有用。
热熔微胶囊化：在此方法中，聚合物首先熔融，并且然后与固体颗粒混合。将混合物悬浮于不可混溶的溶剂(如硅油)中，并在连续搅拌下加热到高于聚合物熔点5℃。一旦乳液稳定，将其冷却直至聚合物颗粒固化。通过用石油醚倾析洗涤所得颗粒以得到自由流动的粉末。用此方法可以获得尺寸介于0.5与1000微米之间的颗粒。用此技术制备的球体的外表面通常是光滑且致密的。此程序用于制备由聚酯和聚酐制成的颗粒。然而，此方法仅限于分子量介于1,000-50,000之间的聚合物。
溶剂去除：此技术主要设计用于聚酐。在此方法中，将药物分散或溶解在所选聚合物在挥发性有机溶剂(如二氯甲烷)中的溶液中。通过搅拌将此混合物悬浮于有机油(如硅油)中以形成乳液。与溶剂蒸发不同，此方法可以用于由具有高熔点和不同分子量的聚合物制备颗粒。通过此程序，可以获得范围介于1-300微米之间的颗粒。用此技术生产的球体的外部形态高度依赖于所用聚合物的类型。
喷雾干燥：在此方法中，将聚合物溶解在有机溶剂中。将已知量的活性药物悬浮(不溶性药物)或共溶解(可溶性药物)于聚合物溶液中。然后对溶液或分散体进行喷雾干燥。小型喷雾干燥机(步琪(Buchi))的典型加工参数如下：聚合物浓度＝0.04g/mL，入口温度＝-24℃，出口温度＝13-15℃，吸气器设置＝15，泵设置＝10毫升/分钟，喷雾流量＝600Nl/小时，并且喷嘴直径＝0.5mm。获得了范围介于1-10微米之间的微粒，其形态取决于所用聚合物的类型。
水凝胶颗粒：由凝胶型聚合物(如海藻酸)制备的颗粒是通过传统的离子胶凝技术生产的。聚合物首先溶解在水溶液中，与硫酸钡或一些生物活性剂混合，并且然后通过液滴形成装置挤出，在一些情况下，所述液滴形成装置采用氮气流来中断液滴。缓慢搅拌(大约100-170RPM)的离子硬化浴位于挤出装置下方以捕获形成的微滴。使颗粒在浴中温育二十到三十分钟，以允许有足够的时间发生胶凝。通过使用各种尺寸的挤出机或改变氮气或聚合物溶液的流速来控制颗粒尺寸。壳聚糖颗粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并与三聚磷酸盐交联来制备。羧甲基纤维素(CMC)颗粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并用铅离子沉淀颗粒来制备。在带负电荷的聚合物(例如，海藻酸、CMC)的情况下，不同分子量的带正电荷的配体(例如，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)可以离子连接。
其它递送媒剂
在一些实施例中，递送媒剂是脂质体或脂质纳米颗粒。脂质体通常是由层状相脂质双层构成的球形囊泡。脂质体可以是例如多层囊泡(MLV)、小单层脂质体囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)或螺旋状囊泡。可用于制备所公开的纳米微粒组合物的脂质体、胶束和其它基于脂质的递送媒剂是本领域已知的。参见例如托尔钦林(Torchilin)等人(先进药物递送评论(Adv Drug Delivery Rev),58(14):1532-55,2006)。预计多种脂质体和外泌体可以与本发明一起使用。脂质体可以包括N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基硫酸甲酯铵(DOTAP)或LipofectamineTM。在一些实施例中，可以使用涉及壳聚糖的递送系统，例如在鲁(Lu)等人,(癌细胞(Cancer Cell),18:185-197,2010)中所描述的。在一些实施例中，纳米载剂可以用于向受试者递送miRNA；纳米载剂在例如普拉马尼克(Pramanik)等人,(分子癌症疗法(Mol Cancer Ther)10:1470-1480,2011)中所描述的。
递送媒剂也可以是二氧化硅颗粒。可用于制备所公开的纳米微粒组合物的合适的二氧化硅颗粒也是本领域已知的。参见例如芭布(Barbe)等人,(先进材料(AdvMaterials),16(21):1959-1966,2004)、恩甘切尔德拉库尔等人,(先进功能材料,25:2646-2659,2015)以及阿吉奥(Argyo)等人,(材料化学(Chem.Mater.),26(1):435-451,2014)。例如，在一些实施例中，硅酮纳米颗粒(例如，如在巴拉利(Bharali)等人,美国国家科学院院刊,102(32):11539-11544,2005中所描述的)可以用于将至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂递送到细胞。二氧化硅或硅在体内的溶解度为颗粒携带的药剂提供了时间释放的能力。此外，可生物降解的聚合物或可生物还原的交联剂可以用于修饰二氧化硅或硅颗粒以提供时间释放能力。
(VI)抗体
本文中的至少一些药剂(如用于诱导免疫检查点阻断的药剂)是抗体。抗体是一种结合剂，所述结合剂是可以结合例如在细胞表面上或在生物样品中的靶配体的分子。术语抗体包含整个抗体和其功能性(即，维持显著和特异性靶结合)片段两者。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可交换地使用并且被本领域技术人员很好地理解。这些术语是指包含一或多种与抗原特异性地结合的多肽的蛋白质。一种形式的抗体包含抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体并且包含两对抗体链，每对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区共同负责与所述抗体识别的抗原结合，而恒定区负责抗体效应功能。
公认的免疫球蛋白多肽包含κ和λ轻链以及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链或其它物种中的等效物。(25kDa或214个氨基酸的)全长免疫球蛋白“轻链”包含在NH2末端处的110个氨基酸的可变区和在COOH末端处的κ或λ恒定区。(50kDa或446个氨基酸的)全长免疫球蛋白“重链”类似地包含(116个氨基酸的)可变区和上述重链恒定区之一，例如(330个氨基酸的)γ。
抗体和免疫球蛋白的特定实施例包含任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保留与抗原特异性结合的抗体片段，包含Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白、荧光分子或稳定的元素同位素等可检测地标记。抗体可以进一步与其它部分，如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等缀合。所述术语还涵盖Fab'、Fv、F(ab')2以及其它保留与其同源抗原特异性结合的抗体片段，以及单克隆抗体。
抗体可以以多种其它形式存在，包含例如双功能(即双特异性)杂合抗体(例如，兰扎韦基亚(Lanzavecchia)等人,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)17:105,1987)，并且以单链形式存在(例如，赫斯顿(Huston)等人,美国国家科学院院刊85:5879-5883,1988；以及伯德(Bird)等人,科学242:423-426,1988)。一般参见胡德(Hood)等人,(1984)“免疫学”,纽约,第2版以及亨克皮勒(Hunkapiller)和胡德(自然323:15-16,1986)。
免疫球蛋白轻链和重链可变区由被三个高变区(也被称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围已经被精确定义(参见“免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”E.卡巴特(E.Kabat)等人,(1991)美国卫生与人类服务部(US Department of Health and Human Services))。在特定实施例中，抗体氨基酸序列的编号可以符合Kabat系统。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的的框架区(为构成性轻链和重链的组合框架区)用于定位和排列CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。
嵌合抗体是轻链和重链基因通常通过基因工程已经从属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自兔单克隆抗体的基因的可变片段可以接合到人类恒定片段，如γ1和γ3。
(VII)药物组合物和施用调配物
本文提供了用于治疗癌症、初癌和其它增殖性疾病的组合物。所述组合物包含至少两种活性组分/药剂，其中一种是抑制至少一种有丝分裂激酶抑制剂的治疗活性剂；并且其中另一种是免疫检查点抑制剂。如本文所描述的，活性剂可以在递送媒剂(构建体、工程化构建体)中递送/与递送媒剂相缔合，所述递送媒剂如脂质体、有机或无机(纳米或微米)颗粒等。如本文所描述的，活性剂可以与连接药剂的化学连接子(例如，抗体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物、小分子-寡核苷酸缀合物或小分子-小分子缀合物)共同递送。
组合物可以直接提供给细胞(如通过使其与细胞接触)或间接提供给细胞(如通过任何生物过程的作用)。例如，组合物可以在生理学上可接受的载剂或媒剂中进行调配并注射到细胞周围的组织或流体中。组合物可以通过简单的扩散、内吞作用或通过任何主动或被动转运机制跨过细胞膜。
当调配成药物组合物时，治疗化合物(如与至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂偶联的递送系统)可以与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。如本文所使用的，短语“药学上可接受的”是指通常认为生理上可耐受的并且在向人或兽医受试者施用时通常不会产生过敏或类似不良反应(如胃不适、头晕等)的分子实体和组合物。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的衍生物”意指在施用于接受者后能够(直接或间接)提供所期望的活性剂或其活性代谢物或残留物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，例如所期望的活性剂的酯。此类衍生物对于本领域技术人员来说是可识别的，无需过度实验。尽管如此，还是要参考伯格(Burger)的药物化学与药物发现(MedicinalChemistry and Drug Discovery)第5版,第1卷：原理与实践(Principles and Practice)的教导。药学上可接受的衍生物包含盐、溶剂化物、酯、氨基甲酸酯和磷酸酯。
虽然可以按原样将组合物用于疗法中，但优选的是，可以在药物调配物中施用所述组合物，例如，与关于预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载剂混合。因此，一方面，药物组合物或调配物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂相关的至少一种活性组合物或其药学上可接受的衍生物。赋形剂、稀释剂和/或载剂在与调配物的其它成分相容的意义上是“可接受的”，并且不会对其接收者造成重大伤害。
本文公开的任何组合物调配物可以有利地包含任何其它药学上可接受的载剂，包含不会产生超过施用的益处的明显不利的、过敏的或其它不良反应的载体(无论是用于研究、预防性治疗和/或治疗性治疗)。用于治疗用途的示范性药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载剂在药学领域中是众所周知的，并且例如在雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)利平科特·威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)(A.R.,格纳罗(Gennaro)编辑,2005)以及雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版,麦克印刷公司(Mack PrintingCompany),1990中所描述的。此外，可以将调配物制备成满足美国食品和药物管理局生物标准办公室(United States FDA Office of Biological Standards)和/或其它相关外国监管机构要求的无菌性、热原性、总体安全性和纯度标准。药物赋形剂、稀释剂和载剂可以关于预期的施用途径和标准药学实践进行选择。
可以在一或多种合适的赋形剂、稀释剂和载剂的帮助下以常规方式呈现此类药物调配物以供使用。药学上可接受的赋形剂有助于或使得有可能形成生物活性材料的剂型，并且包含稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、着色剂和其它成分。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包含苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。如果赋形剂是药学上可接受的，除了执行其期望的功能之外，其在摄入时无毒且耐受良好并且不干扰生物活性材料的吸收。
示范性的通常使用的药学上可接受的载剂包含任何和所有膨胀剂或填充剂、溶剂或共溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，EDTA)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。
示范性缓冲剂包含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
示范性防腐剂包含苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵、六甲基氯化铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
示范性等渗剂包含多元糖醇，包含三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇或甘露醇。
示范性稳定剂包含有机糖、多元糖醇、聚乙二醇；含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水聚合物或多糖。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”意指当向受试者施用以治疗状态、病症或病状时足以影响此类状态、病症或病状的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。精确剂量和调配物将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，利伯曼(Lieberman),医药剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷,1992)；劳埃德(Lloyd),医药学配混的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)(1999)；雷明顿：药学的科学与实践,第20版,编辑格纳罗,(2003)；以及皮卡尔(Pickar),剂量计算(Dosage Calculations)(1999))。在某些情况下，“治疗有效量”用于意指足以调节(例如，增加或降低)期望活性例如10％、50％或90％的量或剂量。通常，在涉及一或多种治疗剂的治疗方案之后，治疗有效量足以引起宿主中的临床显著病状的改善。如本文所讨论的，活性成分的浓度或量取决于期望的剂量和施用方案。
向特定受试者施用的实际剂量可以由医生、兽医或研究人员在考虑如身体、生理和心理因素(包含靶标、体重、癌症阶段、癌症类型、既往或同时进行的治疗干预、受试者的自发病和施用途径)等参数的情况下确定。
用于此用途的有效量将取决于疾病的严重程度及其部位，特别是当涉及转移部位时，以及正在治疗的患者的体重和一般状态。通常，治疗构建体的剂量范围为每天0.01mg/kg到100mg/kg宿主体重，其中更常用的剂量为每天0.1mg/kg到10mg/kg，例如剂量为3-7mg/kg。可以根据需要调整长期时间段内的维持剂量。然而，这些剂量可以根据患者的要求、所治疗的病状的严重程度以及所使用的化合物而变化。例如，可以根据在特定患者中诊断出的癌症的类型和阶段来凭经验确定剂量。在本发明的上下文中，施用给患者的剂量应足以随时间推移在患者中实现有益的治疗应答。剂量的大小也将由在特定患者中伴随特定载体或经转导的细胞类型的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。针对特定情况确定适当剂量在从业者的技能内。通常，以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小增量增加，直到达到在多种情况下的最佳效果。为了方便起见，可以将每日总剂量分成几份，并根据需要在一天中分批施用。
所选剂量可能受期望的治疗效果、施用途径、期望的治疗持续时间和所采用的特定治疗复合物的影响。通常，治疗构建体可以以每次施用约0.001mg/kg到100mg/kg的范围进行施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2次、3次、4次、5次或更多次等，如下文更详细地讨论的)。施用途径也可以作为确定剂量的一个考虑因素。例如，在特定实施例中，治疗构建体通过静脉内或解释途径以0.01mg/kg到100mg/kg的范围施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2次、3次、4次、5次或更多次等)或通过皮下途径(例如，局部注射到肿瘤中或肿瘤附近或TME中)以0.0001mg/kg到1mg/kg的范围施用(例如，每天；或每周2次、3次、4次、5次或更多次；或每月2、3、4、5次或更多次等)。下文讨论了更多示范性剂量。
合适的剂量范围可以为每天、每周或每月0.01mg/kg到100mg/kg体重。示范性剂量可以包含0.05mg/kg到10.0mg/kg的本文公开的活性化合物(治疗构建体)。每日总剂量可以为每天一到三次施用于受试者的0.05mg/kg到30.0mg/kg的药剂，包含使用60分钟口服、静脉内或其它给药的药物施用形式施用0.05-3.0、0.1-3.0、0.5-3.0、1.0-3.0、1.5-3.0、2.0-3.0、2.5-3.0和0.5-3.0mg/kg/天的总日剂量。在一个特定实例中，剂量可以以QD或BID施用于受试者，例如总日剂量为1.5mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg或7.5mg/kg的具有高达92-98％wt/v的本文公开的化合物的组合物。
另外的有用剂量通常可在0.1到5μg/kg或0.5到1μg/kg的范围内。在其它实例中，剂量可以包含1μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、200μg/kg、0.1到5mg/kg或0.5到1mg/kg。在其它实例中，剂量可以包含1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、450mg/kg或更多。
本公开的治疗材料可以用于严重的疾病状态，即危及生命或潜在危及生命的情况。在此类情况下，主治医生可能并且可以认为期望施用显著过量的这些组合物。
如本领域技术人员将理解的，特定剂量将受活性化合物的药代动力学影响。对于施用，治疗有效量(在本文中也称为剂量)可以基于体外测定和/或动物模型研究的结果初步估计。此类信息可以用于更准确地确定所关注的受试者的有用剂量。有用的临床前测试包含药效学分析、毒性分析等。
治疗有效量可以通过在治疗方案过程期间施用单剂量或多剂量来实现(例如，每小时、每2小时、每3小时、每4小时、每6小时、每9小时、每12小时、每18小时、每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周或每月)。
含有活性剂的化合物的有效量包含部分或完全达到期望治疗、预防和/或生物学效果的剂量。特定应用的实际有效量取决于所治疗的病状和施用途径。用于人的有效量可以根据动物模型确定。例如，可以调配用于人的剂量以实现已发现对动物有效的局部(例如，瘤内)或循环水平。
组合物可以与一或多种麻醉剂一起施用，所述一或多种麻醉剂包含乙醇、布比卡因(bupivacaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、左旋布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、普鲁卡因(procaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、丁卡因(tetracaine)、地氟醚(desflurane)、异氟醚(isoflurane)、氯胺酮(ketamine)、丙泊酚(propofol)、七氟醚(sevoflurane)、可待因(codeine)、芬太尼(fentanyl)、氢吗啡酮(hydromorphone)、麻卡因(marcaine)、度冷丁(meperidine)、美沙酮(methadone)、吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、瑞芬太尼(remifentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)、曲马多(tramadol)、苯佐卡因(benzocaine)、地布卡因(dibucaine)、氯乙烷(ethyl chloride)、利多卡因(xylocaine)和/或非那吡啶(phenazopyridine)。
在包含治疗或预防癌症(包含例如癌症转移)的特定实施例中，本文公开的组合物可以与其它癌症治疗(如化疗、靶向疗法、放射疗法和/或免疫疗法)结合使用。本文所述的组合物可以在选定的时间窗内，例如在10分钟、1小时、3小时、10小时、15小时、24小时或48小时的时间窗内或当补充治疗在临床相关的治疗窗内时与另一治疗同时或顺序施用。
药物组合物可以通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、通过滴注或以调配成适合于每种施用途径的剂型的贮库施用。
在一些实施例中，以将组合物递送到靶向细胞的有效量全身性地施用组合物，例如通过静脉内或腹膜内施用。其它途径包含滴注或粘膜。
在某些实施例中，组合物是局部施用的，例如通过直接注射到待治疗的部位中。在一些实施例中，将组合物注射或以其它方式直接施用于一或多个肿瘤或患病组织。通常，局部注射使组合物的局部浓度增加，所述浓度大于全身施用所能达到的浓度。在一些实施例中，通过使用导管或注射器将组合物局部递送到合适的细胞。将此类组合物局部递送到细胞的其它方式包含使用输注泵或将组合物并入到聚合物植入物中，这可以实现组合物向植入物的紧邻区的持续释放。
举例来说，在某些实施例中，局部给予治疗构建体，例如给予容易接近的肿瘤，如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌和淋巴瘤；或全身性地用于其它癌症，如肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和转移癌。
因此，本文所述的治疗组合物可以通过多种途径施用(自身或作为组合疗法的一部分)，所述途径包含用于人或兽医学的任何方便的方式。治疗有效量的期望活性剂可以调配成药物组合物，以通过胃肠外、经粘膜(例如，经口、经鼻或经直肠)或经皮引入。在一些实施例中，施用是肠胃外的，例如通过静脉内注射或小动脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。施用可以作为团注或在一定时间段内通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径连续输注。在某些实施例中，例如那些涉及影响关节的炎性病状的治疗的实施例，可以通过优选地用注射器注射将药物组合物直接施用于滑膜、滑液或关节囊。施用可以是局部的或全身的；所述选择可能受所治疗的病状以及所施用的活性剂和组合物的影响。
对于注射，组合物可以制成水溶液，如在缓冲液中，例如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水。溶液可以含有调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，组合物可以呈冻干和/或粉末形式，以在使用之前用合适的媒剂(例如，无菌无热原水)构建。
包含治疗构建体的组合物可以在水溶液中通过肠胃外注射施用。可注射调配物也可以呈悬浮液或乳液的形式并且任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。此类可注射组合物可以包含稀释剂，如无菌水、各种缓冲内含物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲生理盐水；以及任选地添加剂，如洗涤剂和增溶剂(例如，TWEENTM20、TWEENTM80也称为聚山梨醇酯20或80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)。非水溶剂或媒剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油和玉米油等植物油、明胶以及如油酸乙酯等可注射有机酯。用于注射的调配物可以例如在即将使用前被冻干并重新悬浮。可注射调配物可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入到组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物来灭菌。
在其它实施例中，包含治疗构建体的组合物被局部或通过滴注施用。局部施用可以包含应用于肺、鼻、口腔(舌下、颊)、阴道或直肠粘膜。这些施用方法可以通过用粘膜转运元件调配递送媒剂的壳或涂层而变得有效。组合物可以在吸入的同时被递送到肺，并且当作为气溶胶或空气动力学直径小于约5微米的喷雾干燥的颗粒递送时横跨肺上皮层到达血流。
可以使用多种被设计用于经肺部递送治疗产品的机械装置，包含但不限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。
用于施用于粘膜的调配物通常是可以并入到片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中的喷雾干燥的药物颗粒。标准药用赋形剂可以从任何调配师处获得。
也可以制备透皮调配物。这些通常是软膏、乳液、喷雾剂或贴剂，所有这些都可以使用标准技术来制备。透皮调配物可以包含渗透促进剂。化学促进剂和包含电穿孔和微针的物理方法可以与此方法结合使用。
微针(MN)是一种高度为10-2000μm并且宽度为10-50μm的微米级的针，其可以直接穿透表皮层至真皮组织，疼痛极小或无痛(昊(Hao)等人,生物医学纳米技术杂志(J BiomedNanotechnol),13(12):1581-1597,2017)。可以使用若干种类型的微针。在一些实施例中，基于金属或塑料的微针滚轮可以用于物理地破坏皮肤表面以增强所应用的局部药剂(在此情况下为治疗构建体)的渗透。在一些实施例中，可降解且可溶解的微针可以含有治疗构建体。在施用于皮肤之后，微针可以溶解并释放皮肤层深处的构建体。在一些实施例中，不可降解的微针可以涂覆有治疗构建体，使得其在皮肤层深处递送经涂覆的构建体。微针可以由多种材料制成，包含但不限于聚合物、糖类、多糖、肽、蛋白质、金属、无机化合物等(叶(Ye)等人,先进药物递送评论,127:106-118,2018)。本领域已知的用于微针技术的所有材料和制造方法都适用于增强此治疗构建体的递送。
任何有助于全身或局部递送治疗剂的装置也适用于本文所提供的治疗构建体。例如，肝动脉输注(HAI)泵，即一种将高浓度的细胞毒素剂直接递送到肝转移且全身毒性最小的植入式化疗装置(科恩(Cohen)等人,肿瘤学家(The Oncologist),8(6):553-566,2003)也可以用于递送本文所述的治疗构建体。在一些实施例中，涉及放置小直径输注导管以向脑肿瘤递送治疗剂的对流增强递送(CED)(梅赫塔,A.(Mehta,A.)等人,神经治疗学：美国实验神经治疗学会杂志(Neurotherapeutics:the journal of the American Society forExperimental NeuroTherapeutics),14(2),358-371,2017)也可以用于递送本文所述的治疗构建体。
(VIII)示范性使用方法：
在本文中提供的包含至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂的治疗构建体的情况下，现在已经有治疗和/或预防过度增殖性疾病、病症或病状的方法，所述过度增殖性疾病、病症或病状包含癌症、癌症症状、癌症进展(包含从初癌到癌症)和癌症转移。过度增殖性疾病、病症或病状的具体实例包含癌症。在一些实施例中，癌症可以抑制患有癌症的受试者或个体的免疫系统。在一些实施例中，如本文提供的治疗构建体可以抑制或逆转癌症介导的免疫抑制，并允许免疫识别和清除恶性肿瘤。
如本文所使用的，术语“治疗”或“正在治疗”是指与未经治疗的受试者相比，在经治疗的受试者中发生的癌症的任何改善。此类改善可以是预防癌症恶化或进展(例如，经改善的无进展存活期)。此外，此类改善也可以是癌症或其伴随症状的减少或治愈(例如，肿瘤体积的减小、部分缓解、完全缓解(例如，持续6个月、1年、2年、3年、4年或5年或更长时间)、预防癌症复发或重新恶化、减少转移或减少肿瘤或病变的数量)。应当理解，治疗可能不会对100％的接受治疗的受试者成功。然而，术语要求治疗如本领域技术人员(例如，肿瘤学家、医师)所确定的那样成功。如本文所使用的，术语“预防”是指避免本文所使用的癌症或其伴随综合病症的发作。应当理解，预防是指在未来的某个时间窗内避免癌症的发作。所述时间窗应当优选地从施用本发明意义上的化合物开始并且持续至少1个月、至少6个月、至少9个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年或者甚至持续受试者剩余的生理寿命。应当理解，预防可能不会对100％的接受治疗的受试者成功。然而，术语要求预防如本领域技术人员(例如，肿瘤学家、医师)所确定的那样成功。预防也可以是在缓解后癌症复发的情况下进行的，例如以群体中复发概率的减少所测量的。
所公开的组合物可以用于治疗良性或恶性癌症及其肿瘤。治疗可以直接靶向并杀死癌细胞，通过增加针对癌细胞的免疫应答间接靶向癌细胞；或其组合。
在成熟的动物中，在大多数器官和组织中的细胞再生与细胞死亡之间通常维持平衡。体内各种类型的成熟细胞都有给定的寿命；随着这些细胞死亡，各种类型的干细胞的增殖和分化会产生新的细胞。在正常情况下，新细胞的产生如此调控，以致于任何特定类型的细胞的数量都保持恒定。然而，偶尔会出现不再对正常生长控制机制作出反应的细胞。这些细胞产生的细胞克隆可以扩展到相当大的尺寸，从而产生肿瘤或赘生物。不能无限生长并且不会广泛侵袭周围健康组织的肿瘤是良性的。持续生长并逐渐具有侵袭性的肿瘤是恶性的。术语癌症具体地指代恶性肿瘤。除了不受控制的生长外，恶性肿瘤还表现出转移。在此过程中，一小簇癌细胞从肿瘤中脱落，侵袭血管或淋巴管，并被携带到其它组织，在所述其它组织中继续增殖。以此方式，一个部位处的原发性肿瘤可能在另一个部位处产生继发性肿瘤。
所公开的组合物可以延迟或抑制受试者中肿瘤的生长，减少肿瘤的生长或大小或完全消除肿瘤，抑制或减少肿瘤的转移和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关的症状。例如，在一些实施例中，组合物降低受试者的肿瘤负荷或者随时间推移减缓或预防肿瘤生长。
恶性肿瘤可以根据肿瘤源自的组织的胚胎起源进行分类。癌是源自内胚层或外胚层组织(如皮肤或内脏器官和腺体的上皮层)的肿瘤。发生频率较低的肉瘤源自于中胚层结缔组织，如骨骼、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤则倾向于以肿瘤块的形式生长。恶性肿瘤可能会出现在身体的许多器官或组织处，从而形成癌症。
可以用所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包含但不限于如多发性骨髓瘤等血管癌以及实体癌，包含骨、膀胱、脑、乳腺、宫颈、结肠、直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃和子宫的腺癌和肉瘤。在一些实施例中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。所述组合物还可用于治疗多个位置处的转移或肿瘤。
施用不仅限于治疗现有肿瘤，而且还可以用于预防或降低个体发展此类疾病的风险(即用于预防性用途)并减少癌症的扩散，例如通过转移。预防性疫苗接种的潜在候选者包含具有发展癌症的高风险的个体，即具有某些类型癌症的个人或家族病史的个体。
如本文所使用的，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包含白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性癌症包含：淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗抗性、
Figure BDA0003457831070000681
抗性、HER2阳性、阿霉素抗性、他莫苷芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈或食管)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包含甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛细胞瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特病(Paget's Disease of the Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。如本文所使用的，术语“初癌”是指在癌症之前或发展成癌症的病状或生长。如本文所使用的，术语“癌症转移”是指癌细胞或肿瘤从一个器官或身体部位扩散到另一个器官或身体部位。
术语“白血病”是指血液形成器官的渐进性、恶性疾病，并且总体上其特征在于白细胞和其前体在血液和骨髓中的失调增殖和发展。白血病通常在临床上基于以下各项进行分类：(1)疾病的持续时间和特性-急性的或慢性的；(2)所涉及的细胞的类型；脊髓的(骨髓性的)、淋巴的(淋巴性的)或单核细胞的；以及(3)异常细胞在血液中的数量的增加或非增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性白血病包含例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血胚细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成骨髓细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利氏白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、李德尔氏细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病或未分化型细胞白血病。
术语“肉瘤”通常是指由类似于胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包含软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏肿瘤肉瘤(Wilms'tumorsarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(Roussarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”应理解为源自皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑色素瘤包含例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈丁-帕西黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，所述上皮细胞倾向于浸润周围组织并引起转移。可以用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示范性癌包含例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺性囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮(carcinoma cutaneum)、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌(carcinomaex ulcere)、纤维癌、胶状癌(gelatiniforni carcinoma)、胶样癌(gelatinouscarcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌、许特尔氏细胞癌(Hurthle cellcarcinoma)、玻质状癌(hyaline carcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌(lipomatous carcinoma)、小叶癌(lobularcarcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液质癌(carcinoma mucosum)、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌(carcinomaspongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌(carcinoma tuberosum)、小管癌(tubular carcinoma)、结节性皮癌(tuberouscarcinoma)、疣状癌或绒毛状癌(carcinoma villosum)。
(IX)试剂盒
具体地包含至少一种所描述的治疗构建体(包含含有至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂或与至少一种有丝分裂激酶抑制剂和至少一种免疫检查点抑制剂相关联的递送媒剂)的活性组分可以以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包含一或多个容器，所述一或多个容器包含(含有)一或多种或更多种本文所述的化合物或复合物(例如，抗癌剂)，任选地连同一或多种用于疗法的另外的药剂。例如，一些试剂盒将包含一定量的至少一种另外的抗癌组合物、或一定量的至少一种另外的抗炎剂或两者。
试剂盒中的任何活性组分都可以按预先测量的剂量提供，尽管这不是必需的；并且预计某些试剂盒将包含多于一个剂量。
试剂盒还可以包含由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了机构针对人类施用在制造、使用或销售方面的许可。所述通知可以声明所提供的活性成分可以施用于受试者。试剂盒可以包含使用试剂盒的进一步说明，例如关于施用的说明；妥善处置相关废物等。说明书可以呈试剂盒内提供的印刷说明书的形式，或者说明书可以印刷在试剂盒本身的一部分上。说明书可以呈表格、小册子、手册、CD-ROM或计算机可读装置的形式，或者可以在远程位置(如网站)处提供对说明书的指导。在特定实施例中，试剂盒还可以包含有效使用试剂盒所需的一些或全部必要的医疗用品，如施涂器、安瓿、海绵、无菌胶带、洗必泰(Chloraprep)、手套等。可以对本文所述的任何试剂盒的内容进行更改。试剂盒的说明书将指导使用包含在所述试剂盒中的活性成分来实现本文所述的临床和/或治疗用途。
本文描述了在所公开的发明的实施例的实践和/或测试中使用的合适的方法、材料和实例。此类方法和材料仅是说明性的并且不旨在是限制性的。可以使用与本文所述的方法、材料和实例类似或等效的其它方法、材料和实例。
将下文示范性实施例和实例包含在内以说明本公开的特定实施例。根据本公开，本领域普通技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
(X)示范性实施例。
1.一种治疗构建体，其包含：递送系统；至少一种有丝分裂抑制剂，所述至少一种有丝分裂抑制剂例如与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内；以及至少一种免疫检查点抑制剂，所述至少一种免疫检查点抑制剂例如与所述递送系统偶联或包含在所述递送系统内。
2.根据实施例1所述的治疗构建体，其中所述递送系统包含脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机或有机纳米颗粒或微粒或其混合物。
3.根据实施例2所述的治疗构建体，其中所述递送媒剂包含以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、支化和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、磷酸钙颗粒、铝盐颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银纳米颗粒、碳纳米颗粒、铁纳米颗粒和/或经修饰的胶束。
4.根据实施例1到3中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述递送媒剂包括介孔二氧化硅纳米颗粒。
5.根据实施例4所述的治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒的尺寸为约5-200nm。
6.根据实施例4或5所述的治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有交联聚乙烯亚胺和聚乙二醇。
7.根据实施例1到6中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂和/或免疫检查点抑制剂包含寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
8.根据实施例1到7中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂是以下的抑制剂：polo样激酶(PLK)、极光激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、HASPIN、单极纺锤体1激酶(Mps1)或NimA相关激酶(NEK)。
9.根据实施例1到8中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂包含以下中的一或多种：GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替、Chk 1激酶抑制剂LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、阿利色替、普瑞色替或AZD7762。
10.根据实施例1到9中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂是沃拉色替。
11.根据实施例1到10中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂包含针对PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4中的一或多种的siRNA、抑制剂或抗体。
12.根据实施例1到11中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂选自针对PD-L1、PD-1或CTLA-4的抗体。
13.根据实施例1到12中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
14.根据实施例13所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂包含以下中的至少一种：纳武单抗、派姆单抗、MPDL3280A、伊匹单抗、曲美木单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、匹地利珠单抗或斯巴达珠单抗。
15.根据前述实施例中任一实施例所述的治疗构建体，其进一步包含佐剂。
16.根据实施例15所述的治疗构建体，其中所述佐剂包含以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。
17.根据实施例15或16所述的治疗构建体，其中所述佐剂包含CpG寡核苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特、poly I:C、poly ICLC、dSLIM或EnanDIM。
18.根据实施例17所述的治疗构建体，其中所述佐剂包括CpG寡核苷酸。
19.根据实施例1到18中任一实施例所述的治疗构建体，所述治疗构建体的流体动力学尺寸为5-999nm。
20.根据实施例1到18中任一实施例所述的治疗构建体，所述治疗构建体的流体动力学尺寸为1-1000微米。
21.一种治疗构建体，其包含：免疫检查点抑制剂；有丝分裂激酶抑制剂；以及连接所述免疫检查点抑制剂和所述有丝分裂激酶抑制剂的化学连接子。
22.根据实施例21所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
23.根据实施例21或22所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
24.根据实施例21到23中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体。
25.根据实施例21到24中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4的抗体。
26.根据实施例2125中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD-1或CTLA-4的抗体。
27.根据实施例21到26中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
28.根据实施例21到27中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂选自GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替、Chk 1激酶抑制剂LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、阿利色替、普瑞色替或AZD7762。
29.根据实施例21到28中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂是阿利色替。
30.根据实施例21到29中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括以下中的一或多种：肼；二硫化物；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯；3-(吡啶-2-基二磺酰基)丙酸全氟苯酯；3-甲基-3-(吡啶-2-基二磺酰基)丁酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯；Gly-Phe-Leu-Gly；Ala-Leu-Ala-Leu；Val-Cit；Phe-Lys；Val-Ala；Ala-Phe-Lys；Phe-Lys；(Gly)n，其中n为1-20；β-葡糖苷酸连接子；马来酰亚胺己酰基；N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯；4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸；二溴马来酰亚胺；对氨基苯甲酸；4-硝基苯酚；乙酸；甲酸；N-琥珀酰亚胺4-马来酰亚胺丁酸酯；N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺；N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺；N-琥珀酰亚胺3-马来酰亚胺丙酸酯；N-(3-马来酰亚胺丙酰氧基)琥珀酰亚胺；5-马来酰亚胺戊酸-NHS；分子量为100-10000Da的线性、支化或多臂聚乙二醇；炔丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯；焦磷酸酯；琥珀酰亚胺-4-叠氮基丁酸酯；N-羟基琥珀酰亚胺4-叠氮基苯甲酸酯；1-(4-甲酰基苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-酸叔丁酯；或其残基。
31.根据实施例21到30中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯连接子或其残基。
32.根据实施例21到31中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯。
33.根据实施例21到32中任一实施例所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括分子量为100-10000Da的线性聚乙二醇或其残基。
34.根据权利要求21到33中任一权利要求所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约1-20。
35.根据实施例34所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约2-8。
36.根据实施例34或35所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约4-6。
37.根据实施例21到33中任一实施例所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约1-20。
38.根据实施例37所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约2-8。
39.根据实施例37或38所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约4-6。
40.一种组合物，其包括根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
41.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物。
42.根据实施例41所述的方法，其中所述受试者是人。
43.一种治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物接触。
44.一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物接触。
45.一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使细胞离体与治疗有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物接触。
46.根据实施例44或45所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
47.根据实施例44或45所述的方法，其中所述细胞不是癌细胞。
48.根据实施例47所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
49.根据实施例43到48中任一实施例所述的方法，其进一步包含将至少一个经治疗的细胞返回施用于受试者。
50.一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例40所述的组合物。
51.根据实施例50所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括癌症、初癌或癌症转移中的一或多种。
52.根据实施例51或52所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、结肠癌或肝癌。
53根据实施例50到52中任一实施例所述的方法，其中所述施用包含以下中的一或多项：注射到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处注射；局部输注到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处局部输注；对所述受试者进行全身注射；对所述受试者进行全身输注；由所述受试者吸入；口服施用于所述受试者；或局部应用于所述受试者。
54.根据实施例50到53中任一实施例所述的方法，其中所述施用包括微针应用。
55.一种增强抗癌疗法在有需要的受试者中的效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物以及至少一种抗癌剂。
56.根据实施例55所述的方法，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
57.根据实施例55或56所述的方法，其中所述治疗构建体或组合物以及所述抗癌剂依次或同时施用。
58.一种增强、增加或改善在被诊断为患有瘤变的受试者中的放射疗法效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据实施例1到39中任一实施例所述的治疗构建体或根据实施例40所述的组合物以及至少一种放射疗法。
59.根据实施例58所述的方法，其中所述治疗构建体或组合物以及所述放射疗法依次或同时施用。
60.根据实施例49到59中任一实施例所述的方法，其中所述受试者是人。
61.一种试剂盒，其包含根据实施例1到39中任一实施例所述的免疫治疗构建体以及至少一种抗癌剂。
62.根据实施例61所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
(XI)实例。
实例1：用于治疗癌症的PLK1抑制和PD-L1阻断的组合
Polo样激酶1(PLK1)是一种在各种癌症中过表达并激发致癌特性的关键有丝分裂激酶(刘等人,转化肿瘤学,10(1):22-32,2016)。先前的研究已经说明了PLK1抑制作为治疗策略的潜力，并且若干PLK1小分子抑制剂已经进入临床试验(特里奇(Gutteridge)等人,分子癌症治疗学(Molecular Cancer Therapeutics),15(7):1427-35,2016)。然而，由于功效不佳和剂量限制性毒性，PLK1抑制剂作为单一疗法尚未超越临床试验(德布劳德等人,肿瘤学年鉴：ESMO官方期刊(Annals of Oncology:Official Journal of ESMO),26(11):2341-6,2015；斯科夫斯基等人,欧洲癌症杂志,48(2):179-86,2012；林等人,英国癌症杂志,110(10):2434-40,2014；弗洛斯特等人,当前肿瘤学,19(1):e28-35,2012)。最先进的PLK1抑制剂，即沃拉色替(BI6727)已经进入急性髓性白血病(血癌)的III期临床试验(杰特森等人,白血病,29(1):11-9,2015)，但最终未能达到客观应答的主要终点(英格海姆(Ingelheim),在欧洲血液学协会年会上提出的沃拉色替治疗急性髓性白血病的III期研究结果(Resultsof Phase III study of volasertib for the treatment of acute myeloid leukemiapresented at European Hematology Association Annual Meeting),康涅狄格州里奇菲尔德(Ridgefield,Conn.),2016)。对于肺癌，沃拉色替在II期临床试验中由于在给定剂量限制性毒性(每3周一次300mg)下缺乏应答而被提前终止作为单一疗法(埃利斯(Ellis)等人,临床肺癌(Clinical lung cancer),16(6):457-65,2015)。这些结果表明需要替代性治疗策略来激发抑制PLK1的全部潜力。
最近出现的靶向PD-L1/PD-1轴的免疫检查点阻断为NSCLC患者提供了有希望的结果。肿瘤细胞上的PD-L1表达通过与T细胞的PD-1受体结合并抑制其功能来抑制肿瘤定向的细胞毒性CD8+T细胞活性(奥格布拉姆(Ohaegbulam)等人,分子医学趋势(Trends inMolecular Medicine),21(1):24-33,2015；施莱马里(Shrimali)等人,免疫疗法(Immunotherapy),7(7):777-92,2015；邹等人,科学转化医学,8(328):328rv4-rv4,2016)。最近，PD-1和PD-L1的检查点抑制剂(例如，派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和德瓦鲁单抗)获得FDA批准以作为一线(派姆单抗)或二线疗法治疗NSCLC(盖廷格(Gettinger)，使用免疫检查点抑制的晚期非小细胞肺癌的免疫疗法(Immunotherapy of advanced non-smallcell lung cancer with immune checkpoint inhibition)(Uptodate.com,2018))。然而，虽然有应答的患者可能示出稳健且持久的应答，但仅有少数患者应答，并且许多最初应答者最终会复发(雷克等人,新英格兰医学杂志,375(19):1823-33,2016；马尔霍特拉(Malhotra)等人,肺癌转化研究(Translational Lung Cancer Research),6(2):196-211,2017；莫亚-奥尔诺(Moya-Horno)等人,内科肿瘤学治疗进展(Therapeutic Advances inMedical Oncology),10:1758834017745012,2018)。此外，针对免疫检查点的抗体的全身分布可能导致异常且不受控制的免疫应答，从而导致损害正常组织的免疫相关不良反应(irAE)(雷诺兹等人,临床肿瘤学杂志,36(15_增刊):3096,2018)。这些毒性可能导致治疗中断并且在一些情况下，irAE可能是致命的。因此，提高免疫检查点阻断的应答和治疗功效的策略很受关注(堪瓦尔(Kanwal)等人,治愈医学杂志(Cureus),10(9):e3254-e,2018)。
最近的一项研究示出了PD-L1蛋白丰度在多种人类癌细胞系的细胞周期进程期间波动，在M期和G1早期达到峰值(张等人,自然,553(7686):91-5,2018)。因此，在由诺考达唑(nocodazole)或紫杉醇(taxol)停滞于M期的多个小鼠肿瘤源性细胞系中观察到PD-L1蛋白丰度增加(张等人,自然,553(7686):91-5,2018)。PLK1的减少诱导了强烈的可以在治疗后持续若干天的有丝分裂停滞(图2A-2C以及莫里(Morry)等人,分子癌症疗法2017,16(4):763-772)。总的来说，这些观察结果允许假设将PD-L1抗体与有丝分裂激酶抑制剂(如PLK1抑制剂)组合可以增加癌细胞杀伤，这是由于PLK1抑制剂的凋亡作用和PD-L1检查点阻断将引发的抗肿瘤免疫效应引起的。
在本文中，描述了开发一种装载PLK1抑制剂的与PD-L1抗体缀合的介孔二氧化硅纳米颗粒平台(MSNP)，以协同靶向PLK1和PD-L1两者的组合效应。通过利用纳米颗粒构建体或抗体药物缀合物(ADC)共同递送这些药剂，可以有效地将治疗效果共同定位于肿瘤并减少与药物的全身治疗相关的毒性问题。所述构建体还触发针对癌症的适应性免疫。研究强调了一种合理的组合策略，以通过利用MSNP平台作为递送载剂来增强现有疗法而不增加毒性。
材料和方法
细胞系和试剂：A549 NSCLC购自ATCC(CCL-185)并维持在具有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中。路易斯肺癌(Lewis Lung Carcinoma，LLC)转移变体、LLC-JSP细胞和荧光标记的LLC-JSP细胞由唐·吉本斯博士(Dr.Don Gibbons)的实验室(MD安德森癌症中心(MDAnderson Cancer Center))提供，并在RPMI+10％FBS中培养。所使用的抗体：人PD-L1抗体(eBioscience公司(eBioscience))、小鼠PD-L1(PE，BD生物科学公司(BD Biosciences))、小鼠CD3(APC，eBioscience公司)、小鼠CD8a(Pacific Blue，英杰公司(Invitrogen))、小鼠CD4(BV711，BD生物科学公司)、小鼠PD-1(PE/Cy7，BioLegend公司(BioLegend))。AlexaFluor 488次级抗体购自生命科技公司(Life Technologies)。体内级小鼠PD-L1抗体购自BioXcell公司(BioXcell，BE0101)，并且沃拉色替购自Selleckchem公司(Selleckchem)。siRNA序列：PLK1(反义5'-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCGG-3'；SEQ ID NO:2)；乱序SCR(反义5'-UUAGUCGACAUGUAAACCA-3'SEQ ID NO:3)购自Dharmacon公司(Dharmacon)。
纳米颗粒的合成与表征：正如之前报道的一样，合成了裸MSNP(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-59,2015，以及美国专利公开第2017/0173169号)。对于PLK1抑制剂装载，将沃拉色替溶解在DMSO中并在乙醇溶液中稀释，并与含MSNP的乙醇混合，在室温下振荡(350RPM)过夜。第二天，根据之前的研究(恩甘切尔德拉库尔等人,先进功能材料,25(18):2646-59,2015；恩甘切尔德拉库尔等人,国际纳米医学杂志,13:4015-27,2018)，用PEI(阿法埃莎公司(Alfa Aesar))和mal-PEG-NHS(键凯科技有限公司(Jenkem))涂覆纳米颗粒。对于PD-L1抗体缀合，将体内级小鼠PD-L1抗体(BioXcell公司)缓冲液更换为PBS pH 8(Zeba旋转柱，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))，并按照制造商的方案使用Traut试剂(赛默飞世尔科技公司)进行硫醇化。将硫醇化抗体以20wt.％添加到NP中，并在4℃(300RPM)下振荡过夜。在表征之前，用PBS pH 7.2洗涤纳米颗粒。纳米颗粒大小为90nm，使用Malvern Zetasizer进行测定。抗体载量为4wt.％，通过BCA测定对NP上清液的蛋白质定量进行测定。为了对PLK1抑制剂装载进行定量，在DMSO溶液中振荡纳米颗粒以释放药物并收集上清液。用Tecan酶标仪测量上清液的吸光度以测定装载程度为0.5wt.％。p-iPLK1-NP是装载有PLK1抑制剂和PD-L1抗体两者的纳米颗粒，p-NP是装载有PD-L1抗体的纳米颗粒，并且iPLK1-NP是装载有PLK1抑制剂的纳米颗粒。
流式细胞术：将细胞(100K细胞/孔)置于6孔板中过夜，并在第二天用指定的处理进行处理。处理后，收集细胞并在FAC缓冲液中洗涤和染色前将其等分为每个样品100万个细胞。初级抗体和次级抗体在冰上摇晃下分别染色持续30分钟和1小时。染色后，在用GuavaeasyCyte(微孔西格玛(Millipore Sigma))流式细胞仪(每个样品10,000个事件)进行流式分析之前，在FAC缓冲液中洗涤细胞。对于肿瘤，在通过70um过滤器粉碎以获得单细胞悬浮液之前，采集肿瘤、切碎并与1mg/ml DNA酶一起温育持续30分钟。将RBC裂解缓冲液与细胞一起温育持续5分钟，并用PBS洗涤。在用染料缀合的抗体染色持续30分钟之前(在FAC缓冲液中)，用Fc屏蔽阻断每个样品100万个细胞。然后用FAC缓冲液洗涤细胞，并用Guava进行分析(每个样品50,000个事件)。
蛋白质印迹：将细胞接种在6孔板中过夜，并用指定的处理进行处理。处理后一天更换细胞培养基。处理后三天，在RIPA缓冲液(每孔50-100μl)中裂解细胞。对裂解物进行超声处理并离心(15,000RPM，持续15分钟)并收集上清液。使用BCA定量总蛋白质的量。将30μg蛋白质(每个样品)与4X Novex NuPAGE LDS样品缓冲液和β-巯基乙醇(10％最终浓度)混合。使样品在95℃下变性持续5分钟并装载到凝胶(NuPAGE)上以进行电泳。然后将蛋白质转移到PVDF-FL膜上并用LICOR阻断缓冲液进行阻断。将膜与初级抗体(PLK1、磷酸-STAT3(Tyr705)、β-肌动蛋白)一起在4℃下温育过夜。第二天，用TBS-T冲洗膜，并在室温下在摇晃下添加IRDye缀合的次级抗体(LI-COR)持续1小时。在LI-COR Odyssey CLx成像系统上扫描膜。
处理后的细胞活力：将细胞(1500个/孔)置于白色平底96孔板中过夜。第二天，用指定的处理方法处理细胞，并在处理后24小时更换培养基。处理后3-5天，按照制造商的说明使用细胞滴度Glo测定(普洛麦格公司(Promega))评估细胞活力。用Tecan酶标仪读取发光。
RT-qPCR评估PLK1基因敲低：按照制造商的说明，使用GeneJet RNA纯化试剂盒(赛默飞世尔科技公司)分离RNA。使用EXPRESS One-Step SuperscriptTMqRT-PCR试剂盒(英杰公司)进行一步qRT-PCR。循环条件：50℃持续2分钟、95℃持续10分钟、40次95℃循环持续15秒以及60℃持续1分钟。使用TAQMAN基因表达引物，人HPRT mRNA(Hs99999909_m1)、人PLK1mRNA(Hs00983225_g1)和人PD-L1(Hs00204257_m1)。使用2–ΔΔC(t)方法分析数据。
同基因肿瘤模型和处理：对于单胁腹肿瘤模型，将LLC-JSP鼠类肺癌细胞(200K)接种于C57BL/6雌性小鼠(6周)的右胁腹(查尔斯河NCI菌落(Charles River NCI colony))。在肿瘤接种后8天，小鼠接受了沃拉色替(20mg/kg)和/或PD-L1抗体(来自BioXcell公司的小鼠PD-L1；10mg/kg)的腹膜内(i.p.)处理，每5天一次，总共3个剂量。用游标卡尺测量肿瘤，并且体积按V＝0.5×长度×宽度2进行计算。对于双侧肿瘤，C57BL/6分别在右胁腹和左胁腹接种100K和40K LLC-JSP细胞。接种后12天，每3天向右侧肿瘤瘤内施用上述处理，总共3个剂量。对于单胁腹和双侧胁腹肿瘤模型两者，当总肿瘤负荷超过2000mm3时处死小鼠。对于转移性肺肿瘤模型，向6周龄C57BL/6小鼠静脉内(i.v.)注射LLC-JSP(200K)。在癌细胞注射后3天，将小鼠随机分组，并用静脉内生理盐水、p-iPLK1-NP(25mg/kg NP)或腹膜内PD-L1抗体(5mg/kg)和沃拉色替(1.25mg/kg)进行处理，每3天一次，总共4个剂量。所有研究均由俄勒冈健康与科学大学(OHSU)的机构动物管理与使用委员会(IACUC)审查和批准。
统计分析：所有统计分析均采用GraphPad Prism 8.0(GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.))。两组之间的比较用斯图登氏t测试(Student's t-test)进行。采用双向重复测量ANOVA和图基校正(Tukey's correction)对肿瘤生长进行分析，以进行多重比较。采用对数秩(Mantel-Cox)方法分析卡普兰-迈耶存活曲线。显著性设定为p<0.05。体外数据表示为平均值±SD；体内数据表示为平均值±SEM。
结果
PLK1敲低诱导癌细胞中PD-L1的表达：有丝分裂激酶抑制剂，如小分子抑制剂(例如，BI2536)或针对在纳米颗粒上递送的PLK1的siRNA(参见专利公开第2017/0173169号)敲低PLK1(图2A-2B)，从而导致肺癌细胞死亡(图2C)并使癌细胞处于G2/M生长停滞状态(图2D)。这与先前的报告一致，即PLK1抑制或敲低导致乳腺癌G2/M中的细胞周期停滞(莫里等人,分子癌症疗法,16(4):763-772,2017)。
PLK1敲低导致人(A549，图3A-3B)和鼠类(LLC-JSP，图3C)肺癌细胞系两者中PD-L1表面表达增加。如在图3A中示出的，与对照处理的细胞相比，85％的PLK1 mRNA敲低(通过针对PLK1的siRNA)导致A549细胞系中PD-L1 mRNA表达增加2.5倍。在siRNA处理后3天，A549(图3B)和LLC-JSP(图3C)肺癌细胞系中的表面蛋白水平证实了这一点。
有丝分裂激酶抑制剂杀死癌细胞并上调PD-L1表达：在发现PLK1敲低导致PD-L1上调后，试图确定这是否适用于一般的有丝分裂激酶的抑制。在小鼠肺癌细胞系中针对PLK1(沃拉色替)、极光激酶A(阿利色替)和CHK1(AZD7762)筛选了三种主要的有丝分裂激酶抑制剂。如在图4中示出的，在每种情况下，用沃拉色替、阿利色替或AZD7762处理LLC-JSP(鼠类肺癌细胞系)导致显著的细胞死亡(图4A)和上调的表面PD-L1水平(图4B-4C)。这证实了有丝分裂激酶抑制(不考虑激酶类别)与PD-L1上调之间的联系。存活细胞具有增加的免疫检查点分子水平(例如PD-L1，图3A-3C和图4B-4C)，这预防细胞毒性T细胞攻击存活的癌细胞。因此，将有丝分裂抑制剂(例如，PLK、极光激酶、CHK1、CDK1/2、HASPIN、Mps1、NEK抑制剂)和免疫检查点抑制剂(例如，针对抗PD-L1、PD-1、CTLA-4的单克隆抗体)共同递送在相同的构建体上将产生更大的癌症死亡。
PLK1抑制与PD-L1阻断的组合增强体内肿瘤控制：基于发现PLK1减少会导致PD-L1增加，试图研究PLK1抑制和PD-L1阻断是否将在体内协同。使用LLC-JSP细胞系在具有免疫能力的小鼠中建立胁腹肿瘤模型(陈(Chen)等人,自然通讯(Nature Communications),5:5241,2014)。在肿瘤接种后第8天，每5天用PLK1抑制剂沃拉色替(20mg/kg)和PD-L1单克隆抗体(10mg/kg)对所建立的肿瘤(>60mm3)进行腹膜内处理，总共3个剂量(图5A)。如在图5B中示出的，与单次药物施用相比，组合处理显著降低了肿瘤生长。此外，所述组合显著延长了小鼠的存活期(图5C)，证实了假设。
PLK1抑制剂沃拉色替(iPLK1-NP)的纳米颗粒递送：尽管有丝分裂激酶PLK1有望成为治疗靶标，但目前用小分子抑制剂进行的临床试验令人失望。所有六种PLK1抑制剂(GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、TKM-PLK1和BI6727)均未通过临床试验。为了降低PLK1抑制剂的毒性并提高其肿瘤生物利用度，研究了MSNP平台是否能够提高临床上可用的PLK1抑制剂的功效。莫里等人(分子癌症疗法,16(4):763-772,2017)证明了此MSNP平台有望将siRNA靶向和递送到包含转移到肺的肿瘤的乳腺肿瘤以及原位肺肿瘤。在此研究中，利用所述平台来递送小分子抑制剂沃拉色替，其是最先进的PLK1抑制剂。在用聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)进行表面修饰之前，将沃拉色替装载到介孔二氧化硅(图6A)上。最终纳米颗粒(称为iPLK1-NP)的尺寸为90nm(图6B)，其处于利用EPR效应的适当范围内，并含有0.5wt.％PLK1抑制剂沃拉色替。如在图6C中示出的，与以剂量依赖性方式进行的经媒剂处理的细胞相比，用沃拉色替或iPLK1-NP处理LLC-JSP细胞显著降低了细胞活力。此外，用iPLK1-NP处理比用游离PLK1抑制剂处理更能降低细胞活力(图6C)。与先前使用PLK1 siRNA(图3A-3C)和有丝分裂激酶抑制剂(图4B-4C)的发现一致，用iPLK1-NP处理导致PD-L1细胞表面表达显著增加(图6D)。
用于共同递送iPLK1和PD-L1抗体的纳米颗粒(p-iPLK1-NP)：由于iPLK1-NP可以有效杀死癌细胞并且同时上调存活细胞的PD-L1，旨在通过在iPLK1-NP上缀合PD-L1抗体来利用这一优势以靶向PD-L1+癌细胞。从这个意义上而言，可以产生前馈循环，其中重复施用PD-L1靶向的iPLK1-NP(称为p-iPLK1-NP)将上调PD-L1表达并允许更好的肿瘤靶向以诱导细胞凋亡(通过PLK1抑制)和抗肿瘤免疫应答(通过PD-L1阻断)两者。这对于治疗没有明显的纳米颗粒递送靶标/受体的肿瘤特别有利，并且可能最终允许免疫检查点阻断的更高应答率。如在图7A中示出的，PD-L1抗体与NP上的PEG缀合，并且通过BCA测定确定抗体量为4wt.％。构建体的流体动力学尺寸如在图7B示出的，为约90nm。与iPLK1-NP一样，用p-iPLK1-NP处理显著降低了LLC-JSP细胞系中的细胞活力(图7C)。此外，LLC-JSP细胞与p-iPLK1-NP一起温育持续2小时所阻断的PD-L1表面受体与以25倍高的剂量递送的游离PD-L1抗体一样多(图7D)。这可能是由于当抗体与纳米颗粒一起递送时细胞所经历的高局部抗体浓度引起的。iPLK1-NP在此短时间点对PD-L1水平没有影响(图7D)。如所预期的一样，用iPLK1-NP处理细胞持续2天增加了PD-L1水平，在用含有PD-L1抗体的纳米颗粒(p-iPLK1-NP)处理后，所述PD-L1水平降低至正常水平(参见未处理的)(图7E)。这证明了纳米颗粒靶向和阻断由PLK1抑制诱导的PD-L1受体。
p-iPLK1-NP的局部递送减少了局部和远隔肿瘤的生长：为了评估p-iPLK1-NP的抗肿瘤免疫应答，使用了双侧胁腹肿瘤模型。C57BL/6小鼠分别在右胁腹和左胁腹注射100K和40K LLC-JSP细胞。注射后第12天，每3天向右胁腹(局部)肿瘤注射PBS、p-NP、iPLK1-NP或p-iPLK1-NP(0.5mg NP、2.5μg iPLK1、20μg PD-L1)，总共注射3次(图8A)。监测局部(经处理)和远隔(未经处理)肿瘤的肿瘤生长。与含有单一药物的纳米颗粒(p-NP或iPLK1-NP)相比，用p-iPLK1-NP处理显著降低了局部肿瘤的肿瘤生长(图8B)。重要的是，也观察到经p-iPLK1-NP处理的小鼠的远隔肿瘤发作延迟(图8C)，这说明产生了抗肿瘤免疫应答。抗肿瘤免疫效应并非仅来自纳米颗粒上的PD-L1，而是由纳米颗粒上的PD-L1和PLK1抑制剂两者共同产生的(图8C)。此外，与生理盐水对照或单一药物NP相比，p-iPLK1-NP处理显著延长了小鼠的存活期(图8D)。此外，在单独的研究中，如在图8A中所示的，向小鼠注射生理盐水或p-iPLK1-NP，并且在最后一次处理后一天采集肿瘤以评估T细胞浸润。如在图8E中示出的，与对照肿瘤相比，用p-iPLK1-NP处理的肿瘤具有显著更高的CD3+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，而CD4+TIL没有增强。
p-iPLK1-NP的全身施用可延长患有实验性转移性肿瘤的小鼠的存活期：为了证明p-iPLK1-NP对肺癌的临床潜力，通过静脉内注射LLC-JSP细胞(200K细胞)开发了一种实验性转移性肺肿瘤模型。细胞注射后三天，将小鼠随机分组并每3天用生理盐水、p-iPLK1-NP或游离药物(沃拉色替+PD-L1抗体)处理，总共4个剂量，如在图9A中示出的。所施用的游离药物的剂量是NP剂量的5倍。用p-iPLK1-NP处理的小鼠存活期显著长于用生理盐水处理的小鼠的存活期(图9B)。对于每只死亡小鼠，在视觉上确认肺肿瘤的存在。数据表明，由于纳米颗粒具有靶向肿瘤和共定位治疗效果以及触发适应性抗肿瘤免疫的能力，因此p-iPLK1-NP与以5倍高剂量施用的游离药物一样有效。此外，用p-iPLK1-NP处理没有引起任何体重减轻，证明了构建体的安全性(图9C)。治疗构建体的全身应用允许治疗不适用于局部递送的其它癌症。
p-iPLK1-NP的全身施用依赖于CD8+T细胞：向C57BL/6小鼠静脉内注射200K LLC-JSP细胞。3天后，用生理盐水、p-iPLK1-NP(静脉内，含有2.5μg沃拉色替和20μg PD-L1抗体)或p-iPLK1-NP+抗CD8(200μg，每周两次)处理小鼠。如在图10中示出的，p-iPLK1-NP的功效是免疫介导的，因为CD8耗竭消除了p-iPLK1-NP的作用，并且没有观察到延长的存活期(生理盐水对p-iPLK1-NP+抗CD8抗体；p>0.05＝ns)。免疫介导的应答取代了此特定纳米构建体的直接药物作用。
抗PD-L1缀合的NP的前馈(正反馈循环)递送和特异性：虽然p-iPLK1-NP最初在结合和内化时降低PD-L1水平(如在图7D-E中示出的)，但由于PLK1抑制的信号传导效应，存活细胞的PD-L1水平已经上调(图6D)。在这种情况下，未经调节的PD-L1被用作后续递送p-iPLK1-NP的归巢靶标，从而导致以前馈方式实现癌症靶向(即，随着治疗剂量的增加，靶向性更高，直到所有癌症消失)。为了研究p-iPLK1-NP的前馈靶向性，使用了表达低基线PD-L1水平的4T1鼠类癌细胞。p-iPLK1-NP导致处理4天后4T1细胞中的PD-L1上调(图11A)。然后评估了p-iPLK1-NP在对照(PD-L1低)和经p-iPLK1-NP处理的4T1细胞(PD-L1上调)中的细胞摄取。如在图11B中示出的，在暴露1小时后，p-iPLK1-NP优先地被PD-L1高细胞对PD-L1低细胞吸收近4倍，证明了p-iPLK1-NP的选择性和前馈靶向性。还通过比较用p-iPLK1-NP处理之后各种癌细胞(肺LLC-JSP、乳腺4T1、黑色素瘤B16-F10癌细胞)对骨髓源性树突细胞(BMDC)的活力，评估了细胞杀伤选择性。如在图11C中示出的，p-iPLK1-NP在癌细胞中导致显著的细胞杀伤，但在树突细胞中导致最小的杀伤，这是抗原呈递以开发抗肿瘤T细胞所必需的。抑制有丝分裂激酶如PLK1(例如，使用siRNA，图12A)也降低STAT3的磷酸化，因此将有利于调节肿瘤的免疫抑制环境。
讨论
在此实例中，示出了抑制PLK1和其它有丝分裂激酶极光激酶A和CHK1导致人和小鼠NSCLC细胞中免疫检查点PD-L1表达增加。这表明避免免疫应答是由在有丝分裂激酶抑制下存活的癌细胞所利用的一种机制。
以前的研究也示出了PLK1在免疫方面的作用。例如，PLK1已经被示出是STAT3激活的促进免疫抑制微环境的调节剂(张等人,肠胃病学(Gastroenterology),142(3):521-30.e3,2012)，并且抑制PLK1导致NSCLC细胞中的磷酸化STAT3丢失(燕(Yan)等人,肿瘤学快报(Oncology Letters),16(5):6801-7,2018)并且如本文所报告的(图12A)。此外，发现PLK1与MAVS相关，并负性控制其在诱导I型干扰素方面的活性(格林惠斯(Gringhuis)等人,自然免疫学(Nature Immunology),18(2):225-35,2017；维图尔(Vitour)等人,生物化学杂志(J Biological Chemistry),284(33):21797-809,2009)。有趣的是，PLK1抑制也示出了显著增加对MHC I类蛋白，即抗原呈递表面受体进行编码的HLA mRNA(李(Li)等人,肿瘤学杂志(Journal of Oncology),2018:3979527,2018)。这些研究表明，PLK1抑制可能有望增强免疫疗法。然而，据所知，这是首个报告PLK1抑制与免疫疗法的组合的有效性的研究。
PLK1抑制诱导PD-L1上调，并且PD-L1抗体与PLK1抑制剂的共同递送显著增强如NSCLC所示的治疗结果。其它细胞毒性剂也已示出增加PD-L1表达，包含卵巢癌中的紫杉醇(彭(Peng)等人,癌症研究,75(23):5034-45,2015)、乳腺癌中的CDK4/6抑制剂(张等人,自然,553(7686):91-5,2018)和PARP抑制剂(焦(Jiao)等人,临床癌症研究,23(14):3711-20,2017)。因此，这些药物现在与PD-L1检查点阻断组合进行临床研究是合乎逻辑的(埃斯特万(Esteva)等人,柳叶刀肿瘤学,20(3):e175-e86,2019)。研究结果还表明，这些和其它细胞毒性剂可以与纳米颗粒上的PD-L1免疫检查点阻断组合以促进有效疗法并降低临床毒性。
此实例中所呈现的研究侧重于肺癌，即主要的癌症杀手(美国癌症协会(AmericanCancer Society)，癌症事实与数据(Cancer Facts&Figures.)2018)。与免疫疗法最有希望的黑色素瘤一样，肺癌也是一种具有高突变负荷的疾病，可驱动可以由宿主免疫系统识别的各种新表位的表达(坎贝尔(Campbell)等人,自然遗传学(Nature Genetics),48(6):607-16,2016；里兹维(Rizvi)等人,科学,348(6230):124-8,2015)。因此，免疫疗法是治疗肺癌的有前途的方法。然而，肺癌患者的客观应答率远低于黑色素瘤患者的客观应答率。此处描述的研究说明当PLK1抑制与PD-L1阻断组合时，肺癌如何获得更好的应答。此外，由于PD-L1的增加对PLK1抑制剂没有特异性，因此可以探索诱导PD-L1上调的其它细胞毒性剂与当前的免疫检查点阻断剂协同作用。此外，通过与MSNP平台共同定位治疗效果，所需药物的剂量可以减少5倍。这表明纳米颗粒可以提高功效并降低游离药物的全身毒性。这是改善结果的关键，因为当前采用免疫检查点阻断的组合疗法策略可能导致更高的不良事件发生率。最后，由于MSNP平台的多功能性，除了靶向抗体(例如，PD-L1)和PLK1抑制剂外，siRNA还可以装载成靶向任何被鉴定为癌症进展或免疫逃避调节剂的基因。
实例2：用于增强治疗构建体功能的佐剂寡核苷酸
还可以并入佐剂寡核苷酸以增强抗肿瘤免疫。例如，在p-iPLK1-NP(称为p-iPLK1-NP-CpG)上并入CpG显著提高了7只小鼠中的2只小鼠的存活率，并且一只小鼠完全没有肿瘤(图13)。CpG寡脱氧核苷酸用作危险相关分子模式(DAMP)以刺激PRR，具体地是toll样受体9(TLR9)。这用作激活抗原呈递细胞和随后致敏T细胞的危险信号。因此，通过释放抗原(通过有丝分裂抑制剂杀死癌症)、递送CpG佐剂和阻断免疫检查点，这种疗法解决了癌细胞逃避免疫应答的各种策略(帕特尔(Patel)和米恩(Minn),免疫48(3):417-433,2018)。
实例3：与游离药物对应物相比，阿利色替和PD-L1抗体的抗体药物缀合物(ADC)导致增强细胞杀伤。
免疫检查点抗体-有丝分裂激酶抑制剂ADC由免疫检查点抗体、MKI和连接子构成。抗体充当药物载剂(MKI)。可以定制连接子以获得期望的ADC理化特性和药代动力学，并控制药物释放。药物可以在靶向细胞外或内释放。如果药物在靶向细胞内释放，则抗体也可充当靶向部分以增强细胞对药物的摄取。药物与抗体比率的范围可以为1到20。理想的比率(例如，约2到8或约4到6)应产生最佳的药代动力学和肿瘤累积以及最高的抗肿瘤活性。
材料和方法：PD-L1-阿利色替的合成含有3个步骤。(1)阿利色替-PEG缀合，(2)PD-L1激活，以及(3)PD-L1-阿利色替缀合。(1)：将含0.3ml 5mg/ml阿利色替(美国Selleck化学公司)的二甲基亚砜(DMSO)(美国赛默飞世尔科技公司)与含50μl 60mg/ml(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(美国赛默飞世尔科技公司)的DMSO和含27μl 60mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(美国西格玛奥瑞里奇公司(Sigma-Aldrich，USA))的DMSO混合。之后，添加含57.8μl 40mg/ml H2N-PEG-SH(MW 400)(美国Nanocs公司(Nanocs,USA))的DMSO。用N2吹扫反应混合物持续1分钟，并且然后在室温下搅拌持续12小时。然后添加蒸馏水以沉淀阿利色替-PEG-SH。通过在15,000rpm、4℃下离心持续10分钟收集阿利色替-PEG-SH，并用蒸馏水洗涤3次。将最终清洁的阿利色替-PEG-SH冻干(AdVantage 2.0，美国SP科技公司(SPScientific,USA))以供长期储存。(2)：将0.147ml 6.76mg/ml PD-L1(美国BioXCell公司)与0.9ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)和29μl 5mg/ml 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(美国赛默飞世尔科技公司)水溶液混合。在室温下将反应混合物搅拌持续1小时。使用脱盐柱(美国赛默飞世尔科技公司)收集纯PD-L1-SMCC。(3)：将750μg PD-L1-SMCC和70μg阿利色替-PEG-SH溶解在PBS(pH 7.2)(1ml)、DMSO(50μl)和丙二醇(50μl)的混合物中。用N2吹扫反应混合物持续1分钟，并且然后在室温下搅拌持续24小时。通过脱盐柱收集PD-L1-阿利色替溶液，并且然后冻干。在280nm和318nm处通过UV吸光度测定药物与抗体比率。
结果：已经使用在FDA批准的ADC药物(卡迪拉(Kadcyla)或T-DM1)中使用的N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)连接子制备了PD-L1抗体-阿利色替缀合物。MCC连接子不可切割，但在与抗体-MCC缀合之前，阿利色替通过-HN-CO-键用短PEG链进行修饰(图14A)。此酰胺键可以被内体和溶酶体中的酸性条件水解，从而完整地释放阿利色替。短PEG8(MW 400Da)用于增强阿利色替的溶解度并引入硫醇基以与抗体-MCC缀合。脱盐柱用于去除游离阿利色替和硫醇化的阿利色替。药物与抗体比率(DAR)是每个抗体6个阿利色替分子(通过UV-Vis测定)。当与游离阿利色替相比时，ADC在LLC-JSP细胞中具有显著更高的细胞毒性(图14B)，而游离PD-L1对细胞活力没有任何影响(图14C)。
实例4：治疗构建体的局部调配物和应用
本文公开的治疗构建体可以调配成局部调配物。本领域已知的若干媒剂可以与构建体混合，例如，Aquaphor(基于软膏)和Carbopol(基于凝胶)。加热或表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80(Tween 80)作为乳化剂)可以用于允许更好地混合媒剂和AIRISE的水性悬浮液。作为实例，已证实10wt.％Tween-80不会导致任何siRNA从纳米颗粒过早泄漏。还示出在将混合物温热到55℃后，2.5wt.％Tween-80足以增强siRNA-NP和Aquaphor的混合。
可以使用用于同时增强渗透的方法，如超声波和微针滚轮(例如，针高范围为0.5mm到1.5mm的
Figure BDA0003457831070000871
)。当在猪皮(图15)和小鼠(图16)中测试时，应用针高短至0.5mm的微针可以增强局部siRNA-纳米颗粒调配物的渗透。
图15示出当在猪皮中测试时，微针滚轮增强siRNA纳米颗粒构建体的渗透，猪皮的厚度与人皮的厚度类似。将猪皮与调配物(含Dy677-siSCR-NP的Aquaphor)一起温育持续1.5小时(37℃；5％CO2)。1.5小时后，从经处理的区中取出皮肤穿孔并使用标准方法处理以进行荧光成像。观察到使用微针滚轮的皮肤渗透显著增强。虽然在没有滚轮的情况下给予含siRNA-NP的Aquaphor时，siRNA信号(箭头)被局限在猪皮的外表面，但是观察到siRNA信号(箭头)通过微针预应用穿过表皮下至真皮层(图15)。
图16示出微针滚轮增强siRNA-NP的局部递送。首先，在处理前一天给小鼠剃毛。将Dy677-siSCR-NP(0.72nmol siRNA)与100μL 2.5％Tween-Aquaphor混合(每次应用)。就在处理之前，仅在背部的一侧沿四个方向一致地应用真皮微辊，而另一侧不进行预处理。在有微针预处理和没有微针预处理的情况下，将混合物应用于剃过毛的区(大约2cm2的应用区)以进行比较。在1.5小时的处理时间后，采集经处理的皮肤样品并进行处理以供成像。
图17A-17B示出了在微辊+局部siRNA纳米构建体应用后3天所得的基因敲低。观察到siEGFR-NP相对于经生理盐水处理的组55％的EGFR敲低(*p<0.05)(图17A)。相比之下，siEGFR-NP的一次皮内注射(具有0.72nmol的相同siEGFR剂量)相对于经生理盐水处理的组产生40％的EGFR敲低(图17B)。治疗构建体的微针形式。探索了使用基于葡聚糖、支化淀粉、PVP、PEG、甲基纤维素、壳聚糖或本领域已知的其它聚合物或化合物的可溶解微针进行微针制造，如在图18中所示，所述微针制造允许无痛的家庭治疗并且由于高针密度(每1cm2 100针)而在递送AIRISE-02时非常有效。作为实例(图18)，将含有装载有Dy677-缀合的siRNA的NP的葡聚糖溶液(300mg/ml于水中)浇铸到微针模具上。将溶液离心或抽真空以致密地填充模具。微针通过空气、干燥剂、真空烘箱、冰箱或其组合干燥并从模具中取出。根据模板和优化，针的高度从300到800微米不等。siRNA-NP成功地装载到这些针阵列中(以每个阵列约0.5nmol siRNA)，并且针在应用于猪皮后5分钟内完全溶解。可以通过改变微针的成分来设计不同的溶解时间。不同形状和形式的微针贴剂也可以用不同的模板制造。
如本领域普通技术人员将理解的，本文公开的每个实施例可以包括其特定陈述的要素、步骤、成分或组分、基本上由其组成或由其组成。因此，术语“包含(include)”或“包含(including)”应被解释为叙述：“包括、由...组成或基本上由...组成。”过渡术语“包括(comprise/comprises)”是指包含但不限于，并允许包含未指定的要素、步骤、成分或组分，即使是主要量。过渡性短语“由...组成”不包括任何未指定的要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由...组成”将实施例的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分，并且限制为不实质上影响实施例的要素、步骤、成分或组分。在此上下文中，实质性影响是治疗构建体的生物学影响(如抗癌作用)中的可测量减少。
除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分数量、性质(如分子量)、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化的近似值。至少，并且并非试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。当需要进一步澄清时，术语“约”具有当与所述数值或范围结合使用时由本领域的技术人员合理地赋予其的含义，即表示稍微大于或稍微小于所述值或范围，在所述值的±20％；所述值的±19％；所述值的±18％；所述值的±17％；所述值的±16％；所述值的±15％；所述值的±14％；所述值的±13％；所述值的±12％；所述值的±11％；所述值的±10％；所述值的±9％；所述值的±8％；所述值的±7％；所述值的±6％；所述值的±5％；所述值的±4％；所述值的±3％；所述值的±2％；或所述值的±1％的范围内。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中阐述的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有必然由其相应的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
除非本文中另有所指或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对值的范围的叙述仅旨在充当一种单独指代落入所述范围内的每个单独的值的简化方法。除非本文另外指明，否则将每个单独的值并入本说明书中，就好像每个单独的值是在本文中单独引用的一样。除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
本文公开的本发明的替代性要素或实施例的分组不应被解释为限制。每个组成员可以被单独地或者以与所述组中的其它成员或本文发现的其它要素进行任何组合的方式被引用和保护。出于便利性和/或专利性的目的，预计组中的一或多个成员可以被包含在组中或从组中删除。当进行任何这种包含或删除时，将说明书视为包含修改后的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施例，包含诸位发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前述描述后，这些描述的实施例的变型将变得清楚。发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这些变化，并且诸位本发明人的意图是以与本文具体描述的方式不同的方式来实践本发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包含对所附权利要求书所叙述的主题的所有修改和等效物。此外，本发明涵盖以上描述的要素在其所有可能的变体中的任意组合，除非另外在本文中指出或另外明确地与上下文相矛盾。
此外，本说明书中对专利、印刷出版物、杂志文章和其它书面文本(本文中的参考资料)进行了大量参考。每个参考材料单独以全文引用的方式并入本文中，以供参考教学之用。
应当理解，本文公开的本发明的实施例是对本发明原理的说明。可以采用的其它修改也在本发明的范围内。因此，作为实例而非限制，根据本文的教导，可以利用本发明的替代性配置。因此，本发明不限于精确地如所示出和描述的那样。
本文示出的细节仅作为实例，并且仅用于本发明的优选实施例的说明性讨论，并且是为了提供被认为是对本发明的各个实施例的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述而呈现的。在此方面，并未试图以比对基本理解本发明所需的细节更详细地示出了本发明的结构细节，结合附图和/或实例进行的描述使得本领域技术人员清楚如何可以将本发明的几种形式体现在实践中。
除非在实例中明确地修改，或者当含义的应用使任何构造无意义或基本上无意义时，本公开中使用的定义和解释意在并旨在控制任何未来的构造。如果术语的构造会使其无意义或本质上无意义，则定义应取自韦氏词典(Webster's Dictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的词典，如牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology)(安东尼·史密斯(Anthony Smith)编辑,牛津的牛津大学出版社(Oxford University Press,Oxford),2004)。
序列表
<110> 俄勒冈健康与科学大学(OREGON HEALTH AND SCIENCE UNIVERSITY)
PDX制药公司(PDX Pharmaceuticals, LLC)
<120> 用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体
<130> 51127-005001
<150> US 62/873,770
<151> 2019-07-12
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
223> 合成构建体
<400> 1
gugggcgugg uaccaucugu u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
223> 合成构建体
<400> 2
uauucauucu ucuugauccg g 21
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
223> 合成构建体
<400> 3
uuagucgaca uguaaacca 19

Claims (62)

1.一种治疗构建体，其包括：
递送系统，所述递送系统包括
至少一种有丝分裂激酶抑制剂；以及
至少一种免疫检查点抑制剂。
2.根据权利要求1所述的治疗构建体，其中所述递送系统包括脂质体、基于脂质的颗粒、聚合物颗粒、无机或有机纳米颗粒或微粒或其混合物。
3.根据权利要求2所述的治疗构建体，其中所述递送媒剂包括以下中的一或多种：富勒烯、内嵌金属富勒烯、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯、单壁和多壁碳纳米管、磷酸钙颗粒、铝盐颗粒、支化和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状大分子、微粒、量子点、超顺磁纳米颗粒、纳米棒、纤维素纳米颗粒、硅、二氧化硅和聚合物微球和纳米球、二氧化硅壳、可生物降解的PLGA微球和纳米球、金纳米颗粒、氧化铈颗粒、氧化锌颗粒、银纳米颗粒、碳纳米颗粒、铁纳米颗粒和/或经修饰的胶束。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述递送媒剂包括介孔二氧化硅纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒的平均粒径为约5-200nm。
6.根据权利要求4或5所述的治疗构建体，其中所述介孔二氧化硅纳米颗粒涂覆有交联聚乙烯亚胺和聚乙二醇。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂和/或免疫检查点抑制剂包括寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂是以下各项的抑制剂：polo样激酶(PLK)、极光激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、HASPIN、单极纺锤体1激酶(Mps1)、NimA相关激酶(NEK)。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂包括以下中的一或多种：GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替、Chk1激酶抑制剂LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、阿利色替、普瑞色替或AZD7762。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种有丝分裂激酶抑制剂包括沃拉色替。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂包括针对以下中的一或多种的siRNA、抑制剂或抗体：PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4。
12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD-1或CTLA-4的抗体。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
14.根据权利要求13所述的治疗构建体，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂包括以下中的至少一种：纳武单抗、派姆单抗、MPDL3280A、伊匹单抗、曲美木单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、匹地利珠单抗或斯巴达珠单抗。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的治疗构建体，其进一步包括佐剂。
16.根据权利要求15所述的治疗构建体，其中所述佐剂包括以下中的一或多种：CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物。
17.根据权利要求15或16所述的治疗构建体，其中所述佐剂包括CpG寡核苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、嘎德莫特、polyI:C、polyICLC、dSLIM或EnanDIM。
18.根据权利要求16所述的治疗构建体，其中所述佐剂包括CpG寡核苷酸。
19.根据权利要求1到18中任一权利要求所述的治疗构建体，所述治疗构建体的流体动力学尺寸为5-999nm。
20.根据权利要求1到18中任一权利要求所述的治疗构建体，所述治疗构建体的流体动力学尺寸为1-1000微米。
21.一种治疗构建体，其包括：
免疫检查点抑制剂；
有丝分裂激酶抑制剂；以及
连接所述免疫检查点抑制剂和所述有丝分裂激酶抑制剂的化学连接子。
22.根据权利要求21所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
23.根据权利要求21或22所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或抗体。
24.根据权利要求21到23中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体。
25.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4的抗体。
26.根据权利要求21到25中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1、PD-1或CTLA-4的抗体。
27.根据权利要求21到26中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
28.根据权利要求21到27中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂选自以下：GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、沃拉色替、Chk 1激酶抑制剂LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、阿利色替、普瑞色替或AZD7762。
29.根据权利要求21到28中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述有丝分裂激酶抑制剂是阿利色替。
30.根据权利要求21到29中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括以下中的一或多种：肼；二硫化物；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯；3-(吡啶-2-基二磺酰基)丙酸全氟苯酯；3-甲基-3-(吡啶-2-基二磺酰基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯；
Gly-Phe-Leu-Gly；Ala-Leu-Ala-Leu；Val-Cit；Phe-Lys；Val-Ala；Ala-Phe-Lys；Phe-Lys；(Gly)n，其中n为1-20；β-葡糖苷酸连接子；马来酰亚胺己酰基；N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯；4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸；二溴马来酰亚胺；对氨基苯甲酸；
4-硝基苯酚；乙酸；甲酸；4-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯；N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺；N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺；3-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺酯；N-(3-马来酰亚胺丙酰氧基)琥珀酰亚胺；5-马来酰亚胺戊酸-NHS；分子量为100-10000Da的线性、支化或多臂聚乙二醇；炔丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯；焦磷酸酯；琥珀酰亚胺-4-叠氮基丁酸酯；4-叠氮基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；1-(4-甲酰基苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-酸叔丁酯；或其残基。
31.根据权利要求21到30中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括N-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯连接子或其残基。
32.根据权利要求21到31中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯。
33.根据权利要求21到32中任一权利要求所述的治疗构建体，其中所述化学连接子包括分子量为100-10000Da的线性聚乙二醇或其残基。
34.根据权利要求21到33中任一权利要求所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约1-20。
35.根据权利要求34所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约2-8。
36.根据权利要求34或35所述的治疗构建体，其中有丝分裂激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的比率为约4-6。
37.根据权利要求21到33中任一权利要求所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约1-20。
38.根据权利要求37所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约2-8。
39.根据权利要求37或38所述的治疗构建体，其中免疫检查点抑制剂与有丝分裂激酶抑制剂的比率为约4-6。
40.一种组合物，其包括根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
41.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者是人。
43.一种治疗表现出癌症症状的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物接触。
44.一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物接触。
45.一种治疗从表现出癌症症状的受试者中获得的细胞的方法，所述方法包括使细胞离体与治疗有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物接触。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
47.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述细胞不是癌细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
49.根据权利要求41到48中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将至少一个经治疗的细胞施用返回至受试者。
50.一种治疗被诊断为患有过度增殖性疾病或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求40所述的组合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括癌症、初癌或癌症转移中的一或多种。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括以下中的一或多种：黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、结直肠癌、淋巴瘤、结肠癌或肝癌。
53.根据权利要求50到52中任一权利要求所述的方法，其中所述施用包括以下中的一或多种：
注射到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处注射；
局部输注到所述受试者的肿瘤或在所述受试者的肿瘤处局部输注；
对所述受试者进行全身注射；
对所述受试者进行全身输注；
由所述受试者吸入；
口服施用于所述受试者；或者
局部应用于所述受试者。
54.根据权利要求50到53中任一权利要求所述的方法，其中所述施用包括微针应用。
55.一种增强抗癌疗法在有需要的受试者中的效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下：
有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物；以及
至少一种抗癌剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述治疗构建体或组合物以及所述抗癌疗法依次或同时施用。
58.一种增强、增加或改善在被诊断为患有瘤变的受试者中的放射疗法效果的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下：
有效量的根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体或根据权利要求40所述的组合物；以及
至少一种放射疗法。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述治疗构建体或组合物以及所述放射疗法依次或同时施用。
60.根据权利要求49到59中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者是人。
61.一种试剂盒，其包括：
根据权利要求1到39中任一权利要求所述的治疗构建体；以及
至少一种抗癌剂。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是化学治疗剂、靶向治疗剂或免疫检查点抑制剂。
CN202080049384.XA 2019-07-12 2020-07-13 用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体 Pending CN114096280A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962873770P 2019-07-12 2019-07-12
US62/873,770 2019-07-12
PCT/US2020/041852 WO2021011501A1 (en) 2019-07-12 2020-07-13 Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114096280A true CN114096280A (zh) 2022-02-25

Family

ID=74211001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080049384.XA Pending CN114096280A (zh) 2019-07-12 2020-07-13 用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体

Country Status (9)

Country Link
US (4) US20220257516A1 (zh)
EP (1) EP3996750A4 (zh)
JP (1) JP2022540652A (zh)
KR (1) KR20220035161A (zh)
CN (1) CN114096280A (zh)
AU (1) AU2020313914A1 (zh)
CA (1) CA3139714A1 (zh)
MX (1) MX2022000541A (zh)
WO (1) WO2021011501A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020313914A1 (en) * 2019-07-12 2022-01-20 Oregon Health & Science University Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
CN115702930B (zh) * 2021-08-06 2024-09-24 青岛大学 一种用于乳腺癌、黑色素瘤和/或结直肠癌联合免疫治疗的药物组合物及其应用
CN114958338B (zh) * 2022-05-11 2023-07-14 北京兴德通医药科技股份有限公司 采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017040660A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
WO2017120537A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 The Regents Of The University Of California Mesoporous silica nanoparticles with lipid bilayer coating for cargo delivery
CN107106687A (zh) * 2014-10-03 2017-08-29 诺华股份有限公司 组合治疗
US20180207273A1 (en) * 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US7375096B1 (en) 1998-12-04 2008-05-20 California Institute Of Technology Method of preparing a supramolecular complex containing a therapeutic agent and a multi-dimensional polymer network
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US6740336B2 (en) 2002-10-04 2004-05-25 Mirus Corporation Process for generating multilayered particles
US20080161547A1 (en) 2002-11-14 2008-07-03 Dharmacon, Inc. siRNA targeting serine/threonine protein kinase AKT
KR20200083657A (ko) * 2002-12-09 2020-07-08 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 약리학적 물질의 조성물 및 그 전달방법
EP2899278A1 (en) * 2004-03-12 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. iRNA agents targeting VEGF
US8399025B2 (en) 2004-06-04 2013-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyamine modified particles
US20060293396A1 (en) 2005-01-14 2006-12-28 Eastman Kodak Company Amine polymer-modified nanoparticulate carriers
NZ569741A (en) 2005-12-14 2012-02-24 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
US20080214436A1 (en) 2007-01-26 2008-09-04 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
US9878036B2 (en) 2009-08-12 2018-01-30 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
US20120207795A1 (en) 2010-07-13 2012-08-16 The Regents Of The University Of California Cationic polymer coated mesoporous silica nanoparticles and uses thereof
GB201109966D0 (en) * 2011-06-10 2011-07-27 Cancer Res Inst Royal Materials and methods for treating pten mutated or deficient cancer
AR088140A1 (es) 2011-07-19 2014-05-14 Univ Idaho Sonda y metodo para direccionar acidos nucleicos
CA2820236C (en) 2012-06-15 2022-07-19 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Non-viral nanoparticle-based delivery system
BR112015017490A2 (pt) 2013-01-25 2017-07-11 Nanobiotix uso de nanopartículas inorgânicas
US20160287717A1 (en) 2013-09-18 2016-10-06 Stc.Unm Core and Surface Modification of Mesoporous Silica Nanoparticles to Achieve Cell Specific Targeting In Vivo.
CA2987519A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Yale University Delivery vehicles
WO2015077657A2 (en) 2013-11-22 2015-05-28 City Of Hope Stat3 inhibitors and uses thereof
SI3129406T1 (sl) * 2014-04-11 2019-04-30 Medimmune, Llc Konjugirane spojine, ki vsebujejo cisteinsko konstruirana protitelesa
WO2016013751A1 (ko) 2014-07-22 2016-01-28 주식회사 레모넥스 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도
WO2016054225A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Stc.Unm Plasmid delivery in the treatment of cancer and other disease states
TWI716362B (zh) * 2014-10-14 2021-01-21 瑞士商諾華公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體分子及其用途
WO2016149378A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Pdx Pharmaceuticals, Llc Cross-linked polymer modified nanoparticles
BR112017020491A2 (pt) 2015-03-25 2018-07-17 The Regents Of The University Of Michigan composições e métodos para distribuição de agentes de biomacromolécula.
BR112017018368B1 (pt) 2015-04-22 2022-08-02 Curevac Ag Composição contendo rna para uso no tratamento ou profilaxia de doenças tumorais e/ou cancerosas, e uso de um rna para a preparação da composição
WO2016189532A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted lipid particles for systemic delivery of nucleic acid molecules to leukocytes
WO2017041033A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Brinker C Jeffrey Mesoporous silica nanoparticles and supported lipid bi-layer nanoparticles for biomedical applications
WO2017106129A1 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-lag3 antibodies and antigen-binding fragments
EP3458474B1 (en) 2016-05-18 2022-07-06 ModernaTX, Inc. Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
AU2018252193A1 (en) 2017-04-14 2019-10-17 Tallac Therapeutics, Inc. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
EP3668600B1 (en) 2017-08-10 2024-05-15 Abionyx Pharma SA Cargomers
US20190374479A1 (en) 2018-06-12 2019-12-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Particles for delivery of biomolecules
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
AU2020313914A1 (en) * 2019-07-12 2022-01-20 Oregon Health & Science University Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor
WO2021011496A1 (en) 2019-07-12 2021-01-21 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107106687A (zh) * 2014-10-03 2017-08-29 诺华股份有限公司 组合治疗
US20180207273A1 (en) * 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017040660A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
WO2017120537A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 The Regents Of The University Of California Mesoporous silica nanoparticles with lipid bilayer coating for cargo delivery
US20180098945A1 (en) * 2016-01-08 2018-04-12 The Regents Of The University Of California Mesoporous silica nanoparticles with lipid bilayer coating for cargo delivery

Also Published As

Publication number Publication date
US11679082B2 (en) 2023-06-20
US20230338291A1 (en) 2023-10-26
US20210030679A1 (en) 2021-02-04
CA3139714A1 (en) 2021-01-21
US20220071906A1 (en) 2022-03-10
US12059500B2 (en) 2024-08-13
US11224573B2 (en) 2022-01-18
JP2022540652A (ja) 2022-09-16
EP3996750A4 (en) 2024-01-03
MX2022000541A (es) 2022-04-18
AU2020313914A1 (en) 2022-01-20
US20220257516A1 (en) 2022-08-18
EP3996750A1 (en) 2022-05-18
WO2021011501A1 (en) 2021-01-21
KR20220035161A (ko) 2022-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12059500B2 (en) Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor
US11090367B2 (en) Restoration of tumor suppression using mRNA-based delivery system
US11235058B2 (en) Immunotherapeutic constructs and methods of their use
US20220054633A1 (en) Nanoparticles, controlled-release dosage forms, and methods for delivering an immunotherapeutic agent
WO2021011496A1 (en) Immunotherapeutic constructs and methods of their use
Hallaj et al. Inhibition of CD73 using folate targeted nanoparticles carrying anti-CD73 siRNA potentiates anticancer efficacy of Dinaciclib
WO2014165296A1 (en) Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded rna mediated cell death
Youm et al. siRNA-loaded biodegradable nanocarriers for therapeutic MAPK1 silencing against cisplatin-induced ototoxicity
Jiang et al. Doxorubicin detoxification in healthy organs improves tolerability to high drug doses for enhanced antitumor therapy
WO2023107574A2 (en) Lipid-based compositions and methods thereof
US20240181070A1 (en) Nanovaccines for treatment of viral diseases
Kalaimani et al. Recent advancements in small interfering RNA (siRNA) based therapeutic approach on breast cancer
El Kheir et al. Drug Delivery Systems in the Development of Novel Strategies for Glioblastoma Treatment. Pharmaceutics 2022, 14, 1189
Peres Intracellularly-Targeted Nanoplatform to Target Dendritic Cells and for Immunomodulation
AU2022395048A1 (en) Spherical nucleic acids for cgas-sting and stat3 pathway modulation for the immunotherapeutic treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination