CN103965285B - 一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法。该方法包括：制备二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒和偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒；分别以二者为固相进行多肽合成；向两组固相中加入K试剂。对于前者，K试剂可将合成多肽脱侧链保护但不将多肽切下，得到肽磁纳米探针。对于后者，其可将多肽脱侧链保护并从该固相上切下，得到合成多肽。本方法在外磁场作用下可迅速脱离反应体系，为合成带来很大便利，并且能够简便精确地合成多肽，同时同步构建多肽磁纳米探针，以用于在体外和体内印证合成肽的生物学功能，也可用于大规模多肽库的建立，迅速筛选出功能肽。

Description

一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽 磁纳米探针的方法

技术领域

本发明涉及一种多肽固相合成的方法，特别涉及一种以超顺磁纳米颗粒为固相的多肽合成方法，并在合成多肽的同时同步构建了合成多肽纳米磁探针，可用于其生物功能的检测，本发明属于多肽固相合成技术领域。

背景技术

1、固相多肽合成技术：

固相多肽合成技术是当今生物化学领域的重要技术，该技术的先驱是RobertBruce Merrifield。尽管当今有多种获得多肽的方法（如利用细菌表达等），但仍然有许多多肽序列难以获得（如细菌难以表达的序列）。利用多肽合成技术可以帮助我们在实验室中简便获得该序列的肽。同时在合成的过程中，可在序列中任意加入非天然氨基酸或者小分子化合物，这都是其它方法难以比拟的。多肽合成技术中，可分为液相合成技术和固相合成技术。其中固相多肽合成技术已经发展完善成为该技术的主流。其原理在于利于小珠子作为固相，珠子上修饰官能团可以和氨基酸单体形成共价键，按照设计序列分别按顺序与氨基酸单体反应既可以得到多肽序列。在合成的过程中，多肽稳定地共价结合于固相珠子表面，反应结束后利用特殊化学试剂可将多肽序列从固相珠子上切下。相比于液相合成技术，固相合成法在珠子上进行，更容易进行中间产品的提取和分离，给合成带来了极大的便利。合理设计的固相是该技术的关键，其应当满足以下几点：

1）固相可简便，快捷地与液相分离

2）固相化学性质稳定，可以稳定存在于反应的溶剂中，化学惰性好

3）固相上存在官能团，可以与氨基酸偶联

满足上述条件的固相从材料上又可以分为以下三种：

1）凝胶型固相（指含有官能团的高聚物）其中包括：苯乙烯固相，聚丙烯酰胺固相，聚乙二醇固相等

2）表面型固相：包含多孔玻璃珠，纤维素纤维等

3）复合型固相：指由刚性基质支撑的凝胶型高聚物

2、超顺磁性纳米颗粒：

当铁氧体材料减小至一定尺度时，在一定温度下，铁晶各向异性能垒可与颗粒的热动能抵消，宏观表现为各磁晶磁矩杂乱无章互相抵消，从而不表现出磁性。当在外加磁场的作用下，磁晶磁矩倾向于沿外磁场方向排列，从而表现出磁性。富有这种性质的磁性纳米颗粒被称为超顺磁纳米颗粒。超顺磁纳米颗粒在外磁场的作用下便于操控性，同时可用于核磁共振成像、药物输送等，具有巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法。

为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明的一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒，表面暴露氨基；

（2）二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒，通过HBTU/HOBt/DIEA的偶联策略在其表面偶联rink amide linker（4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸）；

（3）分别以二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒和偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒为固相，利用HBTU/HOBt/DIEA的偶联策略以Fmoc保护的氨基酸为单体，同步逐个接上氨基酸，进行多肽合成；

（4）分别向两组固相中加入K试剂，所述的K试剂由三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巯基乙烷，苯酚以及水配制而成，优选的三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巯基乙烷，苯酚以及水的体积比为82.5：5：2.5：5：5；K试剂针对两种不同的固相起不同的作用：

a对于偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒的固相，用于将合成的多肽脱侧链保护并从该固相上切下；

b对于二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒的固相，用于将合成多肽脱侧链保护但不将多肽切下，得到缀合多肽的磁纳米探针；

（5）将上述步骤（4）a中从偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相上切下的多肽以乙醚沉降，收集产品并用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of FlightMass Spectrometry）验证合成多肽的化学结构；

（6）将上述步骤（4）b中由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相得到的缀合多肽的磁纳米探针溶于PBS（磷酸缓冲液）中，通过体外和体内实验印证合成肽是否具有生物学功能。

所述的体外实验包括体外细胞磁分选，电镜。所述的体内实验包括小动物活体核磁共振成像。

在本发明中，优选的，所述的超顺磁纳米颗粒为下列三种中任意一种：超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒，超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒，超顺磁FePt纳米颗粒。

其中，超顺磁纳米颗粒可按照以下文献所公开的方法进行制备：MonodisperseMFe₂O₄(M)Fe,Co,Mn)Nanoparticles，Shouheng Sun,et.al，J.AM.CHEM.SOC.2004,126,273-279。

在本发明中，优选的，作为固相的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒和偶联rinkamide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒是通过以下步骤制备得到的：

二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相的制备：

1）配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁纳米颗粒的氯仿溶液A；

2）将溶液A置于40°C下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3）向浓缩后的溶液A中加入100ml 15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40°C水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4）将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷（OCTMO），摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS），继续反应48小时；反应结束后，将溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液；收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒；

偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相的制备：

1）配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁纳米颗粒的氯仿溶液A；

2）将溶液A置于40°C下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3）向浓缩后的溶液A中加入100ml15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40°C水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4）将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷（OCTMO），摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS），继续反应48小时；反应结束后，将溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒;

5）将0.38mmol rink amide linker溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，加入69微升N,N-二异丙基乙胺（DIEA）得溶液C，并将得到的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒加入溶液C，置于摇床上室温反应24小时;

6）反应结束后将步骤5）得到的溶液置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒。

在本发明中，优选的，所述的以偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒或者二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒为固相的多肽合成，包括下列步骤：

1）固相的预处理：将偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒或者二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒冻干后，用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤；

2）向步骤1）得到的两种固相中分别加入1ml Fmoc保护的氨基酸单体的活泼酯溶液，所述的活泼酯溶液是将0.38mmol Fmoc保护的氨基酸单体溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，然后加入69微升N,N-二异丙基乙胺（DIEA）活化两分钟得到，反应置于摇床，室温反应3小时；

3）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍；

4）分别向两组固相中加入含有20%（v/v）哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护，反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍；

5）分别向两组固相中按上述方法加入下一个Fmoc保护的氨基酸单体的活泼酯溶液。

进一步的，本发明还提供了按照以上任一项所述的方法制备得到的多肽及多肽磁纳米探针。及

所述的磁纳米探针在体外细胞磁分选、体外电镜观察以及印证合成肽在活体内的生物学功能中的应用。

本方法具有下列优势：

（1）以超顺磁性纳米颗粒为固相，可均匀分散于多肽合成试剂中，并在外磁场的作用下可迅速脱离反应体系，为合成带来很大便利；

（2）以磁性纳米颗粒为基础，构建两种固相，在简便，精确地合成多肽的同时同步构建了缀合该多肽的纳米探针，并可以对其是否具有生物学功能进行迅速判断。该技术可用于大规模用于多肽库的建立，并可迅速筛选出功能肽。

使用超顺磁纳米颗粒为原料。该材料作为固相不但达到了对固相的要求（1、固相可简便，快捷地与液相分离；2、固相化学性质稳定，可以稳定存在于反应的溶剂中，化学惰性好；3、固相上存在官能团，可以与氨基酸偶联。），相比于传统固相更具有以下优势：

1、相比于传统分离固相的离心法，超顺磁纳米颗粒固相在外磁场的作用下可直接分离，方便快捷。

2、通过对超顺磁纳米颗粒表面进行化学修饰可得性质不同的固相，为后续同步合成多肽磁纳米颗粒探针提供了基础。所述的超顺磁纳米颗粒为下列三种中任意一种：超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒，超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒，超顺磁FePt纳米颗粒。

合成多肽的同时同步合成缀合多肽的探针，原因在于加入K试剂对两种固相产生不同效果。对于偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相而言，其rink amide linker在酸性环境下会发生断裂，因此合成的多肽会脱离固相，可用于质谱检测。而对于二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相，合成的多肽与纳米颗粒形成酰胺键，不会在K试剂作用下脱离固相，由此可得多肽偶联的生物探针。可在体外（细胞磁分选，电镜）和体内（小动物活体核磁共振成像）实验印证合成肽的生物学功能。

所述的体外细胞磁分选实验包括以下步骤：

1、将由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的多肽磁探针加入肿瘤细胞悬液中,置于旋转混匀仪中4°C孵育2小时。

2、将孵育后的细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍。

3、将步骤2所得的悬液置于光镜下观察，可通过视野中细胞的数量判断多肽对该细胞的作用的强弱。

所述的体外电镜实验包括以下步骤：

1、将由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的多肽磁探针加入肿瘤细胞悬液中,置于旋转混匀仪中4°C孵育2小时。

2、将孵育后的细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍。

3、将步骤2所得PBS悬液置于离心机中3000rpm离心10分钟，弃去上清，并小心加入戊二醛。

4、将步骤3所得样品固定，脱水，染色，细胞切片后，放置于电镜观察，通过观察磁探针在细胞中的分布进一步判断多肽对该细胞的作用。

所述的体内小动物核磁共振成像进一步印证合成肽在活体的生物学功能，包括以下步骤：

1、准备某种疾病模型的小鼠（如肿瘤等）。

2、通过尾静脉注射由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的多肽磁纳米探针。

3、2小时后将经步骤2处理后的小鼠置于核磁共振仪上，通过T2成像观察病灶部位是否有信号降低来判断合成多肽对活体的生物学效应。

附图说明

图1为以超顺磁纳米颗粒为固相的进行多肽合成及同步构建多肽探针的方法的示意图；

图2为以超顺磁纳米颗粒为固相的多肽合成及磁分离的展示图；

图3为合成五肽（RGDGG）的MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry）；

图4为同步合成的RGDGG-磁纳米探针在体外进行细胞分选，HepG2细胞为αvβ3高表达细胞，可以更高效与RGD多肽结合，因此通过利用RGDGG-磁纳米探针分选的HepG2细胞明显多于αvβ3低表达Hela细胞；

图5为对使用RGDGG-磁纳米探针分选下的HepG2细胞切片并与电镜下观察，可发现通过RGD多肽的作用，磁探针附着于细胞表面，同时可见受体介导内吞；

图6为RGDGG-磁纳米探针对接种HepG2肿瘤的裸鼠进行核磁共振成像，进一步证明RGD多肽对HepG2肿瘤细胞有识别作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1以超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒为固相合成RGDGG五肽及同步构建RGDGG-磁纳米探针

示意图如图1所示。

1、制备二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒（按照文献所公开的方法进行制备：Monodisperse MFe₂O₄(M)Fe,Co,Mn)Nanoparticles，Shouheng Sun,et.al，J.AM.CHEM.SOC.2004,126,273-279。）和偶联rink amide linker（4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸，购买自吉尔生化上海有限公司。）的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒固相：

二氧化硅包壳的超顺磁Fe ₃ O ₄ 纳米颗粒固相的制备：

1）配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒的氯仿溶液A；

2）将溶液A置于40°C下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3）向浓缩后的溶液A中加入100ml15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40°C水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4）将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷（OCTMO），摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS），继续反应48小时。

5）反应结束后，将步骤4）的溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液。收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒。

偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe ₃ O ₄ 纳米颗粒固相的制备：

1）配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒的氯仿溶液A；

2）将溶液A置于40°C下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3）向浓缩后的溶液A中加入100ml15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40°C水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4）将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷（OCTMO），摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS），继续反应48小时。反应结束后，将溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液。收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒。

5）将rink amide linker（0.38mmol）溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA得溶液C。并将得到的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒（5mg）加入溶液C，置于摇床上室温反应24小时。

6）反应结束后麻将步骤5）的溶液置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液。收集沉淀用水洗三遍，得到偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒

2、分别以二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒和偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒为固相，利用HBTU/HOBt/DIEA的偶联策略以Fmoc保护的氨基酸为单体，同步逐个接上氨基酸，进行多肽合成:

1）固相的预处理：将偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒或者二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒冻干后，用DMF洗涤。

2）向上述两种固相（偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒和二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒）分别加入1ml第一个Fmoc保护的氨基酸甘氨酸（Fmoc-Gly）单体的活泼酯溶液（0.38mmolFmoc保护的Fmoc-Gly溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA后活化两分钟）。反应置于摇床，室温反应3小时。

3）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

4）分别向两组固相中加入20%哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护。反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

5）弃去上述两种固相的DMF，并分别加入1ml第二个Fmoc保护的氨基酸甘氨酸（Fmoc-Gly）单体的活泼酯溶液（0.38mmolFmoc保护的Fmoc-Gly溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA后活化两分钟）。反应置于摇床，室温反应3小时。

6）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

7）分别向两组固相中加入20%哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护。反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

8）弃去上述两种固相的DMF，并分别加入1ml第三个Fmoc保护的氨基酸天冬氨酸（Fmoc-Asp）单体的活泼酯溶液（0.38mmolFmoc保护的Fmoc-Asp溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA后活化两分钟）。反应置于摇床，室温反应3小时。

9）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

10)分别向两组固相中加入20%哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护。反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

11)弃去上述两种固相的DMF，并分别加入1ml第四个Fmoc保护的氨基酸甘氨酸（Fmoc-Gly）单体的活泼酯溶液（0.38mmolFmoc保护的Fmoc-Gly溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA后活化两分钟）。反应置于摇床，室温反应3小时。

12）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

13）分别向两组固相中加入20%哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护。反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

14）弃去上述两种固相的DMF，并分别加入1ml第五个Fmoc保护的氨基酸精氨酸（Fmoc-Arg）单体的活泼酯溶液（0.38mmolFmoc保护的Fmoc-Arg溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，加入69微升DIEA后活化两分钟）。反应置于摇床，室温反应3小时。

15）反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

16）分别向两组固相中加入20%哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护。反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍。

3、分别向两组固相中加入K试剂（三氟醋酸/苯甲硫醚/1,2-二巯基乙烷/苯酚/水：82.5/5/2.5/5/5）反应20分钟。K试剂针对两种不同的固相起不同的作用：

a对于偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒的固相，可将合成的多肽脱侧链保护并从该固相上切下；

b对于二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒的固相，可将合成多肽脱侧链保护但不将多肽切下，得到缀合多肽的磁纳米探针。

4、将上述步骤3a中从偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒固相上切下的多肽以乙醚沉降，收集产品并用MALDI-TOF-MS验证合成多肽的化学结构。

以超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒为固相的多肽合成及磁分离的展示图如图2所示；合成五肽（RGDGG）的MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）检测结果如图3所示。

实施例2以超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒为固相合成RGDGG五肽及同步构建RGDGG-磁纳米探针

按照实施例1的方法制备二氧化硅包壳的超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒和偶联rink amidelinker（4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸，购买自吉尔生化上海有限公司。）的二氧化硅包壳的超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒。分别以二者为固相合成RGDGG五肽及同步构建RGDGG-磁纳米探针，方法同实施例1。

实施例3体外细胞分选实验

将实施例1步骤3b中由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相得到的缀合多肽的磁纳米探针溶于PBS中，通过体外细胞分选实验印证合成肽对细胞的作用。

方法：

1)将由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的多肽磁探针（0.15mg）分别加入1ml Hela细胞和HepG2细胞悬液中（细胞浓度为200000个/ml）,置于旋转混匀仪中4°C孵育2小时；

2)将孵育后的两组细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍；

3)将经步骤2）处理后所得的悬液置于光镜下观察，可通过视野中细胞的数量判断多肽对该细胞的作用的强弱。

结果：图4为同步合成的RGDGG-磁纳米探针在体外进行细胞分选，HepG2细胞为αvβ3高表达细胞，可以更高效与RGD多肽结合，因此通过利用RGDGG-磁纳米探针分选的HepG2细胞明显多于αvβ3低表达Hela细胞。

实施例4体外电镜实验

包括以下步骤：

1）将实施例1制备得到的由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的多肽磁探针（0.15mg）加入1ml HepG2细胞悬液中（细胞浓度为200000个/ml），置于旋转混匀仪中4°C孵育2小时；

2）将孵育后的细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍；

3）将步骤2）所得PBS悬液置于离心机中3000rpm离心10分钟，弃去上清，并小心加入戊二醛；

4）将步骤3）所得样品固定，脱水，染色，细胞切片后，放置于电镜观察，通过观察磁探针在细胞中的分布进一步判断多肽对该细胞的作用。

结果：图5为对使用RGDGG-磁纳米探针分选下的HepG2细胞切片并与电镜下观察，可发现通过RGD多肽的作用，磁探针附着于细胞表面，同时可见受体介导内吞。

实施例5五肽RGDGG在活体内的生物学功能验证

采用体内小动物核磁共振成像进一步印证实施例1合成的五肽RGDGG在活体内的生物学功能：

方法：

1）选择BABL/c裸鼠，于25°C恒温饲养两周，并与肩部种HepG2肿瘤；

2）通过尾静脉注射0.3mg的由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相所得的RGDGG-磁纳米探针。实验以注射二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒（不参与多肽合成）作为对照；

3）2小时后将经步骤2）处理的两只小鼠置于核磁共振仪上，通过T2成像观察病灶部位是否有信号降低。

结果：图6为RGDGG-磁纳米探针对接种HepG2肿瘤的裸鼠进行核磁共振成像，进一步证明RGD多肽对HepG2肿瘤细胞有识别作用。

Claims (10)

1.一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒，表面暴露氨基；

(2)二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒，通过HBTU/HOBt/DIEA的偶联策略在其表面偶联rink amide linker；

(3)分别以二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒和偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒为固相，利用HBTU/HOBt/DIEA的偶联策略以Fmoc保护的氨基酸为单体，同步逐个接上氨基酸，进行多肽合成；

(4)分别向两组固相中加入K试剂，所述的K试剂由三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巯基乙烷，苯酚以及水配制而成；K试剂针对两种不同的固相起不同的作用：

a对于偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒的固相，用于将合成的多肽脱侧链保护并从该固相上切下；

b对于二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒的固相，用于将合成多肽脱侧链保护但不将多肽切下，得到缀合多肽的磁纳米探针；

(5)将上述步骤(4)a中从偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相上切下的多肽以乙醚沉降，收集产品并用MALDI-TOF-MS验证合成多肽的化学结构；

(6)将上述步骤(4)b中由二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相得到的缀合多肽的磁纳米探针溶于PBS中，通过体外和体内实验印证合成肽是否具有生物学功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巯基乙烷，苯酚以及水的体积比为82.5：5：2.5：5：5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的超顺磁纳米颗粒为下列三种中任意一种：超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒，超顺磁Fe₂O₃纳米颗粒，超顺磁FePt纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于作为固相的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒和偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒是通过以下步骤制备得到的：

二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相的制备：

1)配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁纳米颗粒的氯仿溶液A；

2)将溶液A置于40℃下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3)向浓缩后的溶液A中加入100ml 15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40℃水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4)将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷(OCTMO)，摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，继续反应48小时；反应结束后，将溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液；收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒；

偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒固相的制备：

1)配置100ml浓度为0.05mg/ml的超顺磁纳米颗粒的氯仿溶液A；

2)将溶液A置于40℃下，以150rpm的转速减压蒸馏将溶液浓缩至10微升；

3)向浓缩后的溶液A中加入100ml 15mM的十二烷基磺酸钠水溶液，在40℃水浴中以60W的超声功率超声10min得溶液B；

4)将溶液B置于摇床，加入50微升正辛基三甲氧基硅烷(OCTMO)，摇匀30分钟后；继续滴加50微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，继续反应48小时；反应结束后，将溶液放置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒；

5)将0.38mmol rink amide linker溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入69微升N,N-二异丙基乙胺(DIEA)得溶液C，并将得到的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒加入溶液C，置于摇床上室温反应24小时；

6)反应结束后将步骤5)得到的溶液置于磁铁上，放置10小时后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的以偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒或者二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒为固相的多肽合成，包括下列步骤：

1)固相的预处理：将偶联rink amide linker的二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒或者二氧化硅包壳的超顺磁纳米颗粒冻干后，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤；

2)向步骤1)得到的两种固相中分别加入1ml Fmoc保护的氨基酸单体的活泼酯溶液，所述的活泼酯溶液是将0.38mmol Fmoc保护的氨基酸单体溶于1ml的0.4mmol/L的HBTU/HOBt的DMF溶液中，然后加入69微升N,N-二异丙基乙胺(DIEA)活化两分钟得到，反应置于摇床，室温反应3小时；

3)反应结束后，分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍；

4)分别向两组固相中加入含有20％(v/v)哌啶的DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸Fmoc保护，反应结束后分别将两组反应置于磁铁上，收集磁颗粒并弃去溶液，分别用DMF洗三遍；

5)分别向两组固相中按上述方法加入下一个Fmoc保护的氨基酸单体的活泼酯溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的多肽磁纳米探针。

7.权利要求6所述的多肽磁纳米探针在制备体外细胞磁分选、体外电镜观察以及印证合成肽在活体内的生物学功能的试剂中的应用。

8.一种利用权利要求6所述的多肽磁纳米探针进行体外细胞磁分选的方法，所述方法不属于疾病的诊断和治疗方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将权利要求6所述的多肽磁纳米探针加入肿瘤细胞悬液中，置于旋转混匀仪中4℃孵育2小时；

2)将孵育后的细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍；

3)将步骤2)所得的悬液置于光镜下观察，通过视野中细胞的数量判断多肽对该细胞的作用的强弱。

9.一种利用权利要求6所述的多肽磁纳米探针进行体外电镜观察的方法，所述方法不属于疾病的诊断和治疗方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将权利要求6所述的多肽磁纳米探针加入肿瘤细胞悬液中，置于旋转混匀仪中4℃孵育2小时；

2)将孵育后的细胞置于磁铁上，放置5分钟后，弃去溶液，并用PBS洗三遍；

3)将步骤2)所得PBS悬液置于离心机中3000rpm离心10分钟，弃去上清，并小心加入戊二醛；

4)将步骤3)所得样品固定，脱水，染色，细胞切片后，放置于电镜观察，通过观察磁探针在细胞中的分布进一步判断多肽对该细胞的作用。

10.一种利用权利要求6所述的多肽磁纳米探针通过核磁共振成像进一步印证合成肽在活体内的生物学功能的方法，所述方法不属于疾病的诊断和治疗方法，其特征在于包括以下步骤：

1)准备某种疾病模型的小鼠；

2)通过尾静脉注射权利要求6所述的多肽磁纳米探针；

3)2小时后将经步骤2)处理后的小鼠置于核磁共振仪上，通过T2成像观察病灶部位是否有信号降低来判断合成多肽对活体的生物学效应。