CN103911293B - 一株高产紫杉醇的内生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明从南方红豆杉的幼茎中分离得到一株可产生紫杉醇的内生真菌菌株，其分类命名为葡萄座腔菌J11（Botryosphaeria？dothidea？J11），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC？NO:M2013591。本发明还涉及了一种应用所述的保藏菌株生产紫杉醇的方法，其包括在培养基中培养所述的保藏菌株以使在所述菌株菌丝内产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内中回收并提纯紫杉醇。本发明为利用微生物发酵生产紫杉醇提供了新的菌种，通过该菌株发酵生产紫杉醇的周期短，成本低，其摇瓶发酵的紫杉醇的产量经HPLC分析检测，达到617.6μg/L，有应用于工业化生产的潜能。

Description

一株高产紫杉醇的内生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法

技术领域

本发明涉及一种产紫杉醇的真菌，尤其涉及一种能产紫杉醇的葡萄座腔菌，以及应用该菌株发酵生产紫杉醇的方法，属于生物工程和生物制药技术领域。

背景技术

紫杉醇（Paclitaxel，商品名为Taxol）是全球范围内销量最大的来源于植物的抗癌药。紫杉醇为一种结构复杂的二萜类化合物，是红豆杉属植物的天然产物。1963年美国科学家Wall和Wani等从太平洋短叶红豆杉(TaxusbrevifoliaNutt.)的树皮分离得到紫杉醇，1971年Wall和Wani等鉴定出这种天然活性产物的结构。研究已证实紫杉醇通过抑制细胞有丝分裂的纺锤体解聚而抑制肿瘤细胞的增殖。由于紫杉醇抑癌机理明确，且在极低浓度下即可肿瘤细胞的生长和增殖，美国FDA于1992年底批准紫杉醇用于临床治疗对常规化疗无效的卵巢癌和乳腺癌。随后，紫杉醇又被扩大到治疗其它转移性乳腺癌、晚期卵巢癌和非小细胞肺癌等。

全球对紫杉醇的需求量非常大，已出现紫杉醇供应危机。紫杉醇的有机合成手性基团较多，合成路线复杂，成本高,产率低，至今无法应用于工业生产。近年来，国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养的红豆杉细胞系己超过10个，其中大部分己证实能产生紫杉醇，但是离体培养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破，例如,培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定等等。目前，紫杉醇的主要来源为红豆杉属植物的树皮，但是红豆杉属植物的树皮中的紫杉醇含量特别低（0.003%～0.05%）。随着紫杉醇应用范围的扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也给红豆杉资源带来严重威胁，可能造成生态环境的严重破坏。正因为如此，我国已将红豆杉列为明令禁止砍伐的国家一级保护植物。虽然各生物技术公司大规模种植红豆杉，从全株及枝叶中提取紫杉醇，即使如此仍然不能满足紫杉醇的供给。

1993年美国学者Stierle和Strobel从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产紫杉醇的内生真菌—安德鲁紫杉菌（Taxomycesandreanae）。因此，通过大规模培养产紫杉醇内生真菌，为工业化生产紫杉醇开辟了一条新的途径。除安德鲁紫杉菌外，拟盘多毛孢属（Pestalotiopsissp.）中产紫杉醇的内生真菌种类较多。最初，筛选出的小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）的紫杉醇含量仅为几十ng/L，通过大量筛选，在拟盘多毛孢属中筛选的内生真菌的紫杉醇含量达到120～140μg/L，筛选出的异色拟盘多毛孢（P.versicolor）的紫杉醇含量达到478μg/L。此外，在镰刀菌属(Fusarium)、肉座菌属(Hypocreasp.)、根霉属(Rhizopussp.)、绿僵菌属(Metarhiziumsp.)等属中也相继发现了产紫杉醇内生真菌，且其紫杉醇的含量逐渐提高。

但目前仍然不能通过产紫杉醇内生真菌进行紫杉醇的工业化生产，以满足全球对紫杉醇的需求。主要原因在于：1）产紫杉醇内生真菌的紫杉醇产量低；2）目前发现的产紫杉醇内生真菌的种类仍然偏少。

发明内容

针对现有技术中存在的仍需从红豆杉中筛选种属分布范围更广，紫杉醇产量更高的产紫杉醇内生真菌的问题，本发明对红豆杉进行了大量的筛选和研究工作，以获得新的高产紫杉醇的内生真菌。

因此，本发明的一个目的在于提供一株产紫杉醇高产内生真菌菌株以及利用该菌株生产紫杉醇的方法，为工业化大规模发酵法生产紫杉醇提供新途径。

本发明提供的紫杉醇产生菌菌株J11已于2013年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)，该菌种保藏号为CCTCCNO:M2013591,分类命名为葡萄座腔菌J11（BotryosphaeriadothideaJ11）。

本发明还包括所公开的葡萄座腔菌菌株的突变体，这些突变体本质上具有相同的或改进的产紫杉醇性能。突变体的制造程序为微生物领域公知技术。例如，广泛应用紫外线和亚硝基胍达到突变目的。

本发明进一步涉及所列举的微生物的变体。这些变体可以通过，例如多核普酸序列，与来自所列举的分离的微生物的序列有高度同源性来识别，除此之外，这些变体与分离的微生物一样具有期望的产紫杉醇的生物活性。

在具体实施方式中，本发明还包括了所公开的产紫杉醇活性的保藏菌株的变体，其中所述的变体的多核苷酸序列至少95％，96%，97%，98%或至少99%或100%与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2一致。

在具体实施方式中，本发明还包括了所公开的产紫杉醇活性的保藏菌株的变体，其中所述的变体的多核苷酸序列至少95％，96%，97%，98%或至少99%或100%与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中的均一致。

在本发明中，“95%相似性”是指碱基中可以存在最多5%的单一碱基取代，"96%相似性”是指碱基中可以存在最多4%的单一碱基取代，依次类推，“99%相似性”是指碱基中可以存在最多1%的单一碱基取代。

在具体实施方式中，本发明所述保藏菌株摇瓶发酵紫杉醇的产量经HPLC分析检测，达到617.6μg/L。

本发明进一步包括组合物以及组合物在产紫杉醇中的应用，所述的组合物包含产紫杉醇有效量的所公开的保藏葡萄座腔菌菌株。

另一方面，本发明还提供了一种所公开的葡萄座腔菌J11菌株生产紫杉醇的方法，所述方法包括：在培养基中培养葡萄座腔菌J11菌株以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。

本发明提供的葡萄座腔菌菌株J11与已知的产紫杉醇内共生真菌相比，发酵周期短，产量高。已知的产紫杉醇内共生真菌发酵周期长，一般是2～3周，紫杉醇产量低，发酵工艺难于掌握。这就意味着，用本发明的菌株有可能实现紫杉醇的大规模发酵生产。

与其它紫杉醇生产方法相比，例如从红豆杉树木原料中直接提取的方法，化学法全合成或植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇的方法，本发明提供的微生物可以通过发酵培养直接生产紫杉醇，其生产成本低，不会对生态资源造成破坏，发酵工艺易于掌握，后续的分离纯化步骤简单，产率高，因此在这几点上都有鲜明的可比性。

附图说明

图1左：为本发明J11菌株在PDA固体培养基上生长2天的菌落特征；图1右：为本发明J11菌株在PDA固体培养基上生长2周的菌落特征。

图2为本发明J11菌株的ITS序列扩增电泳图谱，M表示标准DNA分子量的电泳图谱。1,2,3,4,5表示5个PCR扩增反应所扩增的5个ITS序列。

图3为本发明J11菌株的LSU序列扩增电泳图谱，M表示标准DNA分子量的电泳图谱。1,2,3,4,5表示5个PCR扩增反应所扩增的5个LSU序列。

图4为利用超高分辨质谱仪maXisimpact对紫杉醇标样进行的超高分辨质谱分析。图上：超高分辨质谱仪对紫杉醇标样的高分辨质谱图，图下：质谱数据库中紫杉醇标样的标准质谱。

图5为利用超高分辨质谱仪maXisimpact对本发明菌株的提取物进行的超高分辨质谱分析。图上：超高分辨质谱仪对本发明J11菌株的发酵提取物的高分辨质谱图，图下：质谱数据库中紫杉醇标样的标准质谱。

图6为紫杉醇标准样品的高效液相色谱分析所获得的回归曲线和回归方程。

图7为紫杉醇标准样品的高效液相色谱图。

图8为J11菌株紫杉醇粗提物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：产紫杉醇内生真菌的分离

本实施方式产紫杉醇的内生真菌J11菌株从南方红豆杉（Taxuschinensisvar.mairei）茎中分离得到。本实施方式产紫杉醇的J11菌株按以下步骤分离获得:1)将南方红豆杉茎先用无菌水冲洗(去掉树皮表面的尘土等杂质)，再用75%的乙醇浸泡3～l0min，然后用无菌水冲洗(冲洗去乙醇)，再用无菌剪刀剪成面积为0.5cm×0.5cm的小块;2)将南方红豆杉茎小块分别栽种于PDA培养基平板（每个平板4～5块样品），放于25～28℃培养箱中静置培养至小块周围明显长出菌落;3)挑取长势较好的菌落接种于PDA固体培养基，在28℃恒温条件下培养，纯化，保存。

上述PDA(potatodextroseagar)培养基按下述配比和条件制备：马铃薯180～220g，蔗糖20g，琼脂20g（固体培养基时使用），马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加蔗糖和琼脂，溶化后补足水至1L，自然pH值，121℃，灭菌15分钟后使用。

本发明的分离的J11菌株具有以下菌落特征：在25～28℃温度下，在PDA平板上生长，2至3天时菌落呈半透明白色菌丝，直径约5cm；3天后菌落从接种点开始出现青褐色，并向菌落四周呈放射状快速生长；一周后，菌落长满9cm培养皿，且菌丝逐渐转变为褐色，菌落继续生长；两周后，菌落表面出现向上直立生长的菌丝，呈浅褐色，略带灰色，此时，菌落颜色进一步加深，从背面观察，菌落呈黑色，用接种环刮取菌丝时，发现有相当一部分菌丝嵌入培养基中生长，难于刮取下来。该菌株生长的最佳温度为25～28℃，在37℃不能生长。J11菌株的菌落特征非常符合葡萄座腔菌属的葡萄座腔菌特征，葡萄座腔菌也叫葡萄溃溃疡病病菌，广泛分布于各种林木中，此次在南方红豆杉中发现产紫杉醇内生葡萄座腔菌还是首次。

实施例2：微生物菌株J11的种属鉴定

对于产紫杉醇内生真菌菌种的鉴定，由于真菌类微生物的鉴定需要根据有性孢子作为判断的主要依据，在实践操作中难度大，特别是对于难于产生有性孢子的内生真菌，形态鉴定似乎难以为继。随着现代分子生物学及其实验方法的不断发展和完善，国际上也采用DNA条形码作为鉴定真菌的主要手段和方法。核糖体ITS（internaltranscribedspacer）序列以及核糖体LSU（largesubunitrRNAgene）序列作为分子标签（条形码）是科学家经过长期大量的实验而总结得到的。这两种分子标签与其它分子标签相比，更具可靠性，对于真菌及内生真菌的分子鉴定具有普遍意义。因此，本发明采用核糖体ITS序列和核糖体LSU序列作为鉴定本发明菌株的主要方法。

（1）以ITS作为分子标签对J11菌株的分子分类鉴定

通过CTAB-SDS法提取产紫杉醇内生真菌J11菌株的基因组DNA，以其作为模板，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，以核糖体ITS(ITS5-ITS4)，即以ITS-F:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS-R：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′作为引物，通过Bio-Rad公司的PTC-200PeltierThermalCycler扩增J11菌株的ITS序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，该ITS序列扩增成功，结果如图1所示。

该扩增的DNA片段由华大基因有限公司通过双脱氧链终止法测序，经DNAStar软件拼接和校正后，得到一个544bp的ITS片段，该片段的DNA序列为SEQIDNO:1。

通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）工具，将J11菌株中的544bpITS序列进行核苷酸Blast比对，发现J11菌株中544bp的ITS序列与BotryosphaeriadothideaKER-U-BDQ1（GeneBankAccessionNo.KF466871.1）菌株，BotryosphaeriadothideaKER-U-BDAPLA（GeneBankAccessionNo.KF466486.1）菌株和BotryosphaeriadothideaHuB10s1（GeneBankAccessionNo.JX275786.1）菌株等在18S核糖体RNA基因部分序列、内部转录间隔序列1、5.8S核糖体RNA基因序列、内部转录间隔序列2，28S核糖体RNA基因部分序列具有100%的一致性。因此，可以确定J11菌株为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）的一个新菌株。

（2）以LSU作为分子标签对J11菌株的分子分类鉴定

同样，通过CTAB-SDS法提取J11菌株的基因组DNA，以其作为模板，通过PCR，以核糖体的LSU(LROR-LR5)，即LSU-F：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′和LSU-R：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′作为引物，通过Bio-Rad公司的PTC-200PeltierThermalCycler扩增J11菌株的核糖体LSU序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，该LSU序列扩增成功，结果如图2所示。

该扩增的DNA片段由华大基因有限公司通过双脱氧链终止法测序，经DNAStar软件拼接和校正后，得到一个870bp的LSU片段，该片段的DNA序列为SEQIDNO:2。

同样地，通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库的BLAST工具，将J11菌株中的870bp的LSU序列进行核苷酸Blast比对，发现J11菌株与BotryosphaeriadothideaCBS331.33（GeneBankAccessionNo.DQ377849.1），BotryosphaeriadothideaCBS115476（GeneBankAccessionNo.NG027577.1）和BotryosphaeriadothideaCBS990.70（GeneBankAccessionNo.JX275786.1）菌株在28S核糖体大亚基RNA基因部分序列具有100%的一致性。因此，通过LSU序列的比对，进一步证明J11菌株为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）的一个新菌株。

葡萄座腔菌也叫葡萄溃疡病病菌，其种类繁多，是广泛分布于林木类中的一种致病真菌，寄主类型多样，病理特征差异较大。由于在实验室和自然界难于获得其有性孢子，且其无性型孢子形态特征存在极大的分化与不确定性，因此，无性系名称较多，且无性型与有性型缺乏严格的一对一的对应关系,因而葡萄座腔菌属（BotryosphaeriaCes&DeNot）系统分类一直存在较大的争议。本发明是首次在南方红豆杉中分离得到产紫杉醇的葡萄座腔菌。因此，南方红豆杉中很可能存在并有待发现其它产紫杉醇的其葡萄座腔菌菌株，以及与葡萄座腔菌亲缘相近的菌株。

实施例3：鉴定J11菌种是否产紫杉醇

薄层层析（thinlayerchromatography,TCL）通过Rf值，高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPCL）通过保留时间（retentiontime）作为鉴定产紫杉醇内生真菌的方法，但由于误差范围较大，目前已渐渐被淘汰，仅作为产紫杉醇内生真菌判断的初步依据，不能作为最终的鉴定方法。而核磁共振（nuclearmagneticresonancespectroscopy，NMR）方法虽然鉴定结果可靠，可鉴定紫杉醇的化学结果，但涉及到从发酵液中分离和纯化高纯度的紫杉醇，如通过制备液相色谱纯化高纯度的紫杉醇，操作程序复杂，且对实验条件要求较高。高分辨质谱（highresolutionmassspectroscopy）比普通质谱具有更高的灵敏度，不需对样品中的目标产物分离和纯化，即可检出样品中的飞克级别含量的化合物。因此，超高分辨质谱在一定程度上可取代核磁共振技术，作为检出和鉴定复杂样品中某一未知样品，如紫杉醇的有效方法。因此，本发明利用高分辨质谱及其数据库鉴定J11是否产紫杉醇。该方法大大简化了操作程序，操作过程简单，且鉴定结果可靠。

为证明J11菌株能够产生紫杉醇，利用产自于德国的超高分辨质谱仪maXisimpact（BrukerDaltonicsInc.），以中国食品药品检定研究院纯度为99.6%的紫杉醇作为标准对照样品，对J11的提取物进行超高分辨质谱分析，结果如图3所示。结果表明，来源于南方红豆杉茎部的葡萄座腔菌J11菌株的提取物和天然红豆杉植物中分离纯化得到的紫杉醇标准品的图谱完全一致，即二者具有一样立体化学结构，因此能够证明菌株J11具产生紫杉醇的能力，是一株产紫杉醇内生真菌。

实施例4：微生物J11生产紫杉醇的方法

1）发酵培养：从活化的J11菌株中挑取一环接种于装有250mlPDA培养基（培养基的制备按实施例1中所涉及的方法进行配制）的培养瓶中，置于恒温培养摇床上，在28℃，150rpm/min条件下振荡培养5～7天，直到菌丝体长满培养瓶。2）菌丝体收集：收集在250mLPDL培养基上培养的J11菌株的菌丝体，4500r/mim离心15min，弃上清液，收集菌丝体。将菌丝体冷冻干燥后，置于研钵中液氮研磨30min，使细胞充分破碎。3）紫杉醇提取：将研磨好的菌丝体加蒸馏水至100mL，倒入分液漏斗中，再加入等量的乙酸乙酯，震荡摇匀，静置3h，待分层明显且上层萃取液清亮时，把下层的菌液放出，倒出上层萃取液（上层萃取液溶有紫杉醇），下层菌液继续用等体积乙酸乙酯反复萃取二次，合并三次所得的萃取液。4）获取粗提产物：将所有萃取液转移至旋转蒸发仪中，于80℃浓缩后，加2mL色谱甲醇溶解，即可获得粗提产物。5）纯化：粗提产物用色谱纯化的方法纯化，得产物紫杉醇。

实施例5：测定J11菌株生产紫杉醇的产量

紫杉醇含量的检测以紫杉醇标准样品通过高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）进行。在相同的保留时间（retentiontime）内，作一个紫杉醇浓度和峰面积标准曲线，并进行回归分析，求出回归方程。然后，根据内生真菌J11样品的峰面积计算紫杉醇的含量。

标准样品的配制：精确称取紫杉醇标准品10mg，溶于色谱纯的甲醇中，定容到10mL，配制成1mg/mL母液备用，将母液稀释到10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL的系列标准样品溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。

高效液相色谱条件：采用岛津液相色谱仪分析，检测器SPD-20A，恒温箱CTO-20A，双元泵LC-20AT，自动进样器SIL-20A。检测波长为227nm，色谱柱为ZORBAXEclipsePlusC18,4.6×250mm，5μm，为反相C18柱，流动相速度为1.5mL/min；流动相为甲醇(色谱纯)∶水(双蒸水)=65∶35；柱温为45℃，进样量为20μL。

在相同保留时间下，检测得到峰面积与浓度的关系，得到回归曲线与回归方程，结果如图4所示。从图中看出，回归系数R为0.999，说明实验条件理想，拟合程度很高。

紫杉醇标准样品的进样量为20μL，样品浓度为100μg/mL时，获得如图5所示的高效液相色谱图。

将实施例4制备的紫杉醇粗体产物用色谱甲醇稀释至1mL,进样量为80μL，获得如图6所示的高效液相色谱图。

通过HPLC的对比分析，J11菌株与紫杉醇标样在相同的保留时间内均有一紫外吸收峰，根据标样的回归方程计算J11菌株的峰面积及进样量，换算得到提取物进样浓度为7.72μg/mL，由于进样量稀释了10倍，因此，J11菌株2mL提取物中的紫杉醇含量为154.4μg，即250mL培养基中紫杉醇的产量为154.4μg，那么1L培养物中紫杉醇的浓度为617.6μg/L。

与现有产紫杉醇内生真菌相比，葡萄座腔菌菌株J11是一株紫杉醇高产菌株，可能在大规模发酵法生产紫杉醇方面具有应用前景。在自然发酵条件下，J11菌株的紫杉醇产量即可达到617.6μg/L，是目前报道的未经优化发酵条件下，紫杉醇产量最高的野生株。如果通过优化发酵条件，J11菌株的紫杉醇产量可能更高。另一方面，如果能够利用该菌株，通过诱变育种获得紫杉醇高产菌株，使其产量达1mg/L以上，甚至更高，那么通过大规模发酵法培养产紫杉醇内生真菌实现产业化生产紫杉醇将会为期不远。

Claims (7)

1.一株产紫杉醇的内生真菌菌株，其分类命名为葡萄座腔菌J11(BotryosphaeriadothideaJ11)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO:M2013591。

2.如权利要求1所述的产紫杉醇的内生真菌菌株，其特征在于：所述菌株摇瓶发酵紫杉醇的产量经HPLC分析检测，达到617.6μg/L。

3.一种利用如权利要求1所述的产紫杉醇的内生真菌菌株生产紫杉醇的方法，其特征在于：在培养基中培养权利要求1所述产紫杉醇的内生真菌菌株以使在所述菌株细胞内产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内回收并提纯紫杉醇。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述培养基为自然pH的PDA培养基，其组成为g/L：马铃薯180～220g，蔗糖20g，固体补加20g琼脂粉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的培养是在需氧条件下进行，温度为25～28℃，发酵初始pH值为自然的PDA培养基的pH值。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述回收并提纯紫杉醇的步骤包括：

(1)从发酵液分离出发酵菌丝体；

(2)将菌体冷冻干燥，液氮研磨，加入蒸馏水，倒入分液漏斗中，再加入等体积的乙酸乙酯；

(3)震荡摇匀，静置，待分层明显且上层萃取液清亮时，把下层的液体放出，倒出上层萃取液；

(4)下层液体继续用等体积乙酸乙酯反复萃取多次，合并所有的萃取液；

(5)使用旋转蒸发器浓缩所有的萃取液，将浓缩物溶解在适量甲醇中，即获得粗提产物；

(6)将第(5)步所得粗提产物用色谱纯化的方法纯化，即得产物紫杉醇。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于:第(6)步所述色谱纯化方法中，使用一个或一个以上的色谱柱，填料为C18，流动相为甲醇/H₂O。