CN102234669B - 4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化及分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：(1)、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化；(2)、将步骤(1)产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化；随后添加川芎嗪继续生物转化，收集转化产物，即得。本发明还公开了从上述产物中分离纯化4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素及其含量检测的方法。本发明通过生物转化方法对鬼臼毒素分子结构进行修饰，具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种鬼臼类化合物的制备方法，尤其涉及4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法，本发明还涉及该4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的分离纯化方法以及含量检测方法，属于鬼臼类化合物的生物转化领域。
背景技术
4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素是一种鬼臼类化合物(又名4-(2，3，5，6-tetramethylpyrazine-1)-4’-demethylepipodophyllotoxine)，其结构式为图(I)所示。
(I)
对鬼臼毒素的C环4位，以β碳氮键芳环取代作为修饰方向所得到的衍生物普遍具有良好的抗肿瘤活性和生物利用度，这已被众多文献或专利报道(Bioorgan MedChem 2005；13(22)：6218-6225，Anticancer Res，2006，26(3A)：2149-2156，US-07/987,765)。尽管4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素是否具有体内抗肿瘤作用目前还不能确定，但申请人其对体外肿瘤细胞毒性的前期研究表明，4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素对KB等肿瘤细胞生长具有良好的抑制作用，因此作为一种抗肿瘤化合物，具有药物开发的潜在价值。
目前针对鬼臼类衍生物的结构修饰研究，以化学合成方法为主。然而，随着人类需求的日益增长，化学合成法已显出较大弊端：一是规模小、产量低；二是化学残留难以除去，三是生产成本高。上述这些因素必将导致4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的价格高昂，因此寻找一种适合大规模工业化生产4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，成为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素研发的重中之重。
基于生物转化技术具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点，越来越多的学者倡导以生物转化技术为代表的绿色制药过程(Curr Opin ChemBiol 2009；13：43-50)。研究证明利用生物转化对鬼臼毒素进行分子结构修饰具有可行性，如：果德安教授(J Aslan Nat Prod Res 1998；1(2)：99-120)利用掌叶大黄细胞和青霉菌转化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D环的反式结构转化为顺式结构，得到鬼臼苦素；英国诺丁汉大学Broomhead等(Phytochemistry 1991；30(5)：1511-1517)发现美国金钟连翘悬浮培养细胞具有将鬼臼毒素氧化为鬼臼毒酮的能力，同时产生少量的鬼臼苦酮。澳大利亚墨尔本大学Teng等(Biocataly Biotransfor 2007；25(7)：1-8)以大麦悬浮培养细胞转化鬼臼毒素得到异鬼臼苦酮。
综上所述，开发研究出一种廉价易行的生产4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明首先所要解决的第一个技术问题是提供一种将鬼臼毒素转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法，该方法切实可行、操作简单、质量可控、成本低、易规模化工业生产，能够根据需要很好地解决4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素生产用于不同规模、不同研究领域等一系列问题。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：
(1)、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(2)、将步骤(1)所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4′-去甲基表鬼臼毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。
所述的腐殖性土壤菌可以是Desulfitobacterium chlororespirans Co23(DSM11544)，Desulfitobacterium dehalogenans JW/DU1(ATCC 51507)，Desulfitobacteriumhafniense DCB2(DSM 10664)，D.hafniense DB7(DSM 13498)，D.hafniense PCP1(ATCC 700357)，D.hafniense TCE1(DSM 12704)，Desulfitobacterium sp.strain PCE1(DSM 10344)，Dehalospirillum multivorans(DSM 12446)或藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)；所述的腐殖性土壤寄生菌可以从湖北恩施或神农架等地的土壤中分离得到的腐殖性土壤菌；
为了达到更好的生物转化效果，更优选的，所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroi SH-f13)，其微生物保藏号是CCTCC NO：M2010038；其分类命名是：藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroi SH-f13)；保藏时间是：2010年2月1日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉，武汉大学；该藤仓赤霉SH-f13从取自湖北神农架的腐殖性土壤中分离得到，本发明通过试验发现，当采用CCTCC NO：M2010038作为第一阶段的转化用菌时，相比于其它的腐殖性土壤菌具有更好的生物转化效果(转化率为最高)；
所述的鬼臼类植物内生菌可从小檗科植物如：八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶(Diphylleia)或沙地柏(Sabina vulgaris Ant)等植物中分离得到的鬼臼类植物内生菌；优选的，所述的鬼臼类植物内生菌是细交链格孢(Alternariaalternata)S-f6，其微生物保藏号是CCTCC NO：M 2010037；其分类命名是细交链格孢S-f6(Alternaria alternata S-f6)：保藏时间是：2010年2月1日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉，武汉大学；该细交链格孢(Alternaria alternata)S-f6从取自中科院武汉植物园药园的八角莲植物茎部中分离得到。采用的分离方法为无菌条件下，将八角莲茎部纵切面平铺于土豆琼脂平板，28℃下富集培养后，依次进行液体培养、平板划线、挑取单菌落于土豆琼脂斜面，得到纯培养物。
上述生物转化方法中，所述生物转化包括摇瓶级或生物反应器规模的生物转化。其中，步骤(1)或步骤(2)中所述的生物转化温度优选为15-40℃，更优选为30℃；当采用摇瓶进行生物转化时，所述的摇床转速优选为50-300转/分钟；更优选的，所述的摇床转速为150转/分钟。
其中，步骤(1)中将鬼臼毒素作为底物加入到液体发酵培养基时，所加入的终浓度优选至0.01-5克/升，更优选为0.2克/升；
优选的，步骤(2)中将4′-去甲基表鬼臼毒素作为底物加入到液体发酵培养基时，所加入的终浓度优选至0.01-5克/升，更优选为0.2克/升；当发酵产生4′-去甲基表鬼臼毒酮后，在液体发酵培养基中添加川芎嗪至终浓度为0.01-5克/升，优选为0.1克/升。
步骤(1)或步骤(2)中所述的液体发酵培养基的组成为：
酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升、pH值2-9；优选的，所述的液体发酵培养基的组成是：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、pH值为7；
所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼臼类植物内生菌二级液体种子的制备，包括以下步骤：(1)培养斜面菌种；(2)培养一级液体种子；(3)培养二级液体种子；
作为参考，上述各个步骤所述的培养基和培养条件可以是：
(1)培养斜面菌种
培养基：葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0.05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；
培养条件：培养温度为15-40℃。
(2)培养一级液体种子：
培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；
培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；
(3)培养二级液体种子：
培养基：同一级液体种子培养基；
培养条件：同一级液体种子培养。
为了使微生物发酵朝着更有利于4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素生物合成的方向发展，本发明对各个阶段的培养基和培养条件进行了优化，最终发现，当各个培养阶段分别采用以下培养基和培养条件时，相比于其它的培养基和培养条件，发酵产物中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的含量有了明显的提高：
(1)培养斜面菌种：
培养基：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件：培养温度为30℃。
(2)培养一级、二级液体种子：
培养基：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；
培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟。
基于真菌的生物转化法中的生物催化剂具有可培养性，通过控制培养条件，菌丝体能够利用培养基成分中的鬼臼毒素作为碳源进行代谢。因此，采用生物转化的方法，利用廉价的培养基在摇瓶中培养菌丝体，具有周期短、成本低、操作简单、易培养、能够按照需求人为的控制原料供应量等众多优势。本发明利用微生物代谢工程的原理，可以有针对性地对菌丝体的生长进行代谢调控，使生物转化朝着有利于4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素生成的方向发展。
上述方法中，步骤(1)中从发酵液或菌丝体中分离纯化4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括以下步骤：
(1)将生物转化基质离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；(2)分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。
优选的，步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待分离纯化样品；
优选的，步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；更优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种从上述发酵液或菌丝体中分离纯化4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法。
所述的分离纯化依次包括以下步骤：
(1)将生物转化产物离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；(2)分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。
优选的，步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待分离纯化样品；
优选的，步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；更优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种从上述发酵液或菌丝体中检测4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量的方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种从上述发酵液或菌丝体中检测4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量的方法，包括：
(1)收集样品：将生物转化产物离心，分别收集上清液和菌丝体沉淀；
(2)制备待测样品：
(A)发酵上清液待测样品的制备：将发酵上清液与有机溶剂进行混合过滤或将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，得发酵液待测样品；
(B)菌丝体待测样品的制备：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；
(3)检测：待测样品使用液相色谱-紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器或电化学检测器或蒸发光检测器或示差折光检测器或质谱检测器检测，色谱柱为高效反相液相色谱住或高效正相液相色谱柱或Innovation高效液相色谱柱；通过对比相同色谱条件下4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的含量进行定量。
优选的，步骤(1)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心；
优选的，步骤(2)中所述的发酵液待测样品按照以下步骤制备：将发酵上清液与乙腈以1∶2进行混合后，在8000-15000转/分钟的转速下离心，取上清液；或以二氯甲烷对发酵液中进行萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，作为发酵液待测样品；
步骤(2)中所述的菌丝体待测样品优选按照以下步骤制备：将菌丝体进行回流提取，控制温度在30-150℃；用氯仿富集非极性成分，得菌丝体待测样品；
步骤(3)中所述的检测优选按照以下条件进行：色谱柱温度为0-80℃；进样方式为分流或不分流方式，体积1-20微升，流速0.2-2毫升/分钟；紫外检测器的检测波长为200-400nm；质谱所采用的电离方式为ESI电离，扫描离子质荷比范围为50-650，4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素特征碎片离子质荷比为519。
按照上述方法对本发明所制备的发酵液或菌丝体中的4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量进行检测，其结果为每升发酵液中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量达到0.1-50毫克；菌丝体(干重计)中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量达到0.1-15毫克/100毫克菌丝体。
当然，上述检测方法中，供试样品可用其他的预处理方法进行处理，如对样品衍生化等；对供试样品进行分析时，也可采用其它的检测方法，如用液相色谱-质谱联用、液相色谱-荧光检测器联用等。
本发明采用生物转化方法将鬼臼毒素转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素，至少从两方面解决了4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素产业化的难题。首先，本发明将生物转化技术应用于鬼臼类化合物和吡嗪类化合物的改造，在很大程度对以天然活性先导化合物为资源的药物开发提供了一种新思路。其次，生物转化技术属于绿色技术，避免了化学合成导致有机残留、规模小、产量低、成本高等不利因素，同时作为一种绿色安全的大规模生产方式有着无可比拟的巨大优势，利用生物转化法生产4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素具有成本低、E-factor低、操作简单、易培养、质量可控、可以有效的防止化学残留等优势。
附图说明
图1生物转化鬼臼毒素为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素路线。
图2用于制备本发明菌丝体待测样品的回流提取装置。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
1、生物转化所用菌种：
鬼臼类植物内生菌：细交链格孢(Alternaria alternata S-f6)，其微生物保藏号是CCTCC NO：M 2010037；
腐殖性土壤菌是藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroi SH-f13)，其微生物保藏号是CCTCC NO：M2010038；
2、鬼臼毒素和川芎嗪：均从西安和霖生物工程有限公司购买，纯度98％。
实施例1
1、第一阶段鬼臼毒素转化为4′-去甲基表鬼臼毒素：
1)、斜面菌种培养：本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为(营养PDA斜面)：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；马铃薯浸汁的制备方法：200g新鲜土豆去皮并切成边长约1cm的正方体小块，将切好的小块置于装有1L去离子水的搪瓷缸中，煮沸15min，待土豆软而不散时，用八层纱布过滤，取滤液并再次定容至1L，所得溶液用于配置PDA培养基。
用接种针以两点法将藤仓赤霉SH-f13接种于PDA斜面，培养条件：培养温度为30℃。灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为5天；
2)、一级液体种子培养
一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；一级液体种子培养：无菌操作下，精密吸取10ml无菌水至藤仓赤霉培养斜面中，以接种铲沿着菌苔表面刮取长度菌丝，将得到的10ml均匀菌丝悬液，接种于装有40ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。
3)、二级液体种子培养：二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，无菌操作下，精密吸取5ml均匀的藤仓赤霉一级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。
4)、生物转化
发酵培养基的配方为：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值为7；鬼臼毒素母液的配制：称取鬼臼毒素250毫克于50毫升容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得5毫克/毫升鬼臼毒素母液。
无菌操作下，将1毫升鬼臼毒素母液加入装有44毫升发酵培养基的250毫升三角摇瓶中。然后精密吸取5毫升均匀的藤仓赤霉二级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45毫升发酵培养基和底物的250毫升三角摇瓶中，28℃下，120rpm恒温摇床中培养8天。
2、4′-去甲基表鬼臼毒素的分离纯化
(1)、制备待分离样品：取步骤1所得藤仓赤霉转化鬼臼毒素5天后发酵液1升样品于2升的分液漏斗中，加入乙酸乙酯500毫升。手摇震荡至水相与有机相充分混合，静置15分钟后结束为一次，共萃取三次。将经过分液后的乙酸乙酯层旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，取5毫升氯仿将干燥样品进行复溶，保存于4℃的冰箱中作为菌丝体供分离样品。
(2)分离纯化4′-去甲基表鬼臼毒素：依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮(20∶1)系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮25∶1系统作为展开剂，将Rf值0.3的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮25∶1系统作为展开剂，将Rf值0.3的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥并以甲醇重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。
3、第二阶段4′-去甲基表鬼臼毒素经4′-去甲基表鬼臼毒酮转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素：
1)、斜面菌种培养：本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为(营养PDA斜面)：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；马铃薯浸汁的制备方法：200g新鲜土豆去皮并切成边长约1cm的正方体小块，将切好的小块置于装有1L去离子水的搪瓷缸中，煮沸15min，待土豆软而不散时，用八层纱布过滤，取滤液并再次定容至1L，所得溶液用于配置PDA培养基。
用接种针以两点法将细交链格孢接种于PDA斜面，培养条件：培养温度为30℃。灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为5天；
2)、一级液体种子培养
一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；一级液体种子培养：无菌操作下，精密吸取10毫升无菌水至细交链格孢培养斜面中，以接种铲沿着菌苔表面刮取长度菌丝，将得到的10毫升均匀菌丝悬液，接种于装有40毫升霉菌基本培养基的250毫升三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。
3)、二级液体种子培养：二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，无菌操作下，精密吸取5ml均匀的细交链格孢一级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45毫升霉菌基本培养基的250毫升三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。
4)、生物转化
发酵培养基的配方为：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值为7；
4′-去甲基表鬼臼毒素母液的配制：称取经分离纯化得到的生物转化产物4′-去甲基表鬼臼毒素250mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得5mg/ml 4′-去甲基表鬼臼毒素母液。
川芎嗪母液的配制：称取川芎嗪125mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得2.5毫克/毫升川芎嗪母液。
无菌操作下，将1毫升4′-去甲基表鬼臼毒素母液加入装有44毫升发酵培养基的250ml三角摇瓶中，然后精密吸取5毫升均匀的细交链格孢二级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45ml发酵培养基和4′-去甲基表鬼臼毒素的250ml三角摇瓶中，28℃下，120rpm 恒温摇床中。生物转化5天后，无菌操作下，将1毫升川芎嗪母液加入发酵基质中，28℃下，120rpm恒温摇床中继续转化5天。
实施例24-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的分离纯化
(1)、制备待分离样品：取实施例1所得细交链格孢菌丝体置于60℃烘箱中4天，待菌丝体完全干燥后以粉碎机粉碎至粉末状样品，取200克该样品于2升的圆底烧瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿1升，圆底烧瓶上端连接回流提取器，提取器上端连接冷凝管冷水回流(图2)。加热至沸腾保持2小时后结束为一次，共回流提取三次。将经过过滤后的氯仿旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，取5毫升氯仿将干燥样品进行复溶，保存于4℃的冰箱中作为菌丝体供分离样品。
(2)分离纯化4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮(40∶1)系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮35∶1系统作为展开剂，将Rf值0.46的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮35∶1系统作为展开剂，将Rf值0.46的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥并以甲醇重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。
实施例34-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量的测定
(1)、将实施例1所获得的发酵液离心(10000转/分钟、20分钟、4℃)，取2毫升上清液用于4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的测定；将4毫升乙腈加入2毫升发酵液，并进行离心(13000转/分钟、20分钟)；取上清液经0.45微米针头滤膜过滤，保存于4℃的冰箱中作为发酵液供试样品。
(2)、取实施例1所得新鲜菌丝体于60℃烘干，将烘干后的菌丝体研磨至200目粉末，取100克菌丝体粉末于2升的圆底烧瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿1升，圆底烧瓶上端连接回流提取器，提取器上端连接冷凝管冷水回流(图2)。加热至沸腾保持2小时后结束，经过过滤后的氯仿进行旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，取100毫升乙腈将干燥进行复溶，取乙腈部分于2毫升容量瓶中并定容至刻度，保存于4℃的冰箱中作为菌丝体供试样品。
(3)、供试样品用液相色谱进行检测：进样量20微升，用反相高效色谱柱(美国安捷伦科技，长150毫米，内径4.5毫米，液膜厚度0.5微米)或者相似极性柱分离；紫外检测波长254纳米；甲醇-水系统作为流动相，流速恒流0.8毫升/分钟；色谱柱温度45℃。
根据与同样条件下4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素对照品的出峰时间确定4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素后，根据两者的峰面积比与浓度比得出样品中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的浓度，通过外标法得出原发酵液及菌丝体中4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的浓度。
(4)、检测结果：实施例1所制备的发酵液中，4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素产量为2.3毫克/升；实施例1所制备的菌丝体中，4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素产量为7.4毫克/升。
Claims (17)
1.一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：
（1）、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；（2）、将步骤（1）所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4′-去甲基表鬼臼毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体；
所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）SH-f13，其微生物保藏号是CCTCC NO:M2010038；
所述的鬼臼类植物内生菌是细交链格孢（Alternaria alternata）S-f6，其微生物保藏号是CCTCC NO:M2010037。
2.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：所述的生物转化包括摇瓶级或生物反应器规模的生物转化；其中，步骤（1）或步骤（2）中所述的生物转化温度为15-40℃；当采用摇瓶进行发酵时，所述的摇床转速为50-300转/分钟。
3.按照权利要求2所述生物的方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（2）中所述的生物转化温度为30℃；当采用摇瓶进行发酵时，所述的摇床转速为150转/分钟。
4.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：步骤（1）中将鬼臼毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度0.01-5克/升；步骤（2）中在发酵培养基中添加川芎嗪至其终浓度为0.01-5克/升。
5.按照权利要求4所述生物的方法，其特征在于：步骤（1）中将鬼臼毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度为0.2克/升；步骤（2）中在发酵培养基中添加川芎嗪至其终浓度为0.1克/升。
6.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：步骤（1）中或步骤（2）中所述的液体发酵培养基组成是：酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升、pH值2-9；
所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼臼类植物内生菌二级液体种子的制备包括以下步骤：（1）培养斜面菌种；（2）培养一级液体种子；（3）培养二级液体种子；
其中，培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0.05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；
培养条件：培养温度为15-40℃；
培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；
培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；
培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；
培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟。
7.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：步骤（1）中或步骤（2）中所述的液体发酵培养基组成是：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、pH值为7。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：
培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件：培养温度为30℃；
培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；
培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟；
培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为：
培养基：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；
培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的分离纯化包括：（1）将生物转化基质离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；（2）分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；（3）依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤（2）所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干,得到发酵上清液待分离纯化样品；所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待分离纯化样品；
步骤（3）中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
11.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤（3）中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；其中，以体积比为20：1的氯仿：丙酮作为洗脱液；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡。
12.由权利要求1-11任何一项方法所得到的含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。
13.从权利要求12所述的含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液中分离纯化4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，其特征在于，包括：
（1）将含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；（2）分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；（3）使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。
14.按照权利要求13所述的方法，其特征在于：
步骤（2）所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干,得到发酵上清液待分离纯化样品；所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待分离纯化样品；
步骤（3）中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；
将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
15.按照权利要求14所述的方法，其特征在于：步骤（3）中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；以体积比为40：1的氯仿：丙酮系统作为洗脱液。
16.从权利要求12所述的含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体中检测4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素含量的方法，包括：
(1)收集样品：将含有4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液离心，分别收集上清液和菌丝体沉淀；
(2)发酵液或菌丝体待分离纯化样品的制备：
(A)发酵液待测样品的制备：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，得发酵液待测样品；
(B)菌丝体待测样品的制备：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；
(3)检测：待测样品使用液相色谱-紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发光检测器、示差折光检测器或质谱检测器检测，色谱柱为高效反相液相色谱住、高效正相液相色谱柱或Innovation高效液相色谱柱；通过对比相同色谱条件下4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的含量进行定量。
17.按照权利要求16的方法，其特征在于：
步骤(1)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心；
步骤(2)中所述的发酵液待测样品按照以下步骤制备：以二氯甲烷对发酵液中进行萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，作为发酵液待测样品；步骤(2)中所述的菌丝体待测样品按照以下步骤制备：将菌丝体进行蒸馏回流提取，控制温度在30-150摄氏度；用氯仿富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；
步骤(3)中所述的检测按照以下条件进行：色谱柱温度为0-80℃；进样方式为分流或不分流方式，体积1-20微升，流速0.2-2毫升/分钟；紫外检测器的检测波长为200-660nm；质谱所采用的电离方式为ESI电离，扫描离子质荷比范围为50-650，4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素特征碎片离子质荷比为519；核磁共振谱用核磁共振仪测定，TMS为内标，氘代甲醇和氘代氯仿为溶剂，质谱数据以离子阱质谱仪测定。
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Granted publication date: 20131016 Termination date: 20180429 |