CN103833800B - 分离鼠李糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分离鼠李糖脂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于分离鼠李糖脂的方法。
背景技术
鼠李糖脂是表面活性的糖脂并且是某些微生物的代谢产物，其最广为人知的生产者可能是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。
鼠李糖脂具有特殊的表面活性性质，例如强发泡能力，从而有多种技术应用对其有强烈的兴趣。
鼠李糖脂可以通过发酵的方式基于可再生的原材料在温和条件下制备，因此非常符合目前的“可持续性”和“绿色化学”的趋势，对鼠李糖脂的兴趣在近年来稳定地增长。
然而，迄今为止鼠李糖脂仅在市场上以高价格少量供应，并且只能与在特定应用中通常用于身体护理产品和家庭清洁用品的化学合成表面活性剂相竞争。高成本的一个原因特别是含有大量次要污染组分的发酵液的发酵产品难以进行后处理。这些污染组分包括未完全反应的亲油性和两亲性物质(例如，三甘油酯和部分甘油酯以及脂肪酸)、亲油性和两亲性细胞成分(例如，细胞膜的磷脂)以及在发酵期间用于控制泡沫的消泡剂(例如，基于硅氧烷、植物油或聚醚的消泡剂)。
消泡剂在后续的应用中特别麻烦，而且由于鼠李糖脂的两亲性，使得它们彼此的分离非常困难。除了泡沫抑制组分，在很多情况下，还必须分离亲水性的发酵副产物，例如蛋白质和微生物多糖，这是由于它们在最终产物中可能由于其他原因带来其他麻烦(微生物稳定性、毒物学性质等)。
最后，在后处理期间，由于在市场方面表面活性剂溶液要求尽可能高浓度的形式，因此也必须实现水性RL溶液的高浓度。为了生态学的原因，运输的产品应该含有最小可能量的水，以确保每kg活性物质的最低的可能燃料消耗。通过发酵获得的产品浓度相对较低，迄今为止在现有文献中已知没有浓度超过100g/l。
现有文献公开了一些用于纯化鼠李糖脂的方法，其经常是不同形式的混合物(例如，单-和双-鼠李糖脂)，并且分离它们与上述杂质。
各种技术上要求苛刻的方法允许部分纯化，根据工艺例如使用膜过滤、离子交换剂上的吸附和发酵期间的泡沫分级分离，然而亲水性杂质和疏水性杂质通过这些工艺步骤中的任何一个都不能被分离至足够的程度。进而，在工业规模上，还没有研究出成本上合算的用于纯化RL的方法，并且与传统化学合成表面活性剂相比，在生产成本方面倾向于非常昂贵。对于现有的色谱方法自然也存在这样的问题。
Sarachat等(2010)描述了使用有机溶剂或平均极性的溶剂混合物(例如，乙酸乙酯、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇或二氯甲烷)来进行发酵液的酸萃取，其中亲油性组分首先被共-萃取出来。鼠李糖脂被冷却沉淀，并且在第二步骤中通过逐步添加非极性溶剂(例如，己烷或氯仿)来进一步纯化。
该方法有明显的缺点，即添加毒物学上不可接受的、基于石油的非极性溶剂如己烷或氯仿，并且需要冷却结晶步骤。除了同样的较高成本之外，对于加工和安全的技术要求，这种方法在可持续性、绿色化学方面也是不理想的。进而，目前已经存在法规要求，源自这种方法的产品不能给予生态许可和不允许上市。
本发明的目的是提供一种用于纯化鼠李糖脂的方法，其能够克服现有技术中的至少一个缺点。
发明内容
令人惊讶地发现下面描述的方法能够实现本发明的目的。
因此，本发明提供一种如本申请权利要求所要求保护的用于分离鼠李糖脂的方法。
本发明的方法的优点是使用较少的溶剂。
进一步的优点是使用的溶剂在毒物学和安全上是可接受的。
进一步的优点是可以使用源自可持续资源的溶剂。
进一步的优点是本发明的方法可以在能量上有利的温度下进行。
进一步的优点是本发明的方法可以使用简单的技术设备进行。
本发明的方法的进一步的优点是其允许在非常短的时间内纯化／浓缩大量的产物。
优点还在于在本发明的方法中，浓缩和纯化的产物不是作为固体获得，而是作为液相获得，其有利于在后继技术中进一步加工。所生产的高度浓缩的溶液构成最终的产物。
本发明的方法的进一步的优点是其适合于处理发酵液和已经部分纯化的鼠李糖脂。
本发明的用于分离鼠李糖脂的方法包括下列工艺步骤：
A)提供水性介质，其包含至少一种鼠李糖脂并且pH值小于6，特别地小于5；
B)使所述介质与至少一种有机溶剂接触以得到多相体系并且分离水相；
C)将pH值升高至6或更高的值以提供多相有机体系；
D)分离鼠李糖脂富集的有机相；和
E)任选地进一步纯化所述鼠李糖脂。
根据本发明，术语“鼠李糖脂”应理解为特别指的是通式(I)的化合物或其盐，
其中
m=2、1或0，特别地为1或0；
n=1或0，特别地为1；
R1和R2各自独立地为相同或不同的具有2-24、优选5-13个碳原子的有机基团，特别地任选地支化的、任选地取代的(特别是羟基-取代的)、任选地不饱和(特别地任选地单-、双-或三不饱和)的烷基基团，优选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基以及其中o=1-23、优选4-12的(OH2)o-CH3的基团。
根据本发明，“pH”定义为在25℃下，搅拌5分钟之后，根据ISO4319(1977)使用pH电极校准后，相应物质的测量值。
根据本发明，术语“水性介质”应理解为指的是，基于整个考虑的组合物，包含至少5重量％水的组合物。
除非另有说明，所有提到的百分比(％)为质量百分比。
根据本发明，在本发明的方法中，优选步骤A)中的总水性介质包含10g／l-300g/l、特别是50g/l-150g/l的鼠李糖脂，所述的升数据指的是总的水性介质。
在本发明的方法中，步骤A)中的水性介质特别优选为无细胞或含细胞发酵液，优选无细胞发酵液。
特别地，本发明的方法的特征在于，步骤A)中的水性介质的pH值为2-4.5，特别是3.5-4。在这一点上，有利地，pH值可以使用酸来调节，特别是无机酸，其特别优选自HCl、H2SO4、硝酸、磷酸、碳酸，并且特别地为HCl。
本发明的方法的优势在于，如果在步骤D)之后，一定量的水存在于富集鼠李糖脂的有机相中，则所述方法具有下述技术效果，即通过简单地去除(例如蒸馏)有机溶剂，就可获得高浓缩的水性鼠李糖脂部分；因此，本发明的优选方法的特征在于，步骤B)中的有机溶剂或有机溶剂的混合物能够溶解0.1-30重量％、优选0.5-7重量％量的水，其中所述重量百分比指的是有机溶剂和水的总量。
步骤B)中优选的有机溶剂选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、丁-1-醇、丁-2-醇和二乙醚，其中特别优选乙酸乙酯。
根据本发明，优选在本发明的方法中，在20℃下，水性介质与有机溶剂或有机溶剂的混合物在接触之前的体积比为0.2：1-5：1，优选2：1-4：1，并且特别优选2.9：1-3.1：1。
本发明的方法的一个优选实施方式的特征在于，在步骤C)中，所述pH值升高至6.1-9，优选6.5-8，特别优选6.9-7.1。
根据本发明，优选在本发明的方法的步骤C)中，通过无机碱来升高所述pH值，特别是通过碱土金属碱、碱金属碱，优选水溶液，或通过氨来升高所述pH值，特别优选NaOH和KOH。
本发明的方法的一个优势在于其大部分能够在环境温度下进行，因此步骤B)、C)和D)优选在10-50℃的温度范围内进行，优选15-30℃，特别优选18-25℃。
在步骤E)中，鼠李糖脂可以根据需要进一步纯化。本发明的方法的一个优选实施方式的特征在于，在步骤E)中，任何存在的有机溶剂通过至少部分蒸发从鼠李糖脂中分离。在这一点上，优选地，有机溶剂的蒸发在减压下和升高的温度下进行。特别地，0.01-1巴、优选0.15-0.3巴的压力范围连同20-80℃、优选40-60℃的温度据证实是有利的。
本发明的方法可以进一步包括步骤F)，其涉及回收任何存在的消泡剂，特别是从有机相中回收。然后其可以有利地在后续的发酵中重新利用。
下列实施例通过举例的方式描述本发明，其并不是对本发明的限制，本申请的范围源自整体上的说明书和权利要求，而实施例则用于具体说明所述实施方式。
具体实施方式
实施例1：通过萃取和pH诱导的相分离由鼠李糖脂／脂肪酸混合物分离和浓缩鼠李糖脂
下面描述的用于纯化和浓缩的起始材料是通过发酵制备的鼠李糖脂粗产物。其含有约50％的各种鼠李糖脂以及约20％的各种脂肪酸类杂质，这些杂质通过发酵底物引入或者在发酵期间作为副产品形成。这些杂质主要是C10羟基脂肪酸及其二聚体和单不饱和C12脂肪酸。为了在所有制备步骤中检测这些杂质，在此使用专门为此目的开发的薄层色谱方法。从RL浓度为50g/l的水溶液开始进行鼠李糖脂的纯化。水溶液中脂肪酸的量为20g/l。
发酵液和部分纯化的粗产物经常含有蛋白质，其阻碍萃取后的相分离并且导致形成大量的中间相。在大部分情况下，产物或收率损失也与此相关。为了防止这种现象，首先通过添加1重量％的可商购蛋白酶制品(枯草杆菌蛋白酶(alkalase)，Novozymes)在pH=7和60℃下水解蛋白质。从而大大地简化随后的萃取。为了萃取鼠李糖脂，借助浓HCl将水溶液的pH值调节至4.0。然后用相同体积的乙酸乙酯来进行萃取。成功萃取后，在分液漏斗中于室温下(25℃)快速和可靠地进行相分离。
在此步骤中，亲水性杂质保留在水相中。更多的亲油性杂质和几乎100％的存在的鼠李糖脂则溶解在有机相中。
将含鼠李糖脂的有机相进行分离和进一步加工。通过添加50％浓度的KOH(水溶液)将溶液的pH值调节至7。在该pH值范围内溶液的突然变暗表明形成另一有机相；将该有机相再次于室温下(25℃)在分液漏斗中快速和简单地分离，鼠李糖脂变成主要富集在下层相中，并且亲油性杂质则大部分保留在上层相中。
从而，鼠李糖脂不仅实现了相当高的浓度，而且同时也实现了有效的纯化。在分离了含鼠李糖脂的下层相之后，通过在0.2巴和60℃下简单蒸馏来除去有机溶剂。
获得的鼠李糖脂部分的浓度为500g／l。
纯度为80％。这对应于纯化因子(purification factor)为1.6的10倍浓度，总体收率为95％。
最终产品与包含杂质的起始溶液相比具有显著改善的应用性质。特别地，由此改进了发泡性质。这使用SITA(R-2000)的泡沫检测仪来进行分析。纯化的产品表现出显著更快的泡沫形成动力学，并且同样地获得显著更高的泡沫体积。
实施例2：通过萃取和pH诱导相分离由鼠李糖脂／消泡剂混合物分离和浓缩鼠李糖脂
为了从鼠李糖脂溶液中分离消泡剂，使用Jeneil Biosurfactants的可商购鼠李糖脂混合物(JBR505)。
从RL浓度为50g/l的水溶液开始进行鼠李糖脂的纯化。以20g/l的最终浓度添加含硅氧烷的DOW Corning1500消泡剂。
为了萃取鼠李糖脂，借助浓HCl将水溶液的pH值调节至4.0。然后用相同体积的乙酸乙酯来进行萃取。成功萃取后，在分液漏斗中于室温下(25℃)快速和可靠地进行相分离。
在此步骤中，亲水性杂质保留在水相中。更多的亲油性杂质和几乎100％的存在的鼠李糖脂则溶解在有机相中。
将含鼠李糖脂的有机相进行分离和进一步加工。通过添加50％浓度的KOH(水溶液)将溶液的pH值调节至7。在该pH值范围内溶液的突然变暗表明形成另一有机相；将该有机相再次于室温下(25℃)在分液漏斗中快速和简单地分离，鼠李糖脂变成主要富集在下层相中，并且大部分亲油性杂质以及几乎100％的消泡剂则保留在上层相中。从而，实现了鼠李糖脂的纯化和相当高的浓度，并且同时实现了消泡剂的有效分离。消泡剂的分离通过定量1H-NMR分析来证实。实际上，在含鼠李糖脂的下层相中无法检测到约-0.1ppm的化学位移的聚二甲基硅氧烷消泡剂的典型信号，但是在上层乙酸乙酯相中却相当明显。在分离了含鼠李糖脂的下层相之后，通过在0.2巴和60℃下简单蒸馏来除去有机溶剂。
获得的鼠李糖脂部分的浓度为450g/l。
纯度为75％。这对应于纯化因子为1.5的9倍浓度，总体收率为90％。
最终产品与未纯化的起始溶液相比具有显著改善的应用性质。
实施例3：由含鼠李糖脂和消泡剂的发酵液分离和浓缩鼠李糖脂
用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株进行发酵，所述恶臭假单胞菌含有鼠李糖脂生物合成基因RhlA、RhlB和RhlC。在摇瓶中按照WO2012013554A1中描述的方法进行预培养。矿质培养基(M9)同样地用作主培养物。于2升的发酵槽中，在通过葡萄糖供料实现的限制碳的条件下进行发酵。葡萄糖供料通过参考溶解氧信号来进行。溶解氧通过20％的饱和度下的搅拌器速度来调节。通过pH电极和添加NH4SO4来将pH调节至7。为了防止发酵液的过度发泡，在一种情况下计量加入含硅氧烷的消泡剂DOW Corning1500，并且在另一种情况下计量加入葵花籽油。发酵进行4天，达到15g/l的生物干物质。通过HPLC确定鼠李糖脂的浓度，其为9.8g／l。在发酵结束后获得的发酵液，在既不使用DOW Corning1500消泡剂也不使用葵花籽油的情况下表现出强烈的发泡趋势。在通过10000g离心分离和随后通过酸化至pH=4的沉淀后，将含鼠李糖脂的下层相分离并且用水在pH=4下洗涤几次。将得到的产物通过添加NaOH再次调节至pH=7，这时沉淀的鼠李糖脂再次溶解。以这种方式获得的产物具有不利的应用性质。通过SITA测量法分析的泡沫形成动力学和获得的总泡沫体积是不足的。相比之下，通过本文所要求保护的方法则获得具有优异的应用性质的产物，特别是优异的发泡性质。
在此，萃取步骤和随后的浓缩按照上面实施例中所描述的来实施。其可以直接从含细胞的发酵液进行，或者在分离细胞后进行。如果没有分离细胞，则相分离进行得明显更慢，并且形成含细胞和产物的中间相，结果导致收率降低，但是纯度和应用性质不受影响。在得到的产物中，通过1H-NMR仍然可以检测到痕量的DOW Corning1500消泡剂和葵花籽油。但大部分保留在上层有机相中，并且在除去溶剂后，可以任选地用于进一步的发酵。
Claims (17)
1.一种用于分离鼠李糖脂的方法，其包括下列工艺步骤：
A)提供水性介质，其包含至少一种鼠李糖脂并且pH值小于6；
B)使所述介质与至少一种有机溶剂接触以得到多相体系并且分离水相；
C)将pH值升高至6.5-8以提供多相有机体系；
D)分离鼠李糖脂富集的有机相；和
E)任选地进一步纯化所述鼠李糖脂，
其中，
步骤A)中的水性介质的pH值为3.5-4，
步骤B)中的有机溶剂或有机溶剂的混合物能够溶解0.1-30重量％量的水，并且
其中步骤B)中的至少一种有机溶剂选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、丁-1-醇、丁-2-醇和二乙醚。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A)中的总水性介质包含10g/l-300g/l的鼠李糖脂。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A)中的总水性介质包含50g/l-150g/l的鼠李糖脂。
4.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，步骤B)中的有机溶剂或有机溶剂的混合物能够溶解0.5-7重量％量的水。
5.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，水性介质与有机溶剂或有机溶剂的混合物在接触之前的体积比为0.2:1-5:1。
6.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，水性介质与有机溶剂或有机溶剂的混合物在接触之前的体积比为2:1-4:1。
7.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，水性介质与有机溶剂或有机溶剂的混合物在接触之前的体积比为2.9:1-3.1:1。
8.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，在步骤C)中，所述pH值升高至6.9-7.1。
9.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，在步骤C)中，通过无机碱来升高所述pH值或通过氨来升高所述pH值。
10.根据权利要求9的方法，其中所述无机碱是水溶液的形式。
11.根据权利要求9的方法，其中所述无机碱包括碱土金属碱或碱金属碱。
12.根据权利要求11的方法，其中所述无机碱是水溶液的形式。
13.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，在步骤C)中，通过NaOH或KOH来升高所述pH值。
14.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，步骤B)、C)和D)在10-50℃的温度范围内进行。
15.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，步骤B)、C)和D)在15-30℃的温度范围内进行。
16.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，步骤B)、C)和D)在18-25℃的温度范围内进行。
17.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，在步骤E)中，有机溶剂通过至少部分蒸发从所述鼠李糖脂中分离。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
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Effective date of registration: 20160113 Address after: essen Applicant after: Evonik Degussa GmbH Address before: essen Applicant before: Evonik Industries AG |
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Address after: Essen, Germany Patentee after: Evonik Operations Ltd. Address before: Essen, Germany Patentee before: EVONIK DEGUSSA GmbH |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20180525 Termination date: 20211125 |