CN103687866A

CN103687866A - 用于治疗病毒性感染的嘌呤单磷酸酯前药

Info

Publication number: CN103687866A
Application number: CN201280036015.2A
Authority: CN
Inventors: 雷蒙德·F·斯基那兹; 赵忠贤; 周龙胡; 张宏旺; 于戈·普拉代尔; 斯蒂文·J·科阿斯
Original assignee: AMORY UNIV; RFS Pharma LLC
Current assignee: AMORY UNIV; RFS Pharma LLC
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2014-03-26
Also published as: EP2710023A2; EP2710023A4; CA2836579A1; BR112013029761A2; RU2013125713A; US20140212382A1; WO2012158811A2; MX2013013570A; KR20140033446A; WO2012158811A3

Abstract

本发明涉及使用核苷类似物单磷酸酯前药治疗或预防病毒性感染的化合物、组合物和方法。更具体地说，人类患者或其它动物宿主中的HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒和黄热病。该化合物为某些2,6-二氨基2-C-甲基嘌呤核苷一磷酸酯前药和经修饰的前药类似物，及其药学上可接受的盐、前药和其它衍生物。特别地，该化合物显示出针对HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒和黄热病的强效抗病毒活性。本发明教导了如何修饰2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤以及如何以迄今为止不可获得的治疗相关浓度将核苷酸三磷酸酯递送到聚合酶。

Description

用于治疗病毒性感染的嘌呤单磷酸酯前药

技术领域

本发明涉及使用核苷酸类似物治疗或预防病毒性感染的化合物、方法和组合物。更具体地，本发明描述了2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷一磷酸酯前药和经修饰的前药类似物、药学上可接受的盐或其其它衍生物，以及其在病毒性感染，尤其是1）包括丙型肝炎（HCV）、西尼罗病毒（West Nile virus）、登革病毒、基孔肯雅（Chikungunya）病毒和黄热病的黄病毒科病毒；和2）包括诺如病毒（Norovirus）和札幌病毒（Sapovirus）的杯状病毒感染的治疗中的用途。本发明教导了如何修饰2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤的代谢途径以及如何以迄今为止不可获得的治疗相关浓度将核苷酸三磷酸酯(nucleotide triphosphate)递送到聚合酶。

背景技术

核苷类似物作为一个类具有完善的监管历史，目前有超过10种由美国食品及药物管理局（US FDA）批准用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）。在开发抗病毒疗法中的挑战是抑制病毒复制而不损伤宿主细胞。通常，为了表现出抗病毒活性，核苷类似物必须由宿主细胞激酶代谢性转化为它们相应的三磷酸形式（NTP）。以所述三磷酸形式，核苷聚合酶抑制剂模拟天然核苷酸，因为它们与五种天然存在的核苷5’-三磷酸（NTP）的一种（即CTP、UTP、TTP、ATP或GTP）竞争用于RNA或DNA延伸。因此核苷类似物通过作为链终止子或延迟的链终止子来抑制病毒复制。

丙型肝炎病毒（HCV）已经感染了全世界超过180万人。据估计，每年新感染三到四百万人，其中70%将发展为慢性肝炎。在发达国家中，HCV对全部肝癌病例的50-76%和所有肝移植的三分之二负有责任。标准疗法[聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林（核苷类似物）]仅仅在50-60%的患者中起作用并与显著的副作用有关。因此，迫切需要新的HCV药物。

丙型肝炎病毒基因组包含包封在核衣壳和脂质包膜内的正链RNA并且由9.6kb的核糖核苷酸组成，其编码大约3000个氨基酸的大的多肽（Dymock et al.Antiviral Chemistry&Chemotherapy2000,11,79）。成熟后，这种多肽被切割成至少10个蛋白。这些蛋白之一，NS5B，具有聚合酶活性并参与从作为模板的单链病毒RNA基因组的双链RNA的合成。长期以来，用于HCV繁殖的方便的细胞培养模型的缺乏已阻碍了选择性地抑制HCV复制的新型抗病毒策略的开发。首先随着1999年HCV复制子系统的建立(Bartenschlager,R.,Nat.Rev.DrugDiscov.2002,1,911–916and Bartenschlager,R.,J.Hepatol.2005,43,210–216)以及2005年强健的HCV细胞培养模型的发展(Wakita,T.,et al.,Nat.Med.2005,11,791-6;Zhong,J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,9294-9;Lindenbach,B.D.,et al.,Science2005,309,623-6)，这种障碍经已经得到了克服。

可通过通过NS5B蛋白的竞争性抑制操纵NS5B的聚合酶活性来阻止HCV复制。作为选择，链终止子核苷类似物也可掺入到延伸的RNA链。近来，数个专利申请（包括WO99/43691,WO01/32153,WO01160315,WO01179246,WO01/90121,WO01/92282,WO02/48165,WO02/18404,WO02/094289,WO02/057287,WO02/100415(A2),US06/040890,WO02/057425,EP1674104(A1),EP1706405(A1),US06/199783,WO02/32920,US04/6784166,WO05/000864,WO05/021568）已描述了核苷类似物作为抗HCV剂。

基孔肯雅病毒（CHIKV）为通过携带病毒的埃及伊蚊（Aedes Aegyptimosquitoes）传播到人类的昆虫传播病毒[Lahariya C,Pradhan SK.Emergence ofchikungunya virus in Indian subcontinent after32years:a review.J Vect Borne Dis.2006;43(4):151-60]。基孔肯雅病毒（CHIKV）为披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）的成员。CHIKV最早在1953年从坦桑尼亚的发热病人的血液分离，自此一直在西非、中非和南非和亚洲的许多地区被反复鉴定，并从那时被列为那些区域的许多人类流行病的原因。近代已经有与危重疾病相关的CHIKV的爆发。CHIKV引起具有与登革热相似的症状的疾病。CHIKV常表现为仅持续2至5天的疾病的急性发热期，接着是可包括影响四肢关节的关节痛病（关节痛）、肌痛症（肌肉痛）、头痛、疲劳（虚弱）、恶心、呕吐和皮疹的拖延期。与CHIKV感染相关的关节痛持续数周或数月，或者在某些情况下持续数年。潜伏期（从感染到疾病的时间）可能为2-12天，但是通常为3-7天。急性的基孔肯雅热一般持续几天到几周，但是一些患者具有持续数周的拖延的疲劳。此外，一些患者具有报道的失能性关节疼痛，或者可持续数周或数月的关节炎。没有与CHIKV感染有关的死亡、神经侵袭案例或出血案例被结论性地记载在科学文献中。目前没有针对基孔肯雅病毒感染的特异治疗，也没有用于阻止感染的被认可的任何疫苗。

诺如病毒是在无包膜正链RNA家族杯状病毒科发现的四种病毒属的一种。杯状病毒科的其它三种为兔病毒、水疱疹病毒和札幌病毒。札幌病毒为利用人类作为宿主的除了诺如病毒外的属的唯一成员。诺如病毒基因组大约7.6kb，具有三个开放读码框（ORFs）。第一个ORF编码包括解旋酶、蛋白酶和RNA指导的RNA聚合酶（RDRF）的非结构蛋白，所有这些都是病毒复制所必须的。剩下的两个ORFs编码衣壳蛋白(Jiang,X.(1993)Virology195(1):51-61)。诺如病毒的许多菌株已被分为其中I、IV和V感染人类(Zheng,D.P.,et al.(2006)Virology346(2):312-323)的5个基因型组并且由CDC估计造成大约2300万肠胃炎案例，相当于美国每年的食物传染疾病的40%(Mead P.S.(1999)Emerg.Infect.Dis.5(5):607-625)。

常见症状为呕吐、腹泻和肠痉挛。呕吐为儿童中最常见的症状，而腹泻在被感染的成人中较常见。脱水是一个重要的问题。在美国由于这种病毒的死亡为每年大约300个患者，并且这些死亡通常在具有弱的免疫系统的患者中(Centers for Disease Control and Prevention.“Norwalk-like viruses:”public healthconsequences and outbreak management.MMWR2001;50(No.RR-9):3)。从接触到完全感染的潜伏期通常为24到48小时，大约30%的被感染个体没有表现出症状。症状通常持续24到60小时(Adler,J.L.and Zickl,R.,J.(1969)Infect.Dis.119:668-673)。病毒脱落可在感染后持续长达2周，但是还不清楚这种病毒是否具有传染性。

诺如病毒首先经由通过受污染的食物或水、人与人接触、呕吐物或粪便样品的气溶胶的粪口途径传播。粪便样品中的病毒滴度可达到每毫升10⁶到10⁷个粒子，并且粒子在0℃（32°F）到60℃（140°F）的温度是稳定的(Duizer,E.et al.,(2004)Appl.Environ.Microbiol.70(8);4538-4543)。该病毒具有高度传染性，以及各种来源显示感染可能需要接种少至10到100个病毒粒子(Centers for DiseaseControl and Prevention.“Norwalk-like viruses:”public health consequences andoutbreak management.MMR2001;50(No.RR-9):3-6)。这导致了学校、养老院、游艇、医院或人们聚集的其它地点的流行病。

诺如病毒被命名为诺瓦克样病毒，名称来源于1968年在俄亥俄州诺瓦克的一所学校的爆发。作为诺瓦克疾病原因的病毒粒子是在通过三组人类志愿者的直肠拭子滤液传代后由免疫电子显微镜在1972年鉴定出的(Kapikian,A.Z.et al.(1972)J.Virol.10:1075-1081)。在随后的数年，该病毒由于其电子显微图像而被称为小圆结构病毒，因为它是杯状病毒科家族的成员而被称为杯状病毒，和/或在原始分离株后可能最常见的诺瓦克样病毒。该病毒的常用名包括冬季呕吐病毒、急性肠胃炎、食物中毒和病毒性肠胃炎。虽然感染的结果通常不危及生命，但是设施使用损失和生产力损失的成本是巨大的，因此，用于治疗人类诺如病毒感染的疗法将是非常可取的。

目前对诺如病毒感染还没有被认可的药物治疗(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，并且这可能至少部分归因于细胞培养系统的可用性的缺乏。近来，已开发了用于原始诺瓦克G-I株的复制子系统(Chang,K.O.,et al.(2006)Virology353:463-473)。为了使复制子的复制发生，诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子均需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶为功能性的。最近，已报道体外细胞培养感染力检测利用诺如病毒基因型组I和II接种体(Straub,T.M.et al.(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)。该检测利用微载体珠上的小肠上皮细胞在旋转壁式生物反应器中进行，并且至少在最初看来似乎用这个系统筛选有意义数量的化合物将是困难的。最终所述感染力检测对于筛选进入抑制剂可能是有用的。其它团体，如Ligocyte制药公司（Ligocyte Pharmaceuticals,Inc.）(http://www.ligocyte.com/)已集中于试图开发针对诺如病毒的疫苗，但是，这些努力尚未成功并且可能是困难的，其常常为在低复制酶保真度为进化利益的病毒系统中的情况。

西尼罗病毒（WNV）来自黄病毒科家族，并且主要为蚊虫传播疾病。它于1937年在乌干达的西尼罗地区首次被发现。根据来自疾病预防控制中心的报道，WNV在非洲、中东、欧洲、大洋洲、西亚和中亚以及北美都发现过。它在北美的首次出现始于1999年的纽约市大都会区。它在北美为季节性流行，通常爆发于夏季并持续到秋季，呈现出对环境健康的威胁。它的自然循环为鸟类-蚊子-鸟类和哺乳动物。蚊子，尤其是尖音库蚊（Culex pipiens），当它们吸食受感染鸟类时被感染。然后受感染的蚊子当它们叮咬时将WNV传播给其它鸟类和包括人类的哺乳动物。在人类和马中，致命的脑炎为WNV感染的最严重的表现。在一些受感染的鸟类中WNV也可引起死亡。对于WNV感染没有特异的治疗。在具有较轻症状的案例中，人们经历诸如发热和自行延续的疼痛的症状，但是即便健康人也会生病数周。在比较严重的案例中，人们通常需要去医院，在那儿他们可接受支持性治疗。

登革热感染同样来自黄病毒科家族并且在新加坡为最重要的虫媒传播感染(Epidemiol News Bull2006,32,62-6)。在全球范围内，每年有预计五千万到1亿例的登革热（DF）和几十万例的登革出血热（DHF），具有5%的平均死亡率。许多患者很少或没有残留病地从登革热感染中恢复。登革热感染通常为无症状的，但是可能呈现为典型的登革热、登革出血热或登革休克综合征。即使对于门诊病人，维持足够的水合作用的需要也是非常重要的。登革热感染可通过静脉补液疗法进行有效地管理，并且如果早期诊断，死亡率可保持在1%以下。为了管理疼痛和发热，怀疑有登革热感染的患者应该施用对乙酰氨基酚制剂。阿司匹林和非甾体抗炎药物可能会加重与一些登革热感染有关的出血倾向。然而，以前描述的登革热感染的一些临床表现包括肝衰竭(Dig Dis Sci2005,50,1146-7)、脑病(J Trop Med Public Health1987,18,398-406)和格林-巴利综合征(Intern Med2006,45,563-4)。

已有人发现，基于细胞培养中的潜伏或者体内施用，2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷转化为相应的6-羟基-2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤。我们发现这对于各种其它6-取代嘌呤核苷同样适用。这些化合物充当G或I类似物的前药，多为前药阿巴卡韦（Abacavir）和其体内转化为相应的G类似物卡巴韦((-)-碳环2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧鸟苷)的情况。这种转化严重限制了可体内形成的作为潜在抗病毒剂的6-取代嘌呤核苷三磷酸的多样性。

根据HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和黄热病已在全世界范围内达到令人恐慌的水平并且对受影响的患者具有重大的和某些情况下具有悲剧性影响的事实，对于提供治疗这些疾病的新的有效的药剂与对宿主具有较低毒性的剂仍然存在着强烈的需求。

这将有利于提供新的抗病毒剂或化疗剂、包括这些剂的组合物以及使用这些剂治疗的方法，特别有利于治疗耐药突变病毒。本发明提供这类剂、组合物和方法。

发明内容

本发明提供了治疗或预防宿主中HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒或黄热病感染的化合物、方法和组合物。所述方法包括施用治疗或预防有效量的至少一种如本文所述的化合物以治疗或预防HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒或黄热病感染，或者施用足以降低HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒或黄热病感染的生物学活性的量。所述药物组合物包括一种或多种本文描述的化合物，，连同药学上可接受的载体或赋形剂，用于治疗患有癌症或受HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒或黄热病感染的宿主。所述制剂还可包括至少一种另外的治疗剂。另外，本发明包括制备所述化合物的方法。

与丙型肝炎复制子一样，为了使复制子的复制发生，诺如病毒复制子需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶为功能性的。所述复制子可被用于高通量检测。其评价要被活性筛选的化合物是否抑制诺如病毒解旋酶、蛋白酶和/或聚合酶行使功能的能力，由对复制子的复制的抑制表明。

所述化合物为各种2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷的单磷酸酯形式或者为当体内施用时同样被三磷酸化的单磷酸酯形式的类似物。我们已发现，相当令人惊奇地，这些核苷的单磷酸酯前药的制备部分地（或可能全部地）保护6-氨基基团不转化为G类似物。通过制备所述单磷酸酯前药，我们已开发了将核苷酸递送到聚合酶的方法，其在本发明之前是不可能的，或者至少以治疗相关浓度不可能。在一些实施方案中，本发明将两种三磷酸酯递送到聚合酶，其中的一种被认为是G类似物而另一种被认为是A类似物。本发明使得新的及新颖的系列核苷酸三磷酸酯（以及与相应的G类似物的混合物）可在体内制备并被作为抗病毒剂。

本文描述的化合物包括β-D-2,6-二氨基-2-C-甲基嘌呤核苷的单磷酸酯类似物。在一个实施方案中，所述活性化合物为式（A）；在另一个实施方案中，所述活性化合物为式（B）：

或其药学上可接受的盐或前药，其中：

当在磷中心处存在手性时，其可以全部地或部分地为R_p或S_p或它们的任意混合物

R¹为OH或F；

Y为O或S;

R²⁴选自OR¹⁵、

和脂肪醇衍生的（例如但不限于：

）（其中R¹⁵、R¹⁷和R¹⁸如下文所定义）；

当体内施用时，R²和R³能提供在生物系统中部分或者完全地抵抗6-NH₂脱氨的核苷单磷酸酯或硫代核苷单磷酸酯。代表性的R²和R³独立地选自：

(a)OR¹⁵，其中R¹⁵选自H、Li、Na、K、苯基和吡啶基；苯基和吡啶基由一到三个取代基取代，所述取代基独立地选自(CH₂)_0-6CO₂R¹⁶和(CH₂)_0-6CON(R¹⁶)₂；

R¹⁶独立地为H、C_1-20烷基、衍生自脂肪醇（如油醇、二十八烷醇、三十烷醇、亚麻醇等）的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、

烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或者环烷基取代的C_1-5烷基；

(b)

或者

(c)L-氨基酸的酯，其中R¹⁷仅限于在天然L-氨基酸中存在的基团，并且R¹⁸为H、C_1-20烷基、衍生自脂肪醇（如油醇、二十八烷醇、三十烷醇、亚麻醇等）的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

(d)R²和R³可连在一起形成环

其中R¹⁹为H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、衍生自脂肪醇（如油醇、二十八烷醇、三十烷醇、亚麻醇等）的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

(e)R²和R³可连在一起形成选自

和

的环

其中，R²⁰为O或NH，并且

R²¹选自H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、衍生自脂肪酸（如油酸、亚油酸等等）的碳链以及被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

所述化合物可通过，例如，制备5’-OH类似物、然后将这些转化为单磷酸酯类似物来制备。

另外，本文描述的所述化合物为HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和/或黄热病的抑制剂。因此，这些化合物也可以用于治疗被HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和/或黄热病共同感染的患者。

附图说明

图1：24的ORTEP绘图；

图2：25(S_P)的ORTEP绘图

图3：25(S_P)的ORTEP绘图

图4：通过HCV NS5B的((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯的掺入。

图5：通过HCV NS5B的((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-羟基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯的掺入。

图6：在50μM12的Huh7细胞中孵育4小时后形成的核苷酸的LC/MS分析。

图7：在50μM8a的Huh7细胞中孵育4小时后形成的核苷酸的LC/MS分析。

图8：8a的代谢抑制产生2,6-二氨基和G三磷酸酯的细胞内递送

图9：在50μM8b-up的Huh7细胞中孵育4小时后形成的核苷酸的LC/MS分析。

图10：8b-up的代谢抑制产生2,6-二氨基和G三磷酸酯的细胞内递送。

图11：DAPD在37℃以50μM的浓度在PBM细胞中经过4小时的细胞内代谢。

图12：包含6-氨基和5’-MP前药的磷酰胺酯RS-864在37℃以50μM的浓度在PBM细胞中孵育4小时。

具体实施方式

本文描述的2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药显示对HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和黄热病的抑制活性。因此，所述化合物可用于治疗或预防宿主中的病毒感染，或者减弱病毒的生物活性。所述宿主可为被HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和/或黄热病感染的哺乳动物，并且尤其是人类。所述方法包括施用有效量的一种或多种本文描述的所述2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药。

还公开了包括一种或多种本文描述的化合物连同药学上可接受的载体或赋形剂的药物制剂。在一个实施方案中，所述制剂包括至少一种本文描述的化合物和至少一种另外的治疗剂。

参考以下定义，将更好地理解本发明：

I.定义

术语“独立地”在本文中用于表示独立应用的变量从应用到应用独立地变化。因此，在化合物如R’’XYR’’，其中R’’“独立地”为碳或氮中，两个R’’可均为碳，两个R’’可均为氮，或者一个R’’可为碳而另一个R’’为氮。

如本文所用，术语“对映体纯”指的是包括至少约95%以及优选约97%、98%、99%或100%的核苷酸单一对映体的核苷酸组合物。

如本文所用，术语“基本上不含”或“基本上不存在”指的是包括按重量至少按重量85%到90%、优选按重量95%到98%以及更优选按重量99%到100%的核苷酸指定对映体的核苷酸组合物。在优选实施方案中，本文描述的所述化合物基本上不含对映体。

同样地，术语“分离的”指的是包括按重量至少85%到90%、优选按重量95%到98%以及更优选按重量99%到100%的核苷酸，其余部分包含其它化学种类或对映体的核苷酸组合物。

在一些情况下，磷原子可以为手性的，本文称为“P*”或“P”，其表示并且其具有与用于这类分配的Cahn-Ingold-Prelog规则的公认含义一致的“R”或“S”的指代。通式A和B的前药由于磷中心的手性可作为非对映体的混合物而存在。当手性存在于磷中心处时，其可全部或部分地为R_p或S_p或它们任意的混合物。

除非另有说明，如本文使用的术语“烷基”指的是饱和的直链、支链或环状的伯、仲或叔烃，包括取代和未取代的烷基。所述烷基可任选地由不以其它方式干扰反应或者提供过程改进的任何配基（包括但不限于卤代、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺、磺酰基、硫酰基、亚磺酰基、磺酰胺基（sulfamonyl）、酯、羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯）所取代，这些配基可以是未被保护的，在必要时也可以是被保护的，如本领域技术人员已知的，例如，如通过引用纳入本文的Greene等,有机合成中的保护基团,约翰·威利父子出版公司,第二版,1991中所教导的。具体包括有CF₃和CH₂CF₃。

在文中，每当术语C（烷基范围）被使用时，该术语独立地包括那类的每个成员犹如具体和分别说明的那样。术语“烷基”包括C_1-22烷基配基，并且术语“低级烷基”包括C_1-6烷基配基。本领域的普通技术人员应该理解，有关烷基配基通过用后缀“-yl”替代后缀“-ane”来命名。

术语“烯基”指的是不饱和的、直链或支链的烃基基团，因为它包含一个或多个双键。本文公开的烯基可任选地由不对反应过程产生不利影响的任何配基（包括但不限于对于烷基配基上的取代基所描述的那些）所取代。烯基的非限制性的实例包括乙烯、甲基乙烯、亚异丙基、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2-丙烷-二基、1,3-丁烷-二基和1,4-丁烷-二基。

术语“炔基”指的是不饱和的、直链或支链的无环烃基，因为它包含一个或多个三键。所述炔基可任选地由不对反应过程产生不利影响的任何配基（包括但不限于上文对于烷基配基所描述的那些）所取代。合适的炔基的非限制性的实例包括乙炔基、丙炔基、羟丙炔基、丁炔-1-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基和己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基基团。

术语“烷基氨基”或“芳基氨基”指的是分别具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。

如本文使用的以及除非另有说明，术语“被保护的”指的是为阻止其进一步反应或者为了其它目的而被加至氧、氮或磷原子的基团。多种氧和氮保护基为有机合成领域中的本领域技术人员所熟知，并被描述如在前面的Greene等,有机合成中的保护基中。

单独或组合地，术语“芳基”是指含一个、两个或三个环的碳环芳香系统，其中所述环可以以悬垂方式连接在一起或可以稠合。芳基的非限制性的实例包括苯基、联苯基或萘基或从芳香环去除氢后剩下的其它芳香基团。术语芳基包括取代的和未取代的配基。所述芳基可任选地由不对所述过程产生不利影响的任何配基（包括但不限于对于烷基配基上文所描述的那些）取代。取代芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、单芳基酰氨基磺酰基（monoarylamidosulfonyl）、芳基亚磺酰氨基、二芳基酰氨基磺酰基、单芳基-酰胺基磺酰基（monoaryl amidosulfonyl）、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳硫基、杂芳基亚磺酰基、杂芳基磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基、杂芳烷酰基、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、饱和杂环基、部分饱和的杂环基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳基烷基、杂芳烷基、芳烯基、和杂芳基烯、碳芳烷氧基。

术语“烷芳基”或“烷基芳香基”指的是具有芳基取代基的烷基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”指的是具有烷基取代基的芳基。

如本文使用的，术语“卤代”包括氯代、溴代、碘代和氟代。

术语“酰基”指的是羧酸酯基，其中所述酯基的非羰基配基选自直链的、支链的或环状的烷基或低级烷基、烷氧基烷基包括但不限于甲氧基甲基、芳烷基包括但不限于苄基、芳氧基烷基如苯氧甲基、芳基包括但不限于任选地被卤素（F,Cl,Br,I）、烷基（包括但不限于C₁,C₂,C₃和C₄）或者烷氧基（包括但不限于C₁,C₂,C₃和C₄）所取代的苯基、磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基（包括但不限于甲磺酰基）、单、二或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧三苯甲基、取代苄基、三烷基甲硅烷基（如二甲基-t-丁硅烷基）或者二苯甲基硅烷基。所述酯类中的芳基优选包括苯基。术语“低级酰基”是指其中非羰基配基为低级烷基的酰基。

术语“烷氧基”和“烷氧烷基”包括具有烷基配基的直链或支链的含氧基团，如甲氧基。术语“烷氧烷基”也包括具有连接到烷基的一个或多个烷氧基的烷基，即形成单烷氧烷基和二烷氧烷基。所述“烷氧基”可进一步由一个或多个卤原子取代，如氟代、氯代或溴代，以提供“卤代烷氧基”。该类基团的实例包括氟代甲氧基、氯代甲氧基、三氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟代乙氧基、氟代乙氧基、四氟代乙氧基、五氟代乙氧基和氟代丙氧基。

术语“烷基氨基”表示分别包含连接到氨基的一个或两个烷基的“单烷基氨基”和“二烷基氨基”。术语芳基氨基表示分别包含连接到氨基的一个或两个芳基的“单芳基氨基”和“二芳基氨基”。术语“芳烷基氨基”包括连接到氨基的芳烷基。术语芳烷基氨基表示分别包含连接到氨基的一个或两个芳烷基的“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。术语芳烷基氨基还表示包含连接到氨基的一个芳烷基和一个烷基的“单芳烷基单烷基氨基”。

如本文使用的术语“杂原子”指的是氧、硫、氮和磷。

如本文使用的术语“杂芳基”或“杂芳香基”指的是芳香环中包括至少一个硫、氧、氮或磷的芳香基团。

术语“杂环”、“杂环基”和环杂烷基指的是非芳香环基，其中有至少一个杂原子如氧、硫、氮或磷在环上。

杂芳基和杂环基的非限制性实例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)，吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,4-噻二唑基、异恶唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、恶唑、异恶唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪，和蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1,2,3-恶二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、oxaziranes、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷、5-氮杂尿嘧啶基、三吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶、腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤、N⁶-苄基嘌呤、N⁶-卤代嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-炔属嘌呤、N⁶-酰基嘌呤、N⁶-羟烷基嘌呤、N⁶-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N⁵-烷基嘧啶、N⁵-苄基嘧啶、N⁵-卤代嘧啶、N⁵-乙烯基嘧啶、N⁵-炔属嘧啶、N⁵-酰基嘧啶、N⁵-羟基嘌呤，和N⁶-硫代嘌呤，和异恶唑基。所述杂芳香基可任选地如上文对芳基所述的被取代。所述杂环或杂芳香基可任选地被选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个取代基取代。所述杂芳香基可按要求部分或完全地被氢化。作为非限制性的实例，二氢吡啶可代替吡啶使用。杂环上或杂芳基上的功能性的氧和氮基可按需要或要求被保护。合适的保护基为本领域技术人员所熟知，并且包括三甲基硅烷基、二甲基己硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基和叔丁基二苯基硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。所述杂环或杂芳香基可被不对所述反应产生不利影响的任意配基（包括但不限于上文对于芳基所描述的那些）所取代。

如本文使用的术语“宿主”指的是病毒可在其中复制的单细胞或多细胞生物，包括但不限于细胞系和动物和优选的人类。或者，所述宿主可携带病毒基因组的一部分，其复制或功能可被本发明的化合物改变。术语宿主特别指受感染的细胞、转染所有或部分病毒基因组的细胞以及动物，尤其是灵长类（包括但不限于黑猩猩）和人类。在本发明的大多数动物应用中，所述宿主为人类患者。但是，某些适应症的兽医学应用被清楚地涵盖在本发明（如在治疗黑猩猩中的使用）。

术语“肽”指的是通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连接的包含两个到一百个氨基酸的各种天然或合成化合物。

术语“药学上可接受的盐或前药”在整个说明书中用于描述一旦施用给患者将提供核苷酸单磷酸酯化合物的核苷酸化合物的任何药学上可接受的形式（如酯、磷酸酯、酯或相关基团的盐）。药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机的或有机的碱和酸的那些。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁、药学领域中众所周知的许多其它酸当中的那些。药学上可接受的前药指的是在宿主中被代谢例如被水解或被氧化以形成本发明的化合物的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的功能性配基上具有生物不稳定的保护基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。本发明化合物的前药形式可以具有抗病毒活性，可以被代谢以形成表现所述活性的化合物，或者两者兼具。

前药也包括已公开的核苷的氨基酸酯（见如欧洲专利说明书第99493号,其正文通过引用纳入本文，其描述了阿昔洛韦的氨基酸酯，特别是显示与阿昔洛韦自身相比的改进的水溶性的甘氨酸酯和丙氨酸酯，以及美国专利第4,957,924号（Beauchamp），其公开了以与α-碳原子相邻的侧链支化为特征的阿昔洛韦的缬氨酸酯，其显示了与丙氨酸酯和甘氨酸酯相比的口服施用后的改进的生物利用度）。用于制备这种氨基酸酯的方法在美国专利第4,957,924号（Beauchamp）中已公开，其正文通过引用纳入本文。作为缬氨酸自身使用的替代，可使用氨基酸的功能对等物（例如，酸性卤化物如酸性氯化物或酸酐）。在这种情况下，为了避免不良副反应，使用氨基保护的衍生物可能是有利的。

II.活性化合物

在一个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中R¹为OH或F，并且R⁴和R⁵独立地为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。衍生自脂肪醇的碳链通常具有8到34个碳原子，并且可包括0、1或多个双键。脂肪醇常常但不总是通过相应脂肪酸的还原获得。术语“脂肪酸基”在本文用于指仍然包含所述酸的羰基作为连接点的这些碳链。例如，，油醇为顺式-9-十八烯-1-醇，一种具有单一双键的18碳链。衍生自油醇的碳链（本文也称作“油烯基的碳链”）为顺式-9-十八烯。下面提供了用于R¹、R⁴和R⁵的代表值：

R¹	R⁴	R⁵
			OH	Me	Me

F	Me	Me
			OH	Et	Et
F	Et	Et
			OH	i-Pr	i-Pr
F	i-Pr	i-Pr
			OH	油烯基的碳链	油烯基的碳链
F	油烯基的碳链	油烯基的碳链

在另一个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中，R¹如权利要求1所定义，R⁶为碱金属或H，并且R⁷为衍生自脂肪醇的碳链。下面提供了用于R¹、R⁶和R⁷的代表值：

R¹	R⁶	R⁷(的碳链)
			OH	Na	亚油基
F	Na	亚油基
			OH	K	亚油基
F	K	亚油基
			OH	Na	油烯基
F	Na	油烯基
			OH	K	油烯基
F	K	油烯基
			OH	H	亚油基
F	H	亚油基
			OH	H	油烯基
F	H	油烯基

在另一个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中，R¹如权利要求1所定义，R⁸为-C(O)-C_8-34烷基或烯基，或为脂肪酸基。下面提供了用于R¹、R⁶和R⁷的代表值：

R¹	R⁸
		OH	亚油酸基
F	亚油酸基
		OH	油烯酸基
F	油烯酸基

在第四个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中，R¹如式1所定义，R⁹为O或NH，并且R¹⁰为C_11-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。下面提供了用于R¹、R⁹和R¹⁰的代表值：

R¹	R⁹	R¹⁰
			OH	O	Me
F	O	Me
			OH	NH	Me
F	NH	Me
			OH	O	Et
F	O	Et

OH	NH	Et
			F	NH	Et
OH	O	i-Pr
			F	O	i-Pr
OH	NH	i-Pr
			F	NH	i-Pr
OH	O	油烯基的碳链
			F	O	油烯基的碳链
OH	NH	油烯基的碳链
			F	NH	油烯基的碳链

在第五个实施方案中，所述化合物具有下式中的一种：：

其中，R¹如式1所定义，R¹¹为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。下面提供了用于R¹和R¹¹的代表值：

R¹	R¹¹
		OH	Me
F	Me
		OH	Et
F	Et
		OH	i-Pr
F	i-Pr
		OH	油烯基的碳链
F	油烯基的碳链

在第六个实施方案中，所述化合物具有下式中的一种：：

其中，R¹如式1所定义，并且R¹²和R¹³为O或NH。下面提供了用于R¹、R¹²和R¹³的代表值：

R¹	R¹²	R¹³
			OH	O	O
F	O	O
			OH	O	NH
F	O	NH
			OH	NH	NH
F	NH	NH

在第七个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中，R¹如式1所定义，R⁴为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链，并且R¹²为O或NH。下面提供了用于R¹、R⁴和R¹²的代表值：

R¹	R⁴	R¹²
			OH	Me	O
F	Me	O
			OH	Et	O
F	Et	O

OH	i-Pr	O
			F	i-Pr	O
OH	油烯基的碳链	O
			OH	Me	NH
F	Me	NH
			OH	Et	NH
F	Et	NH
			OH	i-Pr	NH
F	i-Pr	NH
			OH	油烯基的碳链	NH
F	油烯基的碳链	NH

在第八个实施方案中，所述化合物具有下式：

其中，

并且R¹、R¹¹、R⁷和R¹³如上文所定义。

还公开了基于4-（取代磺酰基）苯酚的离去基团制备单一或富集的磷中心非对映异构体的方法。其中，所述代表可在包含固定手性中心的生物系统中转化为单磷酸酯的一个或多个基团，并且G1为如甲基、三氟甲基、苯基等的基团。所述R_p/S_p混合物可通过色谱法或结晶分离。或者，所述R_p/S_p混合物可通过与4-(取代硫基)苯酚反应而分离，其中仅一个或者主要仅一个非对映异构体与所述4-(取代硫基)苯酚反应，允许通过色谱法或结晶分离。分离之后，硫醚到砜的氧化允许作为单磷酸酯前药形成试剂的使用。

还公开了基于4-(甲磺酰)苯酚的离去基团制备核苷的的单一或富集的磷中心非对映体的方法。所述方法包括：a)苯基二氯磷酸酯即F1与4-(甲磺酰)苯酚继而与丙氨酸乙酯反应产生大约1:1的R_p/S_p混合物形式的G1的反应；b)氧化为砜H1；c)H1R_p/S_p与4-(甲硫基)苯酚的反应，其中仅一种非对映体反应，使得可通过色谱法分离c)分离之后所述甲硫基J1被氧化为所述单一或富集的非对映体砜I1；d)所述单一或富集的非对映体砜I1与核苷的5’-OH反应使得可形成单一或富集的非对映体核苷J1；e)所述单一或富集的非对映体砜I1与4-(甲硫基)苯酚的反应使所述磷中心反转，形成包含与I1相反的磷立体化学的L1；f)L1到砜的氧化和与核苷的5’-OH的反应使得可形成具有与J1相反的磷立体化学的单一或富集的核苷前药非对映体。

在上文的实施方案中，在一些情况下，所述磷原子可以为手性的，本文称为“P*”或“P”，其表示并且其具有与用于这类分配的Cahn-Ingold-Prelog规则的公认含义一致的"R"或"S"的指代。由于磷中心处的手性这些实施方案可作为非对映体的混合物而存在。当手性存在于这些实施方案的磷中心处时，其可全部地或部分地为R_p或S_p或它们任意的混合物。

III.立体异构现象和多晶型现象

本文描述的化合物可具有不对称中心并且以外消旋物、外消旋混合物、单一非对映体或对映体的形式出现，所有的同分异构形式均被包括于本发明。具有手性中心的本发明的化合物可以以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可显示多晶型现象。本发明包含本发明化合物的外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式，或它们的混合物，其具有本文描述的有用的性能。所述光学活性形式可通过例如通过再结晶技术的外消旋形式的拆分、通过自光学活性起始材料的合成、通过手性合成或者通过使用手性固定相的色谱分离或者通过酶拆分来制备。本领域技术人员可纯化各种核苷，然后衍生所述核苷以形成本文所述的化合物，或者纯化核苷酸本身。

所述化合物的光学活性形式可使用本领域已知的任何方法制备，包括但不限于通过再结晶技术的外消旋形式的拆分、通过自光学活性起始材料的合成、通过手性合成、或者通过使用手性固定相的色谱分离。

获得光学活性材料的方法的实例至少包括以下：

i)晶体的物理分离：用以手工分离单一对映体的肉眼可见的晶体的技术。如果分离的对映体的晶体存在，即所述材料为聚结体，并且所述晶体在视觉上可区分，则可使用该技术；

ii)同时结晶：用以从外消旋物的溶液分别结晶单一对映体的技术，只有当外消旋物在固态时为聚结体方有可能；

iii)酶法拆分：用以凭借对映体与酶的反应的不同速率部分或完全地分离外消旋物的技术；

iv)酶法不对称合成：所述合成的至少一个步骤使用酶催化反应以获得所需对映体的对映体纯的或富集的合成前体的合成技术；

v)化学不对称合成：用以由非手性前体在生产不对称（即手性）产物的条件下合成所需对映体的合成技术，其可使用手性催化剂或手性助剂实现；

vi)非对映异构体分离：外消旋化合物与对映体纯的试剂（手性助剂）反应使单一对映体转换为非对映体的技术。然后所得非对映体借助它们现在更明显的结构差异通过色谱法或结晶分离并随后除去所述手性助剂获得所需对映体；

vii)一级和二级不对称转化：使来自外消旋物的非对映体平衡以在来自所需对映体的非对映体的溶液中产生优势或者来自所需对映体的非对映体的优先结晶扰乱所述平衡以致最后基本上所有材料均被转化为来自所需对映体的结晶非对映体的技术。然后所需对映体从所述非对映体释放；

viii)动力学拆分：该技术指的是在动力学条件下借助对映体与手性、非外消旋试剂或催化剂的不等的反应速率而实现外消旋物的部分或完全拆分（或者部分拆分的化合物的进一步拆分）；

ix)从非外消旋前体的光学异构特异性合成：所需对映体从非手性起始材料获得并且立体化学完整性在合成过程中不受到损害或仅仅是最低程度地受到损害的合成技术；

x)手性液相色谱法：用以使外消旋物的对映体凭借它们与固定相不同的相互作用在液体流动相中被分离的技术（包括但不限于通过手性HPLC）。所述固定相可由手性材料制成或者所述流动相可包含另外的手性材料以引起所述不同的相互作用；

xi)手性气相色谱法：用以使所述外消旋物挥发以及使对映体凭借它们在气体流动相中与包含固定非外消旋手性吸附相的柱子的不同的相互作用而分离的技术；

xii)用手性溶剂萃取：用以使对映体凭借一种对映体优先溶解于特定的手性溶剂而分离的技术；

xiii)跨手性膜转运：用以使外消旋物与薄膜屏障接触的技术。所述屏障通常分离两种能混溶的流体（其中一种包含所述外消旋物），并且驱动力如浓度或压力差异引起跨越所述膜屏障的优先转运。由于所述膜仅允许所述外消旋物的一种对映体通过的非外消旋手性性质，所以发生了分离。

手性色谱法，包括但不限于模拟移动床色谱法，用于一个实施方案中。多种手性固定相有市售。

IV.核苷酸盐或前药制剂

在化合物具有足够碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱的盐的情况下，以药学上可接受的盐的形式施用所述化合物可能是合适的。药学上可接受的盐的实例为与可形成生理上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可以形成合适的无机盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

药学上可接受的盐可使用本领域所熟知的标准方法获得，例如通过使具有足够碱性的化合物如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应。也可以制备羧酸的碱金属（如钠、钾或锂）或碱土金属（如钙）的盐。

可施用本文描述的核苷酸前药以另外地增加活性、生物利用度、稳定性或以其它方式改变所述核苷酸单磷酸酯的性能。

许多核苷酸前药配体是已知的。通常，核苷的单磷酸酯或其它类似物的烷基化、酰化或其它亲脂性修饰会增加所述核苷的稳定性。

可取代所述单磷酸酯配基上的一个或多个氢的取代基的实例为烷基、芳基、类固醇、碳水化合物（包括但不限于糖类、1,2-甘油二酯和醇类）。许多在R.Jones&N.Bischofberger,Antiviral Research,1995,27,1-17and S.J.Hecker&M.D.Erion,J.Med.Chem.,2008,51,2328-2345.中有描述。这些中的任一种可以与已公开的核苷酸联合使用以达到所需效果。

所述活性核苷酸也可作为如通过引用纳入本文的下列参考文献所公开的5’-磷酸醚类脂（5’-phosphoether lipid）提供：Kucera,L.S.,N.Iyer,E.Leake,A.Raben,Modest E.K.,D.L.W.,and C.Piantadosi,“Novel membrane-interactive ether lipidanalogs that inhibit infectious HIV-1production and induce defective virusformation,”AIDS Res.Hum.Retroviruses,1990,6,491-501;Piantadosi,C.,J.Marasco C.J.,S.L.Morris-Natschke,K.L.Meyer,F.Gumus,J.R.Surles,K.S.Ishaq,L.S.Kucera,N.Iyer,C.A.Wallen,S.Piantadosi,and E.J.Modest,“Synthesis andevaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity,”J.Med.Chem.,1991,34,1408-14;Hosteller,K.Y.,D.D.Richman,D.A.Carson,L.M.Stuhmiller,G.M.T.van Wijk,and H.van den Bosch,“Greatly enhanced inhibition ofhuman immunodeficiency virus type1replication in CEM and HT4-6C cells by3’-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol,a lipid prodrug of3,-deoxythymidine,”Antimicrob.Agents Chemother.,1992,36,2025-29;Hostetler,K.Y.,L.M.Stuhmiller,H.B.Lenting,H.van den Bosch,and D.D.Richman,“Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine andother antiviral nucleosides.”J.Biol.Chem.,1990,265,61127。

公开了可共价掺入所述核苷（优选在本文描述的核苷酸的R²和/或R³位点）的合适的亲脂性取代基，或者亲脂性制剂的美国专利的非限制性实例包括美国专利第5,149,794号（Yatvin等人）；第5,194,654号（Hostetler等人）；第5,223,263号(Hostetler等人)；第5,256,641号(Yatvin等人)；第5,411,947号(Hostetler等人)；第5,463,092号(Hostetler等人)；第5,543,389号(Yatvin等人)；第5,543,390号(Yatvin等人)；第5,543,391号(Yatvin等人)和第5,554,728号(Basava等人)，其全部通过引用纳入本文。公开可连接到本发明的核苷的亲脂性取代基，或者亲脂性制剂的外国专利申请包括WO89/02733、WO90/00555、WO91/16920、WO91/18914、WO93/00910、WO94/26273、WO96/15132、EP0350287、EP93917054.4和WO91/19721。

V.治疗方法

被HCV、诺如病毒、札幌病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒和/或黄热病以及杯状病毒科或黄病毒科分类家族的其它病毒或其基因片段感染的宿主，包括但不限于人类，可通过给患者在药学上可接受的载体或稀释剂的存在下施用有效量的所述活性化合物或者其药学上可接受的前药或盐来治疗。所述活性物质可以以液体或固体形式通过任何合适的途径例如口服、肠道外、静脉、皮内、皮下或者局部施用。

在用于治疗病毒感染的治疗用途中，所述化合物和/或组合物可以以对于实现治疗益处适当的剂量水平施用给被诊断为所述病毒感染的患者。所述“治疗益处”和语法上的等同物是指化合物的施用经过一段时间后在患者中引起有益效果。例如，当患者中的病毒滴度或者病毒载量降低或者停止增加时，可实现治疗益处。

如果化合物的施用减慢或者完全终止了通常伴随病毒感染的不利症状的起始，那么不管患者中的病毒滴度或者病毒载量，同样可实现治疗益处。本文描述的化合物和/或组合物也可在处于形成病毒感染危险中或者已经接触病毒的患者中预防性地施用以预防所述病毒感染的形成。例如，所述化合物和/或其组合物可施用给可能已经接触过所述病毒的患者。

VI.联合或交替治疗

在一个实施方案中，本发明的化合物可连同选自进入抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和基于免疫的治疗剂的至少一种其它抗病毒剂一起使用。

例如，当用于治疗或预防HCV感染时，所述活性化合物或其前药或药学上可接受的盐可与另一种抗HCV剂（包括但不限于上式的那些）联合或交替施用。通常，在联合治疗中，有效剂量的两种或更多剂被一起施用，然而在交替治疗期间，有效剂量的每种剂被连续施用。所述剂量将取决于药物的吸收、失活和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。应当注意，剂量值还会随着要缓解的病况的严重程度而变。还应当理解，对于任何特定受试者，具体的给药方案和时间表应当根据个体需要以及施用或监督施用所述组合物的人的专业判断而随时间调整。

可与本文公开的化合物联合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括下表1中的那些。

表1：目前临床开发中的抗丙型肝炎化合物

VIII.用于治疗诺如病毒感染的联合治疗

除了本文描述的抗病毒化合物外，也可存在其它化合物。例如，已知I型干扰素（IFN）抑制诺如病毒复制。某些维生素，尤其是维生素C，被认为在治疗某些病毒性感染中有效。一项研究表明，补充维生素A减少诺如病毒GII感染的患病率，增加诺如病毒GI和GII脱落的长度，并降低NoV相关腹泻的发病率(1:J Infect Dis.2007Oct1;196(7):978-85.Epub2007Aug22)。赖氨酸被认为是抗病毒剂。也有人认为，衍生自基因型II（GII）诺如病毒的病毒样颗粒（VLPs）结合于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖和其它带负电的葡糖氨基葡聚糖。为了治疗感染症状，医生也可施用止吐药、止泻剂和/或止痛剂。

VIII.药物组合物

被黄病毒科家族病毒或杯状病毒科病毒或它们的基因片段感染的宿主，包括但不限于人类，可通过在药学上可接受的载体或稀释剂的存在下给所述患者施用有效量的活性化合物或者其药学上可接受的前药或盐来治疗。所述活性材料可以以液体或固体形式通过任何合适的途径例如口服、肠道外、静脉、皮内、皮下或者局部施用。

所述化合物的优选剂量将为每天以接受者体重计约0.1到约100mg/kg之间，更普遍地，约1到50mg/kg之间，以及优选地，约1到约20mg/kg之间的范围。药学上可接受的盐和前药的有效剂量范围可以以要递送的母体核苷的重量计算。如果所述盐或前药以其自身显示活性，那么有效剂量可使用所述盐或前药的重量如上文进行估算，或者通过本领域技术人员已知的其它手段估算。

所述化合物可以以任何合适的剂型单位方便地施用，包括但不限于每单位剂型含7到3000mg，优选70到1400mg活性成分的剂量形式。50-1000mg的口服剂量通常是方便的。

理想地，应当施用活性成分以达到从约0.2到70μM，优选约1.0到15μM的活性化合物的血浆峰浓度。例如，这可通过静脉注射活性成分的0.1%到5%溶液（可选地在生理盐水中）实现，或者作为所述活性成分的大丸剂施用。

活性化合物在药物组合物中的浓度将取决于该药物的吸收、失活和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。应当注意，剂量值还将随着要缓解的病况的严重程度而变。还应当理解，对于任何特定受试者，具体的给药方案应当根据个体需要以及施用或监督施用组合物的人的专业判断而随时间调整，并且本文所提到的浓度范围仅为示例性的，无意用来限制要求保护的组合物的范围或实施。所述活性成分可一次施用，或者可被分为几个较小的剂量以不固定的时间间隔施用。

所述活性化合物的优选的施用方式为口服。口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食性载体。它们可被包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用，所述活性化合物可与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为所述组合物的部分。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含下述的任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助滑剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者增味剂如薄荷、水杨酸甲酯或桔子调味品。当剂量单位形式为胶囊时，除了以上类型的材料外，还可包含液体载体如脂肪油。另外，单位剂量形式可包含改变剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖、虫胶或其它肠溶剂的包衣。

所述化合物可作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄膜剂、口香糖等的组分施用。除了所述活性化合物外，糖浆剂可包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、颜料和着色剂以及调味剂。

所述化合物或其药学上可接受的前药或盐也可以与不损害所需作用的其它活性材料混合，或与增强所需作用的材料混合，例如抗生素、抗真菌药、抗炎药或其它抗病毒药，包括但不限于其它核苷化合物。用于肠道外、皮内、皮下或局部用药的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂如氯化钠或葡萄糖。肠道外制剂可被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

如果静脉内施用，那么优选的载体为生理盐水或磷酸盐缓冲液盐水（PBS）。

在优选的实施方案中，所述活性化合物以会保护该化合物不从体内迅速排出的载体配制，如控释制剂，包括但不限于埋植剂和微胶囊化传送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。例如，肠溶衣包被的化合物可用于保护通过胃酸的裂解。制备这类制剂的方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。合适的材料也可商业上获得。

脂质体悬浮液（包括但不限于靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体）也优选作为药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利第4,522,811号（通过引用纳入本文）中描述的。例如，脂质体制剂可通过将合适的脂质（如硬酯酰磷脂酰乙醇胺、硬酯酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇）溶解在无机溶剂中，随后将其蒸发，在容器的表面上留下干燥脂质的薄膜。然后将所述活性化合物或其单磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液引入所述容器中。然后将所述容器手动旋转以使脂质材料从容器的边释放并分散脂质聚合物，从而形成脂质体混悬液。

在描述本发明中使用的术语对本领域技术人员而言是常用的和已知的。如本文所使用的，以下缩写具有所指出的含义：

aq 水的

CDI 羰二咪唑

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

EtOAc 乙酸乙酯

h 小时/小时（hour/hours）

HOBt N-羟基苯并三唑

M 摩尔

min 分钟

rt或RT 室温

TBAT 四丁基铵二氟三苯基硅酸盐

TBTU O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸

THF 四氢呋喃

IX.制备活性化合物的一般方案

还提供了容易地制备2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药的方法。本文公开的所述2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药可按下面具体描述的制备，或者通过本领域技术人员已知的其它方法制备。本领域的普通技术人员应当理解，这些方案绝非限制性的并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行细节的变化。

通常，作为本文描述的单磷酸酯前药，式A和B的核苷单磷酸酯前药通过首先制备相应的核苷，然后封端5’-羟基（和3’-羟基）来制备，其可容易地在体内转化为单磷酸酯并最终转化为活性的三磷酸酯形式。

各种反应方案总结如下。

方案1为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是核苷1的合成方法。

方案2为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是核苷1的备选合成方法。

方案3为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药I的合成方法。

方案4为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药II的合成方法。

方案5为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药III的合成方法。

方案6为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药IV-VI的合成方法。

方案7为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药VII的合成方法。

方案8为本发明活性化合物合成的非限制性实例，尤其是单磷酸酯前药VIII-IX的合成方法。

方案9为1'-α-甲磺酸，16的合成路径的非限制性实例。

方案10为1'-α-甲磺酸，16的备选合成路径的非限制性实例。

式A和B的化合物的制备采用(a)Rajagopalan,P.;Boudinot,F.D;Chu,C.K.;Tennant,B.C.;Baldwin,B.H.;Antiviral Nucleosides:Chiral Synthesis andChemotheraphy:Chu,C.K.;Eds.Elsevier:2003.b)Recent Advances in Nucleosides:Chemistry and Chemotherapy:Chu,C.K.;Eds.Elsevier:2002.c)Frontiers inNucleosides&Nucleic Acids,2004,Eds.R.F.Schinazi&D.C.Liotta,IHL Press,Tucker,GA,USA,pp:319-37d)Handbook of Nucleoside Synthesis:Vorbruggen H.&Ruh-Pohlenz C.John Wiley&sons2001)中概述的方法以及采用一般方案1-2通过首先制备核苷1来完成，制备核苷1可由本领域的普通技术人员完成。具体地，核苷1可通过在路易斯酸如TMSOTf的存在下偶联糖2与受保护的甲烷硅基化的或游离的嘌呤碱基来制备。3’和5’羟基的脱保护得到核苷1。

方案1核苷1的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤（如2-NH₂，6-Cl嘌呤）；R¹为如活性化合物部分中所定义的）

作为选择，核苷1可由1’-卤代、1’-磺酸基或1’-羟基化合物3来制备。对于1’-卤代或1’-磺酸基的情况，受保护的或游离的嘌呤碱基在碱如三乙基胺或氢化钠的存在下随后脱保护将得到核苷1。对于1’-羟基的情况，受保护的或游离的嘌呤碱基在Mitsunobu偶联剂如偶氮二异丁腈的存在下随后脱保护会得到核苷1。

方案2核苷1的备选合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤（如2-NH₂，6-Cl嘌呤）；R¹为如活性化合物部分中所定义的）

单磷酸酯前药I可如方案3所概述的从苯酚4开始制备。将4暴露于三氯氧磷或三氯硫磷（phosphorothioyl trichloride）提供5，其随后能够与氨基酯6反应得到磷酰胺酯7。然后核苷1可通过5’-羟基与氯代磷酰氨基丙酸（chlorophosphorylamino propanoate），7反应转化为单磷酸酯类似物8。从8的碱基和/或糖去除保护基团（如果存在的话），提供了单磷酸酯前药I。

方案3单磷酸酯前药I的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y、R¹⁶、R¹⁷和R¹⁸为如活性化合物部分中所定义的）单磷酸酯前药II可通过苯酚4与三氯氧磷或三氯硫磷反应以提供二苯基磷酰氯，9来制备（方案4）。然后核苷1可通过5’-羟基与二苯基磷酰氯，9反应转化为中间体单磷酸酯类似物。去除保护性基团（如有必要）提供单磷酸酯前药II。

方案4单磷酸酯前药II的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y、R¹⁶和R¹⁷为如活性化合物部分中所定义的）单磷酸酯前药III可通过核苷1与三氯氧磷或三氯硫磷反应而制备。然后，所产生的中间体可与L-氨基酯反应随后与水反应（方案5）。去除保护性基团（如有必要）提供单磷酸酯前药III。

方案5单磷酸酯前药III的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y、R¹⁷和R¹⁸为如活性化合物部分中所定义的）单磷酸酯前药IV可通过核苷1与三氯氧磷或三氯硫磷反应而制备。然后所产生的中间体与L-氨基酸的酯反应随后与11反应（方案6）。去除保护性基团（如有必要）提供单磷酸酯前药IV。利用相似的试验方案与由R¹⁵OH或11代替10，也可以制备单磷酸酯前药V和VI。

方案6单磷酸酯前药IV-VI的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y、R¹⁷、R¹⁸和R²⁰为如活性化合物部分中所定义的）

环状磷酸、磷酰胺酯或磷酰二胺酯前药IV可通过核苷1与三氯氧磷或三氯硫磷反应而制备。然后所产生的中间体可与双亲核试剂12反应（方案7）。去除保护性基团（如有必要）提供单磷酸酯前药VII。

方案7单磷酸酯前药VII的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y和R²⁰为如活性化合物部分中所定义的）3’,5’-环状磷酸前药VIII可通过三氯氧磷或三氯硫磷与含OH或NH的试剂如苯酚4反应而制备。所得中间体15可被纯化或直接用于与核苷1反应（方案8）。去除保护性基团（如有必要）提供单磷酸酯前药VIII。相关的3’,5’-环状磷酸前药IX可以以类似的方式从10、11、13或14制得。3’,5’-环状磷酸前药VIII-IX也可通过包括磷（III）中间体与1反应随后氧化为磷酸（V）的已知方法制备（方案8）。

方案8单磷酸酯前药VIII-IX的合成方法。（碱基为2,6-二氨基嘌呤或可转化为2,6-二氨基嘌呤的碱基；R¹、Y、R¹⁴、R¹⁷、R¹⁸和R²⁰为如活性化合物部分中所定义的）

对于X=磺酸基（方案2）的化合物3的情况，例如16（方案9），其可用磺酸由15在偶联条件下制备。例如，偶联条件如偶氮羧酸盐与磷（III）试剂的Mitsunobu偶联可提供16。化合物15在磺酸或磺酸盐的存在下可用在溶剂如二氧六环或甲苯中的偶氮二异丁腈和三苯基膦偶联到15。

方案91'-α-甲磺酸,16的合成途径

此外，磺酸酯16可通过首先借助（方案9）偶联条件如用羧酸或羧酸盐、偶氮羧酸盐和磷（III）试剂的Mitsunobu偶联来反转15的羟基而提供17来制备。化合物17可在醋酸或醋酸盐的存在下用在溶剂如二氧六环或甲苯中的偶氮二异丁腈和三苯基膦偶联到15。17的醋酸基的选择性去除可在醇系溶剂例如甲醇中用碱如碳酸钾进行，以提供1’-反转的醇18。16到18的转化可在碱如三乙胺或二异丙基乙胺的存在下在溶剂如二氯甲烷或二氯乙烷中用磺酰氯或酸酐进行。

方案101'-α-甲磺酸,16的备选合成途径

在某些情况下，磷原子可为手性的，本文称为“P*”或“P”，其表示并且它具有与用于这类分配的Cahn-Ingold-Prelog规则的公认含义一致的"R"或"S"的指代。由于磷中心的手性，式A和B的前药可以非对映体的混合物存在。当手性存在于磷中心处时，其可全部地或部分地为R_p或S_p或它们任意的混合物。

在另外的实施方案中，本发明涉及制备醇的含磷类似物的方法，其中磷氧键通过与具有1°、2°或3°醇或者1°、2°或3°醇盐的通式G或H的试剂反应而形成。

其中：

式G或H的磷中心处的手性可全部或部分为R_p或S_p或它们任意的混合物，Y、R²和R³如上文所定义的，以及

R²²独立地为H、C_1-20烷基、CF₃、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基、或者被低级烷基、烷氧基、二（低级烷基）-氨基、氯、氟、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基。

在该实施方案中，所述醇类不限于本文描述的嘌呤核苷，而是可以是任意的醇类，包括但不限于具有任意包括任意5’-OH配基的糖的核苷上的所述5’-OH配基。使用该方法形成的化合物可以是任意所需磷酸酯。

在该实施方案的一个方面，当式G或H的R²和/或R³含有手性中心时，所述方法还包括通过结晶所述G或H的非对映的混合物分离所述磷非对映体的步骤。当式G或H的R²和/或R³含有手性中心时，所述方法还可包括通过使式I化合物与式G或H的非对映体混合物反应而分离所述磷非对映体的步骤，

其中，R²²如上文所定义，并且

R²³选自H、Li、Na、K、NH₄和与Ca或Mg的二盐。

当式G或H的R²和/或R³含有手性中心时，所述方法还可包括通过使式I化合物与式G或H的单一或富集的非对映体反应而使磷的立构中心反转的步骤。

其中，R²²如上文所定义，以及

R²³选自H、Li、Na、K、NH₄和与Ca或Mg的二盐。

本发明在以下展示合成2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷和前药的制备方法的实施例1-8中和展示用于2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷、核苷酸和核苷酸类似物的生物评价的方法的实施例9-31中得到了进一步的阐释。本领域的普通技术人员将理解，这些实施例不以任何方式进行限制并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行细节的变化。

具体实施例

代表本发明的具体化合物按照以下实施例和反应顺序制备；描述所述反应顺序的实施例和图表以实例说明的方式提供以帮助理解本发明并不应被解释为以任何方式限制其后所附的权利要求书所阐述的本发明。当前的化合物也可用作随后的实施例的中间体以产生本发明的另外的化合物。没有试图一定优化任何反应所获得的收率（yields）。本领域技术人员将知道如何通过反应时间、温度、溶剂和/或试剂的常规变化来增加该收率。

无水溶剂购自Aldrich Chemical Company,Inc.(Milwaukee)。试剂购自商业来源。除非另有说明，实施例中使用的材料从容易得到的商业供应商获得或通过化学合成领域的技术人员所熟知的标准方法合成而得。熔点（mp）在数字电热熔点仪上测定并且未被校正。¹H和¹³C NMR谱在室温下在Varian Unity Plus400光谱仪上测定并以内部四甲基硅烷低场ppm报道。进行氘交换、去耦实验或2D-COSY以确认质子分布。信号多重性通过s(单重峰)、d(双重峰)、dd(双重峰的双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、br(宽峰)、bs(宽单峰)、m(多重峰)表示。所有J-值以Hz计。质谱在Micromass Platform LC光谱仪上使用电喷射技术进行测定。元素分析通过Atlantic Microlab Inc.(Norcross，GA)进行。分析TLC在Whatman LK6F硅胶板上进行，并且制备TLC在Whatman PK5F硅胶板上进行。柱色谱在Silica Gel上或经由反相高效液相色谱进行。

实施例1：2,6-二氨基2’-C-甲基单磷酸酯前药8a和8b的合成

(2R,3R,4R,5R)-5-((苯甲酸基)甲基)-2-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-甲基四氢呋喃-3,4-二基二苯钾酸酯3

向在-78℃的(3R,4S,5R)-5-((苯甲酸基)甲基)-3-甲基四氢呋喃-2,3,4-三基三苯钾酸酯1(2.9g,5mmol)和2,6-二氨基嘌呤2(830mg,5.5mmol)在无水乙腈中的搅拌悬浮液中加入DBU(2.3mL,15.0mmol)，然后缓慢加入TMSOTf(3.8mL,20.0mmol)。反应混合物在-78℃搅拌20分钟，然后升高到0℃。在0℃搅拌30min后，反应混合物逐渐加热到65℃，并搅拌过夜。将反应混合物用CH₂Cl₂(200mL)稀释并用饱和NaHCO₃洗涤。分离各层并将所得水层用CH₂Cl₂(2x20mL)萃取。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥。去除溶剂后，通过硅胶柱色谱(EtOAc中0%到10%的MeOH)纯化残余物。获得2.8g的化合物3（收率92%）。C₃₂H₂₈N₆O₇的LC/MS计算值为608.2，实测值：609.2(M+1)。

(2R,3R,4R,5R)-5-((苯甲酸基)甲基)-2-(2,6-双(双(二碳酸二叔丁酯)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-甲基四氢呋喃-3,4-二基二苯钾酸酯4

将3(1.4g,2.3mmol)、Boc酸酐(3.0g,13.8mmol)和DMAP(56mg,0.46mmol)在THF(12mL)中的溶液室温搅拌30h。反应完成后，所述溶剂在减压下去除并通过快速柱色谱（己烷中0%到40%的EtOAc）纯化残余物。获得2.1g的白色固体4（收率90%）。

二叔丁基(9-((2R,3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-2,6-二基)双(二碳酸二叔丁酯氨基甲酸酯)5

室温下向4(1.7g,1.68mmol)在无水甲醇(50mL)的溶液中加入甲氧基钠的溶液(4.37M,0.3mL,1.3mmol)30分钟（通过TLC和LC-MS监测）。反应完成后，分批加入Dowex树脂(H⁺型)以调节pH值到7.0。将树脂过滤并用甲醇洗涤，将滤液浓缩并通过快速柱色谱（CH₂Cl₂中0%到10%的MeOH）纯化残余物以提供1.08g的白色固体5（收率92%）。¹H-NMR(CD₃OD):0.92(s,3H,CH₃),1.40(s,18H,6x CH₃),1.41(s,18H,6x CH₃),3.89(dd,1H,J=2.8Hz,J=12.4Hz),4.03-4.11(m,2H),4.22(d,1H,J=8.8Hz,H₃’),6.19(s,1H,H₁’),9.09(s,1H,H₈);¹³C-NMR(CD₃OD):20.2,27.9,28.1,60.9,73.1,80.2,84.6,84.9,85.4,93.3,128.8,147.0,151.2,151.9,152.0,152.9,155.0;C₃₁H₄₈N₆O₁₂的LC/MS计算值为696.3,实测值:697.4(M+1)。

(2S)-乙基2-((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基

四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰氨基)丙酸酯8a

向在0℃的5(780mg,1.12mmol)和N-甲基咪唑(0.45mL,5.8mmol)在THF(5mL)中的溶液中逐滴加入(2S)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰氨基)丙酸酯¹(5.8mL,5.8mmol)。所得混合物室温搅拌过夜。在减压下去除所述溶剂后，残余物通过快速柱色谱(CH₂Cl₂中0%到10%的MeOH)纯化以提供576mg作为白色固体的7a（收率54%）。将预冷的(<10℃)TFA溶液(80%,23mL)加入冰浴中预冷的(～5℃)7a中(550mg,0.58mmol)。将溶液从冰浴温度搅拌至室温，然后在室温搅拌4h（通过TLC和LC/MS监测）。反应完成后，在减压下去除溶剂并将残余物与甲醇（4x15mL）共蒸发。将残余物溶解在甲醇(20mL)中并用饱和NaHCO₃中和。在去除溶剂后，残余物通过快速柱色谱(CH₂Cl₂中0%到15%的MeOH)纯化以提供225mg的作为白色固体的8a（71%）（两步收率38.3%）。¹H-NMR(CD₃OD)(1:1磷非对映体的混合物):0.94(s,3H,CH3),0.97(s,3H,CH₃),1.13-1.19(m,6H,2x CH₃),1.16-1.31(m,6H,2x CH₃),3.90-4.58(m,14H),5.93(s,1H,H₁’),5.96(s,1H,H₁’),7.14-7.34(m,10H,Ar-H),7.86(s,2H,H₈);³¹PNMR(CD₃OD):4.77,4.89;C₂₂H₃₀N₇O₈P的LC/MS计算值：551.1,实测值:552.3(M+1)。

Ethyl3-(2-(((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)苯基)丙酸酯8b

使用类似的步骤以合成前药8b。从210mg5获得8b(110mg)，两步收率56%。8b-up Major（首先洗脱“up”）：旋光度[α]²⁴ _D-7.08(c0.24,MeOH);¹H-NMR(CD₃OD)0.97(s,3H,CH₃),1.15-1.20(m,6H,2x CH₃),1.34(d,3H,J=7.2Hz,CH₃),2.62(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),2.99(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),3.95-4.58(m,9H),5.94(s,1H,H₁’),7.07-7.38(m,4H,Ar-H),7.86(s,1H,H₈);³¹PNMR(CD₃OD):5.03;LC/MS calcd.for C₂₇H₃₈N₇O₁₀P651.2,observed:552.2(M+1).8b-down Minor(最后洗脱“down”):旋光度[α]²⁴ _D+12.12(c0.13,MeOH);¹H-NMR(CD₃OD):0.97(s,3H,CH₃),1.15-1.17(m,6H,2x CH₃),1.34(d,3H,J=7.2Hz,CH₃),2.62(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),2.99(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),3.96-4.51(m,9H),5.91(s,1H,H₁’),7.10-7.39(m,4H,Ar-H),7.86(s,1H,H₈);³¹PNMR(CD₃OD):4.98;C₂₇H₃₈N₇O₁₀P的LC/MS计算值为651.2,实测值:652.3(M+1)。

参考文献:

1.(a)Perrone,P.;Daverio,F.;Valente,R.;Rajyaguru,S.;Martin J.A.;

V.;Pogam,S.L.;Najera,I.;Klumpp,K.;Smith,D.;B.and McGuigan,C.First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a4’-Substituted PurineNucleoside(4’-Azidoadenosine):Conversion of an Inactive Nucleoside to aSubmicromolar Compound versus Hepatitis C Virus.J.Med.Chem.2007,50,5463-5470.(b)Uchiyama,M.;Aso,Y.;Noyori,R.;Hayakawa,Y.O-Selectivephosphorylation of nucleosides without N-protection.J.Org.Chem.1993,58,373-379.

实施例2:2,6-二氨基嘌呤2’-C-甲基单磷酸酯前药11的合成。

乙基3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(2-(3-乙氧基-3-氧丙基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,11.

向0℃的5(630mg,0.91mmol)和N-甲基咪唑(0.35mL,4.5mmol)在THF(3mL)中的溶液中逐滴加入二乙基3,3'-(((氯代磷酰基)双(氧基))双(2,1-亚苯基))二丙酸酯9在THF(9mL,4.5mmol)的溶液。所得混合物室温搅拌过夜。减压下去除溶剂后，残余物通过以MeOH的梯度(CH₂Cl₂中0%到10%的MeOH)的快速柱色谱纯化以提供540mg的白色固体10（收率53%）。将预冷的（<10℃）TFA溶液(80%,26mL)加入冰浴中预冷的(～5℃)10(540mg,,0.58mmol)。将溶液从0℃搅拌至室温，然后在室温下搅拌4h(通过TLC和LC/MS监测)。反应完成后，在减压下去除溶剂并将残余物与甲醇（4x15mL）共蒸发。将残余物溶解在甲醇(20mL)中并用饱和NaHCO₃中和。在去除溶剂后，残余物通过快速柱色谱(CH₂Cl₂中0%到15%的MeOH)纯化以提供270mg的作为白色固体的11（77%）。C₂₂H₃₀N₇O₈P的LC/MS计算值为728.2,实测值:729.3(M+1).

实施例3：2,6-二氨基嘌呤2’-C-甲基单磷酸酯前药的备选合成。

(2S)-乙基2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰氨基)丙酸酯(8a)

向在0℃的12(30mg,0.1mmol)在THF(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入(2R)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰氨基)丙酸酯¹(0.4mL，，0.4mmol)，然后分批加入t-BuMgCl(0.4mL,0.4mmol)。搅拌几分钟后，反应升温至室温并在室温下搅拌过夜。反应混合物用饱和氯化铵（aq）中和，然后通过快速柱色谱(CH₂Cl₂中10%到20%的MeOH)纯化产生8a(1mg,1.8%)。

C₂₂H₃₀N₇O₈P的LC/MS计算值为551.1,实测值:552.1(M+1).

参考文献:

1.(a)Perrone,P.;Daverio,F.;Valente,R.;Rajyaguru,S.;Martin J.A.;

,V.;Pogam,S.L.;Najera,I.;Klumpp,K.;Smith,D.;B.and McGuigan,C.First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a4’-Substituted PurineNucleoside(4’-Azidoadenosine):Conversion of an Inactive Nucleoside to aSubmicromolar Compound versus Hepatitis C Virus.J.Med.Chem.2007,50,5463-5470.(b)Uchiyama,M.;Aso,Y.;Noyori,R.;Hayakawa,Y.O-Selectivephosphorylation of nucleosides without N-protection.J.Org.Chem.1993,58,373-379.

实施例4:17a和17b的合成;用于单磷酸酯前药合成的单一非对映体。

乙基3-(2-羟苯基)丙酸酯,14

在0℃在N₂气氛下，向二氢香豆素13(13g,87.74mmol)在500ml无水乙醇中的溶液中加入催化浓度的H₂SO₄(0.10mL)。去除冷水浴并将反应物朝着室温搅拌12h。在0℃将溶液用固体NaHCO₃处理至pH=6.0-6.5并过滤所得悬浮液。将滤液在减压下浓缩并在硅胶柱上纯化以产生黄色油状化合物14(16.2g,83.4mmol)，收率95%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35(s,1H),7.13-7.07(m,2H),6.89-6.84(m,2H),4.14(q,J=6.8Hz,2H),2.90(m,2H),2.72(m,2H),1.23(t,J=6.8Hz,3H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ175.89,154.50,130.74,128.15,127.52,120.93,117.33,61.51,35.39,24.84,14.25;MS-ESI⁺m/z195(M+H⁺)

乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲硫基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,16a和16b:R_p和S_p的混合物(～1:1)

在-78℃在N₂气氛下，向14(15.5g,79.7mmol)在300ml无水乙醚中的溶液中加入三氯氧化磷(12.2g,79.7mmol)和三乙胺(8.5g,83.7mmol)。在-78℃、N₂气氛下搅拌1h后，将溶液朝着室温再搅拌12h然后在N₂气氛下通过过滤去除固体。将滤液在减压下浓缩并在高度真空下室温干燥6h。在-78℃在N₂气氛下，向所得粘性油在300ml无水CH₂Cl₂中的溶液中加入4-甲硫基苯酚(11.1g,79.0mmol)和Et₃N(8.0g,79.0mmol)超过20min。然后在N₂气氛下将所得溶液在-78℃搅拌1h，再在0℃搅拌6h。在-78℃在N₂气氛下，向溶液中加入L-丙氨酸乙酯盐酸盐(12.2g,79.0mmol)在200ml无水CH₂Cl₂和Et₃N(16.2g,160mmol)中的溶液超过20min。将溶液室温搅拌12h并过滤固体。将滤液在减压下浓缩并在硅胶柱(hexane:EtOAc=3:1to1:1v/v)上纯化以产生化合物16(33.5g,67.7mmol)，两步收率为85%。通过¹H-和³¹P-NMR谱，R_p和S_p混合物的比例为1:1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.43(d,J=8.0Hz,1H),7.22-7.15(m,6H),7.15-7.07(m,1H),4.17-3.90(m,6H),2.93(q,J=8.4Hz,2H),2.58(m,2H),2.45(s,3H),1.39(t,J=6.4Hz,3H),1.27-1.21(m,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.28,-2.29;MS-ESI⁺m/z496(M+H⁺)

乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲磺酰基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,17a,17b:R_p和S_p的混合物(～1:1)

在0℃、在N₂气氛下，向16(11.7g,23.6mmol)在200ml无水CH₂Cl₂中的溶液中加入3-氯过氧苯甲酸(77%maximum,12.3g,53.2mmol)。室温搅拌12h后，将溶剂在减压下去除以及将残余物溶解在200ml乙酸乙酯中并用冷的饱和NaHCO₃溶液(50mL x2)、冷水(100mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥、过滤以及在硅胶柱(hexane:EtOAc=3:1to1:2v/v)上纯化以产生作为两种非对映体的混合物(R_p:S_p～1:1，通过¹H-和³¹P-NMR谱)的化合物17(11.7g,22.2mmol)，收率94%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.92(m,2H),7.48-7.43(m,3H),7.24-7.18(m,2H),7.14-7.10(m,1H),4.53(m,1H),4.19-4.09(m,5H),3.05(m,3H),2.96-2.91(m,2H),2.61-2.56(m,2H),17a:1.43(d,J=6.8Hz,1.5H),17b:1.40(d,J=6.8Hz,1.5H),1.26-1.21(m,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.50,-2.55;MS-ESI⁺m/z528(M+H⁺)

乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲硫基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,16a和16b

在0℃、在N₂气氛下，向化合物17a和17b(0.11g,0.21mmol)在8.0mL无水CH₂Cl₂中的溶液中加入4-甲硫基苯酚(0.015g,0.11mmol)和Et₃N(0.01g,0.12mmol)。室温搅拌48h后，将溶液浓缩并在硅胶(hexane:EtOAc=3:1to1:1v/v)上纯化以产生通过¹H NMR谱的1:2的比例的16a和16b，收率19%(0.02g,0.04mmol)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(d,J=8.0Hz,1H),7.23-7.15(m,6H),7.11-7.07(m,1H),4.18-4.09(m,5H),3.91-3.83(m,1H),2.92(q,J=8.0Hz,2H),2.58-2.53(m,2H),2.46(s,3H),1.40(t,J=6.8Hz,3H),1.26-1.21(m,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.33

来自乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲磺酰)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,17a/17b的R_p/S_p-混合物(1:1)的R_p-或S_p-同分异构体的纯化:

重结晶方法

在室温，将两种非对映体17a和17b的混合物(3.30g)溶解在50ml EtOAc中并用己烷处理直到溶液开始形成白色沉淀然后在3℃保持12h。过滤白色固体然后在高度真空下室温干燥12h。白色固体中17a和17b的比例为2:1(2.4g)。将白色固体溶解在共溶剂(EtOAc:二乙醚=1:1v/v,100mL)中，然后室温搅拌10min。在室温将溶液用己烷处理直到产生轻泥浆（a light slurry）然后在3℃储存24h。将白色固体过滤并在高度真空下室温干燥24h，同时下面将滤液用于获得17b。基于¹H和³¹P NMR数据的分析，产物17a(0.90g,27%.)以95%的纯度获得。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.92(d,J=8.8Hz,1H),7.42(d,J=8.8Hz,3H),7.24-7.19(m,2H),7.14-7.12(m,1H),7.14-7.10(m,1H),4.19-4.11(m,5H),4.02(m,1H),3.05(s,3H),2.94(m,2H),2.58(dd,J=7.2,9.6Hz,2H),1.43(d,J=6.8Hz,3H),1.24(t,J=6.8Hz,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.68;MS-ESI⁺m/z528(M+H⁺)。通过结晶获得17a的单晶体以及获得17a的X-射线结构明确地证实了作为S_p的磷中心的构型（图3）。

将滤液浓缩并在高度真空下室温干燥12h。将粘性油溶解在5ml CH₂Cl₂中并用二异丙醚（50ml）处理以及在室温搅拌10min。所得溶液用己烷处理直到产生轻浑浊（a light turbid）然后在3℃储存24h。将白色固体过滤并在高度真空下室温干燥48h。基于¹H和³¹P NMR数据的分析，产物17b(0.50g,15%)以90%的纯度获得。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.92(d,J=8.4Hz,2H),7.45(d,J=8.4Hz,2H),7.42(d,J=8.0Hz,1H),7.24-7.19(m,2H),7.14-7.10(m,1H),4.20-4.04(m,6H),3.05(m,3H),2.93(m,2H),2.58(t,J=7.6Hz,2H),1.40(d,J=7.2Hz,3H),1.26-1.21(q,J=7.2Hz,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.60;MS-ESI⁺m/z528(M+H⁺).

乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲硫基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,16b

在0℃、在N₂气氛下，向化合物17a(0.053g,0.10mmol)在2.0ml无水CH₂Cl₂中的溶液中加入4-甲硫基苯酚(0.042g,0.30mmol)和DIEA(0.052g,0.04mmol)。室温搅拌48h后，将溶液浓缩并在硅胶(hexane:EtOAc=3:1to1:1v/v)上纯化以产生16b(0.047g,0.095mmol)，收率95%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(d,J=8.0Hz,1H),7.23-7.15(m,6H),7.11-7.07(m,1H),4.18-4.09(m,5H),3.91-3.83(m,1H),2.92(q,J=8.0Hz,2H),2.58-2.53(m,2H),2.46(s,3H),1.40(d,J=6.8Hz,3H),1.26-1.21(m,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.31

乙基3-(2-(((((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-(甲硫基)苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,16a

在0℃、在N₂气氛下，向化合物17b(0.053g,0.10mmol)在2.0mL无水CH₂Cl₂中的溶液中加入4-甲硫基苯酚(0.042g,0.30mmol)和DIEA(0.052g,0.04mmol)。室温搅拌72h后，将溶液浓缩并在硅胶(hexane:EtOAc=3:1to1:1v/v)上纯化以产生16a(0.045g,0.091mmol)，收率91%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(d,J=8.0Hz,1H),7.23-7.15(m,6H),7.11-7.07(m,1H),4.18-4.09(m,5H),3.91-3.83(m,1H),2.92(q,J=8.0Hz,2H),2.58-2.53(m,2H),2.46(s,3H),1.38(d,J=7.2Hz,3H),1.26-1.21(m,6H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ-2.33

实施例5：从17a合成单一非对映体8b-up

乙基3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧基)-4-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)((1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,19

在-78℃、在N₂气氛下，向18(0.036g,0.07mmol)在2mL无水THF中的溶液中加入叔丁基氯化镁(1.0M in THF,0.18mL,2.5equiv.)。室温搅拌1h后，在N₂气氛下将-78℃的17a(0.07g,0.14mmol,2.0equiv.)的溶液加入反应混合物。将反应混合物室温搅拌48h并用在0℃的饱和NH₄Cl(0.5mL)处理，然后倒入冷水(10mL)中并用EtOAc(10mL x3)萃取。将收集的有机层用盐水（10ml）洗涤，用Na₂SO₄干燥、过滤并在硅胶柱(CH₂Cl₂:MeOH=50:1to20:1v/v)上纯化以产生化合物19(0.025g,0.028mmol)，收率40%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.16(s,1H),7.83(s,1H),7.44-7.33(m,6H),7.21-7.05(m,3H),5.99(s,1H),5.27(s,2H),5.22(s,2H),4.66-4.61(m,1H),4.42(d,J=8.0Hz,1H),4.39-4.34(m,1H),4.16-3.97(m,7H),3.85(m,1H),3.19(s,1H),3.01(m,2H),2.66(m,2H),1.86(m,1H),1.26(d,J=6.8Hz,3H),1.22-1.14(dt,J=14.4,7.2Hz,6H),0.94(s,3H),0.93(s,9H),0.19(s,3H),0.13(s,3H);³¹P(162MHz,CDCl₃)δ3.40;MS-ESI⁺m/z900(M+H⁺)

乙基3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)((1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,8b-up

在0℃，向19(0.01g,0.011mmol)在2.0mL无水CH₃CN中的溶液中加入氯化氢(2.0M in diethyl ether,1.0mL)。室温搅拌48h后，减压下去除溶剂和氯化氢。将残余物用二乙醚(5mL x5)洗涤并在高度真空下室温干燥12h。将固体溶解在2.0mL EtOH中，室温搅拌30min。向溶液中加入Pd/C(5.0mg,碳上10%的Pd)，所得悬浮液在室温、在氢气气氛(1atm)下搅拌12h。将溶液用Celite(0.05g)处理并过滤。将滤液在减压下浓缩并在硅胶柱(CH₂Cl₂:MeOH=10:1v/v)上纯化以产生化合物8b-up(0.007g,0.001mmol)，收率91%。¹¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.82(s,1H),7.33(d,J=8.4Hz,1H),7.22(d,J=7.2Hz,1H),7.13(td,J=7.6,2.0Hz,1H),7.06(t,J=7.6Hz,1H),5.90(s,1H),4.60-4.53(m,1H),4.48-4.20(m,1H),4.10-4.04(m,2H),4.02(q,J=7.6Hz,2H),3.96-3.86(m,1H),2.96(t,J=8.0Hz,2H),2.59(t,J=8.0Hz,2H),1.30(dd,J=1.2,7.2Hz,3H),1.16(t,J=7.8Hz,3H),1.13(t,J=7.2Hz,3H),0.93(s,3H);³¹P(162MHz,CD₃OD)δ5.01;MS-ESI⁺m/z652(M+H⁺)。

实施例6：分别从(Rp)-24和(Sp)-25合成磷酰胺酯前药(Sp)-8b-down和(Rp)-8b-up

乙基-3-(2-羟苯基)丙酸酯,21

将二氢香豆素20(10.4g,70.0mmol)加入60ml干乙醇。加入H₂SO₄(0.1mL)，将所得溶液加热回流过夜。在减压下去除乙醇，将残余物溶解在二乙醚中并用碳酸氢钠溶液萃取有机相。将有机相用硫酸钠干燥，将溶剂蒸发并将残余物进行硅胶(MeOH/CH₂Cl₂,MeOH gradient0to10%)色谱分析。分离如无色针状的产物21（收率80%）。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.40(s,1H),7.05-7.15(m,2H),6.84-6.90(m,2H),4.14(q,J=6.8Hz,2H),2.90(m,2H),2.72(m,2H),1.23(t,J=6.8Hz,3H);LC-MS,m/z195(M+1)⁺

乙基3-(2-((氯代(((R)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,23

在Ar气氛下，将21(5.0g,25.7mmol)和三乙胺(3.6mL,25.7mmol)在80ml无水二乙醚中的溶液逐滴加入三氯氧磷(2.4mL,25.7mmol)在70ml无水二乙醚中的-78℃的溶液中超过2h。在Ar气氛下、在-78℃搅拌1h后，将溶液朝着室温再搅拌15h然后在N₂气氛下通过过滤去除固体。固体用无水二乙醚洗涤并且合并的滤液在减压下浓缩然后在高度真空下室温干燥以提供无色油状的22，其无需进一步纯化即可使用。

向-78℃、Ar气氛下的22和预干燥的L-丙氨酸乙酯盐酸盐(3.94g,25.7mmol)在20ml无水CH₂Cl₂中的溶液中加入Et₃N(7mL,51.4mmol)在20ml无水CH₂Cl₂中的溶液超过2h。将溶液在室温搅拌16h，并过滤固体。将滤液在减压下浓缩并在硅胶柱(EtOAc/hexane,EtOAc梯度为0到50%,v/v)上纯化以产生9.52g几乎无色油状的化合物23，两步收率75%。化合物23可通过制备1M的THF溶液和在

分子筛上-70℃储存而进行没有明显降解的长期储存。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.14-7.49(m,4H),4.70-4.80(m,1H),4.09-4.27(m,5H),2.92-3.08(m,2H),2.61-2.65(m,2H),1.50-1.55(m,3H),1.21-1.32(m,6H).³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ8.88,8.72

乙基3-(2-(((R)-(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)磷酰基)氧基)苯基)-丙酸酯24(R_p)和乙基3-(2-(((S)-(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)-磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯25(S_p)

在0℃将Et₃N在无水二乙醚(100mL)中的溶液逐滴加入23(10.0g,25.6mmol)和对硝基苯酚(3.75g,27.0mmol)在二乙醚(200mL)中的溶液超过30min。将反应混合物在0℃搅拌1h，然后朝室温搅拌15h。过滤固体并将滤液在减压下浓缩。将残余物在硅胶柱(EtOAc/CH₂Cl₂,EtOAc梯度为0到10%,v/v)上纯化以产生10.8g、～1:1比例的24和25的混合物，收率85%。用由硅胶柱色谱分析获得的晶体状24作为晶种，将混合物在二异丙醚中的2%CH₃CN中重结晶。通过过滤收集非对映体24(2.2g,>20:124:25)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22-8.24(dd,J=10Hz,J=2.0Hz,2H),7.11-7.44(m,6H),4.06-4.20(m,6H),2.88-3.00(m,2H),2.54-2.59(m,2H),1.40(d,J=6.8Hz,3H),1.25(t,J=7.2Hz,3H),1.23(t,J=7.2Hz,3H).³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ-2.01.LC-MS,m/z495(M+1)⁺。通过在二异丙醚中的2%CH₃CN中结晶获得24的单一晶体并获得24的X-射线结构明确地证实了作为R_p的磷中心的构型（图1）。

将滤液在减压下浓缩至余压，然后在高度真空下室温干燥过夜。将残余物微热溶解在二异丙醚(200mL)中，加入晶种25。在室温放置3天后，通过过滤收集25(510mg,～20:124:25)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22-8.24(dd,J=10Hz,2H),7.11-7.43(m,6H),4.00-4.18(m,6H),2.93-2.98(m,2H),2.55-2.60(m,2H),1.43(d,J=7.2Hz,3H),1.24(t,J=7.2Hz,3H),1.24(t,J=7.2Hz,3H).³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ-2.07.LC-MS,m/z495(M+1)⁺。通过结晶获得25的单一晶体并获得25的X-射线结构明确地证实了作为S_p的磷中心的构型（图2）。

乙基3-(2-(((R)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,8b-up(R_P)

在-78℃、在Ar气氛下，向5(100mg,0.14mmol)在THF(0.5mL)的溶液中加入0.5mL t-BuMgCl溶液(1M,0.5mmol)。将反应混合物在该温度搅拌30min，然后升温至室温。加入13(210mg,0.42mmol)在1mL无水THF中的溶液。将反应混合物在Ar气氛下在室温搅拌3天结束（for completion）。溶剂在减压下蒸发，并将残余物加入在0℃预冷的80%TFA溶液(10mL)。将反应混合物朝着室温再搅拌4h结束。在减压下蒸发溶剂后，残余物被加入少量饱和NaHCO₃至pH7.0。将混合物在减压下浓缩然后在硅胶柱(MeOH/DCM,MeOH gradient0to10%,v/v)上纯化以提供37.5mg8b-up(R_p)，两步收率41%。旋光度[α]²⁴ _D-7.08(0.24,MeOH);¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ0.97(s,3H,CH₃),1.15-1.20(m,6H,2x CH₃),1.34(d,3H,J=7.2Hz,CH₃),2.62(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),2.99(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),3.95-4.58(m,9H),5.94(s,1H,H₁’),7.07-7.38(m,4H,Ar-H),7.86(s,1H,H₈);¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ14..5,14.6,20.4,20.6,26.8,35.4,51.7,61.7,62.5,67.0,74.4,80.1,81.9,92.8,114.4,121.0,126.2,128.8,131.8,133.2,137.5,150.6,152.7,157.7,162.0,174.8,175.1;³¹PNMR(162MHz,CD₃OD):5.03;C₂₇H₃₈N₇O₁₀P的LC/MS计算值651.2,实测值:552.2(M+1)。

乙基3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,8b-down(S_P)

使用类似的步骤以制备8b-down，收率39%。旋光度[α]²⁴ _D+12.12(0.13,MeOH);¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ0.97(s,3H,CH₃),1.15-1.17(m,6H,2xCH₃),1.34(d,3H,J=7.2Hz,CH₃),2.62(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),2.99(t,2H,J=8.0Hz,2H,CH₂),3.96-4.51(m,9H),5.93(s,1H,H₁’),7.10-7.39(m,4H,Ar-H),7.86(s,1H,H₈);¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ14..5,14.6,20.4,20.8,26.8,35.4,51.6,61.6,62.4,67.7,74.7,80.0,82.1,93.0,114.4,121.1,126.2,128.8,131.7,133.1,137.7,150.5,152.6,157.6,161.9,174.7,174.8;³¹PNMR(162MHz,CD₃OD):4.98;C₂₇H₃₈N₇O₁₀P的LC/MS计算值651.2,实测值:652.3(M+1)。

实施例7：乙基泛酸酯（ethyl panthenoate）单一非对映体前药30的合成。

(R)-乙基3-(2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺基)丙酸酯,27

向泛酸钙26(10g,42mmol)在乙醇(200mL)中的搅拌悬浮液中加入催化量的硫酸并将混合物加热回流过夜。将混合物过滤并通过加入饱和NaHCO₃溶液(50mL)中和。乙醇通过在减压下蒸发去除，水相用EtOAc(30mL X5)萃取。合并的有机层用Na₂SO₄干燥、过滤以及蒸发以产生浅黄色油状物的27(7.1g,28.7mmol)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm0.87(s,3H),0.95(s,3H),1.24(t,J=7.1Hz,3H),2.53(t,J=6.2Hz,2H),3.60-3.43(m,4H),3.91(s,1H),3.98(s,1H),4.12(q,J=7.1Hz,2H),4.47(s,1H),7.33(t,J=5.7Hz,1H).C₁₁H₂₂NO₅的LC/MS计算值248.1,实测值:248.1(M+1)。

乙基3-((4R)-5,5-二甲基-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环己烷-4-甲酰氨基)丙酸酯,28和29

向0℃的POCl₃(1mmol,83μL)在THF(5mL)中的搅拌溶液中加入对硝基苯酚(1mmol,139mg)和Et₃N(1mmol,139μL)在THF(1mL)中的溶液。室温搅拌1h后，将混合物加入B(0.81mmol,200mg)和Et₃N(2mmol,83μL)在THF(10mL)中的溶液。将所得混合物在80℃加热2h。将溶液通过10%的NaHCO₃水溶液水解并通过EtOAc萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤并用Na₂SO₄干燥。去除溶剂后，残余物通过硅胶柱色谱(己烷中的50%的EtOAc用于快速洗脱非对映体，然后己烷中的65%的EtOAc用于慢速洗脱非对映体)纯化以提供快速洗脱非对映体28(0.23mmol,100mg)和慢速洗脱非对映体29(0.27mmol,115mg)，总收率60%。

28,快速洗脱非对映体。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δppm1.08(s,3H),1.13(s,3H),1.18(t,J=7.1Hz,3H),2.52(t,J=6.7Hz,2H),3.39-3.53(m,2H),4.00-4.10(m,3H),4.42(d,J=11.4Hz,1H),4.88(s,1H),7.47(d,J=9.2Hz,2H),8.24-8.28(m,2H);³¹PNMR(CD₃OD):-14.02;C₁₇H₂₄N₂O₉P的LC/MS计算值431.1,实测值:431.1(M+1).旋光度[α]²⁴ _D+51.08(c0.184,MeOH)

29,慢速洗脱非对映体。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.89(s,3H),1.18-1.23(m,6H),2.49(t,J=6.5Hz,2H),3.45(dt,J=6.7,2.4Hz,2H),4.10(q,J=7.1Hz,2H),4.22(t,J=11.8Hz,1H),4.57(dd,J=12.7,11.1Hz,1H),4.73(d,J=10.3Hz,1H),7.50(dd,J=9.14,0.93Hz,2H),8.26-8.32(m,2H);³¹PNMR(CD₃OD):-13.31;C₁₇H₂₄N₂O₉P的LC/MS计算值430.1,实测值:431.1(M+1).旋光度[α]²⁴ _D+46.94(c0.196,MeOH)

乙基3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-5,5-二甲基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环己烷-4-甲酰氨基)丙酸酯,30

向0℃的5(0.083mmol,52.8mg)的搅拌溶液中逐滴加入t-BuMgCl(0.25mmol,0.25mL)的1M溶液。0℃搅拌30min后，室温下将28(0.41mmol,2.08mL)在THF中的0.2M溶液逐滴加入。将溶液室温搅拌5天然后蒸干。残余物通过硅胶柱色谱纯化以去除未反应的量的28(己烷中的60%的EtOAc，然后CH₂Cl₂中的15%的MeOH)。纯化的部分在高真空下蒸发、干燥并在CH₂Cl₂(5mL)中稀释。加入甲磺酸(0.23mmol,14.1μL)并将溶液加热回流5h。溶液通过加入Et₃N(0.23mmol,30μL)中和并蒸干。残余物通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂中的直到10%的MeOH)纯化以产生30(0.03mmol,18.0mg)。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δppm1.00(s,3H),1.11(s,3H),1.15(s,3H),1.22(t,J=7.1Hz,3H),2.53(dt,J=6.7,2.4Hz,2H),3.53-3.36(m,2H),4.09(q,J=7.2Hz,2H),4.33-4.13(m,4H),4.55(ddd,J=11.7,7.2,2.0Hz,1H),4.68(ddd,J=11.6,6.6,2.0Hz,1H),4.75(d,J=4.0Hz,1H),5.98(s,1H),7.90(s,1H);³¹P-NMR(CD₃OD):-4.87;C₂₂H₃₅N₇O₁₀P的LC/MS计算值588.2,实测值:588.1(M+1)。

实施例8：2’-F-2’-C-甲基2,6-二氨基嘌呤单磷酸酯前药36的合成。

(2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-醇,31

¹H-NMR(CD₃OD):1.18(d,J=22.3Hz,3H),3.87(dd,J=13.0,3.3Hz,1H),4.02-4.06(m,2H),4.40(dd,J=24.4,9.2Hz,1H),6.12(d,J=18.0Hz,1H),8.13(s,1H).;¹³C-NMR(CD₃OD):15.6,15.8,59.6,71.2,71.4,82.3,89..0,89.4,100.2,102.0,113.1,136.5,151.1,156.5,160.8.C₁₁H₁₅FN₆O₃的LC/MS计算值298.1,实测值:299.2(M+1)。

(2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二甲基氯硅烷)氧基)甲基)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-3-醇,32

向(2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-醇,31(230mg,0.77mmol)在吡啶中的搅拌溶液中加入TBDMSCl(256mg,1.69mmol)。溶液搅拌过夜并加入甲醇(2mL)。搅拌20min后，将溶液蒸干并与甲苯共蒸发两次。残余物通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂中的0%到3%的MeOH)纯化以提供化合物32(275mg,0.67mmol,87%)。¹H-NMR(CD₃OD):0.17(s,6H),0.98(s,9H),1.19(d,J=22.2Hz,3H),3.97(dd,J=12.0,2.5Hz,1H),4.06(dd,J=9.4,1.3Hz,1H),4.16(dd,J=12.0,1.7Hz,1H),4.27(dd,J=24.6,9.4Hz,1H),6.11(d,J=16.7Hz,1H),8.24(s,1H);¹³C-NMR(CD₃OD):-5.276,-5.209,16.7,17.0,19.5,26.6,62.3,71.9,72.1,83.4,89.4,89.8,101.4,103.2,113.9,137.7,152.7,156.5,160.6.C₁₇H₂₉FN₆O₃Si的LC/MS计算值412.2,实测值:413.3(M+1)。

苄基(2-氨基-9-((2R,3R,4R,5R)-4-(((苄氧基)羰基)氧基)-5-(((叔丁基二甲基氯硅烷)氧基)甲基)-3-氟-3-甲基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸酯,33

向0℃的化合物32(225mg,0.55mmol)在CH₂Cl₂(5mL)中的搅拌溶液中相继加入DMAP(266mg,2.2mmol)和CBzCl(0.31mL,2.18mmol)。室温搅拌6h后，将溶液冷却至0℃并再次加入DMAP(266mg,2.2mmol)和CBzCl(0.31mL,2.18mmol)。室温搅拌过夜后，反应用水淬灭并加入CH₂Cl₂。将有机层和水层分离，以及将有机层用水洗涤两次以上。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥、过滤和蒸发。残余物通过硅胶柱色谱（己烷中的10%到45%的EtOAc）以提供化合物33(300mg,0.44mmol,81%)。¹H-NMR(CD₃OD):0.06(d,J=4.1Hz,6H),0.91(s,9H),1.17(d,J=22.4Hz,3H),3.80(dd,J=12.1,2.6Hz,1H),4.05(dd,J=12.1,2.1Hz,1H),4.27(d,J=9.1Hz,1H),5.14-5.23(m,5H),5.53(dd,J=22.6,9.1Hz,1H),6.16(d,J=16.7Hz,1H),7.26-7.43(m,10H),8.30(s,1H).¹³C-NMR(CD₃OD):-5.4,17.4,17.6,19.4,26.5,62.2,68.3,71.6,75.5,75.7,81.2,89.6,90.0,100.4,102.2,116.4,129.2,129.3,129.5,129.6,129.7,129.8,136.5,137.4,138.9,151.5,153.3,154.1,155.9,162.0;C₃₃H₄₁FN₆O₇Si的LC/MS计算值680.3,实测值:681.3(M+1)。

苄基(2-氨基-9-((2R,3R,4R,5R)-4-(((苄氧基)羰基)氧基)-3-氟-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸酯,34

向0℃的化合物33(245mg,0.36mmol)在THF(5mL)中的搅拌溶液中加入Et₃N3HF(0.234mL,1.44mmol)。室温搅拌24h后，溶液用NaHCO₃的饱和溶液中和然后加入EtOAc。将有机层和水层分离，将有机层用NaHCO₃的饱和溶液再一次洗涤，最后用水洗涤。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥、过滤和蒸发。残余物通过硅胶柱色谱(1%然后2%的MeOH在CH₂Cl₂中的溶液)纯化以得到化合物34(198mg,0.35mmol,97%)。¹H-NMR(CD₃OD):1.17(d,J=22.6,3H),3.78(dd,J=12.7,3.2Hz,1H),3.97(dd,J=12.7,2.4Hz,1H),4.24(d,J=9.0Hz,1H),5.23(s,2H),5.19(s,2H),5.62(dd,J=21.2,9.0Hz,1H),6.16(d,J=18.0Hz,1H),7.26-7.43(m,10H),8.25(s,1H);¹³C-NMR(CD₃OD):17.6,17.8,60.8,68.3,71.5,76.2,76.4,81.6,90.2,90.6,100.3,102.2,103.0,116.6,129.3,129.4(2C),129.6,129.7(2C),136.6,137.4,139.8,151.5,153.4,154.1,155.9,161.8;C₂₇H₂₇FN₆O₇的LC/MS计算值566.2,实测值:567.2(M+1)。

乙基3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-(((苄氧基)羰基)氧基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯,35

在0℃，将(2R)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰氨基)丙酸酯(0.5M,0.58mL，0.29mmol)逐滴加入34(32.8mg,0.057mmol)和N-甲基咪唑(23μL,0.29mmol)在THF(0.1mL)中的溶液中。所得混合物朝室温搅拌过夜。在减压下去除溶剂后，残余物通过以MeOH梯度(CH₂Cl₂中0%到10%的MeOH梯度)的快速柱色谱进行纯化以提供42mg白色固体35，收率80%。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ1.10–1.32(m,12H),2.54–2.64(m,2H),2.89–2.97(m,2H),3.89–4.11(m,6H),4.40–4.61(m,2H),5.16–5.28(m,4H),5.86–5.99(m,1H),6.14–6.21(m,1H),6.90–7.45(m,14H),7.97(s,1H);³¹PNMR(162MHz,CD₃OD):4.74,4.77;C₄₃H₅₀FN₇O₁₃P的LC/MS计算值922.3,实测值:922.2(M+1)⁺。

乙基3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四-氢呋喃--2-基)甲氧基)(((S)-1-乙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)苯基)丙酸酯,36

在室温将35(42mg)和10mg10%Pd/C在5ml乙醇中的混合物充满氢气氛并搅拌过夜。所得悬浮液用氮气流脱气、过滤，将滤液浓缩并将残余物通过硅胶柱(DCM中0到10%MeOH的梯度)纯化以提供23mg前药36，收率77%。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ1.14–1.34(m,12H),2.59–2.64(m,2H),2.96–3.00(m,2H),3.93–4.19(m,6H),4.47–4.62(m,3H),6.08–6.15(m,1H),7.07–7.37(m,4H),7.85(s,1H);³¹PNMR(162MHz,CD₃OD):4.88,4.95;C₂₇H₃₈FN₇O₉P的LC/MS计算值653.2,实测值:653.3(M+1)⁺。

实施例9

异丙基3-(2-(((((3R,4R,5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢-呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-异丙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯3a

在室温，向37(630mg,1.91mmol)和38(2.4g,5.71mmol)在无水THF(10mL)和MeCN(1mL)中的搅拌溶液中加入NMI(445μL,5.71mmol)。反应混合物在室温搅拌2.5h。将溶剂在减压下去除，并且将残余物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷中0%到8%的MeOH)纯化。获得1.2g化合物39（收率82%）。C₂₉H₄₀ClN₆O₁₀P的LC/MS计算值698.2,实测值:699.2(M+1)⁺。

异丙基3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢-呋喃-2-基)甲氧基)(((S)-1-异丙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯41

将39(1.2g,1.57mmol)、NaN₃(155mg,2.36mmol)、^tBu₄NI(295mg,0.78mmol)在DMF(2mL)中的溶液在90℃搅拌5h。将反应混合物冷却至室温，加入n-BuBr(0.22mL,2mmol)并在室温搅拌1h以使过量的NaN₃转化为BuN₃。在减压下去除溶剂后，残余物在EtOAc(100mL)和水(30mL)之间分配。将分离的水相用EtOAc(3x30mL)萃取，并且将合并的有机层用Na₂SO₄干燥。去除溶剂后，将残余物加入Pd(OH)₂/C和iPrOH(15mL)。将混合物充满氢气(50PSI)过夜以完成还原反应。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物用EtOAc(100mL)和水(20mL)分配。将水相用EtOAc(3x30mL)萃取，并将合并的有机层用Na₂SO₄干燥。在去除溶剂后，将残余物通过快速柱色谱(CH₂Cl₂中0%到15%的MeOH)纯化以提供650mg的白色固体41（收率61%；两步）。¹H-NMR(CD₃OD)(1:1mixture of P diastereomers):0.97(s,3H,CH₃),1.13-1.21(m,9H,3x CH₃),1.33(s,3H,CH₃),2.56-2.62(m,2H,CH₂),2.97-3.03(m,2H,CH₂),3.91-3.95(m,1H),4.18-4.26(m,2H),4.88-4.61(m,2H),4.83-4.97(m,2H),(m,14H),5.93(s,1H),7.08-7.40(m,4H,Ar-H),7.86(s,1H,H₈);³¹PNMR(CD₃OD):4.99,5.09;C₂₉H₄₂N₇O₁₀P的LC/MS计算值679.3,实测值:680.3(M+1)⁺。

实施例10

试剂和反应条件：a)TBSCl,咪唑,吡啶,0℃然后rt,6h;b)N,N’-羰基二咪唑,DMF,0℃然后rt,4h;c)Et₃N-3HF,THF,0℃然后rt,12h;d)38,NMI,THF,-78℃然后rt,12h;e)NaN₃,DMF,70℃,12h;f)10%Pd/C,H₂(50psi),i-PrOH-EtOAc(2:1v/v),rt,18h。

(2R,3R,4R,5R)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(((叔丁基二甲基氯硅烷)氧基)甲基)-3-甲基四氢呋喃-3,4-二醇(42)

在0℃、在N₂气氛下，向化合物37(1.0g,3.20mmol)在20mL无水吡啶中的溶液中加入咪唑(0.27g,4.0mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)(0.72g,4.8mmol)。搅拌6h后，将溶液在室温用MeOH(1.0mL)处理，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂到CH₂Cl₂:MeOH;10:1)纯化以产生化合物42(1.32g,3.07mmol)，收率96%。MS-ESI⁺m/z430(M+H⁺)。

(3aR,4R,6R,6aR)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-6-(羟甲基)-3a-甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代-2-酮(43)

在0℃、在N₂气氛下，向化合物42(0.89g,2.10mmol)在10mL无水DMF中的溶液中加入N,N’-羰二咪唑(0.85g,5.18mmol)。搅拌4h后，将反应溶液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(己烷:EtOAc;4:1to1:2)纯化以产生2’,3’-O,O-碳酸酯中间体。在0℃、在N₂气氛下，向2’,3’-O,O-碳酸酯中间体在20mL THF中的溶液中加入Et₃N-3HF(1.65mL,10.20mmol)。室温搅拌12h后，将所得溶液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(己烷:EtOAc;10:1toEtOAc:MeOH;20:1)纯化以产生化合物43(0.70g,2.04mmol)，收率97%(2步)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.34(s,1H),7.12(br,2H),6.37(s,1H),5.34(t,J=5.6Hz,1H),5.08(d,J=3.6Hz,1H),4.40(q,J=3.6Hz,1H),3.82-3.70(m,2H),1.30(s,3H);MS-ESI⁺m/z342(M+H⁺)。

异丙基3-(2-(((((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-6a-甲基-2-氧代四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代-4-基)甲氧基)(((S)-1-异丙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯(44)

在-78℃、在N₂气氛下，向化合物43(0.54g,1.58mmol)在10mL无水THF中的溶液中加入磷酸酯酰氯38(1.66g,3.95mmol)在10mL THF和N-甲基咪唑(0.65g,7.90mmol)中的溶液。室温搅拌12h后，将反应溶液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(己烷:EtOAc;4:1到1:2)纯化以产生化合物44(0.89g,1.23mmol)，收率78%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.81-7.79(s,1H),7.40-7.05(m,4H),6.40-5.90(br,2H),6.13-6.08(s,1H),5.61(d,J=4.8Hz,0.5H),5.34(d,J=4.4Hz,0.5H),5.09-4.90(m,3H),4.51-4.43(m,1H),4.24-3.95(m,2H),3.85-3.78(m,1H),3.03-2.86(m,2H),2.64-2.54(m,2H),1.43-1.13(m,18H);MS-ESI⁺m/z725(M+H⁺)。

异丙基3-(2-(((((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-6a-甲基-2-氧代四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代-4-基)甲氧基)(((S)-1-异丙氧基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧基)苯基)丙酸酯(45)

在室温、在N₂气氛下，向化合物44(0.47g,0.65mmol)在10mL无水DMF中的溶液中加入NaN₃(0.13g,1.95mmol)。在70℃搅拌12h后，将所得溶液倒入50mL EtOAc中并用冷水(20mL x3)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。向残余物在15mL i-PrOH:EtOAc;2:1共溶剂中的溶液中加入0.04g of Pd/C(以活性炭计10%的Pd)。在H₂(50psi)下摇动18h，将N₂脱气溶液用硅藻土处理，搅拌30min并过滤。将滤液通过硅胶柱色谱(己烷:EtOAc;1:5到EtOAc:MeOH;20:1)纯化以产生化合物45(0.40g,0.57mmol)，收率87%(通过³¹P NMR测定的非对映体的比例(R_p/S_p)=1:1)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.86-7.81(s,1H),7.40-7.09(m,4H),6.32-6.30(s,1H),5.38-5.34(m,1H),5.02-4.87(m,2H),4.80-4.70(m,1H),4.56-4.38(m,2H),3.99-3.92(m,1H),3.00-2.94(m,2H),2.63-2.55(m,2H),1.38-1.33(m,6H),1.22-1.13(m,12H);³¹PNMR(162MHz,CDCl₃)δ5.45,5.25;MS-ESI⁺m/z706(M+H⁺)。

实施例11

(R)-异丙基3-(2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺)丙酸酯,46

将泛酸钙（panthenoate calcium）26(10g,42mmol)在2-异丙醇(200mL)中的悬浮液冷却至0℃并用HCl气处理直到获得透明溶液(ca.15min)。停止引入HCl气，使得混合物可升温至室温并搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发，将所得残余物溶解在EtOAc中并用NaHCO₃(5%)洗涤。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥、过滤及蒸发以产生透明油状的46（10g,90%）。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm0.86(s,3H),0.97(s,3H),1.22(d,J=6.4Hz,6H),2.51(t,J=6.4Hz,2H),3.55-3.45(m,4H),3.98(s,1H),3.98(s,1H),5.00(t,6.4Hz1H),7.33(t,J=5.7Hz,1H).C₁₂H₂₄NO₅的LC/MS计算值262.1,实测值:262.1(M+1)。

异丙基3-((4R)-2-氯-5,5-二甲基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环己烷-4-甲酰氨基)丙酸酯,47

在0℃，向化合物46(1g,3.8mmol)在THF(15mL)中的溶液中加入Et₃N(11.2mmol，1.6mL)。搅拌30min后，将该溶液逐渐加入POCl₃(4.7mmol,0.45mL)在THF(10mL)中的-75℃冷却溶液中。将所得溶液在0℃搅拌1h，并在室温另搅拌30min。将溶液在减压下浓缩、溶解在二氯甲烷(20mL)中和用NaHCO₃(sat)洗涤。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥，并且将溶剂在减压下蒸发。化合物47在高真空下干燥，就这样使用而不进行进一步的纯化。C₁₂H₂₂ClNO₆P的LC/MS计算值342.0,实测值:342.0(M+1)。

异丙基3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-5,5-二甲基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环己烷-4-甲酰氨基)丙酸酯,48

在室温，向2-氨基-6-氯-嘌呤核苷37(0.2g,0.63mmol)在THF(9mL)中的溶液中加入N-甲基咪唑(0.15mL,1.9mmol)。搅拌45min后，将溶液冷却至0℃，并逐滴加入47(5mL,0.5M，在THF中)的溶液。使得反应混合物可升温至室温并搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发以及将粗制残余物通过快速色谱(洗脱液:CH₂Cl₂中5%到15%的MeOH)纯化。获得化合物48(118mg,0.19mmol)，收率30%。C₂₃H₃₅ClN₆O₁₀P的LC/MS计算值621.1,实测值621.1(M+1)。

异丙基3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-5,5-二甲基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环己烷-4-甲酰氨基)丙酸酯,49

将48(100mg,0.16mmol)和NaN₃(52mg,0.8mmol)在DMF(3mL)中的溶液加热至80℃，并搅拌5h（反应过程通过LC-MS监测）。一旦反应完成，将混合物在减压下浓缩并将粗制残余物通过快速色谱(CH₂Cl₂中0%到20%的MeOH)纯化。获得纯的作为白色固体的6-叠氮化合物(60mg,0.095mmol)，收率59%。C₂₃H₃₄N₉O₁₀P的LC-MS计算值627.2,实测值628.2(M+1)。

将上述6-叠氮化合物(60mg,0.095mmol)和催化量的Pd(OH)₂/C在乙酸乙酯(3mL)中的溶液在室温、大气压下进行加氢8h。将N₂喷雾的混合物通过硅藻土垫过滤并将所得硅藻土用CH₂Cl₂和CH₃OH的50%溶液洗涤。将溶剂在减压下蒸发，并将粗制残余物通过预备的TLC板(洗脱液：CH₂Cl₂中15%的MeOH)纯化。获得非对映体混合物的化合物49(30mg,52%)。¹³P-NMR(CD₃OD):-4.84,-7.21;C₂₃H₃₇N₇O₁₀P的LC-MS计算值602.2,实测值602.2(M+1)。

实施例12

NS5B酶检测

从HCV复制子细胞克隆的21个氨基酸的C-末端截短的HCV NS5B RNA聚合酶，用6-His-末端尾修饰，表达于原核表达载体(pQE60;Qiagen)，随后用Talon钴亲和树脂柱(Clontech,Palo Alto,Calif.)纯化。纯化通过SDS-PAGE和免疫印迹监测。所得纯化蛋白用50mM磷酸钠(pH8.0)–300mM氯化钠–0.5%TritonX-100–50%甘油–2mM二硫苏糖醇透析过夜。当-20℃储存时，透析液维持恒定的活性超过6个月。蛋白用Coomassie Plus蛋白分析试剂(Pierce)和来自同一供应商的牛血清白蛋白标准进行定量。

通过通过监测使用(-)IRES作为模板s使³²P-标记UMP掺入新合成的RNA链来研究NS5B RNA聚合酶反应。在包含2.8mg(-)IRES RNA模板、140单位anti-RNase(Ambion)、1.4mg NS5B、适量的[a-³²P]UTP、各种浓度的天然和修饰的核苷酸、1mM MgCl₂、0.75mM MnCl₂和2mM的二硫苏糖醇在50mM的HEPES缓冲液(pH7.5)中的140mL的总体积中进行稳态反应。核苷酸的浓度根据抑制剂而改变。反应温度为27℃。在期望的时间，取出20mL等分试样，并通过将反应混合物与80mL包含12.5mM EDTA、2.25M NaCl和225mM柠檬酸钠的终止液混合来淬灭反应。为了测定用于天然核苷酸TP(NTP)底物的稳态参数，改变一种NTP的浓度而将另外三种NTP的浓度固定在饱和浓度。为了测定用于A类似物的K_i，将UTP、GTP和CTP的浓度分别固定在10、100和100mM，而改变ATP和所述A类似物的浓度。通过使用印迹杂交装置使淬灭的反应混合物穿过Hybond N+膜(Amersham Biosciences)而将放射性RNA产物从未反应的底物中分离。所述RNA产物保留在所述膜上而游离的核苷酸被洗掉。将所述膜用包含0.6M NaCl和60mM柠檬酸钠的溶液洗涤四次。在将所述膜用水漂洗然后用乙醇漂洗后，将印迹切掉，并在Packard液体闪烁计数仪中计数放射性。基于反应混合物中的总的放射性，计算产物的量。反应的速率由产物形成的时间进程的斜率来测定。为了测定抑制常数(K_i)，反应速率用不同浓度的底物和抑制剂来测定并适用竞争性抑制公式：ν=(V_max·[s])/{K_m·(1+[I]/K_i)+[S]}，其中ν为实测速率，[S]为底物浓度,[I]为抑制剂浓度以及V_max为最大速率。K_m为米歇尔常数，K_i为抑制常数。

参考文献:

1)Stuyver LJ,Whitaker T,McBrayer TR,Hernandez-Santiago BI,Lostia S,Tharnish PM,Ramesh M,Chu CK,Jordan R,Shi J,Rachakonda S,Watanabe KA,Otto MJ,Schinazi RF.Ribonucleoside Analogue That Blocks Replication of BovineViral Diarrhea and Hepatitis C Viruses in Culture Antimicrob.Agents Chemother.2003,47,244.

实施例13

RNA合成和链终止

i)HCV NS5B的表达和纯化:使插入表达载体pET-22(Novagen)的HCVNS5B序列在Escherichia coli BL21(DE3)中表达为C末端截短的酶(Δ21)并利用金属离子亲和色谱(Clonetech的Talon试剂盒)纯化。序列通过测序(Sequetech)证实。

ii)标准反应条件:反应混合物由在包含40mM HEPES（pH8）、10mM NaCl、1mM二硫苏糖醇和0.2mM MnCl₂的缓冲液中的1μM RNA模板(RNA20),1.5μM HCV NS5B和0.25μM放射标记的引物(P16)组成。另外，反应物包含10μMGTP-UTP和3μM测试类似物-TP。30分钟后终止反应，产物用异丙醇沉淀、在95℃热变性5分钟，并在12%聚丙烯酰胺、7M尿素胶上分离。针对核苷酸类似物掺入模板/引物的单一位点，测定了抑制50%的全长产物形成所需要的链终止剂的浓度(EC₅₀)。

iii)数据采集和分析:扫描胶并用phosphorimager(FLA-7000,Fujifilm)分析，并且计算EC₅₀值。

图4显示通过HCV NS5B的((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯的掺入。

图5显示通过HCV NS5B的((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-羟基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯的掺入。

实施例14

HepG2细胞中的线粒体毒性分析:

i)2,6-二氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对细胞生长和乳酸产生的影响:对HepG2细胞生长的影响通过在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM的药物存在下培养细胞来测定。将细胞（每孔5×10⁴个）接入具有补充有10%胎牛血清、1%丙酮酸钠和1%青霉素/链霉素的含非必需氨基酸的最小必需培养基的12-孔细胞培养板中并在37℃培养4天。在培养期结束时，使用血球计测定细胞数目。Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM."Differentialeffects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2cells"Antimicrob.Agents Chemother.2000;44:496-503也有教导。为了测量核苷类似物对乳酸产生的影响，将来自存贮培养的HepG2细胞稀释并以每孔2.5x10⁴个细胞接入12孔培养板。加入各种浓度(0μM,0.1μM,1μM,10μM and100μM)的核苷类似物，并将培养物在37℃、潮湿的5%CO₂气氛中培养4天。在第四天，测定每个孔的细胞数目并收集培养基。将培养基过滤，并使用colorimetric lacticacid assay(Sigma-Aldrich)测定培养基中的乳酸含量。由于乳酸产物可被认为是受损的线粒体功能的标记，所以在2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药类似物的存在下生长的细胞中检测到的乳酸产物的升高的水平会表明药物诱导的细胞毒性效应。

ii)2,6-二氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对线粒体DNA合成的影响:精确定量线粒体DNA含量的实时PCR检测已开发出来(见Stuyver LJ,Lostia S,Adams M,Mathew JS,Pai BS,Grier J,Tharnish PM,Choi Y,Chong Y,Choo H,Chu CK,OttoMJ,Schinazi RF.Antiviral activities and cellular toxicities of modified2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidine analogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002;46:3854-60)。该检测被用于本申请中描述的测定核苷类似物对线粒体DNA含量影响的所有研究中。在该检测中，将低传代次数的HepG2细胞以5,000个细胞/孔接种于胶原包被的96孔板中。将核苷单磷酸酯类似物加入培养基以获得0μM、0.1μM、10μM和100μM的终浓度。在培养第7天，通过使用市售的柱(RNeasy96试剂盒;Qiagen)制备细胞核酸。这些试剂盒同时纯化RNA和DNA，因此全部核酸均被从所述柱上洗脱下来。使用对于目标和参照扩增两者均具有合适的引物和探针的多重Q-PCR方案，从5μl的洗脱核酸中扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基II(COXII)基因和β-actin或rRNA基因。对于COXII，分别使用以下的正义、探针和反义引物：5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3',5'-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3'和5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'。对于β-actin基因(GenBank登录号E01094)的外显子3，所述正义、探针和反义引物分别为5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3',5'-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3'和5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。用于rRNA基因的引物和探针从AppliedBiosystems商购。由于对于所有基因来说可获得相等的扩增效率，所以使用比较CT法以调查线粒体DNA合成的潜在的抑制。比较CT法使用其中目标(COXIIgene)的量用内源参照(theβ-actin or rRNA gene)的量进行归一化并与参照因子（无药对照第7天）有关的算术公式。用于这种方法的算术公式由2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT为（目标试样的平均CT-目标对照的CT）-（参照试样的平均CT-参照对照的CT）(见Johnson MR,K Wang,JB Smith,MJ Heslin,RB Diasio.Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reversetranscription polymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000;278:175-184)。在药物的存在下生长的细胞中的线粒体DNA含量的减少会表明线粒体毒性。

iii)电子显微镜形态学评估:已显示NRTI诱导的毒性引起线粒体的形态学变化（如嵴的丧失、基质溶解和肿胀以及脂滴的形成），其可用使用透射电子显微镜的超微结构分析观察(见Cui L,Schinazi RF,Gosselin G,Imbach JL.Chu CK,Rando RF,Revankar GR,Sommadossi JP.Effect of enantiomeric and racemicnucleoside analogs on mitochondrial functions in HepG2cells.Biochem.Pharmacol.1996,52,1577-1584;Lewis W,Levine ES,Griniuviene B,Tankersley KO,ColacinoJM,Sommadossi JP,Watanabe KA,Perrino FW.Fialuridine and its metabolitesinhibit DNA polymerase gamma at sites of multiple adjacent analog incorporation,decrease mtDNA abundance,and cause mitochondrial structural defects in culturedhepatoblasts.Proc Natl Acad Sci U S A.1996;93:3592-7;Pan-Zhou XR,L Cui,XJZhou,JP Sommadossi,VM Darley-Usmar.Differential effects of antiretroviralnucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2cells.Antimicrob.AgentsChemother.2000,44,496-503)。例如，用10μM非阿尿苷(FIAU;1,2'-脱氧-2'-氟-1-D-阿拉伯呋喃基-5-碘-尿嘧啶)培养的HepG2细胞的电子显微图显示具有与线粒体功能障碍一致的形态学变化的增大线粒体的存在。为确定2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷单磷酸酯前药是否促进线粒体的形态学变化，在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM核苷类似物的存在下，将HepG2细胞(2.5x10⁴个细胞/mL)接种入组织培养皿(35×10mm)中。在第8天，将所述细胞固定、脱水并包埋在前述Eponas中。制备薄片，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，然后使用透射电子显微镜检测。

经过14天的时间，分析化合物8b-up、12和8a对于HepG2肝癌细胞中的核DNA或线粒体DNA、或乳酸产生的影响。上文第(i)部分概述的过程被用于该分析。结果制表如下：

如表中所示，8b-up、12和8a直到50μM都没有对核DNA或线粒体DNA或乳酸产生表现出明显的影响（在HepG2肝癌细胞中，14天检测）。

实施例15

Neuro2A细胞中的线粒体毒性检测

为了评价核苷类似物引起神经元毒性的可能性，小鼠Neuro2A细胞(美国模式培养物保藏所131)将被用作模型系统(见Ray AS,Hernandez-Santiago BI,Mathew JS,Murakami E,Bozeman C,Xie MY,Dutschman GE,Gullen E,Yang Z,Hurwitz S,Cheng YC,Chu CK,McClure H,SchinaziRF,Anderson KS.Mechanismof anti-human immunodeficiency virus activity ofbeta-D-6-cyclopropylamino-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2005,49,1994-2001)。细胞生长50%抑制所必需的浓度(CC₅₀)将使用所述基于3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料的检测进行测量。如上文所述，在所限定的药物浓度下，细胞乳酸和线粒体DNA水平的波动将会进行。在所有试验中，ddC和AZT将用于核苷类似物对照。

实施例16

核苷酸类似物对线粒体DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和核酸外切酶活性的影响

i)人聚合酶γ的纯化：聚合酶γ的重组大亚基和小亚基将如前所述进行纯化(见Graves SW,Johnson AA,Johnson KA.Expression,purification,and initialkinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNApolymerase.Biochemistry.1998,37,6050-8;Johnson AA,Tsai Y,Graves SW,Johnson KA.Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme:reconstitution andcharacterization.Biochemistry2000;39:1702-8)。用分光光度法在280nm测定蛋白质浓度，聚合酶γ的大、小亚基分别具有234,420和71,894M-1cm-1的消光系数。

ii)核苷酸掺入的动力学分析：进行预稳态动力学分析以测定DNA聚合酶γ对于核苷-TP和天然dNTP底物的掺入催化效率(k/K)。这允许测定该酶掺入修饰的类似物和预测毒性的相对能力。通过DNA聚合酶γ掺入核苷酸类似物的预稳态动力学分析基本如前人所述地进行(见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry on incorporation andremoval of5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004,62,57-64;Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicity:comparisonof the incorporation efficiencies of2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphateanalogs by human immunodeficiency virus type1reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004,48,1300-6)。简单地说，将聚合酶γ的大亚基(250nM)和小亚基(1.25mM)和60nM DNA模板/引物在50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.8中的预培养混合物加入包含MgCl₂(2.5mM)和各种浓度核苷酸类似物的溶液。反应将如上文所述进行淬灭和分析。数据将适用如上文所述相同的公式。

iii)人聚合酶γ3'5'核酸外切酶活性分析：通过在dNTP不存在时测量分解产物的形成速率来研究人聚合酶γ核酸外切酶活性。反应通过将MgCl₂(2.5mM)加入聚合酶γ大亚基(40nM)、小亚基(270nM)和1,500nM链终止模板/引物在50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.8中的预培养混合物而引发并在指定的时间点用0.3M EDTA淬灭。所有反应混合物均在20%变性聚丙烯酰胺测序胶(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子影像系统上影像并用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。由早期时间点形成的产物被标绘为时间函数。数据将用SigmaPlot(Jandel Scientific)通过线性回归进行拟合。线的斜率除以反应中活性酶的浓度以计算核酸外切酶活性的kexo(见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,AndersonKS.Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma:comparison ofD-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004;62:57-64;Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationshipbetween antiviral activity and host toxicity:comparison of the incorporationefficiencies of2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type1reverse transcriptase and human mitochondrial DNApolymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004;48:1300-6)。

实施例17

骨髓细胞毒性检测

原代人骨髓单核细胞从Cambrex Bioscience(Walkersville,MD)商购获得。CFU-GM检测在50单位/mL人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的存在下使用双层软琼脂进行，而使用包含1单位/mL红细胞生成素的甲基纤维素基质进行BFU-E检测(见Sommadossi JP,Carlisle R.Toxicity of3’-azido-3’-deoxythymidineand9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hepatopoieticprogenitor cells in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987;31:452-454;Sommadossi,JP,Schinazi,RF,Chu,CK,and Xie,MY.Comparison of Cytotoxicityof the(-)and(+)enantiomer of2’,3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bonemarrow progenitor cells.Biochem.Pharmacol.1992;44:1921-1925)。每个试验在来自三个不同供体的细胞中一式两份地进行。AZT被用作阳性对照。细胞将在化合物的存在下在37℃与5%CO₂下培养14-18天，并使用倒置显微镜计数大于50个细胞的集落以测定IC₅₀。50%抑制浓度(IC₅₀)通过药物浓度对BFU-E存活分数的对数的最小二乘线性回归分析获得。对于独立的非配对样本用Student’s t检验进行统计分析。

实施例18

细胞毒性检测

如前所述，化合物的毒性在Vero、人PBM、CEM(人类淋巴母细胞)和HepG2细胞中进行评估(见Schinazi R.F.,Sommadossi J.-P.,Saalmann V.,Cannon D.L.,Xie M.-Y.,Hart G.C.,Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990,34,1061-67)。环己酰亚胺被列入阳性的细胞毒素对照，以及暴露于溶剂的未处理细胞将被列入阴性对照。细胞毒性IC₅₀使用前人所述的半数有效方法(见ChouT.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984,22,27-55;Belen’kii M.S.&SchinaziR.F.Antiviral Res.1994,25,1-11)由浓度-响应曲线获得。数据列于下面的表2中：

表2：细胞毒性数据。

实施例19

腺苷脱氨酶检测

为了测定核苷和单磷酸前药被腺苷脱氨酶脱氨的倾向，，核苷类似物可以商购的纯化酶进行培养，反应后进行分光光度检测。通常的反应条件涉及在25℃制备含50μM核苷类似物在0.5mL50mM磷酸钾(pH7.4)中的溶液。通常的反应时间为用0.002单位酶7分钟和用0.2单位酶120分钟。（腺苷脱氨酶的单位的定义为，在25℃、pH7.5，一个单位将使1.0μmol的腺苷脱氨成为肌苷。）脱氧腺苷通常被用作阳性对照。脱氧腺苷在所给条件下用0.002单位酶在7分钟内被59%脱氨。脱氧鸟苷通常被用作阴性对照。光密度可在265nm或285nm进行测量。试验起始和结束之间的光密度差除以消光系数，然后乘以反应体积以测定转化为产物的底物摩尔数。产物摩尔数将除以相当于100%完成反应的底物摩尔数然后乘以100以获得脱氨百分比。检测极限通常为0.001光密度单位。

实施例20

核苷类似物三磷酸酯的合成

核苷类似物三磷酸酯由相应的核苷使用Ludwig and Eckstein's方法合成(Ludwig J,Eckstein F.“Rapid and efficient synthesis of nucleoside5'-O-(1-thiotriphosphates),5'-triphosphates and2',3'-cyclophosphorothioates using2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one”J.Org.Chem.1989,54631-5)。粗制核苷类似物三磷酸酯可通过例如使用HiLoad26/10Q Sepharose Fast FlowPharmacia柱和TEAB缓冲液(pH7.0)梯度的FPLC进行纯化。产物可通过UV光谱、质子和磷NMR、质谱和/或HPLC鉴定。

所得三磷酸酯可用作上文所述细胞药理学检测的对照以及与HCV-Pol用于动力学研究（例如，2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤核苷三磷酸酯与HCV-Pol）。

实施例21

HCV复制分析¹

将含HCV复制子RNA的Huh7克隆B细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板，并在接种后立即以10μM的浓度一式三份地进行化合物测试。五天培养(37℃,5%CO₂)后，使用Gentra的versaGene RNA纯化试剂盒分离总的细胞RNA。复制子RNA和内部对照(TaqMan rRNA对照试剂,Applied Biosystems)以一步、多重Real Time RT-PCR分析进行扩增。化合物的抗病毒效力通过从非药物对照的阈值RT-PCR循环减去受试药物的阈值RT-PCR循环来计算(ΔCt HCV)。ΔCt3.3等于复制子RNA水平的1-log的减少（等于少于90的起始材料）。化合物的细胞毒性同样用ΔCt rRNA值进行计算。(2'-C-Me-C)被用作对照。为确定EC₉₀和IC_5O值²，首先将ΔCt:值转化为起始材料的分数³，然后用于计算抑制%。三种化合物（化合物12、化合物8a和化合物8b-up）的数据示于以下表3。

表3：HCV复制子数据

如表3所示，在HCV复制子检测中8b-up的效力是8b-down的约10倍。

表4显示与1b WT杂基因型和EC₉₀ ^*的抗性复制子相比的成倍增加。

表4

参考文献：

1.Stuyver L et al.,Ribonucleoside analogue that blocks replication or bovineviral diarrhea and hepatitis C viruses in culture.Antimicrob.Agents Chemother.2003,47,244-254.

2.Reed IJ&Muench H,A simple method or estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27:497,1938.

3.Applied Biosystems Handbook

实施例22

西尼罗病毒对本文所述化合物的敏感性也可使用在Song,G.Y.,Paul,V.,Choo,H.,Morrey,J.,Sidwell,R.W.,Schinazi,R.F.,Chu,C.K.Enantiomericsynthesis of D-and L-cyclopentenyl nucleosides and their antiviral activity againstHIV and West Nile virus.J.Med.Chem.2001,44,3985-3993中描述的分析进行评估。

实施例23

黄热病对本文所述化合物的敏感性也可如前人在Julander,J.G.,Furuta,Y.,Shafer,K.,Sidwell,R.W.Activity of T-1106in a Hamster Model of Yellow FeverVirus Infection.Antimicrob.Agents Chemother.2007,51,1962-196中描述的进行检测。

实施例24

登革病毒对本文所述化合物的敏感性可使用由Lim et al.,A scintillationproximity assay for dengue virus NS52′-O-methyltransferase—kinetic and inhibitionanalyses,Antiviral Research,Volume80,Issue3,December2008,Pages360-369公开的高通量分析进行评估。

登革病毒(DENV)NS5在其N末端的氨基酸序列具有甲基转移酶(MTase)活性，并且负责该病毒基因组RNA中1型帽结构m7GpppAm2′-O的形成。DENV22′-O-MTase活性的最佳体外条件可使用纯化的重组蛋白和短的生物素化的GTP-加帽的RNA模板鉴定。从初始速度得出的稳态动力学参数可用于建立用于化合物测试的稳健的亲近闪烁分析。由Lim et al.,Antiviral Research,Volume80,Issue3,December2008,Pages360-369的预培养研究显示，MTase–AdoMet和MTase–RNA复合物同样具有催化能力，并且该酶支持随机双向双动力机制。Lim验证了用竞争性抑制剂S-腺苷基-同型半胱氨酸和两个同系物西奈芬净和脱氢西奈芬净的分析。先前将存在于DENV2MTase的N末端的GTP结合口袋假定为所述帽结合位点。该分析允许2′-O-MTase活性的快速和高灵敏度检测并可容易地适用于抑制化合物的高通量筛选。其也适合于很多RNA加帽MTase的酶活性测定。

实施例25

抗诺如病毒活性

化合物可通过抑制诺如病毒聚合酶和/或解旋酶、通过抑制复制周期中需要的其它酶或者通过其它途径显示抗诺如病毒活性。

目前对于诺如病毒感染还没有批准的药物治疗，这可能至少部分是因为细胞培养系统的可用性的缺乏。近来，已开发出用于原始诺瓦克G-I株的复制子系统(Chang,K.O.,et al.(2006)Virology353:463-473)。

为了使复制子的复制发生，诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子二者均需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶为功能性的。最近，已报道利用诺如病毒基因型组I和II接种体的体外细胞培养感染力分析(Straub,T.M.et al.(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)。该分析利用微载体珠上的小肠上皮细胞在旋转壁式生物反应器中进行。该感染力分析可被用于筛选进入抑制剂。

实施例26

HepG2细胞中的细胞药理学

HepG2细胞从美国模式培养物保藏所（Rockville,MD）获得，并在补充有非必需氨基酸、1%青霉素-链霉素的极限必需培养基中、在225cm²的组织培养瓶中生长。每三天更新该培养基，并且每周一次传代该细胞。在暴露于30ml胰蛋白酶-EDTA10min使附着的单层细胞脱离并用培养基连续洗涤三次后，将融合的HepG2细胞以每孔2.5x10⁶个细胞的密度接种于六孔板，并暴露于10μM的[³H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)特定的时长。

该细胞维持在37℃、5%CO₂气氛下。在选择的时间点，将该细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。

细胞内的活性化合物及其各自的代谢物通过将该细胞团用60%甲醇在-20℃孵育过夜来提取，随后在冰浴中用另外的20pal的冷甲醇提取1小时。然后将提取物合并、在温和的过滤空气流下干燥并在-20℃储存直到HPLC分析。

实施例27

Huh7细胞中的细胞药理学

与HepG2细胞药理学所概述的方法相似，将化合物以50μM的浓度一式三份地在Huh-7细胞中孵育4小时。3TC可用作阳性对照且一式两份地进行，而DMSO(10μL)可作为空白对照一式两份地进行孵育。冰冷的70%甲醇可用作提取溶剂。ddATP(10nM)可用作内标准。

当将母体2,6-二氨基-2’-C-甲基嘌呤核苷12与Huh7细胞孵育时，LC/MS分析显示非常低水平的相应的2,6-二氨基-2’-C-甲基嘌呤三磷酸酯。检测到的主要的三磷酸酯起因于2,6-二氨基碱基向相应的鸟嘌呤类似物的转化（图6）。

当12的磷酰胺酯（也就是8a）与Huh7细胞孵育时，LC/MS分析显示出乎意料高水平的相应的2,6-二氨基-2’-C-甲基嘌呤三磷酸酯。此外，鸟嘌呤类似物三磷酸酯也被检测到（图7）。

图8显示磷酰胺酯如何出乎意料地改变2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤12的代谢途径并以迄今为止不可获得的治疗相关浓度细胞内递送2,6-二氨基-2’-C-甲基嘌呤三磷酸酯。另外，两种HCV活性三磷酸酯（一种为A类似物，一种为G类似物）的细胞内递送对细胞激酶的饱和和耐药性病毒的选择有影响。

图9显示在Huh7细胞中用50μM8b-up孵育4h后形成的核苷酸LC/MS分析。这些细胞药理学导致用于8b-up的Huh7细胞显示出具有2,6-二氨基和G三磷酸酯二者的细胞内递送的代谢抑制（图10）。

实施例28

PBM细胞中的细胞药理学

测试化合物在37℃以50μΜ在PBM细胞中孵育4h。然后去除包含培养基的药物并将该PBM细胞用PBS洗涤两次以去除细胞外药物。使用1mL70%冰冷的甲醇(含10nM的内标准ddATP)从10x10⁶PBM细胞提取细胞内药物。沉淀后，将样品在室温维持15min随后涡旋30秒，然后在-20℃储存12h。然后将上清蒸干。干燥的样品储存于-20℃直到LC-MS/MS分析。在分析前，将各样品重新溶解于100μL的流动相A并以20,000g离心以去除不溶性微粒。

在Hypersil GOLD柱(100x1.0mm,3μm粒径;Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)上进行梯度分离。流动相A由2mM磷酸铵和3mM己胺组成。15分钟内，乙腈由10%增加至80%，并在80%保持3min。在10%乙腈的平衡持续15min。总运行时间为33min。流速维持在50μL/min并使用10μL注射。自动进样器和柱室通常分别维持在4.5和30℃。

该分析的前3.5min被转入废液。质谱仪用3.2kV的喷雾电压在阳离子模式下运行。

对于DAPD的情况，通过引入磷酰胺酯观察到6-位代谢的更引人注目的抑制。首先，包含6-氨基的DAPD在37℃以50μM在PBM细胞中4h的细胞内代谢的检测导致检测到高水平的DXG-TP，以及DXG和DXG-MP。然而却观察到低水平的DAPD，没有检测到DAPD的磷酸化形式（图11）。

相反地，包含6-氨基的磷酰胺酯RS-864和5’-MP前药在PBM细胞中的孵育导致检测到低水平的DXG、DXG-MP和DXG-TP(图12)。然而，与DAPD的孵育相比，检测到了非常高水平的DAPD-TP。另外，也观察到低水平的DAPD、DAPD-MP、DAPD-DP。如LC/MS/MS分析所测定的，DXG-TP(6-OH)与DAPD-TP(6-NH₂)的比值约为2到98。基于DAPD-MP前药的孵育产生的细胞内DAPD-TP的高水平表明该MP前药已有效地限制或阻止所述6-氨基到6-OH的转化。

实施例29

食蟹猴中的生物利用度分析

以下步骤可被用于确定化合物是否为生物可利用的。在该研究开始前的一周内，食蟹猴可外科植入慢性静脉导管和皮下静脉进入孔以便血液采集并可进行包括血液学和血清化学评估和体重记录的体检。随着每只猴子（共六只）或者通过静脉大丸药(3只猴子,IV)或者通过口服灌胃(3只猴子,PO)以5mg/mL的剂浓度、以10mg/kg的剂水平给予活性化合物，每只猴子接受约250μCi的³H活性。每个加药注射器在给药前称重以重量法测定所给予制剂的量。尿样以指定的时间(大约18-0小时给药前,0-4、4-8和8-12小时给药后)间隔通过水槽（pancatch）采集并进行处理。同样地，血液样品通过所述慢性静脉导管和VAP采集，或在所述慢性静脉导管方法不可行时从末梢血管采集（给药前,0.25、0.5、1、2、3、6、8、12和24小时后剂量）。分析血液和尿液样品的最大浓度(Cmax)、达到最大浓度时的时间(Tmax)、曲线下面积(AUC)、剂量浓度的半衰期(TV,)、清除率(CL)、稳态分布体积(Vss)以及生物利用度(F)。

实施例30

细胞保护分析（CPA）

该检测基本如Baginski,S.G.;Pevear,D.C.;Seipel,M.;Sun,S.C.C.;Benetatos,C.A.;Chunduru,S.K.;Rice,C.M.and M.S.Collett"Mechanism ofaction of a pestivirus antiviral compound"PNAS USA2000,97(14),7981-7986所述进行。在使用前24h，将MDBK细胞(ATCC)接种于96孔培养板（每孔4,000个细胞）。在以每个细胞0.02噬菌斑形成单位（PEU）的感染复数（MOI）用BVDV(NADL株,ATCC)感染后，将系列稀释的测试化合物以生长培养基中0.5%DMSO的终浓度加入感染和未感染的细胞。每个稀释一式四份进行测试。调整细胞密度和病毒接种物以确保整个实验过程中持续的细胞生长以及在感染后四天后在未处理对照中取得超过90%的病毒诱导的细胞破坏。四天后，将培养板用50%TCA固定并用磺酰罗丹明B染色。各孔的光密度在550nm处在酶标仪中读出。

50%有效浓度(EC₅₀)值被定义为使该病毒的细胞病变效应达到50%减少的化合物浓度。

实施例31

噬菌斑减少分析

对于化合物有效浓度通过噬菌斑减少测定在重复的24孔板中测定。细胞单层用100PFU/孔的病毒感染。然后，将在补充有2%失活血清和0.75%甲基纤维素的MEM中系列稀释的测试化合物加入所述细胞单层。培养物进一步在37℃孵育3天，然后用50%乙醇和0.8%结晶紫固定、洗涤和风干。然后计数噬菌斑以确定获得90%病毒抑制的浓度。

实施例32

产量减少分析

对于化合物，获得病毒载量6-log减少的浓度通过产量减少分析在重复的24孔板中测定。该分析如Baginski,S.G.;Pevear,D.C.;Seipel,M.;Sun,S.C.C.;Benetatos,C.A.;Chunduru,S.K.;Rice,C.M.and M.S.Collett"Mechanism ofaction of a pestivirus antiviral compound"PNAS USA2000,97(14),7981-7986所述并稍作修改进行。

简言之，在以每个细胞0.1PFU的感染复数(MOI)用BVDV(NADL株)感染前24小时，将MDBK细胞接种入24孔板(每孔2x10⁵个细胞)。将系列稀释的测试化合物以培养基中0.5%DMSO的终浓度加入细胞。每个稀释一式三份进行测试。三天后，细胞培养物（细胞单层和上清）通过三个冻-融循环溶解，以及病毒产量通过菌斑检测进行定量。简言之，在使用前24h，将MDBK细胞接种入6孔板(每孔5x10⁵个细胞)。将细胞与0.2mL的测试裂解物孵育1小时、洗涤并用生长培养基中的0.5%琼脂糖覆盖。3天后，细胞单层用3.5%甲醛固定并用1%结晶紫（w/v，50%乙醇中）染色以使菌斑可见。对菌斑计数以确定获得病毒载量6-log减少的浓度。

实施例33

诺如病毒感染的诊断

人们可以通过使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）在受影响的人的粪便中检测病毒RNA来诊断诺如病毒感染。该病毒可在症状发作后48到72小时内取得的粪便试样中鉴定，尽管人们可在症状发作后长达7天取得的样品上使用RT-PCR获得满意的结果。其它诊断方法包括用于至少间隔三周采集的成对血清的滴度升高的电子显微镜和血清学检测。也有商业可获得的酶联免疫分析试剂，但这些往往具有相对较低的灵敏度，限制了它们对于疾病发作的病因学诊断的使用。诺如病毒感染的临床诊断常常使用，特别当肠胃炎的其它病原体已经被排除时。

实施例34

体外抗病毒活性

体外抗病毒活性可在以下细胞系中进行评估：

诺瓦克G-I株(Chang,K.O.,et al.(2006)Virology353:463-473)、GII-4株复制子以及其它诺如病毒复制子可用于检测中以测定本文描述的化合物、或其它化合物或化合物库的体外抗病毒活性。在一些实施方案中，复制子系统为亚基因组的并因此使得可评估非结构蛋白的小分子抑制剂。丙型肝炎复制子有助于发现可用于治疗该病毒的治疗剂(Stuyver,L.J.,et al.(2006)Antimicrob.AgentsChemother.47:244-254)，这可为诺如病毒药物开发提供相同的好处。为了复制子的复制发生，诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子二者均需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶为功能性的。据信，本文描述的化合物抑制病毒聚合酶和/或病毒解旋酶。

也可使用已报道的使用诺如病毒基因型组I和II接种体(Straub,T.M.et al.(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)的体外细胞培养感染力分析。该分析可利用微载体珠上的小肠上皮细胞在旋转壁式生物反应器中进行。该感染力分析可用于筛选能抑制所需病毒的化合物。

虽然前述说明书教导了本发明的原理，以及提供了用于说明目的的实施例，但是可以理解的是，本发明的实践包括所有通常的变化、适应和/或修改，其均落入以下权利要求及其等同物的范围内。

Claims

1.式(A)化合物或式(B)化合物：

或其药学上可接受的盐或前药，其中：

当手性存在于磷中心处时，其可以全部地或部分地为R_p或S_p或它们的任意混合物

R¹为OH或F；

Y为O或S;

R²⁴选自OR¹⁵、

和脂肪醇，

其中，R¹⁵、R¹⁷和R¹⁸如下文所定义；

当体内施用时，R²和R³能提供在生物系统中部分或者完全地抵抗6-NH₂脱氨的一磷酸核苷或硫代一磷酸核苷。代表性的R²和R³独立地选自：

(a)OR¹⁵，其中R¹⁵选自H、Li、Na、K、苯基和吡啶基；苯基和吡啶基被一到三个取代基取代，所述取代基独立地选自(CH₂)_0-6CO₂R¹⁶和(CH₂)_0-6CON(R¹⁶)₂的；

R¹⁶独立地为H、C_1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

(b)

或者

(c)L-氨基酸

的酯，其中，R¹⁷仅限于在天然L-氨基酸中出现的基团，并且R¹⁸为H、C_1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

(d)R²和R³可连在一起形成环其中，R¹⁹为H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基；

(e)R²和R³可连在一起形成选自

和

的环

其中，R²⁰为O或NH，并且

R²¹选自H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链以及被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1--20烷基；其中所述取代基为C_1-5烷基、或者被低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C_3-10环烷基或环烷基取代的C_1-5烷基。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物为β-D构型。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物在生物系统中被转化为6-NH₂和6-OH嘌呤三磷酸酯的混合物C或D；

4.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物在生物系统中被转化为治疗相关浓度的2,6-二氨基2’-C-甲基嘌呤三磷酸酯E或2,6-二氨基2’-C-甲基2’-脱氧2’-氟代嘌呤三磷酸酯F；

5.该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，并且R⁴为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。

6.如权利要求5所述的化合物，其中，R¹、R⁴和R⁵的值选择如下：

R¹ R⁴ R⁵ OH Me Me F Me Me OH Et Et F Et Et OH i-Pr i-Pr F i-Pr i-Pr OH 油烯基油烯基 F 油烯基油烯基

7.该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，R⁶为H或碱金属，并且R⁷为衍生自脂肪醇的碳链。

8.如权利要求7所述的化合物，其中，R¹,R⁶和R⁷的值如以下所提供：

R¹ R⁶ R⁷ OH Na⁺ 亚油基

F Na 亚油基 OH K 亚油基 F K 亚油基 OH Na 油烯基 F Na 油烯基 OH K 油烯基 F K 油烯基

9.该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，并且R⁸为脂肪酸基。

10.如权利要求9所述的化合物，其中，R¹和R⁸的值如以下所提供：

R¹ R⁸ OH 亚油基 F 亚油基 OH 油烯基 F 油烯基

11.该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，并且R⁹为O或NH，并且R¹⁰为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。

12.如权利要求11所述的化合物，其中，R¹、R⁹和R¹⁰的值如以下所提供：

R¹ R⁹ R¹⁰ OH O Me F O Me OH NH Me F NH Me OH O Et F O Et OH NH Et F NH Et OH O i-Pr F O i-Pr OH NH i-Pr F NH i-Pr

13.具有该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，并且R¹¹为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链。

14.如权利要求13所述的化合物，其中，R¹和R¹¹的值如以下所提供：

R¹ R¹¹ OH Me F Me OH Et F Et OH i-Pr F i-Pr

15.该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，并且R¹²和R¹³独立地为O或NH。

16.如权利要求15所述的化合物，其中，R¹、R¹²和R¹³的值如以下所提供：

R¹ R¹² R¹³ OH O O F O O OH O NH F O NH OH NH NH F NH NH

17.具有该式的化合物：

其中，R¹如权利要求1中所定义，R⁴为C_1-6烷基或衍生自脂肪醇的碳链，并且R¹²为O或NH。

18.如权利要求17所述的化合物，其中，R¹,R⁴和R¹²的值如以下所提供：

R¹ R⁴ R¹² OH Me O F Me O OH Et O F Et O OH i-Pr O F i-Pr O OH 油烯基 O OH Me NH F Me NH OH Et NH F Et NH OH i-Pr NH F i-Pr NH OH 油烯基 NH F 油烯基 NH

19.该式的化合物：

其中，

并且R¹¹、R⁷和R¹³如上文所定义。

20.一种制备权利要求1的化合物的方法，其中，磷-5’-氧键是通过与通式G或H的试剂反应而形成的：

其中：

式G或H的磷中心处的手性可全部或部分地为R_p或S_p或它们的任意混合物，

Y、R²和R³如上文所定义，并且

R²²独立地为H、C_1-20烷基、CF₃、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基、或者由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氯、氟、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基；

21.如权利要求20所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法还包括通过结晶所述G或H的非对映混合物而分离磷非对映体的步骤。

22.如权利要求20所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法进一步包括通过使式I的化合物与式G或H的非对映混合物反应而分离磷非对映体的步骤，

其中，R²²如上文所定义，并且R²³选自H、Li、Na、K、NH₄和与Ca、Mg的二盐。

23.如权利要求20所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法还包括通过使式I化合物与式G或H的单一或富集的非对映体反应而使磷的立构中心反转的步骤，

其中，R²²如上文所定义，并且R²³选自H、Li、Na、K、NH₄和与Ca或Mg的二盐。

24.一种制备醇的含磷类似物的方法，其中，磷氧键通过与具有1°、2°或3°醇或者1°、2°或3°醇盐的通式G或H的试剂反应而形成，

其中：

Y、R²和R³如上文所定义，并且

R²²独立地为H、C_1-20烷基、CF₃、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基、或者由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氯、氟、芳基如苯基、杂芳基如吡啶基、取代芳基或取代杂芳基取代的C_1-20烷基。

25.如权利要求24所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法还包括通过结晶所述G或H的非对映混合物而分离磷非对映体的步骤。

26.如权利要求24所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法还包括通过使式I化合物与式G或H的非对映混合物反应而分离磷非对映体的步骤，

27.如权利要求24所述的方法，其中，当式G或H的R²和/或R³包含手性中心时，所述方法还包括通过使式I化合物与式G或H的单个或富集的非对映体反应而使磷的立构中心反转的步骤，

28.一种制备式A或B化合物的方法，包括2,6-二氨基嘌呤或可被转化为2,6-二氨基嘌呤的嘌呤与1’-糖磺酸酯J：

的反应，其中Pr为保护基。

29.化合物J

其中Pr为保护基。

30.权利要求1-19中任一项的化合物在制备用于治疗黄病毒科感染、预防黄病毒科感染或者降低黄病毒科家族病毒感染的生物活性的药剂中的用途。

31.如权利要求30所述的用途，其中，所述病毒选自HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒。

32.如权利要求30所述的用途，其中，要被治疗的感染为HCV。

30、一种用于治疗受包括HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒的黄病毒科家族病毒感染的宿主的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

31、一种用于预防包括HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒的黄病毒科家族病毒感染的方法，包括对需要预防的患者施用预防有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

32、一种用于降低宿主中包括HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒的黄病毒科家族病毒感染的生物活性的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

33.一种用于治疗受包括HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒的黄病毒科家族病毒感染的宿主的方法，其包括施用有效量的在药学可接受的载体中的权利要求1到19的任一项的化合物，连同另一种抗黄病毒科病毒剂。

34.一种用于预防包括HCV、黄热病、登革、基孔肯雅和西尼罗病毒的黄病毒科家族病毒感染的方法，包括对需要预防的患者施用预防有效量的在药学可接受的载体中的权利要求1-4的任一项的化合物，连同另一种抗黄病毒科病毒剂。

35.包括权利要求1-19的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

36.一种用于治疗受诺如病毒或札幌病毒感染的宿主的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

37.一种用于预防诺如病毒或札幌病毒感染的方法，包括对需要预防的患者施用预防有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

38.一种用于降低宿主中诺如病毒或札幌病毒感染的生物活性的方法，包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1-19的任一项的化合物。

39.一种用于治疗受诺如病毒或札幌病毒感染的宿主的方法，其包括施用有效量的在药学上可接受的载体中的权利要求1-19的任一项的化合物，连同另一种抗诺如病毒或抗札幌病毒剂。

40.一种用于预防诺如病毒或札幌病毒感染的方法，包括对需要预防的患者施用预防有效量的在药学上可接受的载体中的权利要求1-19的任一项的化合物，连同另一种抗诺如病毒或抗札幌病毒剂。

41.权利要求1-19的药物组合物，还包括第二抗病毒剂。

42.权利要求37的药物组合物，其中，所述第二抗病毒剂选自干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、非核苷聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、核苷酸或核苷类似物、IRES-依赖的翻译的抑制剂和它们的结合。