CN1036681C - 一种用于分析体液的液相色谱固定相的合成方法 - Google Patents
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Abstract
提出了一种制备体液直接进样分析用高效液相色谱固定相的方法，该方法分两步进行：第一步是多孔硅胶和硅烷中的烷氧基反应，键合上与体液中分析物有分子间相互作用的基团，第二步利用硅烷中剩余的烷氧基和聚乙二醇交联，增加键合相的亲水性。该固定相对体液中大分子不保留，而保留分析物小分子并进行色谱分离。根据分析物的性质，可以选择含有不同性质基团的硅烷，合成一系列体液直接进样分析用固定相，适用于体液试样，如尿、血清、血浆、脑脊髓液等。
Description
本发明是关于高效液相色谱固定相的合成方法。
用于体液直接进样分析的高效液相色谱固定相对于体液中的蛋白质不保留，而分析物能被其保留，进行色谱分离，这种固定相能广泛用于药物分析和临床分析，具有重要的商业价值。
美国4544485号专利介绍了一种内表面反相填料(ISRP)。其制备方法是，硅胶(5μm，8nm)首先和γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷反应，引入缩水甘油氧基丙基键合相，然后用羰基二咪唑活化，通过氨基甲酸酯键合，将肽Gly-L-Phe或Gly-L-Phe-L-Phe的N端连到缩水甘油氧基丙基上，最后用羧基肽酶A使肽链上的苯丙氨酸残基从硅胶外表面上断裂，这种固定相的不足之处是，由于使用酶反应，产品成本高，且每批产品之间的重现性难以得到保证。
一个正在审理的，属于Feibush和Gisch美国专利中，制备了一种体液直接进样用固定相，称作屏蔽疏水固定相(SHP)。SHP的载体上键合有一个亲水性聚氧化乙烯的网状结构，包裹在其内部的是疏水的苯基。体液中的小分子溶质可以通过网状结构，渗入内部，与疏水基团作用而被保留。大分子，如蛋白质，则被亲水屏蔽网所阻拦，不被保留从柱上洗脱下来。SHP柱的应用研究也报告在J.Chromatogr.，433(1988)264。
Desilets，Rounds和Regnier介绍了半透表面反相柱填料的合成。该填料以10nm硅胶为基体，疏水的键合相之外共价键合聚乙二醇，形成一个亲水高聚物半透层，由于半透层的阻挡，生物试样中的蛋白质不能与疏水相接触，而小分子却能通过半透表面实现色谱分离。
Haginaka和Wakai为提高制备填料的重复性和避免使用酶反应，发展了混合功能团固定相(MFP)。合成MFP包括三个基本步骤：引入γ-缩水甘油氧基丙基，引入疏水基团，环氧键转化为双醇基，MFP硅胶载体的内外表面含有相同的亲水和疏水基团，在新制备的MFP柱上，将人血清试样几次进样后，血清白蛋白的回收率就可达到100％。这表明，外表面的吸附部位被蛋白质封闭后，MFP就可用于直接进样分析。
半透表面反相柱填料和混合功能团固定相都是通过γ-缩水甘油氧基引入亲水基团，由于该基团和疏水基团都是通过硅烷和硅胶上的硅羟基反应被键合，在硅胶上难以同时保持较多的亲水和疏水基团存在。
与本发明有关的已有技术可在下列文献中找到：
[1]T.C.Pinkerton，J.Chromatogr.，544(1991)13.
[2]J.A.Perry，J.Liq.Chromatogr.，13(1990)1047.
[3]D.J.Gisch；B.T.Hunter；B.Feibush，J.Chromatogr.，433(1988)264.
[4]C.P.Desilets；M.A.Rounds；F.E.Regnier，J.Chromatogr.，544(1991)25.
[5]J.Haginaka；J.Wakai，Chromatographia，29(1990)223.
本发明的目的是提出用于体液直接进样分析固定相的新合成方法，该法有如下特点：1.合成路线简单；2.成本最低；3.不同批次的产品之间重现性好；4.由于采用新的合成路线，使键合相同时具有较多可与小分子相互作用的基团和亲水基团，前者对药物等小分子的保留是至关重要的，而后者的存在使体液中的蛋白质不被或较少程度地保留在色谱柱上。
本发明的基本构思是，含三个烷氧基的硅烷与硅胶反应后，在键合相的硅烷分子中，未与硅羟基作用的剩余烷氧基可进一步和聚乙二醇反应，增加键合相的亲水性，引入亲水基团并不是通过和硅胶载体上羟基的作用来实现的，因此，不存在和原有的键合反应竞争硅羟基的问题。这是增加键合相亲水性简单且合理的途径。在所有技术文献中，其研究方法均与本发明构思不同。本发明的构思已通过实验发展成为实用技术。
实现本发明的方法包括两个步骤。第一步是把R基三烷氧基硅烷R-Si-(OR’)3键合到硅胶上。根据分析物的性质，可选择不同R基的硅烷进行键合反应。R可以是苯基、烷基，或含氨基、氰基、巯基的基团；第二步是利用第一步反应产物和聚乙二醇反应，增加键合相的亲水性。根据分析物的性质，R基可以是极性的，非极性的或具有离子交换性质的基团。因此，可按上述合成途径，制备出一系列的体液直接进样分析用固定相。
聚乙二醇的引入，除增加亲水性外，还使键合相具有一些新的性质，如亲核基团的存在，可抑制硅胶基体上残余的硅羟基效应。
对人血清中一些药物的实验结果表明，根据本发明合成的固定相，可以用于体液中疏水性和亲水性药物的色谱分析。
本发明的技术实施过程为：
1.键合反应：使R-Si-(OR’)3和硅胶反应，R基可以是苯基、烷基，或含氨基、氰基、巯基的基团，烷氧基可以是甲氧基或乙氧基。反应溶剂为甲苯，反应温度为溶剂沸点温度。根据R基的性质，可在碱性催化剂(如三乙胺)存在下，或无催化剂进行反应。
2.将键合反应产物和聚乙二醇反应，增加键合相的亲水性。该反应是酯交换反应，所考虑的反应条件包括：溶剂的选择、反应物的浓度、催化剂、反应温度和反应时间等。
3.基体硅胶的选择：考虑到色谱分析效率和对体液中大分子的排阻作用，使用粒径为5-40μm，孔径为6-10nm多孔硅胶。
4.反应溶剂：键合相与聚乙二醇之间的反应，可选用甲苯或二甲亚砜，四氯化碳等为溶剂。
5.反应物浓度：酯交换反应为可逆反应，为了促使反应向正反应方向进行，一般聚乙二醇和键合相上的硅烷基的配比为5-10∶1.根据不同分子量聚乙二醇的实验结果，选择分子量范围为200-1000的聚乙二醇作为交联剂。分子量过大，在反应溶剂中不易溶解；小分子量的聚乙二醇含较少的氧化乙烯单元，不利于增加键合相的亲水性。
6.催化剂：碱性物质的存在对酯交换反应有促进作用，三乙胺、吡啶、三甲胺、乙二胺等均可作为催化剂。
7.反应温度：在343K到溶剂沸点温度范围内进行键合相和聚乙二醇之间的反应。
8.反应时间：延长反应时间，对键合相和聚乙二醇之间的反应有利，一般在2-9小时内完成反应。
本发明有六个实施例如下：
1.制备含苯基直接进样用固定相。
5μm6-8nm的硅胶，经酸处理，水洗，在373K真空干燥后备用。
取上述硅胶3g于圆底烧瓶中，依次加入40mL甲苯、1mL苯基三乙氧基硅烷和0.5mL三乙胺。在搅拌条件下，沸点温度回流反应4小时。吸滤，依次用甲苯和甲醇洗涤，在358K真空干燥8小时，得苯基键合相。
取0.5g苯基键合相于圆底烧瓶中，加30mL甲苯、1mL四聚乙二醇和和0.5mL三乙胺。在搅拌下，沸点温度回流反应8小时。产物经吸滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，在358K真空干燥8小时，得含苯基体液直接进样分析用键合相。
产品的元素分析结果如下(基体硅胶比表面为272m2/g)：
C％ H％
苯基键合相 8.59 1.06
含苯基直接进样分析用键合相10.04 1.21
2.苯基键合相制备方法同实施例1.
取0.5g苯基键合相于圆底烧瓶中，加30mL甲苯、8.5mL吡比啶、1mL四聚乙二醇。在搅拌下，沸点温度回流反应8小时，产物经吸滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，在358K真空干燥8小时，产品的元素分析结果为C％9.64；H％1.12.
3.以小比表面的硅胶为原料，反应条件和步骤同实施例1.产品元素分析结果如下：
C％ H％
苯基键合相 3.42 0.32
含苯基直接进样分析用键合相5.00 0.58
4.制备含氨基直接进样分析用固定相
取2.5g 5μm 6-8nm硅胶于100mL圆底烧瓶中，加30mL甲苯、1.7mLγ-氨基丙基三乙氧基硅烷。在搅拌下，沸点温度回流5小时。产物经吸滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，在353K真空干燥12小时，得氨基键合相。
取氨基键合相2.5g于100mL圆底烧瓶中，加60mL甲苯、2mL四聚乙二醇和和0.3mL三乙胺。在搅拌下，沸点温度回流4小时。产物经吸滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，在353K真空干燥12小时，得含氨基直接进样分析用固定相。产品的元素分析结果如下(硅胶比表面为165m2/g)：
C％ H％ N％
氨基键合相 3.76 0.65 0.81
含氨基直接进样分析用键合相4.64 0.80 0.98
5.以大比表面硅胶(372m2/g)为原料，在实施例4条件下得到如下结果：
C％ H％ N％
氨基键合相 6.36 1.45 1.75
含氨基直接进样分析用键合相8.94 1.83 1.54
6.取实施例5中的氨基键合相1g于圆底烧瓶中，加25mL甲苯、5mL吡啶和2mL四聚乙二醇。在搅拌下，沸点温度回流4小时。产物经吸滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，在353K真空干燥12小时。产品的元素分析结果为：C％8.28；H％1.76；N％1.67.
Claims (2)
1.一种用于分析体液的液相色谱固定相的合成方法，其特征是：首先使硅烷R-Si-(OR’)3和多孔硅胶起键合反应，得到键合相，所说的R可以是烷基、苯基或含氨基、氰基、巯基的基团，OR’为甲氧基或乙氧基；然后在碱性催化剂的存在下，使所得的键合相和聚乙二醇反应，所说的碱性催化剂可以是三乙胺、吡啶、三甲胺与乙二胺，聚乙二醇的分子量范围为200-1000，聚乙二醇和键合相上硅烷基的配比为5-10∶1摩尔比，键合相与聚乙二醇反应所使用的溶剂可以为甲苯、二甲亚砜以及四氯化碳，反应温度从343K到所使用溶剂的沸点温度，反应时间为2-9小时。
2.根据权利要求1所说的一种用于分析体液的液相色谱固定相的合成方法，其特征是：所说的多孔硅胶的粒径为5-40μm，孔径为6-10nm。
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