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CN103649121B - 针对adp-核糖基环化酶2的抗体 - Google Patents

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CN103649121B CN201280031772.0A CN201280031772A CN103649121B CN 103649121 B CN103649121 B CN 103649121B CN 201280031772 A CN201280031772 A CN 201280031772A CN 103649121 B CN103649121 B CN 103649121B
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Abstract

本发明提供结合ADP‑核糖基环化酶2的抗体。还提供编码所述抗体的核酸分子，用于表达所述抗体的表达载体、宿主细胞和方法。所述抗体可以用于治疗人类癌症，包括急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌，以及人类炎性疾病、包括哮喘、痛风、克罗恩病、狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病和动脉粥样硬化。

Description

针对ADP-核糖基环化酶2的抗体
简介
本申请一般地涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本文中提供了针对ADP-核糖基环化酶2的抗体和其他治疗性蛋白，编码这类抗体和治疗性蛋白的核酸，用于制备单克隆抗体和其他治疗性蛋白的方法，和用于治疗疾病、如由ADP-核糖基环化酶2表达/活性介导和/或与其配体异常表达/活性相关的癌症的方法。
背景技术
ADP-核糖基环化酶2(也称作骨髓间质抗原1(BST1)或CD157)是脂质锚定的双功能胞外酶，它催化核糖核苷酸环化和水解。它产生能够激活钙释放和蛋白质磷酸化的核苷酸第二信使环状ADP-核糖和ADP-核糖(FEBS Lett.1994,356(2-3):244-8)。它能够以旁分泌方式支持前B细胞的生长，这可能是通过NAD+代谢物的产生(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994,91:5325-5329；J Biol Chem.2005,280:5343-5349)。
ADP-核糖基环化酶2及其同源物CD38似乎充当受体，产生通过兰尼碱受体诱导胞内Ca2+释放的第二信使代谢物(Biochem Biophys Res Commun.1996,228(3):838-45)。它也可以通过CD11b整联蛋白发挥作用以通过PI-3激酶途径实现Ca2+释放(J Biol RegulHomeost Agents.2007;21(1-2):5-11)。先前未报道BST1源自急性髓样白血病(AML)、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌或胰腺癌细胞膜并且代表一种具有新治疗价值和诊断价值的蛋白质。BST1也显示在单核细胞和粒细胞上表达，这两种细胞可能与多种疾病如哮喘、痛风、克罗恩病、狼疮和糖尿病相关并在其中激活。单核细胞也参与动脉粥样硬化斑块的形成。
发明简述
本申请提供针对BST1的抗体，编码这类抗体和治疗性蛋白的核酸、用于制备抗BST1抗体及其他治疗性蛋白的方法和用于治疗疾病的方法，如BST1介导的病症，例如人类癌症，包括急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和人类炎性疾病，包括哮喘、痛风、克罗恩病、狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病和动脉粥样硬化，下文称作‘本发明的疾病’。
因此，本申请提供与BST1结合和显示出一种或多种期望的功能特性的分离抗体、特别地鼠、嵌合、人源化及全人单克隆抗体。这类特性例如包括针对BST1的高亲和力特异性结合。还提供是，使用本发明的抗体、蛋白质和组合物治疗多种BST1介导的疾病的方法。
在一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有：
a)重链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:10具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:51具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:14具有至少80%同一性的序列的第三CDR；和
b)轻链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:16具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:18具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:20具有至少80%同一性的序列的第三CDR。
在又一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有：
a)重链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:9具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:11具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:13具有至少80%同一性的序列的第三CDR；和
b)轻链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:15具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:17具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:19具有至少80%同一性的序列的第三CDR。
在又一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有：
a)重链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:56具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:57具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:58具有至少80%同一性的序列的第三CDR；和
b)轻链可变区，其包含：
i)包含与SEQ ID NO:59具有至少80%同一性的序列的第一CDR；
ii)包含与SEQ ID NO:60具有至少80%同一性的序列的第二CDR；
iii)包含与SEQ ID NO:61具有至少80%同一性的序列的第三CDR。
由本发明抗体识别的表位存在于SEQ ID NO:44的多肽序列内。
在又一个实施方案中，与本文所述的亲本抗体相比，本发明的抗体包含可变的CDR。因此，本发明提供包含亲本抗体的变异可变区的变异抗体，其中所述亲本抗体含有包含SEQ ID NO:10的第一vhCDR、包含选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:51的序列的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:14的第三vhCDR、包含SEQ ID NO:16的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:18的第二vlCDR和包含SEQ ID NO:20的第三vlCDR，并且其中所述变异抗体在第一vhCDR、第二vhCDR、第三vhCDR、第一vlCDR、第二vlCDR和第三vlCDR的集合中总体上具有1、2、3、4、5或6个氨基酸置换，伴随1至4个特殊用途的置换，并且其中抗体保留针对BST1的特异性结合。类似地，亲本抗体可以包含以下CDR：包含SEQ ID NO:9的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:11的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:13的第三vhCDR；包含SEQ ID NO:15的第一vlCDR、包含SEQ IDNO:17的第二vlCDR和包含SEQ ID NO:19的第三vlCDR。另外，亲本抗体可以包含以下CDR：包含SEQ ID NO:56的第一vhCDR、 包含SEQ ID NO:57的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:58的第三vhCDR；包含SEQ ID NO:59的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:60的第二vlCDR和包含SEQ ID NO:61的第三vlCDR。
在又一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有如SEQ ID NO:2所代表的重链可变区序列和如SED ID NO:4所代表的轻链可变区序列。
在另一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有如SEQ ID NO:45所代表的重链可变区序列和如SED ID NO:49所代表的轻链可变区序列。
在另一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有如SEQ ID NO:1所代表的重链可变区序列和如SED ID NO:3所代表的轻链可变区序列。
在又一个实施方案中，分离的抗BST1抗体拥有如SEQ ID NO:52所代表的重链可变区序列和如SED ID NO:53所代表的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，前述抗体的任一种拥有Fc结构域。在一些实施方案中，该Fc结构域是人的。在其他实施方案中，该Fc结构域是变异的人Fc结构域。
在另一个实施方案中，前述抗体的任一种是单克隆抗体。
在一个实施方案中，前述抗体的任一种还拥有缀合的试剂。在一些实施方案中，缀合的试剂是细胞毒性剂。在其他实施方案中，缀合的试剂是聚合物。在另一个实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在另一个实施方案中，PEG是PEG衍生物。
在一个实施方案中，分离的抗体是与前述抗体的任一种竞争结合至BST1的抗体。
在另一个实施方案中，描述了一种用于制备前述抗体的任一种的方法，该方法包括，获得含有编码前述抗体的一种或多种核酸分子的宿主细胞，在宿主细胞培养物中培育宿主细胞，向宿主细胞培养物提供其中表达一种或多种核酸分子的条件，并且从宿主细胞或宿主细胞 培养物回收抗体。
在一个实施方案中，在药物组合物中提供所述抗BST1抗体的任一种。
在另一个实施方案中，提供用于治疗或预防与BST1相关的疾病的方法，该方法包括，向有此需要的受试者施用有效量的前述抗体的任一种。
本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，其结合人BST1上由下述抗体识别的表位：所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:2、1和52的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:4、3、54和55的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体和双特异性抗体。抗体片段可以选自：UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含治疗剂。在本发明的另一个方面，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
在一些实施方案中，本发明的抗体选自：亲和体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。
在可选实施方案中，本发明的组合物包含分离的抗体或抗原结合部分和可药用载体。
在其他方面，本发明的抗体是包含本发明的分离的抗体或抗原结合部分及可药用载体的组合物。
在一些实施方案中，本发明包含分离的核酸分子，其编码与人BST1上的表位结合的分离的抗体或抗原结合部分的重链或轻链。本发明的其他方面包括了包含这类核酸分子的表达载体和包含这类表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备抗BST1抗体的方法，所述方法包括步骤：获得含有编码本发明抗体的一种或多种核酸 分子的宿主细胞；在宿主细胞培养物中培育宿主细胞；向宿主细胞培养物提供其中表达一种或多种核酸分子的条件；并且从宿主细胞或从宿主细胞培养物回收抗体。
在其他实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防与表达BST1的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括，向受试者以有效治疗或预防该疾病的量施用抗BST1抗体或其抗原结合部分的步骤。在一些方面，由本发明抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病是人类癌症。在一些实施方案中，由本发明抗体治疗或预防的疾病包括本发明的疾病。
在其他实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防与表达BST1的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者以有效治疗或预防该疾病的量施用抗BST1抗体或其抗原结合部分的步骤。在一些方面，由本发明抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病是人类癌症。在一些实施方案中，由本发明抗体治疗或预防的疾病是本发明的疾病。
在其他实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防与表达BST1的靶细胞相关的疾病的抗BST1抗体或其抗原结合部分。在一些方面，由本发明抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病是人类癌症。在一些实施方案中，由本发明抗体治疗或预防的疾病是本发明的疾病。
在其他实施方案中，本发明涉及抗BST1抗体或其抗原结合部分的用途，用于制备用以治疗或预防与表达BST1的靶细胞相关的疾病的药物。在一些方面，由本发明的药物治疗或预防的疾病是人类癌症。在一些实施方案中，由本发明的药物治疗或预防的疾病是本发明的疾病。
在其他实施方案中，本发明是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，其结合人BST1上由下述抗体识别的表位：所述抗体包含选自下列的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NO:2中所述的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:4中所述的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:1中所述的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:3中所述的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:52中所述的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:53中所述的轻链可变区氨基酸序列。在其他方面，抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗 体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体和双特异性抗体。在本发明的其他方面，抗体片段选自：UniBody、结构域抗体和纳米抗体。在一些实施方案中，抗体模拟物选自：亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。在其他实施方案中，组合物包含分离的抗体或其抗原结合部分和可药用载体。
在一些实施方案中，本发明是分离的核酸分子，其编码本发明的分离的抗体或其抗原结合部分的重链或轻链，并且在其他方面可以包括包含这类核酸的表达载体和包含这类表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个实施方案是表达任一种本发明抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
本发明的其他方面涉及制备本发明抗体的方法，所述方法包括步骤：
用BST1肽免疫动物；
从所述动物的B细胞回收mRNA；
将所述mRNA转化成cDNA；
在噬菌体中表达所述cDNA，从而由所述cDNA编码的抗BST1抗体呈递在所述噬菌体的表面上；
选择呈递抗BST1抗体的噬菌体；
从所选择的编码所述抗BST1免疫球蛋白的噬菌体回收核酸分子；
在宿主细胞中表达所述回收的核酸分子；和
从所述宿主细胞回收与BST1结合的抗体。
在本发明的一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合，由下述抗体识别的具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的BST1多肽上的表位：所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:2、1或52的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:4、3或53的氨基酸序列。
本发明的其他特征和优点将从不应当解释为限制性的以下详细描述和实施例中显而易见。本申请引用的全部参考文献、Genbank条目、专利和公布的专利申请的内容通过引用的方式并入本文。
附图简述
图1a显示A1的重链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)与小鼠种系VH1-80核苷酸序列的第138392-138424位核苷酸(SEQ ID NO:33)的比对结果；A2的重链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)与小鼠种系VH1-39核苷酸序列的第153362-153394位核苷酸(SEQ ID NO:35)的比对结果。
图1b显示A1的重链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)与小鼠种系VH1-80核苷酸序列的第138461-138511位核苷酸(SEQ ID NO:34)的比对结果；A2的重链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)与小鼠种系VH1-39核苷酸序列的第153431-153481位核苷酸(SEQ ID NO:36)的比对结果。
图2a显示A1的轻链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)与小鼠种系VK4-74核苷酸序列的第496-531位核苷酸(SEQ ID NO:37)的比对结果；A2的轻链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)与小鼠种系VK4-55核苷酸序列的第523-552位核苷酸(SEQ ID NO:40)的比对结果。
图2b显示A1的轻链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)与小鼠种系VK4-74核苷酸序列的第577-597位核苷酸(SEQ ID NO:38)的比对结果；A2的轻链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)与小鼠种系VK4-55核苷酸序列的第598-618位核苷酸(SEQ ID NO:41)的比对结果。
图2c显示A1的轻链CDR3区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)与小鼠种系VK4-74核苷酸序列的第691-718位核苷酸(SEQ ID NO:39)的比对结果；A2的轻链CDR3区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)与小鼠种系VK4-55核苷酸序列的第715-739位核苷酸(SEQ ID NO:42)的比对结果。
图3a和3b显示A549和H226细胞上的BST1的流式细胞分析的结果。
图4a和4b显示抗BST1单克隆抗体由A549和H226细胞内化，使用MabZAP测定法。
图5显示SEQ ID NO:2的第21-137位残基(SEQ ID NO:45)、SEQ ID NO:2的CDR区(以粗体突出显示)被转移至人种系BF238102VH的相应位置的人源化VH链(SEQ ID NO:46)与人种系BF238102VH(SEQ ID NO:47)的比对结果。将显示明显与CDR区接触的残基置换为相应的人残基。这些置换(加下划线)在位置30、48、67，71和100处进行。
图6显示SEQ ID NO:4的第22-128位残基(SEQ ID NO:48)、SEQ ID NO:4的CDR区(以粗体突出显示)被转移至人种系X72441VL的相应位置的人源化VL链(SEQ ID NO:49)与人种系X72441 VL(SEQ ID NO:50)的比对结果。将显示明显与CDR区接触的残基置换为相应的人残基。一个置换(加下划线)在位置71处进行。
图7显示A2重链的CDR2区域(SEQ ID NO:12)与不损失抗原结合亲和力的可能氨基酸置换(SEQ ID NO:51)的比对结果。
图8显示BST1_A2和BST1_A2_NF在效应细胞存在下激发抗体依赖性细胞毒(ADCC)反应。
发明详述
本申请涉及本文所述的以高亲和力与BST1特异性结合的分离抗体，例如，包括但不限于单克隆抗体。在某些实施方案中，提供的抗体拥有特定结构特征，如具有特定氨基酸序列的CDR区。本申请提供分离的抗体(如下文所示，其包括类型广泛的熟知结构物、衍生物、模拟物和缀合物)、产生所述分子的方法和包含所述分子及可药用载体的药物组合物。本申请也涉及使用分子的方法，例如以检测BST1以及治疗与BST1表达(如肿瘤上表达的BST1)相关的疾病和炎性疾病，包括本发明的疾病。
为了可以更轻易地理解本公开内容，首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中给出。
在某些情况下，本申请的人源化和鼠抗体可以与来自除人之外的 物种的BST1交叉反应。在某些实施方案中，抗体可以对一种或多种人BST1完全特异，并且可以不显示出物种型或其他类型的非人类交叉反应性。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致选择性损伤、破坏或从人体中消除正在入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫性或病理炎症的情况下正常的人细胞或组织。
“信号转导途径”指在信号从细胞一个部分传播至细胞的另一个部分中发挥作用的各种信号转导分子之间的生物化学关系。如本文所用，短语“细胞表面受体”例如包括，能够接收信号和跨细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。“细胞表面受体”的例子是BST1。
如本文提到的，术语“抗体”至少包括免疫球蛋白的抗原结合片段(即“抗原结合部分”)。
“抗体”的定义包括，但不限于，全长抗体、抗体片段，单链抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称作“抗体缀合物”)和前述每一者的片段和/或衍生物。通常而言，全长抗体(有时在本文中称作“完整抗体”)指，可以包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL或VK)和轻链恒定区。轻链恒定域包含一个结构域CL。VH区和VL/VK区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间间插有更保守的区域，名为框架区(FR)。每个VH和VL/VK包含从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的3个CDR和4个FR。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补系统统的第一组分(C1q))结合。
在一个实施方案中，抗体是抗体片段。具体的抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段、(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段、(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段、(iv)由单一可变域组成的dAb片段、(v)分离的CDR区、(vi)F(ab′)2片段，包含两个相连的Fab片段的双价片段、(vii)其中VH结构域和VL结构域由允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接的单链Fv分子(scFv)、(viii)双特异性单链Fv二聚体和(ix)“双体抗体(diabody)”或“三体抗体(triabody)”，通过基因融合所构建的多价或多特异性片段。抗体片段可以被修饰。例如，可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键使分子稳定。抗体样式和构造的例子在Holliger和Hudson(2006)NatureBiotechnology 23(9):1126-1136，和Carter(2006)Nature Reviews Immunology 6:343-357以及其中引用的参考文献中描述，所述文献均明确地通过引用的方式并入本文。
本申请提供抗体类似物。这些类似物可以包括多种结构物，包括但不限于全长抗体、抗体片段、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称作“抗体模拟物”)、抗体融合物、抗体缀合物和前述每一者的片段。
在一个实施方案中，免疫球蛋白包括抗体片段。具体的抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段、(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段、(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单一可变域组成的dAb片段、(v)分离的CDR区、(vi)F(ab′)2片段，包含两个相连的Fab片段的双价片段、(vii)其中VH结构域和VL结构域由允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接的单链Fv分子(scFv)、(viii)双特异性单链Fv二聚体和(ix)“双体抗体”或“三体抗体”，通过基因融合所构建的多价或多特异性片段。抗体片段可以被修饰。例如，可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键使分子稳定。抗体样式和构造的例子在Holliger和Hudson,2006,Nature Biotechnology 23(9):1126-1136，和Carter,2006,Nature Reviews Immunology 6:343-357以及其中引用的参考文献中 描述，所述文献均明确地通过引用的方式并入。
已识别的免疫球蛋白基因(例如在人类中)包括kappa(κ)、lambda(λ)和重链基因座(它们一起包含无数可变区基因)，和恒定区基因mu(υ)、delta(δ)、gamma(γ)、sigma(σ)和alpha(α)，它们分别编码IgM、IgD、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE和IgA(IgA1和IgA2)同种型。本文中的抗体意在包括全长抗体和抗体片段，并且可以指来自任何生物的天然抗体、工程化抗体或为实验目的、治疗目的或其他目的重组产生的抗体。
在一个实施方案中，本文中公开的抗体可以是多特异性抗体，并且值得注意地是双特异性抗体，也有时称作“双体抗体”。这些是与两种或更多种不同抗原结合的抗体。双体抗体可以按本领域已知的多种方式制备，例如化学地或从杂合杂交瘤制备。在一个实施方案中，抗体是微型抗体。微型抗体是最小化的抗体样蛋白质，其包含与CH3结构域连接的scFv。在一些情况下，scFv可以与Fc区连接并且可以包括一些或全部的铰链区。关于多特异性抗体的描述，见Holliger和Hudson(2006)Nature Biotechnology23(9):1126-1136及其中引用的参考文献，所述文献均明确地通过引用的方式并入。
如本文所用，“CDR”意指抗体可变结构域的“互补决定区”。CDR中所包含的残基的系统鉴定已经由Kabat开发(Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(目的免疫蛋白质的序列),第5版,美国公共卫生署(UnitedStates Public Health Service),国家健康研究所(National Institutes of Health),Bethesda)和由Chothia开发[Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948]。出于本发明目的，将CDR定义为比Chothia定义的CDR略微较小的残基集合。VL CDR在本文中定义为包括在位置27-32(CDR1)、50-56(CDR2)和91-97(CDR3)处的残基，其中根据Chothia进行编号。因为Chothia和Kabat定义的VL CDR是相同的，因此这些VL CDR位置的编号也遵循Kabat。VH CDR在本文中定义为包括在位置27-33(CDR1)、52-56(CDR2)和95-102(CDR3)处的残基，其中根据Chothia进行编号。这些VH CDR位置对应于Kabat位置27-35(CDR1)、52-56(CDR2)和95-102(CDR3)。
如本领域技术人员将领会到的，本文中公开的CDR也可以包括变体，例如，当将本文中公开的CDR回复突变入不同的框架区时。通常，各个变体CDR之间的核酸同一性相对于本文中所述的序列是至少80%，并且更一般地具有优选增加的至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和几乎100%的同一性。类似地，相对于本文中鉴定的结合蛋白的核酸序列，将“核酸序列同一性百分数(%)”定义为，候选序列中与抗原结合蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数。特定方法使用设置成默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，并且重叠覆盖区和重叠分数分别设置成1和0.125且不选择过滤器。
通常，在编码各个变体CDR的核苷酸序列和本文所述的核苷酸序列之间的核酸序列同一性是至少80%，并且更一般地具有优选增加的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和几乎100%的同一性。
因而，“变体CDR”是这样一种CDR，其与本发明的亲本CDR具有指定的同源性、相似性或同一性并且共有生物学功能，包括但不限于亲本CDR的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的特异性和/或活性。
尽管用于导入氨基酸序列变异的位点或区域是预先确定的，但是突变本身不需要预先确定。例如，为了优化突变在给定位点的性能，可以在靶密码子或靶区域处实施随机诱变，并且针对所需活性的最佳组合，筛选表达的抗原结合蛋白CDR变体。在具有已知序列的DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是熟知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。使用如本文所述的抗原结合蛋白活性测定法进行突变体的 筛选。
氨基酸置换一般是单个残基；插入通常在约一个(1)至约二十个(20)氨基酸残基的级别上，虽然可以耐受非常更大的插入。缺失的范围为约一个(1)至约二十个(20)氨基酸残基，虽然在一些情况下缺失可以大得多。
置换、缺失、插入或其任意组合可以用来获得最终的衍生物或变体。总体上，在一些氨基酸上进行这些改变，以便使分子的改变(特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性)最小化。然而，在某些情况下可以耐受较大改变。
如本文所用的，“Fab”或“Fab区域”意指包含VH、CH1、VL，和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的这种区域，或在全长抗体，抗体片段或Fab融合蛋白或如本文概述的任何其他抗体实施方案的情境下的这种区域。
如本文所用的，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区域”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。
如本文所用的，“框架”意指抗体可变结构域的不包括定义为CDR的那些区域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步再划分为由CDR分隔的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指保留与抗原(例如，BST1)特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的例子包括，(i)Fab片段，一种由VL/VK、VH、CL和CH1结构域结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)实质上是带有部分铰链区的Fab的Fab′片段(见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul编著,第3次补充修订版,1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段[Ward等人(1989)Nature 341:544-546]；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，含有 单个可变结构域和两个恒定域的重链可变区。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL/VK和VH由独立基因编码，但是可以使用重组方法，通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头将它们连接，在所述单条蛋白链中VL/VK区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗体片段，并且按照与完整抗体相同的方式针对用途筛选所述片段。
如本文所用，“分离的抗体”意指一种抗体，它基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，与BST1特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除BST1之外的抗原的抗体)。然而，与BST1特异性结合的分离抗体可以对其他抗原(如来自其他物种的BST1分子)具有交叉反应性。另外和/或可选地，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品，即以自然界中通常不存在的形式存在。
在一些实施方案中，本发明的抗体是重组蛋白、分离的蛋白质或基本上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质不伴有在其天然状态下通常与其结合的至少一些物质，例如在给定的样品中按重量计构成总蛋白的至少约5%或至少约50%。应理解，取决于环境，分离的蛋白质可以按重量计构成总蛋白含量的5%至99.9%。例如，可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以显著更高的浓度产生蛋白质，从而以增加的浓度水平产生该蛋白质。在重组蛋白的情况下，该定义包括在本领域已知的类型广泛的不天然产生抗体的生物和/或宿主细胞中产生抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子的制备物。一种单克隆抗体组合物对一个特定表位显示单一结合特异性和亲和力。如本文所用，“多克隆抗体”指如同完整动物中的情形一样，由几种B-淋巴细胞克隆产生的抗体。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
术语“抗体衍生物”指任何修饰形式的抗体，例如抗体与另一种物质或抗体的缀合物(通常化学连接)。例如，本发明的抗体可以缀合至物质，包括但不限于聚合物(例如PEG)、毒素、标记物等，如下文更充分描述的。本发明的抗体可以是非人、嵌合、人源化或全人的。关于嵌合抗体和人源化抗体概念的描述，见Clark等人,(2000)和其中引用的参考文献(Clark,2000,Immunol Today 21:397-402)。嵌合抗体包含与人抗体的恒定区有效连接的非人抗体的可变区，例如小鼠或大鼠来源的VH和VL结构域(见例如美国专利号4,816,567)。在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人源化的。如本文所用的，“人源化”抗体意指包含人框架区(FR)和一个或多个来自非人类(通常小鼠或大鼠)抗体的互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人抗体称作“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白称作“接纳体”。人源化原则上依赖于将供体CDR移植到接纳体(人)VL和VH框架上(美国专利号5,225,539)。这种策略称作“CDR移植”。经常需要将选择的接纳体框架残基“回复突变”成相应的供体残基，以再次获得在最初移植的构建体中丧失的亲和力(US 5,530,101；US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 6,180,370；US 5,859,205；US 5,821,337；US 6,054,297；US 6,407,213)。人源化抗体最佳地也将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的相应部分，并且因此一般将包含人Fc区。用于人源化非人抗体的方法是本领域已知的，并且可以基本上遵循Winter和合作者的方法进行[Jones等人,(1986)Nature321:522-525；Riechmann等人,(1988)Nature332:323-329；Verhoeyen等人,(1988)Science,239:1534-1536]。人源化鼠单克隆抗体的额外例子也是本领域已知的，例如，结合人蛋白C(O′Connor等人,1998,Protein Eng11:321-8)、白介素2受体[Queen等人,(1989)Proc Natl AcadSci,USA86:10029-33]和人表皮生长因子受体2[Carter等人,(1992)Proc Natl Acad SciUSA 89:4285-9] 的抗体。在替代实施方案中，本发明的抗体可以是全人抗体，即，抗体序列是完全或基本上人的。本领域已知用于产生全人抗体的许多方法，包括使用转基因小鼠[Bruggemann等人,(1997)Curr Opin Biotechnol 8:455-458]或人抗体文库连同选择方法[Griffiths等人,(1998)Curr Opin Biotechnol 9:102-108]。
术语“人源化抗体”意在包括，其中从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系所衍生的CDR序列被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内部产生额外的框架区修饰，如Fc结构域氨基酸修饰，如本文所述。
术语“嵌合抗体”意指，其中可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一个物种的抗体，如其中可变区序列源自小鼠抗体并且恒定区序列源自人抗体的抗体。
术语“特异性结合”(或“免疫特异性结合”)不意在表示，抗体排他性地与其预期靶结合，虽然在许多实施方案中情况如此；即，抗体“与其靶特异性结合”并且与样品、细胞或患者中的其他组分不可检测地结合或基本上不结合。然而，在一些实施方案中，如果与抗体针对非靶分子的亲和力相比，抗体针对预期靶的亲和力约5倍更大，则该抗体“特异性结合”。适当地，不存在与非预期物质(尤其是健康人或动物的天然存在的蛋白质或组织)的显著交叉反应或交叉结合。抗体的亲和力将是其对非靶分子的亲和力的例如至少约5倍，如10倍，如25倍，尤其50倍并且特别地100倍或更大。在一些实施方案中，在抗体或其他结合物质与抗原之间的特异性结合意指，至少106M-1的结合亲和力。抗体可以例如以至少约107M-1，如在约108M-1至约109M-1，约109M-1至约1010M-1，或约1010M-1至约1011M-1之间的亲和力的结合。抗体可以例如以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小、或更优选地10pM或更小的EC50结合。
如本文所用，术语“基本上不结合”蛋白质或细胞意指，不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1x10-6M或更大、更优选地1x10-5M或更大、更优选地1x10-4M或更大、更优选地1x10-3M或更 大、甚至更优选地1x10-2M或更大的KD与蛋白质或细胞结合。
如本文所用，术语“EC50”意指，通过定量导致50%最大反应/作用的浓度所确定的化合物的效力。可以通过Scratchard或FACS确定EC50。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”意指，特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”意指亲和力常数，它从Kd对Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且表述为摩尔浓度(M)。可以使用本领域充分建立的方法确定抗体的KD值。一种用于确定抗体的KD的优选方法是使用表面等离子体共振法，优选地使用生物传感器系统如系统。
如本文所用，用于IgG抗体的术语“高亲和力”指，抗体针对靶抗原具有1x10-7M或更小、更优选地5x10-8M或更小、甚至更优选地1x10-8M或更小、甚至更优选地5x10-9M或更小和甚至更优选地1x10-9M或更小的KD。然而，“高亲和力”结合可以随其他抗体同种型而变动。例如，用于IgM同种型的“高亲和力”结合指，抗体具有10-6M或更小、更优选地10-7M或更小、甚至更优选地10-8M或更小的KD。
术语“表位”或“抗原决定簇”指与免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的位点。表位可以由连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而靠近的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位一般在用变性溶剂处理时丧失。表位一般包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的现有技术和本文所述的那些，例如，X射线晶体学和2-维核磁共振[见，例如Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,第66卷,G.E.Morris编著(1996)].
因此，本发明也包括，结合(即识别)与本文所述的抗体(即BST1_A2，BST1_A1和BST1_A3)相同的表位的抗体。与相同表位结合的抗体可以通过它们与参考抗体以统计学显著的方式交叉竞争靶抗原 (即竞争性抑制参考抗体与靶抗原的结合)的能力来鉴定。例如，如果抗体与相同或结构上相似的表位(例如重叠表位)或空间上接近的表位结合，则可出现竞争性抑制，其中所述空间上接近的表位在结合时在抗体之间造成空间位阻。
可以使用其中测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的例行测定法，确定竞争性抑制。众多类型的竞争性结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定法[见Stahl等人,(1983)Methods in Enzymology9:242]；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA[见Kirkland等人,(1986)J.Immunol.137:3614]；固相直接标记的测定法、固相直接标记的夹心测定法[见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press]；使用I-125标记物的固相直接标记RIA[见Morel等人,(1988)Mol.Immunol.25(1):7)]；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA[Cheung等人,(1990)Virology176:546]；和直接标记的RIA[Moldenhauer等人,(1990)Scand.J.Immunol.32:77]。一般而言，这种测定法涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或具有其的细胞，未标记的试验免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过在试验免疫球蛋白存在的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记物的量，测量竞争性抑制。通常，试验免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多。
其他技术例如包括表位定位方法，如抗原:抗体复合物晶体的X射线分析，其提供表位的原子级分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变型的结合，其中经常将因抗原序列内的氨基酸残基修饰所致的结合丧失视为表位组分的指标。此外，也可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。随后将这些肽视为用于确定与用来筛选肽文库的抗体相对应的表位的先导。为了进行表位定位，还开 发了已显示能够定位构象型不连续表位的计算算法。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本申请的多个方面在以下子部分进一步详细描述。
抗BST1抗体
本发明的抗体通过抗体的特定功能特征或特性来表征。例如，抗体与人BST1特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力例如以8x10-7M或更小，甚至更一般地1x10-8M或更小的KD与BST1结合。本发明的抗BST1抗体优选地显示出一种或多种以下特征，且抗体显示出特定用途：
以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小、或更优选地10pM或更小的EC50与人BST1结合；
与表达BST1的人细胞结合。
在一个实施方案中，抗体优选地与BST1中存在的抗原表位结合，所述表位不存在于其他蛋白质中。优选地，抗体不与相关的蛋白质结合，例如，抗体基本上不与其他细胞黏附分子结合。在一个实施方案中，抗体可以内化入表达BST1的细胞。评价抗体内化作用的标准测定法是本领域已知的，包括例如MabZap或HumZap内化测定法。
评价抗体针对BST1的结合能力的标准测定法可以在蛋白质水平或细胞水平上进行并且是本领域已知的，例如包括ELISA、蛋白质印迹法、RIA、测定法和流式细胞分析。在实施例中详述合适的测定法。也可以通过本领域已知的标准测定法，如通过系统分析评估抗体的结合动力学(例如结合亲和力)。为了评估与Raji或DaudiB细胞肿瘤细胞的结合，Raji细胞(ATCC保藏编号CCL-86)或Daudi(ATCC保藏编号CCL-213)细胞可以从公众可获得的来源如美国典型培养物保藏中心获得，并且用于标准测定法(如流式细胞分析)。
本发明的单克隆抗体
本发明的优选的抗体是如实施例1-4中所述那样分离和结构表征 的单克隆抗体BST1_A2和BST1_A1。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NO:2、1和52中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VK氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、3和53中显示。
鉴于这些抗体的每一种均可以与BST1结合，可以将VH序列和VK序列“混合并匹配”以产生本发明的其他抗BST1结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)测试这类“混合并匹配”的抗体的BST1结合作用。优选地，当将VH链和VK链混合并匹配时，将来自特定VH/VK配对的VH序列替换为结构上相似的VH序列。同样地，将来自特定VH/VK配对的VK序列优选地替换为结构上相似的VK序列。
因此，在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:2、1和52的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ IDNO:4、3和53的氨基酸序列，其中该抗体与BST1、优选地人BST1特异性结合。
优选的重链和轻链组合包括：
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供包含BST1_A2，BST1_A1和BST1_A3的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VH CDR1的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、9和56中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VH CDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:12或51、11和57中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VH CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:14、13和58中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VK CDR1的氨基酸序列分别 在SEQ ID NO:16、15和59中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VKCDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:18、17和60中显示。BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VKCDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:20、19和61中显示。使用Kabat系统描述CDR区[Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242]。
鉴于这些抗体的每一种均可以与BST1结合并且抗原结合特异性主要由CDR1区、CDR2区和CDR3区提供，可以将VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列“混合并匹配”(即可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，虽然每种抗体通常含有VHCDR1、CDR2和CDR3和VKCDR1、CDR2和CDR3)以产生本发明的其他抗BST1结合分子。因此，本发明特别地包括重链和轻链CDR的每种可能的组合。
可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA， 分析)测试这类“混合并匹配”的抗体的BST1结合作用。优选地，当将VHCDR序列混合并匹配时，将来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列替换为结构上相似的CDR序列。同样，当将VKCDR序列混合并匹配时，将来自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地替换为结构上相似的CDR序列。普通技术人员将轻易地明白，可以通过将一种或多种VH和/或VL/VKCDR区序列置换为结构上相似的序列，从本文公开的单克隆抗体BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的CDR序列产生新的VH序列和VK序列。
因此，在另一个方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
包含选自SEQ ID NOs:10、9和56的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
包含选自SEQ ID NOs:12或51、11和57的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
包含选自SEQ ID NOs:14、13和58的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；
包含选自SEQ ID NOs:16、15和59的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
包含选自SEQ ID NOs:18、17和60的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
包含选自SEQ ID NOs:20、19和61的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
所有可能的组合均是可能的，其中抗体与BST1、优选地人BST1特异性结合。
在另一个优选实施方案中，该抗体拥有：
包含SEQ ID NO:10的重链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:51的重链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:14的重链可变区CDR3；和
包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:18的轻链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:20的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体拥有：
包含SEQ ID NO:9的重链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:11的重链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:13的重链可变区CDR3；和
包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:17的轻链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:19的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体拥有：
包含SEQ ID NO:56的重链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:57的重链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:58的重链可变区CDR3；和
包含SEQ ID NO:59的轻链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO:60的轻链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO:61的轻链可变区CDR3。
本领域熟知，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对相应抗原的结合特异性，并且可以基于共同CDR3序列可预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见例如Klimka等人,(2000)British J.of Cancer83(2):252-260(描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人,(2000)J.Mol.Biol.296:833-849(描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:8910-8915(描述了使用鼠抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链可变CDR3结构域和轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每种成员抗体在CDR3结构域外部包含不同序列并且能够以与亲本鼠抗体同样高或更高的亲和力结合与亲本鼠抗体相同的表位)；Barbas等人,(1994)J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(公开了CDR3结构域为抗原结合提供最显著贡献)；Barbas等人,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:2529-2533(描述了将针对人胎盘DNA的三种Fab(SI-1、SI-40和SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上并替换现有的重链CDR3，并且证实该CDR3结构域单独赋予结合特异性)；和Ditzel等人,(1996)J.Immunol.157:739-749(描述了移植研究，其中仅将亲本多特异性Fab LNA3的重链CDR3转移至单特异性IgG结合破伤风类毒素的Fab p313抗体的重链就足以保留亲本Fab的结合特异性)。这些参考文献均通过引用的方式完整地并入。
因此，本发明提供包含一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，所述CDR3结构域来自衍生于人或非人类动物的抗体，其中所述单克隆抗体能够与BST1特异性结合。在某些方面，本发明提供包含一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，所述CDR3结构域来自非人抗体如小鼠或大鼠抗体，其中所述单克隆抗体能够与BST1特异性结合。在一些实施方案中，包含来自非人抗体的一个或多 个重链和/或轻链CDR3结构域的这类本发明抗体(a)能够与相应的亲本非人抗体竞争结合；(b)保留相应的亲本非人抗体的功能特征；(c)结合与相应的亲本非人抗体相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本非人抗体相似的结合亲和力。
在其他方面，本发明提供包含一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，所述CDR3结构域来自人抗体，例如从非人类动物获得的人抗体，其中所述人抗体能够与BST1特异性结合。在其他方面，本发明提供包含一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，所述CDR3结构域来自第一人抗体，例如从非人类动物获得的人抗体，其中第一人抗体能够与BST1特异性结合，并且其中来自第一人抗体的CDR3结构域替代了对BST1缺少结合特异性的人抗体中的CDR3结构域，以产生能够BST1特异性结合的第二人抗体。在一些实施方案中，包含来自第一人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的这类本发明抗体(a)能够与相应的亲本第一人抗体竞争结合；(b)保留相应的亲本第一人抗体的功能特征；(c)结合与相应的亲本第一人抗体相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本第一人抗体相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为鼠VH1-39基因、鼠VH1-80基因或鼠VH69-1基因的产物或源自鼠VH1-39基因、鼠VH1-80基因或鼠VH69-1基因的重链可变区，其中所述抗体与BST1特异性结合。在又一个优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为鼠VK4-55基因、鼠VK4-74基因或鼠VK44-1基因的产物或源自鼠VK4-55基因、鼠VK4-74基因或鼠VK44-1基因的轻链可变区，其中所述抗体与BST1特异性结合。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
包含作为鼠VH1-39基因的产物或源自鼠VH1-39基因的重链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:35和36中所述的核苷酸序列)，包含作为鼠VK4-55基因的产物或源自鼠VK4-55基因的轻链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:40、41和42中所述的核苷酸序列)；并且与BST1、优选地人BST1特异性结合。具有VH1-39和VK4-55基因(具有上文描述的序列)的抗体的例子是BST1_A2。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
包含作为鼠VH1-80基因的产物或源自鼠VH1-80基因的重链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:33和34中所述的核苷酸序列)；包含作为鼠VK4-74基因的产物或源自鼠VK4-74基因的轻链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:37、38和39中所述的核苷酸序列)；并且与BST1、优选地人BST1特异性结合。具有VH1-80和VK4-74基因(具有上文描述的序列)的抗体的例子是BST1_A1。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
包含作为鼠VH69-1基因的产物或源自鼠VH69-1基因的重链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:68和69中所述的核苷酸序列)；包含作为鼠VK44-1基因的产物或源自鼠VK44-1基因的轻链可变区(所述基因包含SEQ ID NOs:70、71和72中所述的核苷酸序列)；并且与BST1、优选地人BST1特异性结合。具有VH和VK基因(具有上文描述的序列)的抗体的例子是BST1_A3。
如本文所用，如果抗体的可变区从使用鼠种系免疫球蛋白基因的系统获得的话，抗体包含作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这类系统包括，用目的抗原筛选噬菌体上展示的鼠免疫球蛋白基因文库。可以通过以下方式鉴定作为鼠种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”鼠种系免疫球蛋白序列的 抗体：将抗体的核苷酸序列或氨基酸序列与鼠种系免疫球蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列比较，并且选出在序列方面与抗体的序列最接近(即最大同一性%)的鼠种系免疫球蛋白序列。作为特定鼠种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定鼠种系免疫球蛋白序列的抗体与该种系序列相比，可以含有氨基酸差异，例如因天然存在的体细胞突变或人为引入的位点定向突变所致的氨基酸差异。然而，选择的抗体一般在氨基酸序列上与鼠种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90%的同一性，并且含有与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如人种系序列)相比时，将该抗体确定为鼠源的氨基酸残基。在某些情况下，抗体可以在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%、或99%的同一性。一般，源自特定鼠种系序列的抗体与该鼠种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比，显示不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，抗体与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比，可以显示不多于5个、或甚至不多于4、3、2或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在又一个实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区，所述可变区包含与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的抗BST1抗体的期望的功能特征。
例如，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID Nos:2、1和52的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自SEQ ID Nos:4、3和53的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；并且抗体与人BST1结合。这类抗体可以以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小、或更优选地10pM或更小的EC50与人BST1结合。
抗体也可以与用人BST1转染的CHO细胞结合。
在多种实施方案中，抗体可以例如是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，VH和/或VK氨基酸序列可以与上文所述的序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。可以通过以下方式获得具有与上文所述序列的VH区和VK区具备高同一性(即80%或更大)的VH区和VK区的抗体：诱变(例如位点定向或PCR介导的诱变)编码SEQ ID Nos:6、5、8、7、54和55的核酸分子，随后使用本文所述的功能测定法，针对保留的功能测试编码的改变的抗体。
两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，%同源性=相同位置数#/位置总数#x100)，考虑为了最佳比对这两个序列而需要导入的空位的数目和每个空位的长度。可以使用如下文非限制性实施例中所述的数学算法，完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分数的确定。
可以利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法[Comput.Appl.Biosci.(1988)4:11-17]，使用PAM120加权余数表、12的空位长度罚分，4的空位罚分，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)中的Needleman和Wunsch[J.Mol.Biol.(1970)48:444-453]算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
额外地或可选地，可以进一步使用本发明的蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。此类检索可以使用Altschul等人的XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)进行。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得带空位的比对结果(出于比较目的)，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402所述，使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov.
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列中的一个或多个序列包含基于本文中所述优选抗体(例如BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3)的指定氨基酸序列，或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗BST1抗体的期望的功能特征。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NOs:14、13和58的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NOs:20、19和61的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；并且所述抗体以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或更优选地10pM或更小的EC50与人BST1结合。
抗体也可以与用人BST1转染的CHO细胞结合。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NOs:12或51、11和57的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNOs:18、17和60的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NOs:10、9和56的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NOs:16、15和59的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NOs:14、13和58的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR3序列包含选自SEQID NOs:20、19和61的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NOs:12或51、11和57的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列； 并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNOs:18、17和60的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NOs:10、9和56的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NOs:16、15和59的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
在多种实施方案中，抗体可以例如是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用，术语“保守性序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法，针对保留的功能测试改变的抗体。
SEQ ID Nos:10、9和56的重链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NOs:16、15和59的轻链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO:12或51、11和57中所示的重链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NOs:18、17和60中所示的轻链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NOs:14、13和58中所示的重链CDR3序列可以包含一种或多种保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失；和/或SEQ ID NOs:20、19和61中所示的轻链CDR3序列可以包含一种或多种保守性序列修饰，如1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸置换、添加或缺失。
结合与本发明抗BST1抗体相同的表位的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供与本发明的任何BST1单克隆抗体结合人BST1上的相同表位的抗体(即，具有与本发明的任何单克隆抗体交叉竞争与BST1的结合的能力的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体BST1_A2(具有分别如SEQ ID Nos:2和4中所示的VH序列和VK序列)、单克隆抗体BST1_A1(具有分别如SEQID Nos:1和3中所示的VH序列和VK序列)、单克隆抗体BST1_A3(具有分别如SEQ ID Nos:52和53中所示的VH序列和VK序列)。
这类交叉竞争性抗体可以基于它们在标准BST1结合测定法中与BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3交叉竞争的能力来进行鉴定。例如，BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞术可以用来展示与本发明抗体的交叉竞争。试验抗体抑制例如BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3与人BST1结合的能力表明，试验抗体可以与BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3竞争与人BST1的结合并且因此结合与人BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3相同的表位。
工程化和修饰的抗体
可以使用具有本文中公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体(其可以用作起始材料来工程化修饰的抗体)来制备本发明的抗体，与起始抗体相比，所述修饰的抗体可以具有改变的特性。可以通过修饰在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内部，例如，一个或多个CDR区内部和/或一个或多个框架区内部的一个或多个氨基酸，将抗体工程化。额 外地或可选地，可以通过修饰恒定区内部的残基(例如以改变抗体的效应子功能)，将抗体工程化。
在某些实施方案中，CDR移植可以用来将抗体的可变区工程化。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外部的序列更多样。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟天然存在的特定抗体的特性的重组抗体，其中所述表达载体包含来自该天然存在的特定抗体的CDR序列，所述CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(见，例如Riechmann,L.等人,(1998)Nature332:323-327；Jones,P.等人,(1986)Nature321:522-525；Queen,C.等人,(1989)Proc.Natl.Acad.See.USA.86:10029-10033；授予Winter的美国专利号5,225,539，和授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NOs:10、9和56；12或51、11和57；以及14、13和58的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NOs:16、15和59；18、17和60；以及20、19和61的氨基酸序列。因而，这类抗体含有单克隆抗体BST1_A2、BST1_A1和BST1_A3的VH和VK CDR序列，但还可以含有与这些抗体不同的框架序列。
这类框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公布的参考文献中获得。例如，鼠重链可变区基因和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在IMGT(国际ImMunoGeneTics)鼠种系序列数据库(可在超文本传输协议//www.imgt.cines.fr/？处获得)中以及在Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，美国卫生和公众服务部， NIH出版编号91-3242中找到；其各自的内容明确地通过引用的方式并入本文。作为另一个例子，鼠重链可变区基因和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。
使用本领域技术人员熟知的称作空位BLAST的序列相似性检索方法之一[Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402]，将抗体蛋白质序列针对汇编的蛋白质序列数据库进行比较。BLAST是一种启发性算法，抗体序列和数据库序列之间的统计学显著的比对结果可能含有所比对字的高评分片段对(HSP)。不能通过延长或修剪改善其评分的片段对被称作一个命中(hit)。简而言之，翻译数据库中的核苷酸序列，并且保留FR1至FR3框架区之间和包括FR1至FR3框架区的区域。数据库序列具有98个残基的平均长度。在蛋白质的整个长度范围内精确匹配的重复序列被移除。使用程序blastp，默认标准参数(低复杂性过滤器例外，其被关闭)和置换矩阵BLOSUM62、用于产生序列匹配的前5个命中的过滤器，进行蛋白质的BLAST检索。翻译全部六个框架中的核苷酸序列，并且将数据库序列的匹配区段中没有终止密码子的框架视为潜在命中。这进而使用BLAST程序tblastx来证实，其中所述tblastx翻译全部六个框架中的抗体序列，并且将翻译结果与数据库中全部六个框架内被动态翻译的核苷酸序列相比较。
同一是在整个序列长度范围内抗体序列和蛋白质数据库之间的精确氨基酸匹配。阳性结果(同一+置换匹配)不是同一，而是存在由BLOSUM62置换矩阵指导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性匹配两个数据库序列，则将具有最多阳性结果的命中确定为匹配性序列命中。
用于本发明抗体的优选框架序列是这样的序列，其在结构上与选择的本发明抗体所使用的框架序列相似，例如，与本发明的优选单克隆抗体所使用的VH1-80框架序列、VH1-39框架序列、VK4-74框架序列和/或VK4-55框架序列相似。可以将VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VK CDR1、CDR2和CDR3序列移植到这样的框架区上，所述框架区的序 列与框架序列源自的种系免疫球蛋白基因中存在的序列相同，或可以将所述CDR序列移植到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，使框架区内部的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见，例如，授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一个类型的可变区修饰是，使VH和/或VKCDR1区、CDR2区和/或CDR3区内部的氨基酸残基突变，以改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以在如本文所述和实施例中提供的体外或体内测定法中评价对抗体结合作用或其他目的功能特性的影响。在一些实施方案中，引入(如上文讨论的)保守修饰。可选地，可以进行非保守修饰。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选地是置换。另外，一般改变CDR区内部不多于1个、2个、3个、4个、5个残基，虽然如本领域技术人员所理解的，其他区域(例如框架区)内的变异可以更大。
因此，在一个实施方案中，本申请提供分离的抗BST1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)包含选自SEQ ID NOs:10、9和56的氨基酸序列或与SEQ ID NOs:10、9和56相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR1区域；(b)包含选自SEQ ID NOs:12或51、11和57的氨基酸序列或与SEQID NOs:12或51、11和57相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区域；(c)包含选自SEQ ID NOs:14、13和58的氨基酸序列或与SEQ ID NOs:14、13和58相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR3区域；(d)包含选自SEQ ID NOs:16、15和59的氨基酸序列或与SEQ ID NOs:16、15和59相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VKCDR1区域；(e)包含选自SEQ ID NOs:18、17和60的氨基酸序列或与SEQ ID NOs:18、17和60相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VKCDR2 区域；和(f)包含选自SEQ IDNOs:20、19和61的氨基酸序列或与SEQ ID NOs:20、19和61相比具有1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VKCDR3区域。
本申请的工程化抗体包括其中例如为改善抗体特性而对VH和/或VK内部的框架残基进行了修饰的那些抗体。一般，进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，已经历过体细胞突变的抗体可含有与该抗体所源自的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与该抗体所源自的种系序列比较而鉴定这类残基。
另一个类型的框架修饰涉及，使框架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称作“去免疫化”并且在美国专利公开号2003/0153043中更详细地描述。
除了在框架区或CDR区内部进行修饰之外或作为替代，本发明的抗体还可以进行工程化以在Fc区内部包含修饰，一般旨在改变抗体的一种或多种功能特征，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。另外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如可以将一种或多种化学部分与抗体连接)或进行修饰以改变其糖基化，这再次旨在改变抗体的一个或多个功能特征。下文进一步详细描述这些实施方案的每一项。Fc区中残基的编号是Kabat的EU index的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，以便改变(例如，增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。这种方法在美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的装配或增加或减少抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以减少抗体的生物学半衰期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合作用，抗体具有削弱的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合作用。这种方法在美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，将抗体修饰以增加其生物学半衰期。多种方法是可行的。例如，可以引入一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F，如美国专利号6,277,375中所述。可选地，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvagereceptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在另一个实施方案中，将抗体产生为UniBody，如通过引用的方式完整并入本文的WO2007/059782中所述。
在另外的其他实施方案中，通过以下方式改变Fc区：将至少一个氨基酸残基替换为不同氨基酸残基以改变抗体的效应子功能。例如，可以将选自第234、235、236、237、297、318、320和322位氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的效应子配体亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个例子中，可以将选自第329、331和322位氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的C1q结合作用和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
在另一个例子中，改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基，以改变抗体固定补体的能力。这种方法在PCT公开案WO94/29351中进一步描述。
在又一个例子中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，来修饰Fc区以增加抗体介导抗体 依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或以增加抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在Presta的PCT公开案WO 00/42072中进一步描述。。另外，已经定位了人IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields,R.L.等人,(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。已显示，在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变改善与FcγRIII的结合。另外，以下组合突变体显示改善FcγRIII结合作用：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。其他的ADCC变体例如在WO2006/019447中描述。
在又一个例子中，修饰Fc区以增加抗体的半衰期，通常通过增加与FcRn受体的结合作用来实现，例如，如PCT/US2008/088053、US 7,371,826、US 7,670,600和WO 97/34631中描述的。在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法是可行的。例如，可以引入一种或多种以下突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述的。可选地，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvage receptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在又一个实施方案中，改变抗体的糖基化。例如，可以产生非糖基化的抗体(即，缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对抗原的亲和力。这类糖修饰也可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以产生一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除在这个位点处的糖基化。这种非糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利5,714,350和6,350,861中进一步详细描述，并且可以通过移除在位置297处的天冬酰胺实现。
额外或可选地，可以产生抗体，所述抗体具有改变的糖基化类型，如具有减少的岩藻糖基数量的低岩藻糖基化的抗体或具有增加的对分型GlcNac结构的抗体。在本领域，这有时称作“工程化糖型”。这类 改变的糖基化模式已被证实增加抗体的ADCC能力。这类碳水化合物修饰通常可以以两种方式完成；例如，在一些实施方案中，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体。本领域中已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞并且它们可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参考POTELLIGENT技术。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺少岩藻糖。通过使用两种替换载体在CHO/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因而产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系[见美国专利公开号2004/0110704、美国专利7,517,670和Yamane-Ohnuki等人,(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614-22]。作为另一个例子，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，从而在这种细胞系中表达的抗体因减少或消除1,6键相关酶而显示出低岩藻糖基化(hypofucosylation)。Hanai等人也描述了这样的细胞系，它们具有添加岩藻糖至与抗体的Fc区结合的N-乙酰葡糖胺的低酶活性或不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。可选地，可以使用糖基化途径酶的小分子抑制剂制备工程化糖型，尤其是进行无岩藻糖化(afucosylation)[参见例如，Rothman等人,(1989)Mol.Immunol.26(12):113-1123；Elbein(1991)FASEB J.5:3055；PCT/US2009/042610和美国专利号7,700,321]。PCT公开案WO 03/035835描述了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，所述细胞系具有降低的连接岩藻糖至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化[还参见Shields,R.L.等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740]。PCT公开案WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的对分GlcNac结构，这导致抗体的增加的ADCC活性[也参见Umana等人,(1999)Nat.Biotech.17: 176-180]。
可选地，可以使用岩藻糖苷酶切去抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基[Tarentino,A.L.等人,(1975)Biochem.14:5516-23]。
本发明涉及的本文中抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以进行聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，一般使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下反应。优选地，可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应实施聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲包括，已经用来衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以适用于本发明的抗体。见，例如，EP 0154316和EP0401384。
在额外的实施方案中，例如在将本发明的抗体用于诊断或检测目的时，抗体可以包含标记物。“标记”在本文中意指，化合物连接有使得能够检测化合物的至少一种元素、同位素或化学化合物。通常而言，标记物分成三类：a)同位素标记物，其可以是放射性同位素或重同位素；b)磁力的、电学的、热学的标记物；和c)有色或发光染料；但标记物也可包括酶和颗粒如磁性颗粒。优选的标记物包括但不限于，荧光镧系元素络合物(包括铕和铽的络合物)和荧光标记物，包括但不限于量子点、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、芪、萤光黄、瀑布蓝、德克萨斯红、Alexa染料、Cy染料和在Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook第6版中描述的其他标记物，所述文献明确地通过引用的方式并入本文。
接头
本发明提供其中抗体经化学接头与配偶物连接的抗体-配偶物缀 合物。在一些实施方案中，接头是肽基接头，其他接头包括肼接头和二硫键接头。除接头与配偶物连接之外，本申请也提供可切割的接头臂，所述接头臂适宜连接基本上任何分子种类。在本文中通过参考本发明的接头臂与治疗性部分的连接来例举接头臂。然而，本领域技术人员易于理解，接头可以连接至各个种类，包括但不限于诊断剂、分析剂、生物分子、靶向剂、可检测标记物等。
肽基接头和其他接头在抗体-配偶物缀合物中的用途描述于美国临时专利申请系列号60/295,196；60/295,259；60/295342；60/304,908；60/572,667；60/661,174；60/669,871；60/720,499；60/730,804和60/735,657和美国专利申请系列号10/160,972；10/161,234；11/134,685；11/134,826和11/398,854以及美国专利号6,989,452和PCT专利申请号PCT/US2006/37793中，所述文献均通过引用的方式并入本文。另外的接头描述于美国专利6,214,345、美国专利申请2003/0096743和美国专利申请2003/0130189，de Groot等人,J.Med.Chem.42,5277(1999)；de Groot等人,J.Org.Chem.43,3093(2000)；de Groot等人,J.Med.Chem.66,8815,(2001)；WO 02/083180；Carl等人,J.Med.Chem.Lett.24,479,(1981)；Dubowchik等人,Bioorg&Med.Chem.Lett.8,3347(1998)；和美国临时专利申请系列号60/891,028中。
在一个方面，本申请涉及可用于将靶向基团与治疗剂和标志物连接的接头。在另一个方面，本申请提供向化合物赋予稳定性、降低其体内毒性或否则有利地影响其药物代谢动力学、生物利用率和/或药效动力学的接头。通常优选地，在这类实施方案中一旦将药物递送至其作用位点，则切割接头，释放活性药物。因而，在一个实施方案中，本发明的接头是无痕迹的，从而一旦从治疗剂或标志物移除(如在活化期间)，不留下存在接头的痕迹。在另一个实施方案中，接头的特征在于，它们在靶细胞中或其附近的位点处(如在治疗作用或标志物活性的位点处)被切割的能力。这类切割在性质上可以是酶促的。这种特征有助于减少治疗剂或标志物的全身性激活，从而降低毒性和全身副作用。 用于酶促切割的优选的可切割基团包括肽键、酯键和二硫键。在其他实施方案中，接头对pH敏感并且借助pH变化进行切割。
本申请的一个方面是，控制切割接头的速度的能力。经常需要迅速切割的接头。然而，在一些实施方案中，更缓慢切割的接头可能是优选的。例如，在持续释放制剂中或在含有快速释放组分和缓慢释放组分的制剂中，提供更缓慢切割的接头可能是有用的。WO 02/096910提供了几种具有肼接头的具体配体-药物复合物。然而，不存在根据需要的环化速率“调节”接头组成的方式，并且所描述的具体化合物以更缓慢的速率(与许多药物-接头缀合物的优选速率相比)从药物中切除配体。相比之下，本发明的肼接头提供一系列环化速率(从非常快至非常慢)，因而允许基于所需的环化速率选择特定的肼接头。
例如，可以用切割时产生单个5元环的肼接头实现非常快的环化。使用这样的肼接头实现向细胞靶向递送细胞毒性剂的优选环化速率，所述肼接头在切割时产生两个5元环或单个6元环(其由在偕位(geminal position)具有两个甲基的接头导致)。已经显示，与不具有偕位处的两个甲基的单个6元环相比，偕二甲基效应使环化反应速率加速。这是由于应力在环中得到缓解所致。然而，取代基有时可以减缓反应，而不是使它加速。阻滞的理由经常可以归因于空间位阻。例如，与偕碳是CH2时相比，偕二甲基取代允许发生快得多的环化反应。
然而，重要的是，在一些实施方案中，更缓慢切割的接头可以是优选的。例如，在持续释放制剂中或在含有快速释放组分和缓慢释放组分的制剂中，提供更缓慢切割的接头可能是有用的。在某些实施方案中，使用肼接头实现慢环化速率，所述肼接头在切割时产生单个6元环(无偕二甲基取代)或产生单个7元环。所述接头也用于使治疗剂或标志物在循环时稳定化，防止降解。该特征提供显著的益处，因为这类稳定化作用导致延长连接的试剂或标志物的循环半衰期。接头也用于减弱连接的试剂或标志物的活性，从而缀合物在循环时是相对良性的并且在期望的作用位点活化后具有期望的作用，例如具有毒性。对于治疗剂缀合物，接头的这种特征用于改善试剂的治疗指数。
优选地，选择稳定化基团以限制治疗剂或标志物被可能存在于血液或非靶组织中的酶清除和代谢，并且进一步选择它们以限制试剂或标志物转运至细胞中。稳定化基团用于阻断试剂或标志物的降解，并且也可以用于提供试剂或标志物的其他物理特征。稳定化基团也可以改善试剂或标志物在以制剂形式或非制剂形式储存期间的稳定性。
理想地，如果稳定化基团在通过以下方式测试时保护试剂或标志物免遭降解：在人血液中于37℃储存试剂或标志物2小时，并且在给定的分析条件下导致试剂或标志物被人血液中存在的酶切割少于20%、优选地少于10%、更优选地少于5%和甚至更优选地少于2%，则稳定化基团可用来使治疗剂或标志物稳定化。本发明也涉及含有这些接头的缀合物。更具体地，本发明涉及可以用于治疗疾病、尤其用于癌症化疗的前药的用途。具体而言，本文所述的接头的使用提供了这样的前药，其相比于结构相似的前药，显示高的作用特异性、降低的毒性和在血液中改善的稳定性。如本文所述的本申请的接头可以在配偶物分子内部的多个位置处存在。
因而，提供了一种接头，所述接头可以含有多种基团中的任一种作为其链的部分，所述基团在体内(例如在血流中)以相对于缺少这类基团的构建体而言增强的速率被切割。还提供了接头臂与治疗剂和诊断剂的缀合物。接头可用于形成治疗剂的前药类似物，并可用于将治疗剂或诊断剂可逆地连接至靶向剂、可检测标记物或固相支持物。接头可以并入包含细胞毒素的复合物。
前药与抗体的连接可以产生优于细胞毒性药物的常规抗体缀合物的额外安全优势。前药的激活可以由肿瘤细胞内和几种正常组织(包括血浆)中的酯酶实现。已经显示，人类中相关酯酶活性的水平与在大鼠和非人类灵长类中观察到的水平十分相似，但低于在小鼠中观察到的水平。前药的激活也可以通过葡糖醛酸糖苷酶的切割实现。除可切割的肽、肼或二硫键基团之外，任选地在细胞毒素和靶向剂之间引入一种或多种自消接头基团。这些接头基团也可以描述为间隔基团并且含有至少两个反应性官能团。通常地，间隔基团的一个化学官能团与治 疗剂(例如细胞毒素)的化学官能团键合，而间隔基团的另一个化学官能团用来与靶向剂或可切割接头的化学官能团键合。间隔基团的化学官能团的例子包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮和巯基。
自消接头通常是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂烷基。在一个实施方案中，烷基或芳基可以包含1至20个碳原子。它们也可以包含聚乙二醇部分。
示例性间隔基团包括例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸和其他氨基酸、1,6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺苯甲酸、苯酞、α-取代的苯酞、羰基、动物酯、核酸、肽等。
间隔基团可以用于向细胞毒素-靶向剂复合物中引入额外的分子量和化学官能团。通常，额外的质量和官能团将影响复合物的血清半衰期和其他特性。因而，通过仔细选择间隔基团，可以产生具有一系列血清半衰期的细胞毒素复合物。
当存在多个间隔基团时，可以使用相同或不同的间隔基团。
可以使用额外的接头部分，其优选地向利用含有该部分的接头的缀合物赋予增加的溶解度或减少的聚集特性，或调节缀合物的水解速率，这类接头不必是自消的。在一个实施方案中，连接部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基、或未取代的杂烷基，前述的任一种可以是直链的、支链的或环状的。取代可以例如是低级(C1-C6)烷基，烷氧基、烷硫基、烷氨基或二烷基氨基。在某些实施方案中，接头包含非环状部分。在另一个实施方案中，接头包含任何带正电荷或带负电荷的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸或聚精氨酸。接头可以包含聚合物如聚乙二醇部分。另外，接头可以包含例如聚合物组分和小的化学部分。在一个优选实施方案中，这类接头包含聚乙二醇(PEG)部分。
PEG部分可以具有1至50个单位的长度。优选地，PEG具有1-12个重复单元、更优选地3-12个重复单元、更优选地2-6重复单元或甚至更优选地3-5个重复单元和最优选地4个重复单元。接头可以完全 由PEG部分组成，或它也可以含有额外的取代或未取代的烷基或杂烷基。有用的是，合并PEG作为该部分的部件以增强复合物的水溶性。另外，PEG部分减少可能在药物与抗体缀合期间发生的聚集的程度。
关于细胞毒素、接头的类型以及使治疗剂与抗体缀合的其他方法的进一步论述，还参见Gangwar等人的名为“Cytotoxic Compounds And Conjugates”的PCT公开案WO2007/059404，Saito,G.等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,CJ.(2001)Adv.DragDeliv.Rev.53:247-264，所述文献各自通过引用的方式完整并入本文。
配偶物分子
本发明包括与配偶物分子如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素缀合的抗体。这类缀合物在本文中也称作“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于(例如，杀死)细胞的任何物质。
本申请的配偶物分子的例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。配偶物分子的例子还包括例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C、和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类(例如柔红霉素(以前为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前为放线菌素)、博来霉素、光神霉 素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
可以与本发明抗体缀合的配偶物分子的其他优选例子包括，多卡米星(duocarmycin)、刺孢霉素、美坦生和奥瑞司他汀(auristatin)，及其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(MylotargAmerican Home Products)。
配偶物分子的优选例子是CC-1065和多卡米星。CC-1065在1981年由Upjohn公司首次从Streptomyces zelensis分离(Hanka等人,J.Antibiot.31:1211(1978)；Martin等人,J.Antibiot.33:902(1980)；Martin等人,J.Antibiot.34:1119(1981))并且发现它在体外和在实验动物中均具有强力抗肿瘤和抗微生物活性(Li等人,Cancer Res.42:999(1982))。CC-1065与双链B-DNA在小沟内结合(Swenson等人,Cancer Res.42:2821(1982))，序列偏好性为5′-d(A/GNTTA)-3′和5′-d(AAAAA)-3′，并且通过分子中存在的其CPI左手单元烷基化3′-腺嘌呤的N3位置(Hurley等人,Science 226:843(1984))。
尽管其强力和广泛的抗肿瘤活性，但是CC-1065不能用于人类中，因为它在实验动物中造成迟发型死亡。CC-1065和多卡米星的许多类似物和衍生物是本领域已知的。已经综述了对许多这类化合物的结构、合成和特性的研究。见，例如，Boger等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35:1438(1996)；和Boger等人,Chem.Rev.97:787(1997)。KyowaHakko Kogya Co.,Ltd的一个研究组已经制备了许多CC-1065衍生物。见，例如，美国专利号5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038和5,084,468；和公布的PCT申请WO 96/10405和公布的欧洲申请0 537 575 A1。Upjohn公司(Pharmacia Upjohn)也在积极制备CC-1065的衍生物。参见例如，美国专利号5,739,350；4,978,757、5,332,837和4,912,227。
抗体物理特性
本发明的抗体可以进一步由抗BST1抗体的多种物理特性表征。各 种测定法可以用于基于这些物理特性检测和/或区分不同类别的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以在轻链可变区或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。一个或多个糖基化位点在可变区中的存在可以导致抗体的免疫原性增加或抗体pK的改变(由于改变的抗原结合作用)[Marshall等人,(1972)Annu Rev Biochem41:673-702；Gala FA and Morrison SL(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick等人,(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人,(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人,(2000)Mol Immunol 37:697-706]。已经知晓，糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。可以使用糖印迹测定法检验可变区糖基化，所述糖印迹测定法切割抗体以产生Fab，并且随后使用测量高碘酸盐氧化和西夫碱形成的测定法检验糖基化。可选地，可以使用Dionex轻色谱法(Dionex-LC)检验可变区糖基化，所述Dionex轻色谱法将源自Fab的糖切割成单糖并分析各种糖含量。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗BST1抗体。可以通过选择在可变区中不含有糖基化基序的抗体或通过使用本领域熟知的标准技术突变糖基化基序内的残基，实现这一点。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体不含有天冬酰胺异构位点。脱酰胺化或异天冬氨酸作用可以分别在N-G或D-G序列上发生。脱酰胺化或异天冬氨酸作用导致产生异天冬氨酸，这由于在侧链羧基端而非主链外产生扭结结构而降低抗体的稳定性。可以使用等量测定法测量异天冬氨酸的产生，所述等量测定法使用反相HPLC检验异天冬氨酸。
每种抗体具有独特的等电点(pI)，但是总体上抗体将落在6和9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI一般落在7-9.5的pH范围内并且IgG4抗体的pI一般落在6-8的pH范围内。抗体可以具有这个范围之外的pI。虽然其作用总体上是未知的，但是存在猜想：具有在正常范围之外的pI的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠作用和不稳定性。可以使用毛细管等电聚焦测定法检测等电点，所述测定法产生pH 梯度并且可以利用激光对焦以增加准确度[Janini等人,(2002)Electrophoresis 23:1605-11；Ma等人,(2001)Chromatographia53:S75-89；Hunt等人,(1998)J Chromatogr A 800:355-67]。在一些情况下，优选具有含有下述pI值的抗BST1抗体，所述pI值落在正常范围内。可以通过选择pI处于正常范围内的抗体或通过使用本领域熟知的标准技术突变带电荷的表面残基，实现这一点。
每种抗体具有指示热稳定性的熔解温度[Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]。较高的热稳定性表示更大的体内总体抗体稳定性。可以使用多种技术如差示扫描量热法测量抗体的熔点[Chen等人,(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人,(1999)Immunol Lett68:47-52]。TM1指示抗体开始解折叠的温度。TM2指示抗体完成解折叠的温度。通常，优选的是，本发明抗体的TM1大于60℃，优选地大于65℃，甚至更优选地大于70℃。可选地，可以利用圆二色性测量抗体的热稳定性[Murray等人,(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9]。
在一个优选实施方案中，选择不快速降解的抗体。可以使用毛细管电泳法(CE)和MALDI-MS测量抗BST1抗体的片段化，如本领域中公知的[Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal.Chem.67:3626-32]。
在另一个优选实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体。聚集作用可能导致触发不希望的免疫应答和/或改变的或不利的药物代谢动力学特性。通常，可接受具有25%或更少、优选地20%或更少、甚至更优选地15%或更少、甚至更优选地10%或更少和甚至更优选地5%或更少的聚集作用的抗体。可以通过本领域熟知的几项技术测量聚集作用，所述技术包括用于鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体的大小排阻柱法(SEC)、高效液相色谱法(HPLC)和光散射法。
工程化抗体的方法
如上文讨论的，具有本文中公开的VH和VK序列的抗BST1抗体可以用来通过修饰VH序列和/或VK序列或与之连接的恒定区而产生新的抗BST1抗体。因而，在本发明的另一个方面，本发明的抗BST1抗体(例 如BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3)的结构特征用来产生结构上相关的保留本发明抗体的至少一种功能特性(如与人BST1结合)的抗BST1抗体。例如，可以将BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3的一个或多个CDR区或其突变物与已知的框架区和/或其他CDR重组地组合，以产生本发明的另外的重组工程化的抗BST1抗体，如上文讨论的。其他类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于工程化方法的初始材料是本文中提供的一个或多个VH序列和/或VK序列或其一个或多个CDR区。为产生工程化抗体，不需要实际地制备(即表达为蛋白质)具有本文中提供的一个或多个VH序列和/或VK序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反地，使用序列中所含的信息作为初始材料以产生源自原始序列的“第二代”序列，并且随后制备“第二代”序列且将其表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种用于制备抗BST1抗体的方法，所述方法包括，提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NOs:10、9和56的CDR1序列、选自SEQ ID NOs:12或51、11和57的CDR2序列和/或选自SEQ ID NOs:14、13和58的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NOs:16、15和59的CDR1序列、选自SEQID NOs:18、17和60的CDR2序列和/或选自SEQ ID NOs:20、19和61的CDR3序列，改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并且将改变的抗体序列表达为蛋白质。
标准分子生物学技术可以用来制备并表达改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体是这样的抗体，所述抗体保留本文所述的抗BST1抗体的一些或全部功能特征，所述功能特征包括但不限于(a)以1x10-7M或更小的KD与人BST1结合；(b)与用BST1转染的人CHO细胞结合。
可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中所述的那些(例如流式细胞术、结合测定法)评估改变的抗体的功能特征。
在工程化本发明抗体的方法的某些实施方案中，可以沿着全部或 部分的抗BST1抗体编码序列随机地或选择性地引入突变，并且可以针对本文所述的结合活性和/或其他功能特征，对所得到的修饰的抗BST1抗体进行筛选。本领域中已经描述了突变方法。例如，PCT公开案WO 02/092780描述了，使用饱和诱变法、合成连接装配法或其组合产生并筛选抗体突变的方法。可选地，PCT公开案WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体的物理化学特性的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。所述核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或可以是部分纯化的或基本上纯的形式。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl区带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳)和本领域熟知的其他技术，与其他细胞组分或其他杂质(例如，其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“变得基本上纯的”。见，F.Ausubel等人编著.(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,N.Y.。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或可以不含有内含子序列。在一个优选实施方案中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得cDNA，所述cDNA编码由杂交瘤产生的抗体的轻链和重链。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从该文库回收编码抗体的核酸。
本发明的优选的核酸分子是编码BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3单克隆抗体的VH序列和VK序列的那些。编码BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3的VH序列的DNA序列分别在SEQ IDNos:6、5和54中显示。编码BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3的VK序列的DNA序列分别在SEQ IDNos:8、7和55中显示。
本发明的其他优选核酸是，与SEQ ID NOs:6、5、8、7、54和55中所示的序列之一具有至少80%序列同一性，如至少85%、至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸，所述核酸编码本发明的抗体或其抗原结合部分。
两个核酸序列之间的同一性百分数是序列中核苷酸相同的位置数目，并且考虑为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。两条序列间的序列比较和同一性百分数的计算可以利用数学算法实现，如上文描述的Meyers和Miller算法或Altschul的XBLAST程序。
此外，本发明的优选核酸包含SEQ ID NOs:6、5、8、7、54和55中所示的核酸序列的一个或多个编码CDR的部分。在这个实施方案中，核酸可以编码BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3的重链和轻链CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列。
与SEQ ID NOs:6、5、8、7、54和55(VH和VK序列)的编码CDR的部分具有至少80%、如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸也是本发明的优选核酸。这类核酸可以在非CDR编码区中和/或在CDR-编码区中与SEQ ID NOs:6、5、8、7、54和55的相应部分不同。在差异处于CDR-编码区内的情况下，与BST1_A2、BST1_A1或BST1_A3的相应CDR序列相比，由该核酸编码的核酸CDR区一般含有如本文定义的一个或多个保守性序列修饰。
一旦获得编码VH区段和VK区段的DNA片段，便可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转化成全长抗体链基因、转化成Fab片段基因或转化成scFv基因。在这些操作中，将编码VK或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(如抗体恒定区或柔性接头)的另一个DNA片段有效连接。如这种环境下所用，术语“有效连接”意指，两个DNA片段如此连接，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍符合读框。
编码VH区的分离DNA可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子有效连接而转化成全长重链基因。鼠重链恒定区基因的序列是本领域已知的[见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的 免疫蛋白质的序列)，第5版，美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242]，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子有效连接。
编码VL/VK区的分离DNA可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子有效连接而转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。鼠轻链恒定区基因的序列是本领域已知的[见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242]并且，可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH的和编码VL/VK的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段有效连接，从而VH和VL/VK序列可以表达为具有由柔性接头连接的VL/VK和VH区的连续单链蛋白[见例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426；Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-554]。
单克隆抗体的产生
根据本发明，BST1或其片段或衍生物可以用作免疫原以产生免疫特异性结合这种免疫原的抗体。这类免疫原可以通过任何便利的手段分离。本领域技术人员理解，许多方法可用于抗体的产生，例如，如Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow和David Lane编著,Cold Spring Harbor Laboratory(1988),Cold Spring Harbor,N.Y.中所述。本领域技术人员还理解，也可以通过各种方法从遗传信息制备模拟抗体的结合性片段或Fab片段[Antibody Engineering:A Practical Approach(Borrebaeck,C.编著),1995,OxfordUniversity Press,Oxford;J.Immunol.149,3914-3920(1992)]。
在本发明的一个实施方案中，产生针对BST1的特定结构域的抗体。在一个具体实施方案中，使用BST1的亲水片段作为产生抗体的免疫原。
在产生抗体时，可以通过本领域已知的技术，例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)实现对所需抗体的筛选。例如，为选择识别BST1的特定结构域的抗体，可以针对结合含有这种结构域的BST1片段的产物，分析产生的杂交瘤。为了选择特异性结合第一BST1同源物但是不特异性结合于(或以较小亲合力结合于)第二BST1同源物的抗体，可以基于对第一BST1同源物的阳性结合和对第二BST1同源物的结合的不存在(或对其的结合的减少)进行选择。类似地，为了选择特异性结合BST1但是不特异性结合于(或以较小亲合力结合于)相同蛋白质的不同同工型(如具有与BST1相同的核芯肽的不同糖型)的抗体，可以基于对BST1的阳性结合和对不同同工型(例如不同糖型)的结合的不存在(或对其的结合的减少)进行选择。因而，本发明提供，与BST1的不同同工型(例如糖型)相比，以更大的亲和力(例如至少2倍，如至少5倍、特别地至少10倍更大的亲和力)与BST1结合的抗体(如单克隆抗体)。
可以在本发明方法中使用的多克隆抗体是，源自免疫动物的血清的非均质抗体分子群体。也可以使用未分级的免疫血清。本领域已知的多种方法可以用于产生针对BST1、BST1片段、BST1相关多肽或BST1相关多肽的片段的多克隆抗体。例如，一种方式是，纯化目的多肽或使用例如本领域熟知的固相肽合成方法合成目的多肽。见，例如，Guide toProtein Purification,Murray P.Deutcher编著,Meth.Enzymol.,Vol.182(1990)；SolidPhase Peptide Synthesis,Greg B.Fields编著,Meth.Enzymol.,Vol.289(1997)；Kiso等人,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38:1192-99,1990；Mostafavi等人,Biomed.Pept.ProteinsNucleic Acids 1:255-60,1995；和Fujiwara等人,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44:1326-31,1996。选择的多肽随后可以用来通过注射各种宿主动物而进行免疫，以产生多克隆或单克隆抗体， 所述宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。根据宿主物种，可以使用各种佐剂(即免疫刺激剂)来增加免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂或不完全佐剂、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基酚和佐剂如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。其它佐剂也是本领域熟知的。
为制备针对BST1的单克隆抗体(mAb)，可以使用通过培养的连续细胞系产生抗体分子的任意技术。例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975,Nature256:495-497)、以及三体瘤技术、人B细胞杂交瘤技术[Kozbor等人,(1983)Immunology Today4:72]和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等人,(1985)，引自MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页]。这类抗体可以属于任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。可以在体外或在体内培育产生单克隆抗体的杂交瘤。在本发明的其它实施方案中，可以利用已知技术在无菌动物中产生单克隆抗体(PCT/US90/02545，其通过引用的方式并入本文)。
制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一项建立非常充分的方法。用于分离免疫的脾细胞以便融合的免疫操作方案和技术是本领域已知的。融合配对体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体和嵌合单克隆抗体(例如人-小鼠嵌合体)。
可以基于如上文所述制备的非人类单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的非人类杂交瘤获得并且可以使用标准分子生物学技术，进行工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法，将鼠可变区与人恒定区连接(见例如授予Cabilly等人的美国专利4,816,567)。为产生人源化抗体，可以使用 本领域已知的方法，将鼠CDR区插入人框架中(见例如授予Winter的美国专利5,225,539和授予Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
也可以使用转基因或转染色体小鼠产生全人抗体，其中所述小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链基因和轻链基因，但是可以表达人重链基因和轻链基因。转基因小鼠以正常方式用选择的抗原(例如BST1的全部或一部分)免疫。可以使用常规杂交瘤技术获得针对抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因而，通过使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括HuMAb(Inc.)和KM品系的小鼠。HuMAb品系(Inc.)在Lonberg和Huszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93)中描述。对于产生人抗体和人单克隆抗体的这项技术及用于产生此类抗体的操作方案的详细讨论，见，例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。KM品系指，携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，其在Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中详述。
另外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统是本领域可获得的并且可以用来产生本发明的抗BST1抗体。例如，可以使用称作Xenomouse的替代性转基因系统(Amgen,Inc.)；这类小鼠在例如授予Kucherlapati等人的美国专利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
可以使用称作“导向选择”的技术产生识别所选择表位的全人抗体。在这种方法中，将选择的非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)用来指导识别相同表位的完全人类的抗体的选择[Jespers等人,(1994)Biotechnology 12:899-903]。
另外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统是本领域可获得的并且可以用来产生抗BST1抗体。例如，可以使用称作“TC 小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；这类小鼠在Tomizuka等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中描述。另外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域中得到了描述[Kuroiwa等人,(2002)Nature Biotechnology 20:889-894和PCT公开号WO2002/092812]且可以用来产生抗BST1抗体。
也可以使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，其中已经在所述SCID小鼠中重构了人免疫细胞，从而其在免疫后可以产生人抗体应答。这类小鼠在例如美国专利5,476,994和3,698,767中描述。
可以通过下述来产生本发明的抗体：使用噬菌体展示技术以产生和筛选多肽文库(针对与所选的靶的结合)[见，例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott和Smith,Science249,386-88,1990；和Ladner等人,美国专利号5,571,698]。噬菌体展示法的基本概念是，在编码待筛选多肽的DNA和所述多肽之间建立物理联系。这种物理联系由噬菌体粒子提供，所述噬菌体粒子将多肽展示为包围噬菌体基因组的衣壳的一部分，所述噬菌体基因组编码所述多肽。在多肽与其遗传物质之间建立物理联系，允许同时大规模筛选数目非常庞大的携带不同多肽的噬菌体。展示对靶具有亲和力的多肽的噬菌体与所述靶结合，并且通过针对所述靶的亲和力筛选来富集这些噬菌体。可以从这些噬菌体的相应基因组中确定从它们展示的多肽的身份。随后可以通过常规手段大量合成被这些方法鉴定为对期望的靶具有结合亲和力的多肽。见，例如美国专利号6,057,098，所述专利通过引用的方式完整并入本文，包括全部的表、图和权利要求。特别地，这种噬菌体可以用来展示从抗体库或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用抗原(例如，使用标记的抗原或与固相表面或珠结合或被固相表面或珠捕获的抗原)选择或鉴定表达抗原结合结构域的噬菌体，其中所述抗原结合结构域结合目的抗原。这些方法中所用的噬菌体一般是丝状噬菌体，所述丝状噬菌体包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，以及与噬菌体基因III蛋白或基因VIII蛋白 重组融合的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。可以用来产生本发明抗体的噬菌体展示法包括在Brinkman等人,(1995)J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等人,(1995)J.Immunol.Methods184:177-186；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic等人,(1997)Gene 187 9-18；Burton等人(1994)Advances in Immunology57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开案WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些；所述文献各自通过引用的方式完整地并入本文。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并且将其用来产生完整抗体(包括人抗体)或任何其他所需的抗原结合片段并且在任何所需的宿主中表达，所述宿主例如，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，如下文详细描述的。例如，还可以使用本领域已知的方法，如在PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等人,(1992)BioTechniques12(6):864-869；和Sawai等人,(1995)AJRI 34:26-34；和Better等人,(1988)Science 240:1041-1043(所述参考文献通过引用的方式完整并入)中公开的那些，利用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术。
可以用来产生单链Fv和抗体的技术的例子包括在美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人,(1991),Methods in Enzymology 203:46-88；Shu等人,(1993)PNAS 90:7995-7999；和Skerra等人,(1988)Science 240:1038-1040中描述的那些。
本发明提供抗BST1免疫球蛋白分子的有功能活性的片段、衍生物或类似物。有功能活性的意指，片段、衍生物或类似物能够激发抗-抗独特型抗体(即三级抗体(tertiaryantibody))，所述抗-抗独特型抗体识别由所述片段、衍生物或类似物所源自的抗体识别的相同抗原。 具体而言，在具体实施方案中，免疫球蛋白分子的独特型的抗原性可以通过缺失特异性识别抗原的CDR序列C端的框架和CDR序列来增强。为确定哪种CDR序列结合抗原，可以通过本领域已知的任何结合测定法，在结合测定法中使用含有CDR序列的合成肽以及抗原。
本发明提供抗体片段，例如但不限于F(ab′)2片段和Fab片段。可以通过已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。F(ab′)2片段由可变结构域、轻链恒定区和重链的CH1结构域组成并且通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生。Fab片段通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生。本发明也提供本发明抗体的重链和轻链二聚体，或其任何最小片段如Fv或单链抗体(SCA)[例如，如美国专利4,946,778；Bird,(1988)Science242:423-42；Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；和Ward等人,(1989)Nature 334:544-5中所述]，或具有与本发明抗体相同的特异性的任何其他分子。通过用氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段(以产生单链多肽)，来形成单链抗体。可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术[Skerra等人,(1988)Science 242:1038-1041]。
在其他实施方案中，本发明提供了本发明免疫球蛋白(或其有功能活性的片段)的融合蛋白，例如其中所述免疫球蛋白借助共价键(例如肽键)在N末端或C末端与不是免疫球蛋白的另一种蛋白质(或其部分，优选地该蛋白质的至少10、20或50个氨基酸的部分)的氨基酸序列融合。优选地，免疫球蛋白或其片段在恒定结构域的N末端与另一种蛋白质共价连接。如上文所述，这类融合蛋白可以促进纯化、增加体内半衰期和促进抗原跨上皮屏障递送至免疫系统。
本发明的免疫球蛋白包括经修饰的类似物和衍生物，即，通过共价连接任何类型的分子来进行修饰，只要这类共价连接不损害免疫特异性结合。例如，但不作为限制，免疫球蛋白的衍生物和类似物包括，已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白酶切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进一步修饰的那些衍生物和类似物。可以通过已知的技 术实施众多化学修饰的任一者，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。另外，类似物或衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
小鼠的免疫
小鼠可以用重组BST1和/或BST1抗原的纯化或富集的制备物或表达BST1的细胞进行免疫。优选地，当首次输注时，小鼠是6-16周龄。例如，BST1抗原的纯化或重组制备物(100μg)可以用来腹膜内免疫小鼠。
采用各种抗原的累积性经验已经显示，用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫时，小鼠产生应答。然而发现，除弗氏佐剂之外的佐剂也有效。此外，发现完整细胞在佐剂不存在时具有高度免疫原性。可以在免疫操作方案期间监测免疫应答，通过眶后采血获得血浆样品。可以通过ELISA(如下文描述的)筛选血浆，以检测令人满意的滴度。可以用抗原连续3日静脉内强化免疫小鼠，5天后处死小鼠并取出脾脏。在一个实施方案中，可以使用A/J小鼠品系(Jackson实验室,Bar Harbor,Me.)。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
如本领域熟知的，可以在宿主细胞转染瘤中，使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合，产生本发明的抗体[例如Morrison,S.(1985)Science229:1202]。
例如，为表达抗体，或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将所述DNA插入表达载体中，从而基因与转录和翻译控制序列有效连接。在这种背景下，术语“有效连接”意指，将抗体基因连接入载体，从而载体内的转录和翻译控制序列执行它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用表达宿主细胞相容。
可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，且第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有 使得重链和轻链多肽能够等同表达的相同选择标记。可选地，可以使用编码重链多肽和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况下，轻链应当置于重链之前以避免过量的有毒的游离重链[Proudfoot(1986)Nature 322:52；Kohler(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197]。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
通过标准方法将抗体基因插入表达载体(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或如果不存在限制性位点，则平末端连接)。本文所述的抗体的轻链可变区和重链可变区可以通过以下方式用来产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，以便VH区段与载体内部的CH区段有效连接并且VK区段与载体内部的CL区段有效连接。此外或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体，使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他控制抗体链基因转录或翻译的表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中描述。本领域技术人员理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于因素，例如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调节序列，如遍在蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件可包含不同来源的序列，如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列 [Takebe,Y.等人,(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472]。
除抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可以携带其他序列，如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进选择其中已经导入载体的宿主细胞(见，例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，全部专利均属于Axel等人)。例如，选择标记基因一般对其中已经导入载体的宿主细胞赋予针对药物(如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中连同甲氨蝶呤选择/扩增一起使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式意在包括，常用于向原核或真核宿主细胞引入外源DNA的各种技术，例如，电穿孔法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法等。虽然理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是最优选的是在真核细胞中并且最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这类真核细胞并且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配并分泌正确折叠和有免疫学活性的抗体。已经报道抗体基因的原核表达不能有效产生高产量的活性抗体[Boss,M.A.和Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13]。
用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(连同载体如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)[Foecking等人,1986,Gene 45:101；Cockett等人,(1990)BioTechnology 8:2]、在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞(其与DHFR选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一个优选的表达系统是在WO 87/04462(Wilson)、WO 89/01036(Bebbington)和EP 338,841(Bebbington)中公开的GS基因表达系统。
各种宿主表达载体系统可以用来表达本发明的抗体分子。这类宿 主-表达系统代表可以借以产生并且随后纯化目的编码序列的载体，且还代表在用适宜的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于，用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，可以根据表达的抗体分子的预期用途有利地选择许多表达载体。例如，当意在大量产生这种蛋白质以用于产生包含抗体分子的药物组合物时，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,(1983)EMBO J.2:1791)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区符合读框地单独连接入载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体[Inouye和Inouye(1985)NucleicAcids Res.13:3101-3109；Van Heeke和Schuster(1989)J.Biol.Chem.24:5503-5509]；并且相似的pGEX载体也可以用于将外来多肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)一起表达为融合蛋白。通常，这类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附并与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，从裂解的细胞中轻易地纯化。pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)作为表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆至该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统(例如腺病毒表达系统)。
如上文讨论的，可以选择这样的宿主细胞株系，其以期望的特定方式调节插入序列的表达或修饰及加工基因产物。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对蛋白质的功能可能是重要的。
为长期、高产量产生重组抗体，稳定表达是优选的。例如，可以通过以下方式产生稳定表达目的抗体的细胞系：用包含抗体的核苷酸序列和选择标记(例如新霉素或潮霉素)的核苷酸序列的表达载体转染细胞，并且针对选择标记的表达进行选择。这类工程化的细胞系可特别地用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。
可以通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平[关于综述，见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press，NewYork，1987)]。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平的提高将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以抗体的产生也将增加[Crouse等人,1983,Mol.Cell.Biol.3:257]。
当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过下列来产生抗体：培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地允许抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的一段时间。一旦已经重组地表达本发明的抗体分子，便可以通过本领域已知的用于纯化抗体分子的任何方法来纯化它，例如通过层析(例如离子交换层析，亲和层析如采用蛋白质A或特定抗原和筛分柱层析(sizing column chromatography))、离心、差异性溶解，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化。
可选地，可以利用对表达的融合蛋白特异的抗体，轻易地纯化任 何融合蛋白。例如，由Janknecht等人描述的系统允许容易地纯化人细胞系中表达的未变性的融合蛋白[Janknecht等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897]。在这种系统中，将目的基因亚克隆至痘苗病毒重组质粒中，从而基因的可读框与由六组氨酸残基组成的氨基端标签以翻译方式融合。该标签充当融合蛋白的基质结合结构域。将源自重组痘苗病毒所感染的细胞的提取物加载到Ni2+次氮基三乙酸-琼脂糖柱上，并且用含有咪唑的缓冲剂选择性地洗脱加组氨酸标签的蛋白质。
与抗原结合的抗体的表征
随后可以通过以下方式选择由这些方法产生的抗体：首先用纯化的目的多肽筛选亲和力和特异性，并且(如果需要)，将该结果与抗体和需要从结合作用中排除的多肽的亲和力和特异性相比较。可以通过例如标准ELISA测试抗体与BST1的结合。筛选方法可以包括，在微量滴定平板的独立孔中固定纯化的多肽。随后将含有潜在抗体或抗体群组的溶液置于相应的微量滴定孔中并且温育约30分钟至2小时。随后洗涤微量滴定孔，并且将标记的第二抗体(例如，如果生成的抗体是小鼠抗体，与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加至各孔并且温育约30分钟，并且随后洗涤。将底物添加至各孔并且当针对固定多肽的抗体存在时，将出现颜色反应。
随后可以在所选的测定设计中，进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在开发针对靶蛋白的免疫测定法时，纯化的靶蛋白充当标准，其中针对所述标准，判断使用所选抗体的免疫测定法的灵敏度和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能不同、某些抗体对(例如，在夹心测定法中)可能在空间上彼此干扰等，所以抗体的分析性能可能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
本领域技术人员理解，在产生抗体或结合性片段并且筛选和选择各种多肽的亲和力及特异性时，可以采用许多方案，但是这些方案不改变本发明的范围。
为了确定选择的抗BST1单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使 用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用BST1包被的ELISA平板进行竞争研究，所述竞争研究使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合作用。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型抗体特异的试剂进行同种型ELISA。
可以通过蛋白质印迹法进一步测试抗BST1抗体与BST1抗原的反应性。简而言之，可以制备BST1并使其经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10%胎牛血清封闭，并且用待测试的单克隆抗体探测。
本发明抗体的结合特异性也可以通过监测(例如，通过流式细胞术监测)该抗体与表达BST1的细胞的结合来确定。通常地，细胞系，如CHO细胞系，可以用编码BST1的表达载体转染。转染的蛋白质可以包含标签(如myc-标签)，优选地处于N端，以便使用针对该标签的抗体进行检测。可以通过将转染的细胞与抗体温育并且检测结合的抗体，来确定本发明抗体与BST1的结合。可以将抗体与转染的蛋白质上的标签的结合用作阳性对照。
可以通过以下方式进一步研究本发明抗体针对BST1的特异性：使用用于确定与BST1的结合作用的相同方法，确定该抗体是否或与其他蛋白质(如Eph家族的另一个成员)结合。
免疫缀合物
在另一个方面，本发明表征了与治疗性部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合的抗BST1抗体或其片段。这类缀合物在本文中称作“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于(例如，杀死)细胞的任何物质。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁 卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂也例如包括抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C、和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类(例如柔红霉素(以前为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前为放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
可以与本发明抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括多卡米星、刺孢霉素、美坦生和奥瑞司他汀和其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(American Home Products)。
细胞毒素可以使用本领域可获得的接头技术与本发明的抗体缀合。已经用来将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的例子包括但不限于含腙、硫醚、酯、二硫键和肽的接头。可以选择例如对溶酶体区室内的低pH的切割作用敏感或对蛋白酶(如肿瘤组织中优先表达的蛋白酶如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))的切割作用敏感的接头。
细胞毒素的例子例如描述于美国专利6,989,452、7,087,600和7,129,261，和PCT申请号PCT/US2002/17210、PCT/US2005/017804、PCT/US2006/37793、PCT/US2006/060050、PCT/US2006/060711、WO2006/110476，和美国专利申请号60/891,028中，其全部均通过引用的方式完整并入本文。关于细胞毒素类型、接头和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还见Saito,G.等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.,(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.,(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
本发明的抗体也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药 物，也称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括，但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的例子是可商业获得的，包括(IDEC Pharmaceuticals)和(Corixa Pharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来制备利用本发明抗体的放射免疫缀合物。
本发明的抗体缀合物可以用来调节给定的生物学应答，并且药物部分不应解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括，例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学应答调节物如，例如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其他生长因子。
用于将这类治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，见，例如Arnon等人,″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人,(eds.),第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,″Antibodies For Drug Delivery″，引自ControlledDrug Delivery(第2版),Robinson等人,(编著),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″，引自Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人,(编著),第475-506页(1985)；″Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，引自MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人,(编著),第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe等人,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面，本发明表征了包含本发明的抗BST1抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以进行衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或针对受体的配体)以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。实际上，本发明的抗体可以进行衍生化或连接至多于一种其他功能分子以产生与多于两个不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这类多特异性分子也意欲包括在本文所用的术语“双特异性分子”中。为了产生本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一种或多种其他结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或结合性模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，所述双特异性分子包含针对第一靶表位(即BST1)的至少一个第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。第二靶表位可以在与第一结合特异性所结合的靶蛋白相同的靶蛋白上存在；或第二靶表位可以在相对于第一结合特异性所结合的靶蛋白而言不同的靶蛋白上存在。第二靶表位可以在与第一靶表位(即BST1)相同的细胞上存在；或第二靶表位可以在不由展示第一靶表位的细胞展示的靶上存在。如本文所用，术语‘结合特异性’指包含至少一个抗体可变结构域的部分。
在本发明的一个实施方案中，第二靶表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够结合至表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN)并结合至表达BST1的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子将表达BST1的细胞靶向效应细胞并触发Fc受体介导的效应细胞活性，如吞噬表达BST1的细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或生成超氧化物阴离子。
在本发明的另一个实施方案中，第二靶表位是CD3或CD5。因此，本发明包括能够结合至表达CD3或CD5的效应细胞(例如表达CD3或 CD5的细胞毒T细胞)并结合至表达BST1的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子将表达BST1的细胞靶向效应细胞并触发CD3或CD5介导的效应细胞活性，如T细胞克隆性扩增和T细胞细胞毒性。在这个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有总计两个或三个抗体可变结构域，其中双特异性抗体的第一部分能够通过特异性结合至位于人免疫效应细胞上的效应子抗原而召集人免疫效应细胞的活性，其中所述效应子抗原是人CD3或CD5抗原，所述第一部分由一个抗体可变结构域组成，并且双特异性抗体的第二部分能够特异性结合至除效应子抗原之外的靶抗原(例如BST1)，所述靶抗原位于除所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上，并且所述第二部分包含一个或两个抗体可变结构域。
在本发明的其中双特异性分子具有多特异性的实施方案中，除了抗Fc结合特异性或抗CD3或CD5结合特异性和抗BST1结合特异性之外，该分子可以进一步包含第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒活性的表面蛋白结合并因而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是，与给定分子(例如抗原或受体)结合并且因而导致增强结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。可选地，抗增强因子部分可以与这样的实体结合，所述实体不同于与第一和第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可以结合细胞毒性T-细胞(例如借助CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的免疫应答增加的其他免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、dAb或单链Fv)作为结合特异性。抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段如Fv或单链构建体，如美国专利号4,946,778中所述的，所述专利的内容明确地通过引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，针对Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提 供，所述单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用，术语“IgG受体”指位于1号染色体上的8个γ-链基因的任一个。这些基因编码总计12种跨膜或可溶性受体同工型，它们分成三个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是一种72kDa分子，它对单体IgG显示高亲和力(108-109M-1)。
某些优选抗Fcγ单克隆抗体的产生和表征描述于PCT公开案WO88/00052和美国专利号4,954,617中，所述文献的教导通过引用的方式完整并入本文。这些抗体与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位在下述位点结合，所述位点不同于该受体的Fcγ结合位点，并且因此，它们的结合作用基本上不被生理学水平的IgG所阻断。可用于本发明中的具体抗FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC登录号HB9469。在其他实施方案中，抗Fcγ受体抗体是人源化形式的单克隆抗体22(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano,R.F.等人,(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和PCT公开案WO94/10332中描述。产生H22抗体的细胞系以名称HA022CL1保藏于美国典型培养物保藏中心并具有登录号CRL11177。
在又一个优选实施方案中，针对Fc受体的结合特异性由结合至人IgA受体(例如Fc-α受体[FcαRI(CD89)])的抗体提供，所述抗体的结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”意在包括位于19号染色体上的一个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码55至110kDa的几种可选剪接的跨膜同工型。FcαRI(CD89)以组成型方式在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上表达，但是不在非效应细胞群体上表达。FcαRI对IgA1和IgA2具有中等亲和力(约5×107M-1)，所述亲和力在暴露于细胞因子如G-CSF或GM-CSF时增加[Morton,H.C.等人,(1996)Critical Reviews in Immunology16:423-440]。已经描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，它们被鉴定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合结构域外部 结合FcαRI[Monteiro,R.C.等人,(1992)J.Immunol.148:1764]。
FcαRI和FcγRI是用于本发明双特异性分子中的优选触发受体，因为它们(1)主要表达在免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)上；(2)以高水平表达(例如5,000-100,000每细胞)；(3)是细胞毒活性(例如ADCC，吞噬)的介体；并且(4)介导被靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
可以用于本发明双特异性分子中的抗体是鼠、人、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以通过使用本领域已知的方法，将结合特异性例如抗-FcR、抗-CD3、抗-CD5和抗-BST1结合特异性缀合而制备本发明的双特异性分子。例如，每种双特异性分子的结合特异性可以单独地产生并且随后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，各种偶联剂或交联剂可以用于共价缀合。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)[见例如Karpovsky等人,(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648]。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人,(1985)Science229:81-83和Glennie等人,(1987)J.Immunol.139:2367-2375中描述的那些。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，二者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
已经通过将双重结合作用工程化入全长抗体样形式，针对双特异性获得了另外的双价结构(Wu等人,2007,Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297；USSN12/477,711；Michaelson等人,2009,mAbs 1[2]:128-141；PCT/US2008/074693；Zuo等人,2000,ProteinEngineering 13[5]:361-367；USSN09/865,198；Shen等人,2006,J Biol Chem 281[16]:10706-10714；Lu等人,2005,J Biol Chem 280[20]:19665-19672；PCT/US2005/025472；所述文献明确地通过引用的方式并入本文)。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，优选地1个巯基残基。
可选地，两种结合特异性可以在相同的载体中编码并且在相同的宿主细胞中表达及装配。这种方法在下述情况下特别有用，其中双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fabx F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如在美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498和5,482,858中描述，所述文献均明确地通过引用的方式并入本文。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法证实双特异性分子与其特异性靶的结合。通常，通过使用特异于目的复合物的标记试剂(例如抗体)，这些测定法各自检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别抗体-FcR复合物并与之特异性结合的酶联抗体或抗体片段检测FcR-抗体复合物。可选地，可以使用多种其他免疫测定法的任一种检测复合物。例如，抗体可以进行放射性标记并且用于放射免疫测定(RIA)中(见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986，所述文献通过引用的方式并入本文)。可以通过工具如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影术检测放射性同位素。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统抗体并且可以使用抗体片段和抗体模拟物来实施。如下文详述的，现在已经开发了多种抗体片段和抗体模拟技术并 且它们是本领域内广泛已知的。尽管这些技术中的许多技术如结构域抗体、纳米抗体和UniBody利用传统抗体结构的片段或其他修饰形式，但是也存在替代性技术，如采用下述结合结构的亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody，其中所述结合结构从不同机理产生并且借助不同机理发挥功能，并且模拟传统的抗体结合作用。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单位，对应于人抗体重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量。Domantis已经开发了一系列庞大和高度功能性的完全人VH和VL dAb文库(每个文库中超过100亿个不同的序列)，并且使用这些文库来选择对治疗性靶特异的dAb。与许多常规抗体相反，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中表达良好。结构域抗体和其产生方法的进一步细节可以通过参考美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684及0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609而获得，所述文献各自通过引用方式完整并入本文。
纳米抗体是抗体衍生的治疗性蛋白质，其含有天然存在的重链抗体的独特结构性和功能性特征。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要地，克隆和分离的VHH结构域是具有原始重链抗体的完整抗原结合能力的非常稳定的多肽。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高度同源性并且可以进一步人源化，而没有活性的任何丧失。重要地，纳米抗体具有低免疫原性潜力，这已经在采用纳米抗体先导化合物的灵长类研究中予以证实。
纳米抗体结合了常规抗体的优点与小分子药物的重要特征。如同常规抗体，纳米抗体显示对其靶的高度靶特异性、高亲和力以及低固有毒性。然而，如同小分子药物，它们可以抑制酶并轻易地抵达受体裂隙。另外，纳米抗体极端稳定，可以通过注射之外的手段施用(见例如WO 04/041867，所述文献通过引用的方式完整并入本文)并且易于制备。纳米抗体的其他优点包括，识别不寻常或隐藏表位(原因在于它 们的尺寸小)、以高亲和力和选择性结合至蛋白质靶的空穴或活性部位内(原因是它们的独特3维构象)、药物样式灵活性、半衰期的可调节性，以及发现药物的容易性和速度。
纳米抗体由单基因编码并且在几乎全部的原核和真核宿主，例如大肠杆菌(见，例如，US 6,765,087，其通过引用方式完整并入本文)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属)(见，例如，US 6,838,254，其通过引用方式完整并入本文)中高效产生。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的纳米抗体。由于相比于常规抗体，纳米抗体显示出优越的稳定性，故可以将它们配制为货架期长的即用型溶液。
纳米克隆方法(见例如，WO 06/079372，其通过引用方式完整并入本文)是一种基于B-细胞的自动化高通量选择，针对想要的靶产生纳米抗体的专利方法，并且可以在本发明的环境下使用。
UniBody是另一种抗体片段技术，然而这种技术基于IgG4抗体的铰链区的去除。铰链区的缺失产生了大小基本上为传统IgG4抗体的一半并且具有单价结合区而不是IgG4抗体双价结合区的分子。也熟知的是，IgG4抗体具有惰性并且因而不与免疫系统相互作用，这对于治疗其中不希望有免疫应答的疾病可以是有利的，并且这个优点传递到UniBody上。例如，UniBody可以发挥抑制或沉默它们结合的细胞，但是不杀伤所述细胞。另外，与癌细胞结合的UniBody不刺激它们增殖。另外，因为UniBody的尺寸是传统IgG4抗体约一半，所以它们可以在较大实体瘤上显示更好的分布，并产生潜在有利的功效。UniBody以类似于完整IgG4抗体的速率从身体中清除并且能够以类似于完整抗体的亲和力与它们的抗原结合。UniBody的进一步细节可通过参考专利公开案WO2007/059782获得，所述文献通过引用方式完整并入本文。
亲和体分子代表基于58个氨基酸残基的蛋白质结构域的一类新亲和蛋白，所述58个氨基酸残基的蛋白质结构域源自葡萄球菌蛋白A的结合IgG的结构域之一。已经将这种三螺旋束结构域用作构建组合 噬菌体文库的支架，其中可以使用噬菌体展示技术，从所述噬菌体文库中选择针对所需分子的亲和体变体[Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,StahlS,Uhlen M,Nygren PA,(1997)′Binding proteins selected from combinatoriallibraries of an α-helical bacterial receptor domain′,Nat Biotechnol 15:772-7.Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,(2002)′Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A′,Eur JBiochem.269:2647-55]。亲和体分子的简单稳健结构连同它们的低分子量(6kDa)，使得它们适合类型广泛的应用，例如，用作检测试剂[Ronmark J.等人,(2002)′Construction andcharacterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli′ JImmunol Methods 261:199-211]和用于抑制受体相互作用[Sandstorm K,Xu Z,ForsbergG,Nygren PA(2003)′Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by aCD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering′Protein Eng 16:691-7]。亲和体和其产生方法的进一步细节可以通过参考美国专利号5831012获得，所述文献通过引用方式完整并入本文。
标记的亲和体也可以用于成像应用中，用于确定同工型的丰度。
DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白)是已经被开发用来探测非抗体多肽的结合能力的抗体模拟物DRP(设计的重复序列蛋白)技术的一个例子。重复序列蛋白如锚蛋白或富亮氨酸重复序列蛋白是广泛存在的结合分子，它们不同于抗体，在胞内和胞外存在。它们的独特模块式架构以重复结构单元(重复序列)为特征，所述重复结构单元堆叠在一起，形成显示出可变的和模块式的靶结合表面的延长重复序列结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样化的结合特异性的多肽组合文库。这种策略包括显示可变表面残基的自我相容性重复序列的共有设计和将它们随机装配成重复序列结构域。
DARPin可以在细菌表达系统中以极高产率产生，并且它们属于已 知的最稳定的蛋白质。已经选择针对宽范围的靶蛋白的高度特异性高亲和力的DARPin，所述靶蛋白包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白。可以获得具有单数字摩尔至皮摩尔范围内的亲和力的DARPin。
DARPin已经用于广泛类型的应用中，包含ELISA，夹心ELISA、流式细胞分析(FACS)、免疫组织化学(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹法。也已证明DARPin在胞内区室中具有高度活性，例如，作为与绿色荧光蛋白(GFP)融合的胞内标记蛋白。DARPin进一步用来以pM范围的IC50抑制病毒进入。DARPin不仅理想地阻断蛋白质-蛋白质相互作用，还抑制酶。作为最常见的变构抑制模型，已经成功地抑制蛋白酶、激酶和转运蛋白。在肿瘤上非常快速和特异的富集和非常有利的肿瘤对血液比使得DARPin特别适用于体内诊断药或治疗方法。
关于DARPin及其他DRP技术的额外信息可以在美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利公开号WO 02/20565中找到，这两份文献均通过引用的方式完整地并入本文。
Anticalin是另一种抗体模拟物技术。在这种情况下，结合特异性源自脂笼蛋白(lipocalin)，一个在人组织和体液中天然和大量表达的低分子量蛋白质家族。脂笼蛋白已经演化成在体内执行一系列与生理转运和储存化学敏感或不溶性化合物相关的功能。脂笼蛋白具有稳健的固有结构，其包含高度保守的β-桶，所述β-桶在蛋白质的一端支撑4个环。这些环形成结合袋的入口，并且该分子这部分中的构象差异解释了各个脂笼蛋白之间结合特异性的变化。
尽管保守β-折叠框架支撑的高变环的总体结构类似于免疫球蛋白，但是脂笼蛋白在大小方面与抗体明显不同，由160-180个氨基酸的单条多肽链组成，所述的单条多肽链略大于单个免疫球蛋白结构域。
将脂笼蛋白克隆并且使它们的环经历工程化以产生Anticalin。已经产生结构上多样的Anticalin的文库，并且Anticalin展示术允许选择并筛选结合功能，随后表达和产生可溶性蛋白用于在原核或真核系统中进行进一步分析。研究已经成功显示：可以形成这样的 Anticalin，其对实际上任何人类靶蛋白是特异的，可以将其分离，并且可以获得纳摩尔范围或更高的结合亲和力。
也可以将Anticalin编制为双重靶向蛋白，即所谓的Duocalin。Duocalin以使用标准制备工艺易于产生的一种单体蛋白质结合两个独立的治疗靶，同时保留靶特异性和亲和力，无论这两个结合结构域的结构取向是什么。
在已知涉及多于单个病因因素的疾病中，通过单个分子调节多个靶是特别有利的。另外，二价或多价结合形式如Duocalins在以下方面具有明显潜力：在疾病中靶向细胞表面分子、介导对信号转导途径的激动效应或通过结合细胞表面受体并且使其簇集而诱导增强的内化作用。另外，Duocalins的高固有稳定性与单体Anticalin相当，从而为Duocalin提供灵活的配制和递送可能性。
关于Anticalin的额外信息可以在美国专利号7,250,297和国际专利公开号WO99/16873中找到，所述两份文献均通过引用的方式完整地并入。本文
可用于本发明环境下的另一个抗体模拟物技术是Avimer。Avimer通过体外外显子改组和噬菌体展示而从一个庞大的人胞外受体结构域家族中演化，从而产生具有结合特性和抑制特性的多结构域蛋白质。已经显示，多个独立的结合结构域的连接产生亲和力并且与常规的单表位结合蛋白相比，导致改进的亲和性和特异性。其他潜在优点包括在大肠杆菌中简单和高效地产生多靶特异性分子、改进的热稳定性和对蛋白酶的抗性。已经获得针对多种靶的具有亚纳摩尔亲和力的Avimer。
关于Avimer的额外信息可以在美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，所述的文献因而均通过引用的方式完整地并入本文。
Versabody是可用于本发明环境下的另一项抗体模拟物技术。 Versabody是半胱氨酸>15%的3-5kDa小蛋白质，其形成替换寻常蛋白质具有的疏水核心的高二硫键密度支架。用少数二硫键替换大量疏水性氨基酸(包含疏水核心)产生更小、更亲水(较少的聚集和非特异性结合)、更抵抗蛋白酶和热并且具有更低T细胞表位密度的蛋白质，原因对MHC呈递作出最大贡献的残基是疏水性的。众所周知全部这4种特性均影响免疫原性，并且预期它们一起引起免疫原性的巨大降低。
Versabody的灵感来自水蛭、蛇、蜘蛛，蝎子，蜗牛和海葵产生的可注射天然生物药物，这些药物已显示出乎意料低的免疫原性。从选择的天然蛋白质家族开始，通过设计和筛选，使尺寸、疏水性、蛋白酶解性抗原加工和表位密度最小化至远低于可注射天然蛋白均值的程度。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了通用样式，所述通用样式包括多价态、多特异性、多种的半衰期机制、组织靶向模块和不存在抗体Fc区。另外，Versabody可以在大肠杆菌中以高产率产生，并且因为它们的亲水性和小尺寸，Versabody是高度可溶的并且可以配制成高浓度。Versabody具有出乎意料的热稳定性(可以将它们煮沸)并提供延长的货架期。
关于Versabody的额外信息，可以在美国专利申请公开号2007/0191272中找到，所述文献通过引用的方式完整地并入本文。
上文提供的抗体片段和抗体模拟物技术的详细描述不意欲是可用于本说明书上下文中的全部技术的全面清单。例如并且非限制性地，可在本发明的环境中使用多项额外技术，包括基于多肽的替代性技术，如互补决定区融合法(如Qui等人,(2007)NatureBiotechnology25(8):921-929中所概述的，所述文献因而通过引用的方式完整地并入本文)，以及基于核酸的技术，如在美国专利5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774和6,387,620中描述的RNA适配体技术，所述全部文献均通过引用的方式并入本文。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了含有与可药用载体一起配制的一种或组合的本发明单克隆抗体或其抗原结合部分的组合物，例如，药物组合物。这类种组合物可以包括一种或组合(例如两个或更多个不同的)本发明抗体或免疫缀合物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以包含与靶抗原上不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
本发明的药物组合物也可以在联合疗法中施用，即，与其他试剂组合。例如，联合疗法可以包括与至少一种其他的抗肿瘤剂或抗炎剂或免疫抑制剂组合的本发明抗体。在下文关于本发明抗体用途的部分中，更详细描述可以在联合疗法中使用的治疗剂的例子。
如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容性的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物，即抗体、免疫缀合物或双特异性分子，可以包覆于保护该化合物免遭可能使化合物失活的酸和其他天然条件的作用的材料内。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指这样的盐，其保留亲本化合物的所希望的生物活性并且不引起任何不希望的毒理作用[见，例如，Berge,S.M.等人,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19]。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸、如氢氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等的那些酸加成盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属如钠、钾、镁、钙等以及衍生自无毒有机胺、如N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些碱加成盐。
本发明的药物组合物也可以包括可药用的抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏 血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度、和通过使用表面活性剂，来维持适宜的流动性。
这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的灭菌方法和通过纳入多种抗菌剂和抗真菌剂例如，尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物存在。也可能希望的是，将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外，可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来获得可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的情况之外，构思了任何常规介质或试剂在本发明药物组合物中的用途。也可以将补充性活性化合物并入组合物中。
治疗性组合物一般必须是无菌的，且在制备和储存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，来维持适宜的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸盐和明胶来获得可注射药组合物的延长吸收。
可以通过将活性化合物以要求的量连同上文所列举的成分之一或 组合(根据需要)并入合适的溶剂中，随后无菌微过滤，而制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和需要的其他成分(来自上文所列举的那些成分)。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥法和冷冻干燥(冻干)法，所述方法产生有效成分外加来自先前无菌过滤的溶液中的任何其他所需成分的粉剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的有效成分的量将根据待治疗的受试者和具体施用模式而变动。可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的有效成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。总体上，以100%计，该量可以是与可药用载体组合的约0.01%至约99%的有效成分，优选约0.1%至约70%、优选约1%至约30%的有效成分。
调整剂量方案以提供想要的最佳应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次大丸剂，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或可以如治疗情况的需要所示，按比例减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的，剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与需要的药用载体一起产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的说明书由下述决定并且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)配制此类活性化合物的领域内的固有限制(用于处理个体敏感性)。
对于抗体施用，剂量是约0.0001至100mg/kg和更常见地0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要施用每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。用于本发明抗BST1抗体的优选剂量方案包括通过静脉内施用的1mg/kg体重或3mg/kg体重，且使用以下给药方案之一给予抗体：(i)每四周给予六个剂量，随后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg 体重一次，随后每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量落在所陈述的范围内。通常在多个时刻上施用抗体。各个剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示的。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中实现约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
可选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人抗体显示最长的半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变动。在预防性应用中，相对低的剂量以相对不频繁的间隔在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中，有时需要相对短的间隔和相对高的剂量，直至疾病的进展被减少或终止，并且优选地直至患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后，可以给患者施用预防性方案。
可以变动有效成分在本发明药物组合物中的实际剂量水平，以获得有效成分的量，所述的量对于特定患者、组合物和施用模型，有效实现期望的治疗应答，而对患者无毒。所选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。
本发明的抗BST1抗体的“治疗有效剂量”优选地导致降低疾病症状的严重性、增加无疾病症状期的频率和持续时间，或预防因疾病侵袭所致的受损或致残。例如，为了治疗BST1介导的肿瘤，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少 约20%、更优选地至少约40%、甚至更优选地至少约60%和仍更优选地至少约80%。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可选地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价组合物的这种特性，这种抑制作用可以通过技术人员已知的测定法体外测量。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤尺寸或否则改善受试者中的症状。本领域普通技术人员能够基于因素例如受试者的大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或施用途径，确定所述量。
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用。如技术人员理解的，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果。本发明抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。
活性化合物可以连同保护化合物免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的多种方法已被授予专利权或是本领域技术人员已知的[见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems(1978)J.R.Robinson编著,Marcel Dekker,Inc.,N.Y]。
可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。例如，在优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物可以用无针皮下注射装置如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880； 4,790,824或4,596,556中公开的装置施用。可用于本发明的熟知植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续递送药物的可变流量的可植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔区室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。这些专利通过引用的方式并入本文。许多其他的此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本发明的单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们例如配制在脂质体中。对于制备脂质体的方法，见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向性药物递送[见，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685]。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见，例如美国专利5,416,016)；甘露糖苷[Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038]；抗体[P.G.Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人,(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180]；表面活性蛋白质A受体[Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134]；p120[Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090]；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
用途和用法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内诊断用途和治疗用途，包括诊断和治疗BST1介导的疾病。
在一些实施方案中，这些分子可以施用至培养的、体外的或体内 的细胞或(例如体内)施用至受试者以治疗、预防或诊断多种疾病。如本文所用，术语“受试者”意在包括人和非人类动物。非人类动物包括全部脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类、羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖类和爬行类。优选的受试者包括具有由BST1活性介导的疾病的人类患者。所述方法特别适合于治疗具有与异常BST1表达相关的病症的人类患者。当针对BST1的抗体与另一种试剂一起施用时，两者可以按任何顺序或者同时施用。
鉴于本发明抗体对BST1的特异性结合，本发明的抗体可以用来特异性检测细胞表面上表达的BST1，并且，可以通过免疫亲和纯化法用来纯化BST1。
另外，鉴于BST1在肿瘤细胞上表达，本发明的抗体、抗体组合物和方法可以用来治疗患有以下疾病的受试者：致肿瘤性疾病，例如，特征在于存在表达BST1的肿瘤细胞的疾病，例如，包括急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。已显示BST1在抗体结合时内化，如下文实施例5中所示的，因此，本发明的抗体可用于任何酬载作用机制例如ADC方法、放射免疫缀合物或ADEPT方案中。
在一个实施方案中，本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以用来检测BST1的水平，或在其膜表面上含有BST1的细胞的水平，所述水平可以随后与某些疾病症状关联。可选地，抗体可以用来抑制或阻断BST1功能，这转而可以与某些疾病症状的预防或改善关联，从而提示BST1作为该疾病的介体。这可以通过使样品和对照样品与抗BST1抗体在允许抗体和BST1之间形成复合物的条件下接触来实现。在样品和对照中检测并且比较抗体和BST1之间形成的任何复合物。
在另一个实施方案中，可以针对与体外治疗用途或诊断用途相关的结合活性，初步测试本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)。例如，可以使用以下实施例中描述的流式细胞分析测试本发明的组合物。
本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子、免疫缀合物和组合物)在治疗和诊断BST1相关疾病中具有额外用途。例如，单克隆抗体，多特异性或双特异性分子和免疫缀合物可以用来在体内或在体外激发一种或多种以下生物学活性：抑制表达BST1的细胞的生长和/或杀伤表达BST1的细胞；在人效应细胞存在下介导对表达BST1的细胞的吞噬或ADCC，或阻断BST1配体与BST1结合。
在一个特定实施方案中，将抗体(例如单克隆抗体，多特异性和双特异性分子和组合物)在体内用于治疗、预防或诊断多种BST1-相关疾病。BST1-相关疾病的例子特别地包括表现急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌的人类癌症组织。
体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的适合途径是本领域熟知的并且可以由普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和重量以及抗体组合物的浓度和/或配方。
如先前所述，本发明的抗BST1抗体可以与一种或多种其他治疗剂例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂一起共施用。抗体可以与试剂连接(作为免疫复合物)或可以与试剂分开施用。在后一种情况下(分开施用)，抗体可以在试剂之前、之后或与其同时施用或可以与其他已知的疗法(例如抗癌治疗，例如，放疗法)共施用。这类治疗剂特别地包括，本身仅在对患者有毒或亚毒性的水平上有效的抗肿瘤剂如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。将顺铂以100mg/kg剂量每4周静脉内施用1次，并且将阿霉素以60-75mg/ml剂量每21日静脉内施用1次。适合与本发明抗体共施用的其他试剂包括用于治疗癌症(例如急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌或胰腺癌)的其他药物，如5FU和吉西他滨。本发明的抗BST1抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共施用提供了 通过对人肿瘤细胞产生细胞毒效应的不同机制起作用的两种抗癌剂。这类共施用可以解决因肿瘤细胞形成药物抗性或其抗原性变化(这可导致肿瘤细胞对抗体无反应)所致的问题。
靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应细胞，也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞和其他携带IgG受体或IgA受体的细胞。如果需要，效应细胞可以从待治疗的受试者获得。靶特异性效应细胞可以作为生理可接受溶液中的细胞悬液施用。施用的细胞的数目可以为108-109级别，但是将根据治疗目的变动。通常，该数量将足以在靶细胞(例如表达BST1的肿瘤细胞)处获得定位并且通过例如吞噬影响细胞杀伤。施用途径也可以变动。
采用靶特异性效应细胞的疗法可以与用于移除所靶向细胞的其他技术联合进行。例如，使用本发明组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)和/或以这些组合物武装的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化疗法联合使用。另外，联合免疫疗法可以用来将两个不同的细胞毒效应子群体引向肿瘤细胞排异。例如，与抗Fc-γRI或抗CD3连接的抗BST1抗体可以与IgG受体或IgA受体特异性结合剂联合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过压制和消除细胞表面上的受体。抗Fc受体的混合物也可以用于此目的。
具有补体结合位点(如来自结合补体的IgG1、IgG-2或IgG-3或IgM的部分)的本发明组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)，也可以在补体存在下使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适宜的效应细胞离体处理包含靶细胞的细胞群体可以通过添加补体或含有补体的血清进行补充。可以通过结合补体蛋白来改进对包被有本发明结合剂的靶细胞的吞噬。在另一个实施方案中，包被有本发明组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可以由补体裂解。在又一个实施方案中，本发明的组合物 不激活补体。
本发明的组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)也可以与补体一起施用。在某些实施方案中，本申请提供包含抗体，多特异性或双特异性分子以及血清或补体的组合物。当补体紧邻于抗体、多特异性或双特异性分子存在时，这些组合物可以是有利的。可选地，本发明的抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清可以分别施用。
还处于本发明的范围内是，包含本发明抗体组合物(例如单克隆抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。试剂盒可以进一步含有一种或多种额外的试剂，如免疫抑制试剂、细胞毒性剂或放射毒性剂或一种或多种额外的本发明抗体(例如抗体，其具有与BST1抗原中区别于第一抗体的表位结合的互补活性)。
因此，可以对用本发明抗体组合物治疗的患者额外地施用(在施用本发明抗体之前、同时或之后)增强或增进抗体治疗效果的另一种治疗剂，如细胞毒性剂或放射毒性剂。
在其他实施方案中，可以额外地用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的试剂治疗受试者，例如，用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗期间施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如抗体、多特异性和双特异性分子)也可以用来靶向表达FcγR或BST1的细胞，例如用于标记这类细胞。对于这类用途，结合剂可以与可被检测的分子连接。因此，本发明提供用于离体或体外定位表达Fc受体(如FcγR)或BST1的细胞的方法。可检测标记物可以例如是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在一个特定实施方案中，本发明提供用于检测BST1抗原在样品中的存在或测量BST1抗原的量的方法，所述方法包括，使样品和对照样品与特异性结合BST1的单克隆抗体或其抗原结合部分在允许抗体或其部分和BST1之间形成复合物的条件下接触。随后检测复合物的形 成，其中，样品与对照样品之间不同的复合物形成表示样品中存在BST1抗原。
在其他实施方案中，本发明提供用于治疗受试者中的BST1介导的疾病的方法，所述疾病例如是人类癌症和人类炎性疾病，包括本发明的疾病。
在又一个实施方案中，通过将化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)与抗体连接，本发明的免疫缀合物可以用来将这类化合物靶向具有BST1细胞表面受体的细胞。例如，抗BST1抗体可以偶联至美国专利号6,281,354和6,548,530、美国专利公开号2003/0050331、2003/0064984、2003/0073852和2004/0087497中描述或WO03/022806中公开的任何毒素化合物。因而，本发明提供体外或离体定位表达BST1的细胞的方法(例如采用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可选地，免疫缀合物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向BST1，用来杀伤具有BST1细胞表面受体的细胞。
本说明书中援引的全部参考文献，包括但不限于全部论文、出版物、专利、专利申请、演讲辞、文本、报告、手稿、手册、书籍、互联网记录，期刊文章、期刊、产品数据页等，在此通过引用的方式完整并入本说明书。对本文中的参考文献的讨论仅意在概述其作者所作出的陈述，而不承认任何参考文献构成了现有技术，并且申请人保留对所引用文献的精确性和关联性提出异议的权力。
虽然出于清楚理解的目的，已经通过例示和实施例详细描述了前述发明，但是本领域技术人员在本发明教导下将易于理解，可以对本发明作出某些变化和修改，而不脱离所附权利要求的精神或范围。
本发明通过不应当解释为限制性的以下实施例进一步说明。
实施例1：噬菌体展示文库的构建
由BST1第29-292位氨基酸组成的重组蛋白(SEQ ID NO:44)通过标准重组方法以真核方式合成并且用作免疫用抗原。
免疫和mRNA分离
如下构建用于鉴定BST1结合分子的噬菌体展示文库。A/J小鼠(Jackson实验室,Bar Harbor,Me.)用重组BST1抗原(胞外结构域)进行腹膜内免疫，在第0日使用弗氏完全佐剂中的100μg蛋白质并且在第28日使用100μg抗原。通过穿刺眶后窦获得小鼠的测试血液。如果，通过测试滴度，通过ELISA认为这些滴度是高的，所述ELISA使用借助中性抗生物素蛋白(Reacti-BindTM)固定的生物素化BST1抗原(NeutrAvidin(TM)包被的聚苯乙烯平板，Pierce，Rockford，Ill.)，则在第70日、第71日和第72日用100μg蛋白质对小鼠进行强化免疫，随后在第77日处死小鼠并进行脾切除术。如果认为抗体的滴度不令人满意，则在第56日用100μg抗原对小鼠强化免疫并且在第63日取得测试血液。如果获得令人满意的滴度，则在第98日、第99日和第100日用100μg抗原对动物强化免疫并且在第105日收获脾脏。
在层流柜中收获脾脏并将其转移至皮式培养皿，剪下并弃去脂肪和结缔组织。在1.0ml溶液D(25.0g硫氰酸胍(Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)、29.3ml无菌水、1.76ml0.75M柠檬酸钠pH7.0、2.64ml10%肌氨酰(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.)、0.36ml2-巯基乙醇(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.)存在下，用来自无菌5cc注射器的柱塞迅速捣碎脾脏。将这种脾悬液用18号针抽吸直至全部细胞裂解，并且将粘稠的溶液转移至微量离心管。皮式培养皿用100μl溶液D洗涤以回收任何剩余的脾。该悬液随后经22号针抽吸额外5-10次。
将样品在两个微量离心管之间平均分配并且按顺序添加以下溶液，并且在每次添加后通过颠倒混合：50μl2M乙酸钠pH4.0、0.5ml水-饱和苯酚(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.)，100μl氯仿/异戊醇49:1(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.)。将溶液涡旋混合10秒并在冰上温育15分钟。在2-8℃以14krpm离心20分钟后，将水相转移至一个新管。添加等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(50:49:1)，并将该管涡旋混合10秒。在冰上温育15分钟后，将样品 在2-8℃离心20分钟，并将水相转移至一个新管并且用等体积异丙醇在-20℃沉淀至少30分钟。在4℃以14krpm离心20分钟后，吸弃上清液，将管短暂离心并且从RNA沉淀物移除全部痕量的液体。
将RNA沉淀物分别溶解于300μl溶液D中，合并并且用等体积异丙醇在-20℃沉淀最短30分钟。将样品在4℃以14krpm离心20分钟，如前吸弃上清液，并且样品用100μl冰冷的70%乙醇淋洗。将样品再次在4℃以14krpm离心20分钟，吸弃70%乙醇溶液，并且将RNA沉淀物真空干燥。将沉淀物重悬于100μl无菌的焦碳酸二乙酯处理的水中。使用吸光度1.0对应于浓度40μg/ml，通过A260确定浓度。RNA贮存在-80℃。
互补DNA(cDNA)的制备
直接使用如上文所述的从小鼠脾纯化的总RNA作为制备cDNA的模板。将RNA(50μg)用无菌水稀释至100μL，并且添加10μL130ng/μL寡聚dT12(在Applied Biosystems392型号DNA合成仪上合成)。将样品在70℃加热10分钟，随后在冰上冷却。在冰上添加40μL5*第一链缓冲液(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)，连同20μL0.1M二硫苏糖醇(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)、10μL20mM脱氧核苷三磷酸(dNTP′s，Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)和10μL水。将样品随后在37℃温育2分钟。添加10μL逆转录酶(SuperscriptTM)II，Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)，并且在37℃继续温育1小时。cDNA产物直接用于聚合酶链反应(PCR)。
通过PCR扩增抗体基因
为了使用PCR扩增基本上全部的H链基因和L链基因，选择与基本上全部公开的序列对应的引物。因为H和L的氨基端的核苷酸序列含有巨大的多样性，所以合成33条寡核苷酸以充当H链的5′引物，并合成29条寡核苷酸以充当κL链的5′引物，如US6,555,310中所述的。每条链的恒定区核苷酸序列仅需要用于H链的一条3′引物和用于κL链的一条3′引物。
对于每个引物对，采用以下组分执行一个50μL反应：50μmol 5′引物，50μmol3′引物，0.25μL Taq DNA聚合酶(5单位/μL，Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)，3μLcDNA(如前述制备的)，5μL2mM dNTP，5μL含MgCl2的10*Taq DNA聚合酶缓冲液(BoehringerMannheim，印第安纳波利斯，Ind.)和H2O至50μL。使用GeneAmp(R)9600热循环仪(PerkinElmer，Foster City，Calif.)，按以下热循环程序进行扩增：94℃1分钟；30个循环的94℃20秒、55℃30秒和72℃30秒；72℃6分钟；4℃。
PCR过程的dsDNA产物随后经受仅使用3′引物的非对称PCR，以基本上仅产生靶基因的反义链。对于每种dsDNA产物，采用以下组分执行一个100μL反应：200μmol3′引物，2μLds-DNA产物，0.5μLTaq DNA聚合酶，10μL2mM dNTP，10μL含MgCl2的10*Taq DNA聚合酶缓冲液(Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)和H2O至100μL。如上文描述的相同PCR程序用来扩增单链(ss)-DNA。
通过高效液相色谱纯化单链DNA和单链DNA的激酶激活
通过添加2.5体积乙醇和0.2体积7.5M乙酸铵和在-20℃温育至少30分钟，按乙醇法沉淀H链ss-PCR产物和L链单链PCR产物。通过在Eppendorf离心机中以14krpm在2-8℃离心10分钟，使DNA离心沉淀。小心地吸出上清液，并将管再次短暂离心。用移液器移除最后一滴上清液。将DNA以中温真空干燥10分钟。将H链产物汇集于210μL水中并且将L链产汇集于另外210μL水中。通过使用Hewlett Packard 1090 HPLC和Gen-PakTM)FAX阴离子交换柱(Millipore Corp.,Milford,Mass.)的高效液相色谱(HPLC)纯化单链DNA。表1中显示用来纯化单链DNA的梯度，并且炉温是60℃。在260nm监测吸光度。以0.5分钟级分收集从HPLC洗脱的单链DNA。将含有单链DNA的级分按乙醇法沉淀、离心沉淀和干燥，如上文所述的。将干燥的DNA沉淀物汇集于200μL无菌水中。
表1-用于纯化ss-DNA的HPLC梯度
时间(分钟) %A %B %C 流速(ml/分钟)
0 70 30 0 0.75
2 40 60 0 0.75
17 15 85 0 0.75
18 0 100 0 0.75
23 0 100 0 0.75
24 0 0 100 0.75
28 0 0 100 0.75
29 0 100 0 0.75
34 0 100 0 0.75
35 70 30 0 0.75
缓冲液A是25mM Tris，1mM EDTA，pH8.0
缓冲液B是25mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0
缓冲液C是40mm磷酸
在制备时将单链DNA5′-磷酸化以便诱变。将24μL10*激酶缓冲剂(United StatesBiochemical，Cleveland，Ohio)，10.4μL10mM腺苷-5′-三磷酸(Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)和2μL多核苷酸激酶(30单位/μL，United States Biochemical，Cleveland，Ohio)添加至每份样品，并且将管在37℃温育1小时。通过在70℃温育所述管10分钟而终止反应。通过用Tris平衡酚(pH>8.0，United States Biochemical，Cleveland，Ohio):氯仿:异戊醇(50:49:1)提取1次并用氯仿:异戊醇(49:1)提取1次，纯化DNA。在提取后，如上文所述，将DNA按乙醇法沉淀并离心沉淀。将DNA沉淀物干燥，随后溶解于50μL无菌水中。使用33μg/ml对应于吸光度1.0，通过在260nm测量DNA等分试样的吸光度确定浓度。样品贮存在-20℃。
制备在生成脾抗体噬菌体文库中使用的尿嘧啶模板
将1ml大肠杆菌CJ236(BioRAD，Hercules，Calif.)过夜培养物添加至250ml带挡板的摇瓶中的50ml2*YT。将培养物在37℃培育至OD600=0.6，用10μl BS45载体噬菌体贮藏物的1/100稀释物接种(US 6,555,310中描述的)并且继续培育6小时。将大约40ml培养 物在4℃以12krpm离心15分钟。将上清液(30ml)转移至新离心管并在添加15μl10mg/ml RNA酶(Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，Ind.)后于室温温育15分钟。通过添加7.5ml的20%聚乙二醇8000(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.)/3.5M乙酸铵(Sigma ChemicalCo.，St.Louis,Mo.)并在冰上温育30分钟，沉淀噬菌体。将样品在2-8℃以12krpm离心15分钟。小心地弃去上清液，并且将管短暂离心以移除全部痕量的上清液。将沉淀物重悬于400μl高盐缓冲剂(300mM NaCl，100mM Tris pH8.0，1mM EDTA)中并转移至1.5ml管。
噬菌体母液用等体积的平衡酚:氯仿:异戊醇(50:49:1)反复提取直至见不到痕量的白色界面，并且随后用等体积的氯仿:异戊醇(49:1)提取。将DNA用2.5体积乙醇和1/5体积7.5M乙酸铵沉淀并且在-20℃温育30分钟。将DNA在4℃以14krpm离心10分钟，将沉淀物用冷70%乙醇洗涤1次并真空干燥。尿嘧啶模板DNA溶解于30μl无菌水中，并且使用吸光度1.0对应于浓度40μg/ml，通过A260确定浓度。将模板用无菌水稀释至250ng/μL，等分并贮存在-20℃。
诱变具有ss-DNA的尿嘧啶模板并电穿孔至大肠杆菌中以产生抗体噬菌体文库
通过将单链重链基因和轻链基因同时引入到噬菌体展示载体尿嘧啶模板上，生成抗体噬菌体展示文库。通过以下方式以2μg规模进行典型诱变：在0.2ml PCR反应管中混合以下组分：8μl(250ng/μL)尿嘧啶模板，8μl10*退火缓冲液(200mM Tris pH7.0，20mMMgCl2，500mM NaCl)，3.33μl激酶激活的单链重链插入物(100ng/μL)，3.1μl激酶激活的单链轻链插入物(100ng/μL)和无菌水至80μl。DNA在GeneAmp(R)9600热循环仪中使用以下热曲线退火：在94℃20秒，85℃60秒，经30分钟从85℃递减至55℃，在55℃保持15分钟。在该程序完成后，将DNA转移至冰上。通过添加8μl10*合成缓冲剂(5mM每种dNTP，10mM ATP，100mMTris pH7.4，50mM MgCl2，20mM DTT)，8μL T4DNA连接酶(1U/μL，Boehringer Mannheim，印第安 纳波利斯，Ind.)，8μL稀释的T7DNA聚合酶(1U/μL，New England BioLabs，Beverly，Mass.)并在37℃温育30分钟，实施延伸/连接。用300μl诱变终止缓冲液(10mM Tris pH8.0，10mM EDTA)终止反应。诱变DNA用平衡酚(pH>8):氯仿:异戊醇(50:49:1)提取一次，用氯仿:异戊醇(49:1)提取一次，并且将DNA在-20℃按乙醇法沉淀至少30分钟。将DNA离心沉淀并且如上文所述，小心地移除上清液。将样品再次短暂离心并且用移液器移除全部痕量的乙醇。将沉淀物真空干燥。使DNA重悬于4μl无菌水中。
使用电穿孔法，将1μl诱变DNA(500ng)转移至40μl电感受态大肠杆菌DH12S(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)中。将转化的细胞与大约1.0ml过夜XL-1细胞混合，所述的过夜XL-1细胞用2*YT培养液稀释至60%初始体积。随后将该混合物转移至15-ml无菌培养管并且添加9ml顶层琼脂，用于铺展在150-mm LB琼脂平板上。将平板在37℃温育4小时并随后转移至20℃过夜。通过用10ml2*YT从这些平板洗下噬菌体，离心去除残片并取得上清液，而取得首轮次抗体噬菌体。这些样品是用于选择针对BST1的抗体的抗体噬菌体展示文库。通过在LB琼脂平板上铺展10μl的10-4稀释度的悬浮细胞，随后在37℃温育平板过夜，来测量电穿孔的效率。通过将10-4稀释度平板上噬斑的数目乘以106，计算出效率。在这些条件下，文库电穿孔效率一般大于1*107个噬菌体。
通过电穿孔转化大肠杆菌
在冰上融化电感受态大肠杆菌细胞。通过温和地上下抽吸细胞2-3次，使DNA与40μL此类细胞混合，小心勿引入气泡。将细胞转移至已经在冰上冷却的Gene Pulser小杯(0.2cm间隙，BioRAD，Hercules，Calif.)，再次小心勿在转移时引入气泡。将小杯置于大肠杆菌脉冲器(BioRAD,Hercules,Calif.)中并且根据制备商的推荐，用设定在1.88kV的电压进行电穿孔。将转化的样品立即重悬于1ml2*YT培养液或400μl2*YT/600μl过夜XL-1细胞的1ml混合物中并且如程序所述那样进行处理。
铺展用抗体噬菌体展示载体诱变反应物转化的细胞或M13噬菌体
将噬菌体样品添加至200μl大肠杆菌XL1-Blue过夜培养物(当在100mm LB琼脂平板上铺展时)，或添加至600μl过夜细胞(当在无菌15ml培养管中在150mm平板上铺展时)。在添加LB顶层琼脂(对于100mm平板，3ml顶层琼脂；或对于150mm平板，9ml顶层琼脂；所述顶层琼脂保存在55℃(见，附录A1，Sambrook等人，同上))后，使混合物均匀分布在已经预温(37℃-55℃)以移除琼脂表面上任何多余水分的LB琼脂平板上。将平板在室温冷却直至顶层琼脂固化。将平板反扣并且如所示那样在37℃温育。
制备生物素化的ADP-核糖基环化酶2和生物素化的抗体
将浓缩的重组BST1抗原(全长胞外结构域)充分透析入BBS(20mM硼酸盐，150mMNaCl，0.1%NaN3，pH8.0)中。在透析后，使1mg BST1(1mg/ml于BBS中)与15倍摩尔过量的生物素-XX-NHS酯(Molecular Probes,Eugene,Oreg.，DMSO中40mM的母液)反应。将反应在室温温育90分钟并随后用终浓度20mM的牛磺酸猝灭(Sigma Chemical Co.，St.Louis,Mo.)。生物素化反应混合物随后在2-8℃针对BBS透析。在透析后，将生物素化的BST1稀释于淘洗缓冲液(40mM Tris，150mM NaCl，20mg/mlBSA，0.1%Tween 20，pH7.5)中，等分和贮藏在-80℃直至使用。
利用位于重链羧基端处的游离半胱氨酸，使抗体与3-(N-马来酰亚胺基丙酰基)生物素(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)反应。通过添加DTT至终浓度1mM，使抗体在室温还原30分钟。使还原的抗体通过SephadexG50脱盐柱，所述脱盐柱在50mM磷酸钾，10mM硼酸，150mM NaCl，pH7.0中平衡。添加3-(N-马来酰亚胺基丙酰基)-生物素至终浓度1mM，并允许反应在室温继续进行60分钟。随后将样品针对BBS充分透析并贮存在2-8℃。
制备抗生物素蛋白磁性乳胶
彻底地重悬磁性乳胶(Estapor，10%固形物，Bangs实验室，Fishers,Ind.)并且以2ml等分至15ml锥形管中。该磁性乳胶悬浮 于12ml蒸馏水中并且使用磁体(PerSeptiveBiosystems，Framingham，Mass.)，与溶液分离10分钟。在用磁体维持磁性乳胶的分离的同时，使用10ml无菌移液器小心地移除液体。该洗涤过程重复额外3次。在最后一次洗涤后，使乳胶重悬于2ml蒸馏水中。在一个独立的50ml锥形管中，将10mg抗生物素蛋白-HS(中性抗生物素蛋白，Pierce，Rockford，Ill.)溶解于18ml40mM Tris，0.15M氯化钠，pH7.5(TBS)中。在涡旋混合下，添加2ml经洗涤的磁性乳胶至稀释的抗生物素蛋白-HS，并且将混合物混合额外30秒。将该混合物在45℃温育2小时，每隔30分钟振摇。利用磁体，使抗生物素蛋白磁性乳胶与溶液分离并且如上文所述，用20ml BBS洗涤3次。在最后一次洗涤后，使乳胶重悬于10ml BBS中，贮存在4℃。
紧邻使用之前，将抗生物素蛋白磁性乳胶在淘洗缓冲液(40mM Tris，150mM NaCl，20mg/mlBSA，0.1%Tween 20，pH7.5)中平衡。将淘洗实验所需的抗生物素蛋白磁性乳胶(200μl/样品)添加至无菌15ml离心管并且用淘洗缓冲液补足至10ml。将管置于磁体上10分钟以使乳胶分离。如上文所述，用10ml无菌移液器小心地移除溶液。将磁性乳胶重悬于10ml淘洗缓冲液中以开始第二次洗涤。用淘洗缓冲液洗涤磁性乳胶总计3次。在最后一次洗涤后，使乳胶重悬于淘洗缓冲液中至起始体积。
实施例2：选择针对BST1抗原的重组多克隆抗体
如实施例1中所述，从产生自超免小鼠的噬菌体展示文库中选择与BST1特异性结合的结合试剂。
淘洗
如实施例1中所述，使用BS45尿嘧啶模板制备首轮抗体噬菌体。进行诱变DNA的电穿孔，产生源自不同免疫小鼠的噬菌体样品。为了在重组多克隆文库中产生更大的多样性，单独淘洗每份噬菌体样品。
在用生物素化的BST1抗原进行第一轮功能性淘洗之前，通过用7F11-磁性乳胶淘洗，从抗体噬菌体文库中选择在其表面上展示重链和 轻链的噬菌体(如US 6,555,310的实施例21和22中所述)。基本上如US 6,555,310的实施例16中所述，对这些富集的文库进行功能性淘洗。具体而言，将10μl1*10-6M生物素化的BST1抗原添加至噬菌体样品(BST1的终浓度大约1*10-8M)，并且允许混合物在2-8℃平衡过夜。
在达到平衡后，将样品用抗生物素蛋白磁性乳胶淘洗以捕获与BST1结合的抗体噬菌体。平衡的抗生物素蛋白磁性乳胶(实施例1)(每份样品200μL乳胶)在室温与噬菌体温育10分钟。在10分钟后，将大致9ml淘洗缓冲液添加至每份噬菌体样品，并且使用磁体，使磁性乳胶与溶液分离。在10分钟分离后，使用10ml无菌移液器小心地移除未结合的噬菌体。随后将磁性乳胶重悬于10ml淘洗缓冲液中以开始第二次洗涤。如上文所述，将乳胶洗涤总计3次。对于每次洗涤，使管与磁体接触10分钟以使得未结合的噬菌体与磁性乳胶分离。在第三次洗涤后，使磁性乳胶重悬于1ml淘洗缓冲液中并且转移至1.5mL管。随后收集对应于每份样品的全部体积的磁性乳胶并使其重悬于200μl2*YT中并且如实施例1中所述，铺展在150mm LB平板上以扩增结合的噬菌体。将平板在37℃温育4小时，随后在20℃过夜。
将用以扩增结合的噬菌体的150mm平板用来产生下一轮抗体噬菌体。在过夜温育后，通过抽吸10mL2*YT培养基到菌苔上并且在室温温和地振摇平板20分钟，从150mm平板洗脱第二轮抗体噬菌体。随后将噬菌体样品转移至带密封盖的15ml一次性无菌离心管，并且通过以3500rpm离心该管15分钟，将源自LB平板的残片沉淀。随后转移含有第二轮抗体噬菌体的上清液至新管。
通过在15ml一次性无菌离心管中将100μl每种噬菌体母液稀释入900μl淘洗缓冲液，建立第二轮功能性淘洗。随后如对于第一轮淘洗所述的，将生物素化的BST1抗原添加至各个样品，并且将噬菌体样品在室温温育1小时。随后如上文所述，用抗生物素蛋白磁性乳胶淘洗噬菌体样品。此时通过在100mm LB琼脂平板上铺展各乳胶样品的等分试样(以确定κ阳性百分数)，监测淘洗的进程。将源自每次 淘洗的大部分乳胶(99%)铺展在150mm LB琼脂平板上以扩增与乳胶结合的噬菌体。将100mm LB琼脂平板在37℃温育6-7小时，此后将平板转移至室温，并且将硝酸纤维素滤膜(孔径0.45mm，BA85 Protran，Schleicher和Schuel,Keene,N.H.)覆盖到蚀斑上。
带有硝酸纤维素滤膜的平板在室温温育过夜并且随后用山羊抗小鼠κ碱性磷酸酶缀合物显色，以确定κ阳性百分数，如下文描述的。群体中具有较低κ阳性百分数(<70%)的噬菌体样品经历一轮采用7F11-磁性乳胶的淘洗，然后使用大约2*10-9M的生物素化的BST1抗原，在2-8℃进行第三轮功能淘洗过夜。也监测这轮淘洗的κ阳性。汇集κ阳性百分数大于80%的各份噬菌体样品并且使它们经受最终轮次的在2-8℃、5*10-9M下的淘洗过夜。将来自第四轮次的功能性淘洗的洗脱的噬菌体内所含有的BST1抗体基因亚克隆至表达载体pBRncoH3中。
总体上，如US 6,555,310的实施例18中所述，进行亚克隆过程。在亚克隆后，将表达载体电穿孔至DH10B细胞中并且混合物在含有1%甘油和10μg/ml四环素的2*YT中培育过夜。在四环素存在下进行第二轮生长和选择后，将细胞的等分试样冷冻在-80℃，作为生产BST1多克隆抗体的来源。通过在含有10μg/ml四环素的LB琼脂平板上铺展多克隆混合物的样品并筛选识别BST1的抗体，从这些多克隆混合物中选出单克隆抗体。
表达和纯化针对ADP-核糖基环化酶2的重组抗体
在设定为37℃，300rpm的Innova4330培养摇床(New Brunswick Scientific,Edison,N.J.)中，从-70℃细胞库过夜产生摇瓶接种物。接种物用来接种含有成分确定的培养基[Pack等人,(1993)Bio/Technology 11:1271-1277]的20L发酵罐(Applikon，FosterCity，Calif.)，所述成分确定的培养基补充有3g/l L-亮氨酸，3g/l L-异亮氨酸，12g/l酪蛋白消化物(Difco，Detroit，Mich.)，12.5g/l甘油和10μg/ml四环素。将发酵罐中的温度、pH和溶解氧分别控制在26℃、6.0-6.8和25%饱和度。通过添加聚丙二醇(Dow， Midland，Mich.)来控制泡沫。以补料分批模式添加甘油至的发酵罐。通过在晚对数生长期期间添加L(+)-阿拉伯糖(Sigma,St.Louis,Mo.)至2g/l，诱导Fab表达。通过在UV-1201分光光度计(Shimadzu,Columbia,Md.)中在600nm处的光密度，测量细胞密度。在运行终止并调节pH至6.0后，使培养物以17,000psi通过M-210B-EH微流化器(Microfluidics,Newton,Mass.)2次。细胞的高压均化释放Fab至培养上清液中。
纯化的第一步骤是膨胀床固定化金属亲和层析(EB-IMAC)。将0.1M NiCl2充入StreamlineTM螯合树脂(Pharmacia,Piscataway,N.J.)并且随后使其在以上行方向流动的50mM乙酸盐，200mM NaCl，10mM咪唑，0.01%NaN3，pH6.0缓冲液中膨胀和平衡。母液用于使得培养物匀浆达到10mM咪唑，此后，在平衡缓冲液中稀释培养物匀浆两倍或更多倍，以降低湿固形物含量至按重量计小于5%。随后将培养物匀浆加载到以表观速度300cm/hr、上行方向流动的Streamline柱上。细胞残片未受阻地通过，但是借助镍和Fab重链上的六组氨酸标签之间的高亲和力相互作用捕获Fab。在洗涤后，将膨胀床转换成填充床并且Fab用以下行方向流动的20mM硼酸盐，150mM NaCl，200mM咪唑，0.01%NaN3，pH8.0缓冲液洗脱。
纯化的第二步骤使用离子交换层析(IEC)。Q Sepharose FastFlow树脂(Pharmacia，Piscataway,N.J.)在20mM硼酸盐，37.5mM NaCl，0.01%NaN3，pH8.0中平衡。来自EB-IMAC步骤的Fab洗脱汇集物在20mM硼酸盐，0.01%NaN3，pH8.0中稀释4倍并加载到IEC柱上。在洗涤后，Fab用37.5-200mM NaCl盐梯度洗脱。在汇集之前，使用Xcell IITM SDS-PAGE系统(Novex，San Diego，Calif.)评价洗脱级分的纯度。最后，将Fab汇集物浓缩和渗滤入20mM硼酸盐，150mM NaCl，0.01%NaN3，pH8.0缓冲液中用于储存。这在配备10,000MWCO盒的Sartocon SliceTM系统中(Sartorius，Bohemia,N.Y.)实现。最终纯化产率通常是50%。通过在280nm处的UV吸光度测量纯化的Fab的浓度，假定吸光度1.6对应于1mg/ml溶液。
实施例3：通过流式细胞分析确定单克隆抗体对BST1的特异性
通过流式细胞术测试实施例2中所选择的针对BST1的抗体的特异性。为测试抗体与细胞表面BST1蛋白结合的能力，将抗体与表达BST1的细胞(分别来自人肺腺癌和人肺鳞状癌的A549和H226)一起温育。将细胞在FACS缓冲液(DPBS，2％FBS)中洗涤，离心并重悬于100μl稀释的初级BST1抗体(也稀释于FACS缓冲液中)中。将抗体-A549复合物在冰上温育60分钟并且随后如上文所述，用FACS缓冲液洗涤两次。细胞-抗体沉淀物重悬于100μl稀释的二抗(也稀释于FACS缓冲液中)内并在冰上温育60分钟。将沉淀物如先前那样洗涤并重悬于200μl FACS缓冲液中。将样品加载到BD FACScanto I I流式细胞仪上，并且使用BDFACSdiva软件分析数据。
结果
流式细胞分析的结果显示，命名为BST1_A1、BST1_A2和BST_A3的4种单克隆抗体有效地与细胞表面人BST1结合。图3a显示BST1_A1和BST1_A2均分别与A549和H226细胞上的BST1特异性结合。图3b显示BST1_A3与A549和H226细胞上的BST1特异性结合。所述结果显示，这些抗体针对A549和H226上BST1的强烈结合作用。
实施例4：针对BST1的单克隆抗体的结构表征
使用标准PCR技术获得了编码BST1_A2和BST1_A1单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的cDNA序列，并且使用标准DNA测序技术，将这些cDNA序列测序。
可以诱变抗体序列，以在一个或多个残基处回复突变成种系残基。
BST1_A2的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:6和2。
BST1_A2的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:8和4。
将BST1_A2重链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白重链 序列比较，结果显示，BST1_A2重链利用来自鼠种系VH1-39的VH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A2VH序列，结果显示，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别阐明如SEQ ID NOs:22、24和26中所示。在图1a和1b中显示了BST1_A2CDR1和CDR2VH序列与种系VH1-39序列的比对结果。
将BST1_A2轻链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白轻链序列比较，结果显示，BST1_A2轻链利用来自鼠种系VK4-55的VK区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A2VK序列，结果显示，轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NOs:28、30和32中所示。在图2a、2b和2c中显示了BST1_A2CDR1、CDR2和CDR3VK序列与种系VK4-55序列的比对结果。
BST1_A1的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:5和1。
BST1_A1的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:7和3。
将BST1_A1重链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白重链序列比较，结果显示，BST1_A1重链利用来自鼠种系VH1-80的VH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A1VH序列，结果显示，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NOs:21、23和25中所示。在图1a和1b中显示了BST1_A1CDR1和CDR2VH序列与种系VH1-80序列的比对结果。
将BST1_A1轻链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白轻链序列比较，结果显示，BST1_A1轻链利用来自鼠种系VK4-74的VK区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A1VK序列，结果显示，轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NOs:27、29和31中所示。在图2a、2b和2c中显示了BST1_A1CDR1、CDR2和CDR3VK序列与种系VK4-74序列的比对结果。
BST1_A3的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:54和52。
BST1_A3的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:55和53。
将BST1_A3重链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白重链序列比较，结果显示，BST1_A3重链利用来自鼠VH种系69-1的VH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A3VH序列，结果显示，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NOs:56、57和58中所示。在图1a和1b中显示了BST1_A3CDR1和CDR2 VH序列与鼠VH种系69-1序列的比对结果。
将BST1_A3轻链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白轻链序列比较，结果显示，BST1_A3轻链利用来自鼠VK种系44-1的VK区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析BST1_A3 VK序列，结果显示，轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NOs:59、60和61中所示。在图2a、2b和2c中显示了BST1_A3CDR1、CDR2和CDR3VK序列与鼠VK种系44-1序列的比对结果。
实施例5：BST1_A1和BST1_A2在A549和H226细胞中的内化和MabZAP
使用MabZap测定法研究H226和A549对BST1_A1和BST1_A2的内化。MabZAP测定法显示，抗BST1单克隆抗体通过结合与毒素皂草毒素蛋白缀合的抗人IgG二抗而内化。(Advanced Targeting System,San Diego,CA,IT-22-100)。首先，BST1Fab与细胞的表面结合。随后，MabZAP抗体与初级抗体结合。接着，MabZAP复合物由细胞内化。皂草毒素蛋白进入细胞，导致蛋白质合成抑制和最终细胞死亡。
如下实施MabZAP测定法。将每种细胞以5x103个细胞/孔的密度接种。将抗BST1单克隆抗体或同种型对照人IgG连续稀释，随后添加至细胞并在25℃温育15分钟。随后添加MabZAP并且在37℃温育72小时。通过Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒(Promega，G7571)检测平板中的细胞生存力，并且使用Promega Glomax读取并分析平板。细胞死亡与抗BST1单克隆抗体的浓度成正 比。图4a和4b显示，与抗人IgG同种型对照抗体相比，抗BST1单克隆抗体BST1_A1和BST1_A2有效地由H226和A549细胞内化。
实施例6：BST1A2的人源化
为了设计BST1_A2 VH和VL的人源化序列，使用三维模型鉴定对于CDR结构的形成重要的框架氨基酸残基。还从GenBank数据库中选择与BST1_A2具有高度同源性的人VH和VL序列。将CDR序列连同鉴定的框架氨基酸残基一起从BST1_A2移植至人框架序列(图5-7)。
实施例7：抗BST1mAbs介导的抗体依赖性细胞毒性
首先，将25μl亲本和非岩藻糖化的抗BST1抗体(BST1_A2和BST1_A2_NF)以10nm/L至0.1nm/L的浓度添加至V型底96孔平板的含有50μl表达BST1的A549和U937细胞的各个孔。随后添加25μl效应细胞至所述孔以产生10:1和25:1的最终效应子:靶(E:T)比率。随后以1000rpm将平板温和地离心2分钟，此后将它在37℃，5%CO2培养箱中温育4小时。在温育3小时后，将10μl裂解溶液添加至仅含有表达BST1的细胞的每个孔，以测量最大LDH释放，和添加至仅含有培养基的一组孔用作体积修正对照。
在温育后，以1000rpm将细胞温和地离心2分钟，此后将50μl上清液转移至平底96孔平板。使用从Promega可获得的CytoTox96非放射性细胞毒性测定法(目录号：G1780)，根据制备商的说明书使试剂盒组分重构并随后将50μl底物混合物添加至每个孔。随后覆盖平板并且在25℃避光静置温育30分钟。此后，向每个孔添加50μl终止溶液并且使用varioskan平板读数仪记录在490nm处的吸光度。
使用已知通过ADCC激发细胞杀伤的抗体作为阳性对照并使用人IgG1同种型对照作为阴性对照，结果显示，BST1_A2和BST1_A2_NF能够在表达BST1的A549和U937细胞上激发ADCC。已显示，在表达BST1的A549细胞上，BST1_A2_NF在10nmol/L时具有大约45%的杀伤作用(图8a)。已显示，在表达BST1的U937细胞上，BST1_A2在1 nmol/L时具有大约20%的杀伤作用，并且已显示，BST1_A2_NF在1nmol/L时具有大约45%的杀伤作用(图8b)。
实施例8：在AML患者中通过流式细胞分析确定单克隆抗体对BST1的特异性
通过流式细胞分析，测试BST_A2与来自AML患者的淋巴母细胞结合的能力。从20位AML患者获取血液。使用如实施例3中所述的方法，已显示，BST_A2与AML患者的大约80%的AML母细胞结合。
序列表

Claims (17)

1.一种与BST1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含：
i)SEQ ID NO:10所示的第一vhCDR；
ii)选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:51中的序列所示的第二vhCDR；和
iii)SEQ ID NO:14所示的第三vhCDR；和
b)轻链可变区，其包含：
i)SEQ ID NO:16所示的第一vlCDR；
ii)SEQ ID NO:18所示的第二vlCDR；和
iii)SEQ ID NO:20所示的第三vlCDR。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含
SEQ ID NO:2所示的重链可变区，和
SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含
SEQ ID NO:46所示的重链可变区，和
SEQ ID NO:49所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含共价连接的部分。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述共价连接的部分是药物。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述药物选自类美登素(maytansinoid)、多拉司他汀、奥瑞司他汀、单端孢霉烯、刺孢霉素和CC1065。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或T-细胞细胞毒性。
9.根据权利要求8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是具有增加的Fc受体结合作用和/或增加的ADCC效力的工程化抗体和/或双特异性抗体。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是与包含BST1的第一抗原和选自CD3抗原及CD5抗原的第二抗原特异性结合的双特异性或多特异性抗体。
11.核酸，其编码根据权利要求1-10中任一项所述的抗体的重链。
12.核酸，其编码根据权利要求1-10中任一项所述的抗体的轻链。
13.宿主细胞，其含有根据权利要求11和/或12所述的核酸。
14.制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达所述抗体或其抗原结合部分的条件下培养根据权利要求13所述的宿主细胞，和任选地分离所述抗体或其抗原结合部分。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备药物中的用途，所述药物用于治疗急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病或肺癌，其中所述抗体或其抗原结合部分由表达BST1的细胞内化，所述抗体包含共价连接的药物缀合物。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗急性髓样白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病或肺癌，其中所述抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或T-细胞细胞毒性。
17.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或用作药物。
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