CN103619168B - 用于治疗白血病的组合物、方法和药盒 - Google Patents

Abstract

用于治疗对象(例如，人)中白血病的组合物、药盒和方法，其包括第一抗癌药物，所述第一抗癌药物由Δ¹²-前列腺素J₃或其衍生物，或前列腺素D受体(DP)激动剂组成。所述组合物还可包含第二抗癌药物。Δ¹²-前列腺素J₃是ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)的稳定代谢物，并且被发现具有抗白血病性质。所述组合物、药盒和方法可特别用于治疗对一种或多种抗癌药物具有抗性的人对象。

Description

用于治疗白血病的组合物、方法和药盒

相关申请的交叉参考

本申请要求2011年6月29日提交的美国临时申请序列号61/502,677、2011年9月15日提交的美国临时申请序列号61/535,149和2012年4月19日提交的美国临时申请序列号61/635,458的权益，出于本文的所有目的，其在此通过引用全文纳入本文。

发明领域

本发明一般涉及分子遗传学、分子生物学和肿瘤学领域。

背景

白血病是非常普遍的疾病，该疾病意味着白细胞的生成不受控制。目前还没有治愈白血病的方法。目前的白血病疗法包括化疗、放疗、干细胞治疗和生物治疗。所有这些疗法都有许多副作用。使用抗白血病药物通过靶向大批癌细胞而非癌症干细胞仅能延长患者的生命。

概述

本文描述用于治疗癌症(例如白血病)的组合物、方法和药盒。靶向癌症干细胞(CSC)对成功战胜癌症复发具有重要意义。本文显示Δ¹²-PGJ₃减轻两种成熟研究的白血病鼠模型中的白血病发展，所述Δ¹²-PGJ₃是一种新型且天然产生的环戊烯酮前列腺素(CyPG)，该物质来自食用鱼油ω-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)，二十碳五烯酸(EPA；20:5)。对感染了弗兰德红白血病病毒(FV)的小鼠或造血干细胞(HSC)池中表达慢性骨髓性白血病(CML)肿瘤蛋白BCR-ABL的那些小鼠腹膜内给予Δ¹²-PGJ₃使血液参数、脾脏组织学完全恢复正常，并提高了所述小鼠的存活率。更重要的是，在脾脏和骨髓中，Δ¹²-PGJ₃选择性靶向白血病干细胞(LSC)引起凋亡。由来自经处理小鼠的供者细胞不能在二次移植体(secondary transplant)内引起白血病证明，该治疗完全根除体内的LSC。这是化合物根除白血病干细胞并有效“治愈”小鼠模型中的CML，从而长时期延长所述白血病小鼠的生命的第一个示例。鉴于n-3PUFA源性CyPG效能和众所周知的对目前所用临床试剂的LSC不应性，Δ¹²-PGJ₃代表了靶向LSC的白血病新化学疗法。

因此，本文描述包含治疗有效量的第一抗癌药物和药学上可接受运载体的组合物，所述第一抗癌药物是分离的或合成的Δ¹²-PGJ₃或其衍生物，其用于抑制含有LSC的对象(例如，患有白血病的对象)内的LSC生长。所述组合物还可进一步包括第二抗癌药物(例如，伊马替尼(imatinib)(新泽西州东汉诺威的诺华公司(Novartis)的))。

本文还描述包含治疗有效量的第一抗癌药物和药学上可接受的运载体的组合物，所述第一抗癌药物是分离的或合成的前列腺素D受体(DP)激动剂，其用于抑制含有LSC的对象内的LSC生长。所述组合物还可包括第二抗癌药物(例如，伊马替尼)。所述DP激动剂可以是，例如：Δ¹²-PGJ₃、ZK118182和PGD2ME中的一种或多种。

本文还描述治疗对象内白血病的方法。所述方法包括给予患有白血病的对象包含治疗有效量的第一抗癌药物的组合物，所述第一抗癌药物是：分离的或合成的Δ¹²-PGJ₃或其衍生物、前列腺素D3衍生物和分离的或合成的DP激动剂中的一种或多种，其用于诱导所述对象内LSC的死亡。所述LSC可以是，例如，慢性骨髓性白血病干细胞或急性骨髓性白血病细胞。在一些实施方式中，所述对象对抗癌药物(例如，伊马替尼)具有抗性。在所述方法中，所述组合物还可包含治疗有效量的第二抗癌药物(例如，伊马替尼、标准化疗剂例如阿糖胞苷或阿霉素等)。

本文还描述治疗对象(例如，人)中白血病的方法。所述方法包括给予所述患有白血病的对象包含治疗有效量的DP激动剂的组合物，其用于诱导所述对象内的LSC死亡。所述LSC可以是，例如，慢性骨髓性白血病干细胞。在一些实施方式中，所述对象对伊马替尼具有抗性。在所述方法中，所述组合物还可包含治疗有效量的抗癌药物(例如，伊马替尼、标准化疗剂例如阿糖胞苷或阿霉素等)。

本文还描述用于治疗对象(例如，人)内的白血病的药盒。所述药盒包括含有治疗有效量的第一抗癌药物的组合物、使用说明书和包装，所述第一抗癌药物是以下之一：分离的或合成的DP激动剂、分离的或合成的Δ¹²-PGJ₃和Δ¹²-PGJ₃衍生物，其用于诱导所述对象内的LSC死亡。所述药盒还可包括第二抗癌药物(例如，伊马替尼、标准化疗剂例如阿糖胞苷或阿霉素等)。

除非另外定义，本文中使用的所有技术术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。

本文所用的“蛋白质”和“多肽”是同义词，指不考虑长度或翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)时的任何肽连接的氨基酸链。

术语“基因”指编码特定蛋白质，或者在某些情况下编码功能或结构RNA分子的的核酸分子。

本文所用术语“核酸”或“核酸分子”指两种或多种核苷酸的链，如RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)。

术语“患者”、“对象”和“个体”在本文中可交换使用，指待治疗和/或从中获得生物样品的哺乳动物(例如，人、啮齿动物、非人灵长类、犬、牛、羊、马、猫等)对象。

本文所用术语“结合”、“结合于”或“相互作用”指一种分子识别和粘附于样品或生物体中特定的第二种分子，但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构不相关的分子。一般而言，“特异性结合”第二分子的第一分子对所述第二分子具有大于约10^-8～10^-12摩尔/升的结合亲和性，并且涉及准确的“手套中的手”对接相互作用，所述相互作用可以是共价和非共价的(氢键、疏水的、离子的和范德华相互作用)。

涉及探针或抗体时，术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)于该探针或抗体，对探针或抗体进行直接标记。

涉及核酸分子或多肽时，术语“天然”指天然产生的(例如，野生型或WT)核酸或多肽。

本文中所用的术语"调控的"、"调控"、“调节的”或“调节”指试剂抑制或提高或保持分子(例如，受体)活性和/或功能的能力。例如，DP抑制剂将下调、减少、降低、抑制或钝化DP的至少部分活性和/或功能。上调指功能和/或活性上的相对增加。

术语“Δ¹²-PGJ₃”指Δ¹²-前列腺素J₃，一种ω-3脂肪酸源性的代谢物。

短语“DP激动剂”指与细胞上的DP位点形成复合物或结合，从而触发细胞活性应答的任何试剂(例如，药物、化合物、激素等)。DP激动剂可以是天然发生的或合成的，或其组合。

短语“白血病干细胞”指确定在功能上具有产生更多白血病干细胞(自我更新)和非干细胞白血病细胞性质的白血病起始细胞。此外，这些细胞通过某些细胞表面标志物的表达来表征，所述细胞表面标志物包括但不限于CD34、CD123和CD117。

短语"分离的"或"生物纯的"指实质上或基本上不含在其天然状态下通常与之相伴的成分的物质。术语"抗体"意在包括通过任何已知技术(例如但不限于酶切、肽合成或重组技术)提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体的抗独特型(抗Id)抗体(可以溶解或结合形式标记)，及其片段、区段或衍生物。

本文中所用的术语“诊断的”、“诊断”和“诊断为”指鉴定病理学状况(例如，白血病)的存在或特性。

本文中所用的术语“样品”以最广义使用。包含多核苷酸、多肽、肽、抗体等的样品可包括体液、细胞制品或培养细胞的培养基的可溶性部分、基因组DNA、RNA或cDNA、细胞、组织、皮肤、毛发等。样品的例子包括唾液、血清、血液、尿液和血浆。

本文所用术语“治疗”定义为将治疗剂施加或给予患者，或将治疗剂施加或给予由患者分离的组织或细胞系，该患者患有疾病、具有疾病症状或疾病倾向，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、疾病症状或疾病倾向。治疗可包括，例如，改善、预防或消除脾大，减少对象内的LSC数量，消除对象内的LSC等。

本文中所用的术语"安全且有效量"指当以本发明方式使用时，与合理的效益/风险比例相称的足以产生所需的治疗响应但没有过度不利副作用(例如毒性、刺激或过敏反应)的成分的量。"治疗有效量"指有效产生所需治疗响应的本发明组合物的量。例如，有效延迟癌(例如，CML)生长或导致癌缩小或防止转移的量。具体的安全且有效量或治疗有效量取决于多种因素而变化，例如所治疗的具体病症、患者身体状况、治疗的哺乳动物或动物类型、治疗持续时间、同时进行的治疗(如果有)的性质和采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。

虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些组合物、药盒和方法，但是下面描述了合适的组合物、药盒和方法。本文引用的所有出版物、专利申请和专利均通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。下文讨论的具体实施方式仅为说明性，不构成限制。

附图简要说明

图1示出Δ¹²-PGJ₃的内源性产生和促凋亡性质。(A)RAW264.7巨噬细胞中的PGD₃、Δ¹²-PGJ₃、15d-PGJ₃内源形成，LC-UV迹线；EPA处理，N=3。(B)含Δ¹²-PGJ₃洗脱物的代表性LC-MS，显示特征区段谱。(C)显示Δ¹²-PGJ₃对BCR-ABL⁺LSC和正常HSC(MSCV-GFP⁺HSC)的对比效果的剂量响应。细胞用Δ¹²-PGJ₃离体处理36小时。通过膜联蛋白V染色检测凋亡。(D)分选自骨髓的Kit⁺Sca-1⁺Lin^-BCR-ABL-GFP⁺细胞在含有Δ¹²-PGJ₃(25nM)或载体对照的培养基中离体培养36小时，然后通过流式细胞术分析GFP⁺细胞。N=3；平均值±标准误(示出)。*p<0.005。以输入GFP⁺细胞百分数表示。(E)在36小时孵育结束时，分离自FV小鼠的LSC的剂量响应与Δ¹²-PGJ₃指示浓度的关系图。通过膜联蛋白V染色和随后的流式细胞术检测LSC凋亡。(F)用25nM各化合物离体培养FV-LSC36小时。N=3；平均值±标准误(示出)，*P<0.0001(相较于PGJ₃)。

图2显示腹膜内给予Δ¹²-PGJ₃根除小鼠内FV白血病。(A)采用不同剂量的Δ¹²-PGJ₃(mg/kg体重)处理的FV感染小鼠的脾重量。N=10/处理组。在感染后一周开始以指示剂量进行Δ¹²-PGJ₃处理7天。*P<0.05。小图：来自各处理组的代表性的脾。UI：未感染的小鼠。(B)用Δ¹²-PGJ₃或载体(Veh)对照处理的FV感染小鼠的脾中的LSC(M34⁺Kit⁺Sca1⁺)分析。(C)Δ¹²-PGJ₃和载体对照处理的小鼠中的CFU-FV集落形成，*P<0.001。(D)感染后第14天，未感染的(左)、FV感染-载体处理(中)和FV感染-Δ¹²-PGJ₃处理小鼠(右)的脾切片H&E染色。左侧各切片上的小框在右侧放大。比例尺，500μm。

图3显示Δ¹²-PGJ₃治疗对通过将体外扩增的FV诱导的LSC移植到FV抗性Stk^-/-小鼠内来诱导的白血病的效果。(A)移植FV-LSC七周后，用载体、0.05mg/kg或0.025mg/kgΔ¹²-PGJ₃处理一周的Stk^-/-小鼠的脾的照片。(B)显示图A情况下的脾重量。N=5/组，*P<0.05(相较于感染的载体组)。(C)用指示量的Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的LSC移植Stk^-/-小鼠中的WBC计数。N=5/组，*P<0.05(相较于感染的载体组)。(D)用LSC移植的Stk^-/-小鼠中的M34⁺Kit⁺Sca1⁺细胞。分离脾细胞并对Kit⁺门选，显示M34和Sca1的表达。N=5/组。

图4显示腹膜内给予Δ¹²-PGJ₃根除鼠CML模型中的LSC并延长其生存。(A)Δ¹²-PGJ₃处理对移植了BCR-ABL-GFP⁺LSC的小鼠的脾大发展的影响分析。对照、用Δ¹²-PGJ₃(0.025mg/kg)或载体对照处理的BCR-ABL移植小鼠的脾的代表性照片和对应的脾重量。N=10/处理组，*P<0.05。(B)用Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的BCR-ABL⁺LSC或MSCV-HSC移植小鼠的WBC计数分析。*P<0.0001。(C)用Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的移植了BCR-ABL⁺LSC或MSCV⁺HSC的小鼠的脾中的Sca-1⁺Kit⁺GFP⁺细胞的流式细胞术分析。N=5/组；*p<0.001。(D)移植了BCR-ABL⁺LSC并用Δ¹²-PGJ₃处理的小鼠在用终末Δ¹²-PGJ₃剂量(0.025mg/kg)处理5周后的骨髓中LSC(Kit⁺Sca-1⁺Lin^-GFP⁺)分析。作为对照，用载体处理BCR-ABL⁺LSC移植小鼠一周以用于比较。(E)移植了BCR-ABL⁺LSC或MSCV-GFP⁺HSC的小鼠在用Δ¹²-PGJ₃(0.025mg/kg)或载体处理后的存活率曲线。N=8/处理组。(F)从C57BL/6小鼠的骨髓分离HSC，并将所述HSC接种在含有PBS或Δ¹²-PGJ₃(25nM)的甲基纤维素中(1×10⁶个细胞/mL/孔；Epo、SCF、IL-3和BMP4)，并培养一周。对造血集落(培养物中的集落形成细胞，CFC)计数。所示数据代表三次重复实验。

图5证明来自Δ¹²-PGJ₃-处理受者的脾细胞二次移植显示无白血病。图A～C表示将用Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的CD45.1+BCR-ABL小鼠的移植物二次移植到CD45.2受者小鼠中。图D～E表示将来自Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的小鼠的FV-LSC移植进入二次BALB/c-Stk^-/-受者。(A)接受来自载体处理或Δ¹²-PGJ₃处理的供者细胞的供者细胞的二次移植小鼠的脾形态(上左)、脾重量(下左)和WBC计数(右)。(B)来自二次移植体的脾细胞流式细胞术分析。对GFP⁺门选细胞并显示Kit和Sca1的表达。(C)脾细胞中供者CD45.1表达的分析。(D)接受来自载体处理或Δ¹²-PGJ₃处理的供者细胞的供者细胞的二次移植小鼠的脾形态(上左)、脾重量(下左)和WBC计数(右)。(E)来自二次移植体的脾细胞流式细胞术分析。对M34⁺门选细胞并显示Kit和Sca1的表达。

图6显示PGD₃向PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的体外自发转化。

图7显示CyPG对LSC的剂量依赖性促凋亡效果。

图8显示Δ¹²-PGJ₃靶向伊马替尼抗性BCR-ABL(GFP)+细胞。LSC分离自用伊马替尼(75mg/kg)处理一周，然后停止该处理的小鼠。然后监测该小鼠的白血病发展。处死发展了白血病的小鼠，并将其脾脏用作LSC来源。

图9显示由合成DP激动剂引起的BCR-ABL⁺LSC凋亡。

图10显示，通过检测骨髓细胞在体外培养中形成分化集落的能力得出，Δ¹²-PGJ₃与相关的激动剂不影响正常人造血细胞。将人未分级骨髓细胞(5×10⁵个/孔)铺板于补充有指示浓度药物的含IL-3、GM-CSF、G-CSF、SCF和Epo的甲基纤维素完全培养基。12天后对总集落计数。

图11显示Δ¹²-PGJ₃不影响正常骨髓细胞分化成幼红细胞系(erythroid lineage)(爆式红系集落形成单位，BFU-E)。

图12的一对图表显示DP介导来自患者(#011711)的急性转化期CML细胞的Δ¹²-PGJ₃依赖性凋亡。

图13显示DP介导来自患者(#100810)的AML细胞的Δ¹²-PGJ₃依赖性凋亡的实验结果。此外，Δ¹²-PGJ₃还特异性靶向白血病干细胞(CD34+CD38-CD123+细胞)使其凋亡。

图14显示Δ¹²-PGJ₃和伊马替尼(新泽西州东汉诺威的诺华公司(Novartis))在BCR-ABL⁺LSC移植CML模型小鼠中的比较结果。图15的表格列出Δ¹²-PGJ₃对来自AML和急性转化期CML患者的LSC的效果。

图16的一对图显示由DP激动剂(内源性与外源性)和DP拮抗剂引起的人原代AML细胞的凋亡。

发明详述

AML是成人白血病中最常见类型之一。遗憾的是，AML的五年相对生存率相较于其它白血病形式而言是最低的。AML是干细胞疾病，其中LSC占据该疾病等级的顶端。LSC能自我更新并生成非干细胞子代，这制造出大批白血病细胞。尽管化疗剂能够有效靶向大批白血病细胞，但LSC具有活性机制以躲避这些药物的杀伤。因此，无法消除LSC引起所述疾病的复发。由于该性质，LSC的特异性靶向是成功治疗的根本。尽管已经认识到需要以抗LSC为基础的新的治疗，但仍缺乏靶向LSC的基于机理药物的鉴定。显然需要新途径。本文描述用于治疗癌症(例如白血病)的组合物、方法和药盒。发现源自ω-3脂肪酸的代谢物Δ¹²-PGJ₃，其有效根除两种慢性白血病小鼠模型中的LSC。在本文所述的实验中，这些发现广泛显示Δ¹²-PGJ₃通过诱导AML鼠模型和人AML白血病样品中的凋亡而有效靶向AML LSC。相反，Δ¹²-PGJ₃对正常造血干细胞或造血祖细胞的分化没有影响。Δ¹²-PGJ₃通过诱导LSC和白血病细胞中的p53表达来产生作用。LSC中的p53高水平表达与自我更新不相容，并导致凋亡。这些数据表明Δ¹²-PGJ₃是用于治疗AML的化疗剂。这是化合物根除白血病干细胞并有效“治愈”小鼠模型中的CML，从而长时期延长所述白血病小鼠的生命的第一个示例。

生物学方法

本文描述了包括常规分子生物学技术的方法。这些技术通常是本领域已知的，详见方法学著作，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版，第1～3卷，Sambrook等编，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，2001；和Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，Ausubel等编，格林出版和韦利科学公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，纽约，1992(定期更新)。

用于治疗对象内白血病的组合物

本文描述用于治疗对象(例如，人对象)内白血病的组合物。可使用所述组合物治疗的白血病的示例包括急性骨髓性白血病(AML)、CML、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方式中，组合物包括治疗有效量的Δ¹²-前列腺素J₃或其衍生物(第一抗癌药物)和药学上可接受的运载体，所述第一抗癌药物抑制具有LSC的对象内的LSC生长。抑制LSC生长包括诱导所述癌细胞死亡(致死)，和/或诱导所述癌细胞分化(促进更高分化的表型，例如，使LSC分化成终末分化细胞)。可以使用Δ¹²-前列腺素J₃或其衍生物的任何合适形式(例如，合成的、分离的)。可特别在本文所述的组合物和方法中使用的Δ¹²-前列腺素J₃衍生物是诱导LSC凋亡或分化的那些(例如，16,16-二甲基-Δ¹²-PGJ₃)。在该实施方式中，当给予对象时，所述组合物诱导LSC凋亡。所述组合物还可包含一种或多种其它抗癌药物(例如，第二抗癌药物)。其它抗癌药物的例子包括伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、新一代BCR-ABL抑制剂，以及标准化疗药物，例如阿糖胞苷或阿霉素或类似种类的药物。在一个实施方式中，包括伊马替尼或新一代BCR-ABL抑制剂和Δ¹²-PGJ₃的联合治疗可尤其具有治疗性。

在另一个实施方式中，组合物包括治疗有效量的DP激动剂(第一抗癌药物)和药学上可接受的运载体，所述第一抗癌药物抑制具有LSC的对象内的LSC生长。DP激动剂的示例包括小分子、蛋白质、肽、多核苷酸、寡核苷酸、有机化合物、无机化合物、合成化合物或分离自单细胞或多细胞生物的化合物。DP激动剂的特定示例包括PGD₂ME(前列腺素D₂甲酯(9α,15S-二羟基-11-氧代-前列-5Z,13E-二烯-l-酸甲酯)和ZK118182([[4-[5R-氯-2Z-[3R-环己基-3S-羟基-1R-丙烯基]-3S-羟基环戊基]-2R-丁烯基]氧基]-乙酸异丙酯)。DP激动剂可以是活化DP的任何试剂。本文所述的组合物和方法中可使用活化DP的任何试剂以诱导LSC死亡并治疗白血病。包括DP激动剂的组合物还可包括一种或多种其它抗癌药物(例如，第二抗癌药物)。如上所述，其它抗癌药物的示例包括伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、新一代BCR-ABL抑制剂，以及标准化疗药物，例如阿糖胞苷或阿霉素等。本文所述的组合物中，Δ¹²-前列腺素J₃可由购买或按所描述方法(例如，下文实施例部分)合成获得。同样，Δ¹²-前列腺素J₃衍生物可按Kimball等人所述合成(Kimball FA,Bundy GL,Robert A和Weeks JR(1979)，Synthesisand biological properties of9-deoxo-16,16-9-methylene-PGE₂(9-脱氧-16,16-9-亚甲基-PGE₂的合成与生物学性质).Prostaglandins17:657-66)。

有效剂量

上述组合物优选以有效剂量，即能够在经处理对象内产生所述结果(例如，抑制所述对象内LSC生长和/或诱导LSC死亡)的量给予哺乳动物(例如，啮齿动物、人、非人灵长类、犬、牛、羊、马、猫等)。本发明方法中使用的组合物的毒性和疗效可通过标准药学方法测定。如医学和兽医学领域所熟知，用于任何一个动物的剂量取决于多种因素，包括对象的大小、体表面积、体重、年龄、给予的特定组合物、给药时间和给药途径、总体健康状况、癌症临床症状和同时给予的其它药物。本文所述的组合物通常以诱导LSC死亡(例如，诱导LSC凋亡)的剂量给予，所述诱导通过鉴定血液参数的降低(全血计数(CBC))或癌细胞生长或增殖来检测。在本文所述的实验中，用以根除LSC的Δ¹²-PGJ₃的量经计算为0.6微克/天/克小鼠×7天。一般而言，所述剂量以mg/Kg对象/天=ug/g对象/天计。在一个典型实施方式中，给予约0.025～约0.05mg/Kg/天的剂量。所述剂量通常以1次/天给予数周。

治疗癌症的方法

本文描述治疗癌症(例如，白血病)和/或紊乱或其症状的方法。所述方法包括给予对象(例如，哺乳动物如人)治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的运载体和足以治疗该疾病或紊乱或其症状的量的Δ¹²-PGJ₃、其衍生物，或DP激动剂(第一抗癌药物)。在所述方法中，通常给予足以诱导所述对象内LSC死亡的量的Δ¹²-PGJ₃、其衍生物或DP激动剂。在一个典型实施方式中，所述LSC是CML干细胞。在一些实施方式中，可向对伊马替尼或其它抗癌药物具有抗性的对象给予所述组合物。在所述方法中，所述组合物还可包含治疗有效量的一种或多种其它抗癌药物(例如，第二抗癌药物，例如伊马替尼)或标准化疗剂。

本发明的治疗方法(包括预防性治疗)一般包括给予需要的对象(包括哺乳动物，特别是人)治疗有效量的本文所述组合物。这类治疗适合给予患有、具有、倾向于发生、或有风险发生疾病、紊乱或其症状的对象，特别是人。可通过任何客观或主观判断由诊断测试或者对象或健康护理提供者的意见(如遗传学测试、酶或蛋白质标记物、标记物(如本文所述)、家族史等)，确定“有风险”的对象。

用于治疗癌症(例如，白血病)的含有Δ¹²-PGJ₃、其衍生物或DP激动剂组合物可通过任何合适的方式给予，该方式导致的治疗剂浓度(例如，当联合其它成分时)有效改善、减少或稳定癌症。所述Δ¹²-PGJ₃、其衍生物或DP激动剂可以任何适当的量包含在任何合适的运载体物质中，并且通常是占所述组合物总重的1～95%(重量)。该组合物可以适合局部或全身给药(如胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内)的剂型提供。可按照常规药学实践配制药物组合物(参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药剂学科学和实践》)(第20版)，A.R.Gennaro编，LWW出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)，2000和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(《药学技术百科全书》)，J.Swarbrick和J.C.Boylan编，1988-1999，纽约的MD出版社(Marcel Dekker))。

本文所述的组合物可通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)，采用含有常规、无毒的药学上可接受运载体和佐剂的剂型、制剂或经合适递送装置或植入体经胃肠外给药。这类组合物的配制和制备是药物配制领域技术人员众所周知的。配制可参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy(《雷明顿：药剂学科学和实践》)，同上。

胃肠外使用的组合物可以单位剂型提供(如装在单剂量安瓿中)，或以含有若干剂量的小瓶提供，其中可加入合适的防腐剂(见下文)。该组合物可以是溶液剂、混悬剂、乳剂、输注装置或植入递送装置等形式，或者可以制成干粉，临用前用水或另一合适载体重建。除了减少或改善癌症的活性药剂外，该组合物可包含合适的胃肠外可接受的运载体和/或赋形剂。可将活性治疗剂掺入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等进行控释。而且，该组合物可包含混悬剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。

如上所述，本文所述药物组合物可以是适合无菌注射的形式。为了制备这种组合物，将合适的活性治疗剂溶解或悬浮于胃肠外可接受的液体载体中。可以使用的可接受载体和溶剂是水，通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或适当缓冲液调整到适当pH的水，1,3-丁二醇、林格溶液以及等张氯化钠溶液和右旋糖溶液。水性制剂也可包含一种或多种防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在一种化合物只是少量溶于水或微溶于水的情况下，可加入溶解促进剂或增溶剂，或者溶剂可包含10-60%w/w丙二醇等。

用于制备微球和/或微胶囊的材料是，例如，可生物降解/可生物侵蚀的聚合物，如聚乳酸羟基乙酸(polygalactin)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酸)和聚(乳酸)。配制控释胃肠外制剂时可采用的生物相容性运载体是糖(如右旋糖苷)、蛋白质(如白蛋白)、脂蛋白或抗体。植入体中所用的材料可以是不可生物降解的(如聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(如聚(已内酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或其组合)。

口服使用的制剂包括在混合物中含活性成分(例如，Δ¹²-PGJ₃或其衍生物、DP激动剂)和无毒药学上可接受赋形剂的片剂。这样的制剂是技术人员已知的。赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；粒化和分解剂(例如，纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；结合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯树胶、藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、镁铝硅酸盐、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂和抗结合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油或滑石)。其它药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、增味剂、增塑剂、致湿剂、缓冲剂等。片剂可未包衣，也可用已知技术包衣，可任选地以延迟崩解和胃肠道的吸收，从而在较长时间内提供持续作用。所述包衣可适合于以预定模式释放所述活性药物(例如，为了获得控释制剂)或可适合于直到通过胃之后才释放所述活性药物(肠溶衣)。所述包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)或肠溶衣(例如，基于异丁烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素、聚邻苯二甲酸酯乙酸乙烯酯(polyvinyl acetate phthalate)、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可采用延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

可任选地，可联合任何其它抗癌治疗(例如，伊马替尼)来给予本文所述的组合物；这些方法是技术人员已知的，并记载于Remington:The Science andPractice of Pharmacy(《药剂学科学和实践》)，同上。在一个示例中，联合放射治疗给予有效量的Δ¹²-PGJ₃、其衍生物或DP激动剂。希望联合是有益的协同作用。鉴定抑制癌(例如，白血病)细胞生长和/或诱导LSC凋亡的治疗组合在本发明方法中是有用的。

在一个实施方式中，本发明提供监测治疗过程的方法。所述方法包括如下步骤：在已经给予治疗量的本文所述组合物的患有或疑似患有癌症(例如，白血病)相关紊乱或其症状的对象中，采用细胞表面蛋白作为诊断性标志物(例如，可包括但不限于CD34、CD38、CD90和CD117))或诊断性检测(例如，筛选、分析)测定LSC分析和血液参数中的变化水平。可将所述方法测定的标记物水平与健康正常对照或其他患病患者中已知的标记物水平作比较，以确立该对象的疾病状态。在优选实施方式中，在测定第一水平后的时间点测定对象标记物的第二水平，比较这两个水平以监测病程或疗效。在某些优选实施方式中，在按照本文所述方法开始治疗之前测定对象的治疗前标记物水平；然后，可将这种治疗前标记物水平与治疗开始后该对象的标记物水平作比较，以确定疗效。

用于治疗对象内白血病的药盒

本文描述用于治疗对象内白血病的药盒。典型的药盒包括含有治疗有效量的DP激动剂或Δ¹²-前列腺素J₃或其衍生物(第一抗癌药物)的组合物、包装和使用说明书，所述第一抗癌药物用于诱导对象内LSC的死亡。在药盒中，所述组合物还可包含单位剂量形式的药学上可接受的运载体。若有需要，所述药盒还包含有效量的其它抗癌药物(例如，第二抗癌药物，如伊马替尼)。在一些实施方式中，所述药盒包括无菌容器，其中含有治疗或预防性组合物；这类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、囊、起泡包装或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合保持药物的其它材料制成。

实施例

下面的具体实施例进一步说明了本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，且不应以任何方式对本发明范围构成限制。

实施例1–Δ¹²-前列腺素J₃(ω-3脂肪酸源性的代谢物)选择性消除小鼠内的LSC

研究了由EPA的Δ¹²-PGJ₃的内源性形成，并检测该新型n-3PUFA代谢物在两种白血病成熟研究模型中靶向LSC的能力，所述两种白血病成熟研究模型为：弗兰德病毒(FV)-诱导的红白血病(Ben-David Y和BernsteinA,Cell.1991;66:831-834)和用于使用BCR-ABL-IRESGFP逆转录病毒诱导小鼠内CML的成熟建立模型(Schemionek M等，Blood.2010;115:3185-3195；Pear WS等，Blood.1998;92:3780-3792；Hu Y等，Proc Natl Acad SciUSA.2006;103:16870-16875；Zhao C等，Nature.2009;458:776-779)，其中，将转导的HSC移植入小鼠所导致的病理学与CML慢性期类似。FV通过激活骨形态发生蛋白-4(BMP4)-依赖性应激红细胞生成(stress erythropoiesis)通路来诱导白血病，这导致靶细胞的快速增殖和急性疾病(Subramanian A等，J Virol.2008;82:382-393)。本文所述的结果证明，对FV感染小鼠和BCR-ABL⁺转导HSC(下文称作BCR-ABL⁺LSC)移植小鼠给予Δ¹²-PGJ₃(以低达0.6μg/g小鼠/天的剂量)完全消除了白血病，恢复了血液学参数，并通过激活LSC细胞中的ATM/p53凋亡通路根除了这些细胞。

方法

细胞培养。鼠红白血病(MEL)细胞培养在含10%FBS的DMEM中。为检测3个系列的PG生成，使BALB/c源性RAW264.7巨噬细胞样细胞(ATCC)在含5%FBS、250nM亚硒酸钠和50μM EPA(作为BSA偶联物)的DMEM中培养72小时，然后用大肠杆菌(E.coli)内毒素脂多糖(LPS；血清型0111B4；50ng/ml)刺激30分钟。使所述细胞在新鲜DMEM中另培养24～144小时。用在细胞培养级无脂肪酸的BSA(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))中培养的细胞作为对照。如下所述，在不同时间回收培养基并分析3个系列的PG。使用Trizol试剂按照生产商说明(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))从细胞或组织分离总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems)制备cDNA。使用补充方法中所述的引物对p53和β-肌动蛋白进行半定量RT-PCR。使用先前描述的标准方法(Vunta H等，J BiolChem.2007;282:17964-17973)制备LSC的核蛋白和细胞质蛋白。

PGD₃代谢物的制备、分离和光谱表征。使PGD₃(卡曼化学品公司(CaymanChemicals))用0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4，含0.9%NaCl，以100μg/mL的终浓度在37℃振荡孵育不同时间(24小时～144小时)。反应产物和那些来自细胞培养基上清液的那些物质如下文补充信息和方法中所述通过HPLC纯化并通过UV和MS分析。

凋亡。LSC的凋亡如下文补充信息和方法中所述使用膜联蛋白V进行。

FV诱导的红白血病和FV白血病干细胞(FV-LSC)的生成：按照先前的描述用FV感染BALB/c小鼠(Subramanian A等，J Virol.2008;82:382-393；Harandi OF等，J Clin Invest.2010;120:4507-4519)。在感染后第14天，分离脾脏并产生脾细胞的单细胞悬液。所述细胞通过70μm无菌滤器过滤，并使流过的细胞在RBC裂解缓冲液中重悬，然后离心。白血病干细胞通过FACS分离。脾细胞用抗Kit、Sca1(加利福尼亚州圣地亚哥的白乐津公司(BioLegend))和M34抗体标记。M34是识别SFFV的包膜蛋白的单克隆抗体(Chesebro B等，Virology.1981;112:131-144)，并且按照先前的描述使用该抗体(Subramanian A等，J Virol.2008;82:382-393)。按照指示，在补充有200ng/ml音猬蛋白(SonicHedgehog，Shh)、15ng/ml骨形态发生蛋白-4(BMP4)(皆来自明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和50ng/ml干细胞因子(SCF；派普罗泰克公司(Peprotech))的Methocult培养基(温哥华BC的干细胞技术公司(Stem CellTechnologies))M3334中培养M34⁺Kit⁺Sca1⁺细胞。对于CFU-FV试验，按照先前的描述将细胞铺板在含有胎牛血清但不添加生长因子的甲基纤维素培养基中(Mager DL等，Proc Natl Acad Sci USA.1981;78:1703-1707)。

将FV-LSC移植到BALB/c-Stk^-/-小鼠内：如上所述产生FV-LSC。通过眼窝后注射将2.5×10⁵个FV-LSC移植到BALB/c-Stk^-/-小鼠内。在移植后六周用CyPG或载体对照按文中指示处理所述小鼠。

采用MIGR-BCR-ABL逆转录病毒引入CML：获得MIGR-BCR-ABL和对照MSCV-GFP逆转录病毒。按先前的描述所述在HEK293细胞中生成病毒储液(Finkelstein L等，Oncogene.2002;21:3562-3570)。C57BL/6小鼠用5-氟尿嘧啶(5-FU；150mg/Kg，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma))处理以富集循环HSC。在处理后第四天获得骨髓细胞并用MIGR-BCR-ABL或MSCV-GFP对照病毒在含有5%FCS并补充有2.5ng/ml IL-3和15ng/ml SCF(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的IMDM培养基中感染过夜。通过眼窝后注射将0.5×10⁶个转导的细胞移植到用950拉德辐射预处理的C57BL/6受者小鼠内。为增加CML和对照小鼠的数量，在移植GFP⁺17天后通过FACS分离脾细胞，并将1×10⁵个GFP⁺细胞移植到经辐射的(950拉德)C57BL/6二次(移植)受者内。移植后两周，按照指示用CyPG和载体对照处理小鼠。对于离体实验，通过FACS从移植小鼠的骨髓或脾中分离Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺细胞。分选的细胞培养在补充有Shh、SCF和BMP4的Methocult培养基M3334(温哥华BC的干细胞技术公司(Stem CellTechnologies))中，并用指示的CyPG和载体对照处理指示时间长度。为显示Δ¹²-PGJ₃对正常造血祖细胞的影响，在含Epo(3U/ml)、SCF、IL-3和BMP4的甲基纤维素培养基(1x10⁶个细胞/mL/孔)中于Δ¹²-PGJ₃(25nM)存在或缺失下培养分离自C57BL/6小鼠骨髓的HSC。对造血集落(培养物中的集落形成细胞，CFC)计数。

进行二次移植以测试用Δ¹²-PGJ₃处理后的残留LSC：就CML模型而言，B6.SJLPtprca Pep3b/BoyJ(CD45.1⁺)小鼠用5-FU处理，并分离富含循环HSC的骨髓细胞，然后如上所述用MIGR-BCR-ABL病毒或对照MSCV-GFP病毒感染。如上所述，将细胞移植到C57BL/6(CD45.2)接受体小鼠内。所述小鼠按指示用Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理。处理后两周，如上所述分离脾细胞并将其移植到经辐射的C57BL/6(CD45.2)二次接受体内。二次移植两周后，分析小鼠的WBC计数、脾大并通过流式细胞术分析骨髓和脾中的GFP⁺或CD45.1供者细胞的存在。还使用经Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理的FV感染小鼠进行二次移植。如上所述用弗兰德病毒感染BALB/c小鼠。所述小鼠按指示用Δ¹²-PGJ₃或载体对照处理。处理后两周，从FV感染小鼠分离脾细胞并将其移植到BALB/c-Stk^-/-接受体小鼠内(1×10⁵个细胞/小鼠)。移植后五周后，测试二次移植小鼠的WBC计数、脾大并通过流式细胞术测试M34⁺Kit⁺Sca1⁺FV-LSC的存在。

用PG处理小鼠：在指示日用CyPG处理用FV-诱导红白血病的小鼠或用MIGR-BCR-ABL诱导CML的小鼠。小鼠用每天腹膜内注射Δ¹²-PGJ₃(0.01-0.1mg/kg)、15d-PGJ₂(0.1mg/kg)或9,10-二氢-15d-PGJ₂(0.1mg/kg)处理7天。全部三种化合物都用羟丙基-β-环糊精(30%w/v；西格玛公司(Sigma)；载体对照)配制。所有实验用小鼠都经过宾夕法尼亚州立大学的IACUC批准。

LSC中ATM激酶的抑制。分离自FV感染小鼠或BCR-ABL⁺LSC移植小鼠的LSC用指示浓度的ATM特异性抑制剂(MTPO，2-吗啉-4-基-6-噻蒽-1-基-吡喃-4-酮；KU55933；50nM；卡巴开公司(Calbiochem))或ATM/ATR特异性抑制剂(CGK-733；1μM；卡巴开公司)处理，然后用CyPG处理。

统计学分析。结果以平均值±标准误表示，并且用斯氏t检验使用GraphPadPrism分析组间差异。统计学显著性的标准是P<0.05。

结果

EPA内源性代谢物：为了将EPA源性CyPG的有力抗白血病效果和其内源产量相关联，检测用EPA(50μM)培养的鼠巨噬细胞样细胞(RAW264.7)中的PGD₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的细胞生物合成。RAW264.7细胞(表达H-PGDS²⁶)用细菌内毒素脂多糖(LPS；50ng/ml)刺激以诱导COX-2表达。经处理的细胞在LPS处理后48小时产生可检测量的PGD₃及其代谢物。对培养基上清液的LC-MS分析确定了仅在用EPA处理的细胞中有PGD₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的产量增加(图1A；图6)。基于LC-保留时间和质谱裂解图，鉴定细胞代谢物为PGD₃(m/z349；图6A)、Δ¹²-PGJ₃(m/z331.45；图1B)和15d-PGJ₃(m/z313.45；图S1A)。在无外源EPA培养的细胞中未见这些代谢物(图1A)。估计用50μM EPA处理的巨噬细胞在48小时内产生约0.15μMΔ¹²-PGJ₃/10⁶个细胞。PGD₃在磷酸盐缓冲的盐水中的体外非酶脱水产生PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃。使PGD₃(100μg/ml；卡尔曼化学品公司(Cayman Chemicals))在无血清环境中于37℃孵育24～48小时导致形成Δ¹²-PGJ₃、PGJ₃(Δ¹³-PGJ₃)(PGJ3也称作D13-PGJ3，因为碳13不饱和；这是形成的异构体)和15d-PGJ₃，这些物质在反向LC(C₁₈)柱上良好分辨，其保留时间分别为9.63、9.97和11.02分钟(图6B、C)。在37℃延长PGD₃孵育至144小时也产生这些代谢物，其中Δ¹²-PGJ₃多于其它代谢物(图6C)。血清的存在(10%)并不影响PGD₃转化(图6E)。纯化Δ¹²-PGJ₃的紫外光谱分析确定存在共轭的二烯样结构，λ_max=242nm；而PGJ₃和15d-PGJ₃在约300nm处显示明显的峰，这是环戊烯酮结构的特征峰。同时，这些数据确定PGD₃代谢物的内源产量和Δ¹²-PGJ₃在水性环境中具有提高的稳定性。

Δ¹²-PGJ₃诱导LSC凋亡：此处，在两种成熟研究的白血病鼠模型中检测PGD₃代谢物的促凋亡性质。对小鼠移植转导了表达逆转录病毒的BCR-ABL的HSC(以下称作BCR-ABL小鼠)。用低剂量的Δ¹²-PGJ₃孵育分离自BCR-ABL小鼠的脾的Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺LSC显著增加这些细胞的凋亡(IC₅₀为约12nM)，但不影响正常HSC，所述正常HSC由分离自移植了用MSCV-GFP对照病毒转导的HSC的小鼠(以下称作MSCV对照小鼠)的Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺细胞代表(图1C)。当用Δ¹²-PGJ₃离体处理分离自骨髓的BCR-ABL LSC(Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺)时也观察到类似效果(图1D)。采用FV-LSC也观察到相同效果(图1E)。用EPA孵育FV-LSC无影响，而PGJ₃显示仅增加2倍凋亡，以25nM的Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃处理导致凋亡的显著增加(约75%)(图1F)。还检测了ARA源性PGJ₂、Δ¹²-PGJ₂和15d-PGJ₂对FV-LSC和源自BCR-ABL小鼠的LSC的效果。采用Δ¹²-PGJ₂和15d-PGJ₂观察到类似对Δ¹²-PGJ₃的反应，而PGJ₂基本无效(图7A)。相反，用9,10-二氢-15d-PGJ₂(15d-PGJ₂衍生物，碳9处无不饱和)处理FV-LSC无凋亡(图7B)。用25～1000nM的Δ¹²-PGJ₃或15d-PGJ₂离体处理分选自移植小鼠的脾的Sca1⁺GFP⁺Kit⁺BCR-ABL⁺LSC显著增加所述细胞凋亡；而9,10-二氢-15d-PGJ₂甚至在高达1μM的浓度仍无效(图7C)。尽管本文所述的全部数据清楚地证明Δ¹²-PGJ₃的促凋亡能力，下一步仍检测Δ¹²-PGJ₃是否调节NF-κB或PPARγ，因为曾有文献显示这是15d-PGJ₂诱导凋亡的机制(Rossi等，Nature.2000;403:103-108；Forman BM等，Cell.1995;83:803-812)。由凝胶迁移分析显示，高nM范围浓度的Δ¹²-PGJ₃不影响LPS处理的RAW264.7细胞中的NF-κB通路。此外，通过核提取物的EMSA和Western印记分析分选的经Δ¹²-PGJ₃处理的BCR-ABL⁺LSC中的NF-κB活化显示，没有NF-κB活化。并且，报告物试验中，用引起LSC凋亡的纳摩尔浓度的Δ¹²-PGJ₃无法激活PPARγ。同样，用罗格列酮(合成的PPARγ激动剂)处理FV-LSC(NolteRT等，Nature.1998;395:137-143)不影响LSC增殖，指示该凋亡通路并不涉及PPARγ(图7B，小图)。综上所述，这些数据指示CyPG中的亚烷基环戊烯酮(alkylidenecyclopentenone)结构是有效诱导来自两种鼠白血病模型的LSC凋亡所绝对必需的，所述凋亡的机理不涉及PPARγ或NF-κB。

Δ¹²-PGJ₃根除白血病并减轻FV感染小鼠中的脾大。鉴于Δ¹²-PGJ₃对体外LSC的有力促凋亡潜能，测试Δ¹²-PGJ₃在FV感染的白血病小鼠中消除LSC的能力。在用FV感染后7天，所述小鼠用Δ¹²-PGJ₃以0.01和0.05mg/kg/天另处理一周，在感染后第14天处死所述小鼠。相较于载体处理的小鼠，用Δ¹²-PGJ₃以0.05(图2A)和0.1mg/kg处理的FV感染小鼠显示无脾大迹象。尽管0.01mg/kg处理没有完全消除脾大，但仍有显著减小(约50%)(图2A)。用15d-PGJ₂也观察到类似趋势；而9,10-二氢-15d-PGJ₂对改善脾大没有任何效果。流式细胞术分析清楚显示，Δ¹²-PGJ₃(0.05mg/kg)完全根除脾中的Sca1⁺Kit⁺M34⁺Ter119^lo细胞(图2B)，该细胞代表LSC群。用15d-PGJ₂获得相同结果；但9,10-二氢-15d-PGJ₂-处理无效。与没有脾大和LSC完全消除一致，在Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₂处理的小鼠内，总白细胞和网状细胞计数降低至正常水平。之前的工作已显示，形成集落形成单位-弗兰德病毒(CFU-FV)的转化的白血病细胞显示因子非依赖性生长，这可通过在不含生长因子的甲基纤维素培养基中铺板感染的脾细胞来检测(Mager DL等，ProcNatl Acad Sci USA.1981;78:1703-1707)。Δ¹²-PGJ₃-处理的小鼠中的CFU-FV完全降低至背景水平，这与未感染小鼠中的那些相似(图2C)。载体处理的FV感染的脾的组织学检测显示因白血病胚细胞(leukemic blasts)浸润导致脾架构完全消失，红系祖细胞增殖替代了血窦(图2D)。与脾大减小的结果一致，用Δ¹²-PGJ₃处理FV感染小鼠导致小动脉周围淋巴组织的边界更完好(图2D)。相较于载体处理的FV感染组而言，CyPG处理组中的个体肿瘤坏死增加，红系祖细胞基本较低，并且伴随凋亡小体的增加出现了少数巨细胞(图2D)。FV感染的小鼠的CyPG处理恢复了脾架构，该脾架构如同未感染的小鼠，具有边界完好的红髓区和白髓区。

Δ¹²-PGJ₃抑制LSC的扩增，但不抑制病毒复制。为了排除Δ¹²-PGJ₃是通过抑制病毒复制来阻断FV诱导的白血病，使用FV诱导的白血病的第二种模型。此处，将FV-LSC移植到Stk^-/-小鼠内。简式Stk(Sf-Stk)(Stk/Ron受体酪氨酸激酶的天然发生的截短形式)，是由FV易感位点2(Fv2)编码的(Persons DA等，NatGenet.1999;23:159-165)。Fv2抗性小鼠表达低水平的Sf-Stk，其无法支持受感染细胞的增殖。因此，移植FV-LSC到Stk^-/-小鼠内导致由供者细胞扩增而非病毒感染的散播引起的白血病。将由野生型小鼠产生的LSC移植到同系Stk^-/-小鼠内。用Δ¹²-PGJ₃(以0.025mg/kg和0.05mg/kg)处理导致脾大显著减少，伴随白细胞计数减少(图3A-C)。经移植的Stk^-/-小鼠的脾中的LSC的流式细胞术分析指示，在用Δ¹²-PGJ₃处理后，M34⁺Sca1⁺Kit⁺细胞完全被消除(图3D)；而用9,10-二氢-15d-PGJ₂或载体处理来自Stk^-/-小鼠的LSC既不影响其LSC的活力又没有减轻脾大的效果。用Δ¹²-PGJ₃或15d-PGJ₂处理FV诱导的白血病显著减少血细胞比容、WBC计数和网状细胞计数(这些都是白血病标志)；而9,10-二氢-15d-PGJ₂对任何上述测试参数均无效果(图3C)。

Δ¹²-PGJ₃减轻由移植BCR-ABL⁺LSC导致的白血病。图1的体外研究显示，Δ¹²-PGJ₃处理导致BCR-ABL⁺LSC凋亡，但不导致正常HSC(MSCV-GFP⁺HSC)凋亡。然后，检测Δ¹²-PGJ₃在BCR-ABL小鼠中的抗白血病活性，该小鼠是CML慢性期模型(Pear WS等，Blood.1998;92:3780-3792)。如图4所示，用0.05mg/kgΔ¹²-PGJ₃处理移植了BCR-ABL⁺LSC的小鼠1周完全减轻脾大，获得的脾重量与用MSCV-GFP⁺HSC移植的那些相近(图4A)。此外，Δ¹²-PGJ₃处理还显著减少外周血中的白细胞计数(图4B)，减少脾中的Kit⁺Sca1⁺GFP⁺LSC(图4C)，并且根除BCR-ABL⁺LSC移植小鼠的骨髓中的Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺LSC(图4D)。更重要的是，用Δ¹²-PGJ₃处理BCR-ABL⁺LSC移植小鼠挽救了全部小鼠；而用载体处理的那些在移植了LSC之后两周死亡(图4E)。相反，用Δ¹²-PGJ₃处理MSCV-GFP⁺HSC移植小鼠对WBC计数或其它血液学或存活参数没有效果，表明Δ¹²-PGJ₃不影响造血作用的稳定状态(图4E)。为了进一步证明Δ¹²-PGJ₃不影响正常造血分化，接下来通过CFC试验中检测Δ¹²-PGJ₃对集落形成能力的影响测试了Δ¹²-PGJ₃处理是否对造血祖细胞有不良作用。将来自5-FU处理小鼠的骨髓铺板在含有多种细胞因子、25nMΔ¹²-PGJ₃缺失或存在下的甲基纤维素培养基中。Δ¹²-PGJ₃处理的细胞和对照(PBS)处理的细胞中的CFC数没有区别(图4F)。

为了确定Δ¹²-PGJ₃已经根除了LSC，采用来自Δ¹²-PGJ₃或载体处理BCR-ABL小鼠的脾细胞进行二次移植。用CD45.1⁺标记以原始供者MIGR-BCR-ABL转导的骨髓细胞；而第一和第二接受体用CD45.2⁺标记。接受来自载体处理小鼠的供者细胞的二次移植体快速发展了脾大和高WBC计数，指示白血病。相反，Δ¹²-PGJ₃处理小鼠的供者细胞的二次受者无法发展脾大或高WBC计数(图5A)。进一步分析脾的LSC显示，Δ¹²-PGJ₃处理小鼠的供者细胞的受者缺乏Kit⁺Sca1⁺GFP⁺细胞。并且，CD45.1表达分析也显示所述脾中不存在CD45.1⁺供者细胞(图5C)。载体处理小鼠的供者细胞的二次受者在其脾中显示许多供者源性Kit⁺Sca1⁺GFP⁺和CD45.1⁺供者细胞(图5B和C)。用分离自用Δ¹²-PGJ₃或载体处理的FV-LSC移植的BALB/c-Stk^-/-小鼠的供者脾细胞进行类似的二次移植实验。类似于BCR-ABL二次移植体，接受Δ¹²-PGJ₃处理小鼠的供者细胞的小鼠无法发展脾大或高WBC计数，并且在其脾中缺乏LSC(图5D和E)。综合起来，这些数据清楚证明Δ¹²-PGJ₃根除两种不同骨髓性白血病鼠模型中的LSC的能力。

EPA代谢物选择性激活LSC中的p53：来自FV感染小鼠的分选的LSC用10或25nMΔ¹²-PGJ₃离体处理12小时导致p53表达在转录水平上的显著上调。相似地，用15d-PGJ₂处理LSC也显示相似趋势；而9,10-二氢-15d-PGJ₂无效。有趣的是，PGJ₂处理仅较小程度上调p53的表达，但没有上调至采用其它CyPG观察到的程度。然而，用培养基(在37℃)预孵育PGJ₂42小时，然后添加LSC导致p53表达增加，这表示可能发生PGJ₂(Δ¹³-PGJ₂)转变为Δ¹²-PGJ₂或15d-PGJ₂和PGJ₃(Δ¹³-PGJ₃)转变为Δ¹²-PGJ₃或15d-PGJ₃从而使转变之后的代谢物比之前的代谢物更有效的时间依赖性异构化事件(图1E)。用Δ¹²-PGJ₃或15d-PGJ₂(25nM)离体处理BCR-ABL⁺LSC也导致p53mRNA的类似增加；而9,10-二氢-15d-PGJ₂-处理无效。时程分析显示，在用Δ¹²-PGJ₃离体处理FV-LSC之后，p53转录水平快速升高，从而在12小时内观察到最大p53表达。未感染和载体处理的FV感染小鼠的全脾中的p53表达分析清楚显示没有增加；而Δ¹²-PGJ₃处理小鼠(处理1周)显示脾中的显著p53表达。类似地，在用Δ¹²-PGJ₃处理12小时的分选的LSC中观察到p53蛋白的核水平升高，但在未处理或载体处理的细胞中没有观察到该结果。为了确定p53作为Δ¹²-PGJ₃依赖性LSC凋亡的关键介导物的作用，在缺乏功能性p53的鼠红白血病(MEL)细胞中检测CyPG的促凋亡作用。使源自CFU-FV的MEL细胞增殖成细胞系。用Δ¹²-PGJ₃处理MEL细胞无法起始凋亡。MEL细胞显示对抗白血病药物(例如红比霉素、米托蒽醌和阿糖胞苷)处理的敏感性，但对导致p53再活化的MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂Nutlin无敏感性。这些数据确定LSC凋亡中p53通路的Δ¹²-PGJ₃依赖性活化的作用。

已知p53活性的活化受ATM依赖性信号通路的调节。接着检测了ATM在Δ¹²-PGJ₃的促凋亡活性中是否起关键作用。除了磷酸化的p53蛋白增加以外，仅在来自Δ¹²-PGJ₃处理的移植了FV-LSC的小鼠的总脾提取物中观察到pChk2水平的增加。FV感染小鼠的脾切片TUNEL染色显示仅Δ¹²-PGJ₃处理组中的凋亡增加。与TUNEL染色结果一致，观察到Bax表达的活化，Bax是Δ¹²-PGJ₃处理的FV感染的小鼠而非FV感染的载体处理的小鼠的脾中凋亡的下游介导物。综合而言，上述实验表明，ATM-p53信号轴(signaling axis)涉及促进Δ¹²-PGJ₃依赖性凋亡。为了进一步确定ATM的相关性，使用两种ATM的特征明确的抑制剂。分选的FV-LSC用ATM的高亲和性抑制剂(MTPO)和针对ATM与相关ATR激酶的双重抑制剂(CGK-733)离体预孵育，然后用Δ¹²-PGJ₃处理，阻断了p53的CyPG依赖性表达，这指示ATM在Δ¹²-PGJ₃引起的凋亡中起关键介导物的作用。与采用FV观察到的类似，通过增加的膜联蛋白V染色和胱冬酶3与胱冬酶8活化的western印迹分析显示，用25nMΔ¹²-PGJ₃处理BCR-ABL⁺LSC(Kit⁺Sca1⁺Lin^-GFP⁺)导致凋亡的显著增加。Δ¹²-PGJ₃处理导致p53转录的增加；而在GFP⁺细胞中有伴随性减少。与在FV-LSC中观察到的类似，用MTPO预处理这些细胞阻断了Δ¹²-PGJ₃对凋亡和p53表达诱导的作用。讨论

在本研究中，证明了在巨噬细胞中，EPA源性PGD₃代谢成环戊烯酮PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃。在巨噬细胞培养基中检测到的这些稳定代谢物中，仅Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃靶向FV诱导白血病和基于BCR-ABL⁺逆转录病毒的CML鼠模型中的LSC并使其凋亡。相反，EPA和PGJ₃无效。这些数据表明CyPG的促凋亡活性需要在亚烷基环戊烯酮结构和碳12位不饱和方面的结构功能关系。

基于LC-MS/MS研究，由引起LSC凋亡(IC₅₀=7nM)所需适当浓度的巨噬细胞产生足够量的Δ¹²-PGJ₃(约0.15μM/10⁶个巨噬细胞)。除了它对LSC的促凋亡效果，Δ¹²-PGJ₃对HSC或下游祖细胞没有不良作用。这些研究指示，LSC以立体选择性方式对Δ¹²-PGJ₃和其它相关的CyPG显示出敏感性提高。通过这些内源性代谢物诱导LSC凋亡需要ATM/p53信号轴，这导致体内白血病的完全消除(基于对两种不同白血病小鼠模型的观察)。这些数据显示，该处理消除LSC至在二次移植体上没有显示任何LSC活性的程度。这些研究支持ATM作为LSC中亲电子“胁迫”响应通路的重要介导物的作用。

总而言之，通过在两种白血病鼠模型中激活ATM-p53凋亡通路证明了巨噬细胞产生显示有力促LSC凋亡活性的内源性Δ¹²-PGJ₃的能力。腹膜内给予Δ¹²-PGJ₃根除BCR-ABL逆转录病毒CML模型中的LSC，在给予Δ¹²-PGJ₃最后剂量后五周没有明显复发。相反，载体处理的移植了LSC的小鼠无法活过移植后第16天(图4F)。现有的抗癌疗法对LSC无效；因此稳定内源性代谢物消除LSC的能力使其成为了潜在的疗法。此外，这些结果指示源自食用n-3PUFA的Δ¹²-PGJ₃具有作为白血病治疗中的化学预防剂的可能性。补充信息和方法

PGD₃代谢物的制备、分离和光谱表征。使PGD₃(卡曼化学品公司(CaymanChemicals))用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4，含0.9%NaCl)，以100μg/mL的终浓度在充有氩气的密封棕色小瓶中于37℃振荡孵育不同时间(24小时～144小时)。在10%FBS存在下进行相似反应。所述反应混合物或细胞培养基上清液用1NHCl酸化至pH3.0，并用两体积的己烷:乙酸乙酯(50:50)提取三次。使有机相通过无水硫酸钠，并在氩气下蒸发。将所述有机相贮备于-80℃直至进一步处理。通过反向LC在Dynamax半定量C₁₈柱(10×250mm)上使用MeCN:H₂O:乙酸(70:30:1)以2ml/分钟分离类花生酸，在280nm监测洗脱物。收集峰，用氩浓缩并在MS级甲醇中重构以供MS/MS和紫外光谱分析。通过直接注入负电喷雾电离模式的三重四极杆质谱仪(API2000，ABI SCIEX)分析类花生酸。将电喷雾电压和和离子喷雾发生器温度分别设定为-4000V和300℃。使用氮作为气帘气(12psi)和雾化气(15psi)。将去簇电压、散焦电压和入口电压分别设为-50V、-400V和-10V。

使用由HPLC纯化的Δ¹²-PGJ₃在以多反应监测(MRM)模式操作的MS上绘制两种转换(331.5～313.5m/z和331.5～269.5m/z)的标准校准曲线。在贝克曼(Beckman)DU7500二极管阵列分光光度计(Diode Array Spectrophotometer)上记录所有LC纯化的PGD₃代谢物在甲醇中的紫外光谱。分别使用PGJ₂、Δ¹²-PGJ₂和15d-PGJ₂(都来自卡曼化学品公司(Cayman Chemicals))的摩尔消光系数来计算PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的浓度。针对p53和β-肌动蛋白进行半定量RT-PCR。半定量PCR在由LSC制备的cDNA上进行。在琼脂糖(1%w/v)凝胶上显示条带并通过密度计量学计算。

凋亡。在DMEM中稀释LSC，使用16号针头重悬，并通过离心收集。1×10⁵个细胞在200μl结合缓冲液(0.1M HEPES，含有1.4M NaCl、25mM CaCl₂，pH7.4)中重悬。将膜联蛋白V FITC(BD生物科学公司(BD Biosciences))与细胞在冰上孵育15分钟，然后通过流式细胞术分析。

细胞活力研究。在含有10%FBS的DMEM中培养MEL细胞，并用不同的常用抗白血病药物(例如红比霉素(DNR)、米托蒽醌(MIT)和阿糖胞苷(CYT))以1μM的终浓度处理24小时。使用p53活化剂Nutlin(5μM；卡曼化学品公司(CaymanChemicals))作为对照以显示MEL细胞中缺乏p53活化和凋亡。药物处理24小时后，采用来自马里兰州盖瑟斯堡的岛津分子技术公司(Dojindo MolecularTechnologies,Inc.)的CCK-8试剂盒通过MTT试验检测细胞增殖。将报告的全部活力值与未处理细胞(UT)做比较，指定未处理细胞的活力值为100%。结果以三个独立观测的平均值±SEM表示。

图6显示PGD₃向PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的体外自发转化。图6a是显示EPA转化成CyPG的通路示意图。显示了PGD₃和15d-PGJ₃的代表性MS。在图6b～d中，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4，含0.9%NaCl)，以100μg/mL的终浓度在充有氩气的密封棕色小瓶中于37℃振荡孵育PGD₃(来自卡曼化学品公司(Cayman Chemicals))不同时间(24小时～144小时)。在图6e中，如上所述使PGD₃在磷酸盐缓冲盐水中稀释的10%FBS中于37℃孵育48小时。所述PG使用己烷:乙酸乙酯(50:50)提取并用氩浓缩有机相。通过反向LC在Dynamax半定量C₁₈柱(10×250mm)上使用MeCN:H₂O:乙酸(70:30:1)以2ml/分钟分离所述类花生酸，并在280nm监测洗脱物。收集峰，用氩浓缩并在MS级甲醇中重构以供紫外-MS/MS分析。以N=8的独立反应为代表。

用紫外光谱分析Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的转化过程与时间的关系。LC纯化的Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃在甲醇中重构，并在贝克曼(Beckman)DU7500二极管阵列分光光度计(Diode Array Spectrophotometer)上以合适的溶剂背景为对照，通过紫外光谱分析光谱性质。分别使用PGJ₂、Δ¹²-PGJ₂和15d-PGJ₂的摩尔消光系数来计算PGJ₃、Δ¹²-PGJ₃和15d-PGJ₃的浓度。N=3为代表。结果指示，亚烷基环戊烯酮结构的形成之后的分子内重排形成Δ¹²-PGJ₃和从PGD₃前体产生双脱水产物15d-PGJ₃。

图7显示CyPG对LSC的剂量依赖性促凋亡作用。测试来自FV感染小鼠和鼠CML模型中的LSC培养物中的源自花生四烯酸的CyPG(2个系列的PG)诱导凋亡的能力。图7A中，Δ¹²-PG_J或15d-PGJ₂相较于载体而言能够诱导凋亡，但PGJ₂不能。已知15d-PGJ₂是PPAPγ激动剂。在图7B中，FV LSC用15d-PGJ₂、9,10-二氢-15d-PGJ₂(失活形式)或罗格列酮(市售可得的合成PPAPγ激动剂(图7B的小图))处理。罗格列酮和9,10-二氢-15d-PGJ₂无法诱导凋亡。在图7C中，检测Δ¹²-PG_J3、15d-PG_J2或9,10-二氢-15d-PG_J2诱导鼠CML模型中凋亡的能力。仅Δ¹²-PG_J3、15d-PG_J2是有活性的，而9,10-二氢-15d-PG_J2无效果。这些数据显示，CyPG并不是通过PPAPγ活化机制来诱导凋亡。在图7a中，针对M3⁴⁺Sca¹⁺Ki^t+LSC分选来自FV感染的小鼠脾细胞，并用25nM PG_J2、Δ¹²-PG_J2或15d-PG_J2在含有200ng/ml音猬因子(sHH)、50ng/ml SCF和15ng/ml BMP4的甲基纤维素干细胞培养基中孵育36小时。所述细胞用膜联蛋白V-FITC染色并通过流式细胞术分析。N=4为代表。平均值±标准误。相较于载体(PBS)而言*P<0.001。在图7b中，显示9,10-二氢-15d-PG_J2和15d-PG_J2的促凋亡功能的比较。小图：罗格列酮对LSC凋亡的作用。使罗格列酮(0.1～2.0μM)与LSC如上所述在培养基中孵育36小时，然后用膜联蛋白V对所述细胞染色，随后进行流式细胞术。图7c显示分离自用BCR-AB^L+转导的HSC移植的经CyPG处理后的小鼠的脾的BCR-AB^L+Ki^t+Sca¹⁺细胞的凋亡分析结果。LSC用指示浓度的各化合物离体处理36小时。以平均值±标准误显示，*P<0.001。

测试Δ¹²-PG_J3对NF-κB和PPAPγ的作用。RAW264.7巨噬细胞用DMSO、0.25或1.0μM的Δ¹²-PG_J3预处理，随后用100ng/mL大肠杆菌(E.coli)LPS刺激4小时。制备核提取物并用凝胶迁移分析检测NΦκB和³²P标记的共有双链寡核苷酸探针的结合。NS=非特异性条带。泳道1～5分别代表未处理、单独LPS、DMSO+LPS、Δ¹²-PG_J3(0.25μM)+LPS和Δ¹²-PG_J3(1μM)+LPS。从脾中分选BCR-ABL LSC，将其铺板，并用PBS、25nMΔ¹²-PG_J3或9,10-二氢15d-PG_J2处理0、2或6小时。获得所述细胞并用标准技术制备核提取物。使用来自各样品的10μg核蛋白进行凝胶迁移反应。使用来自LPS处理的鼠(RAW264.7)巨噬细胞的核提取物作为NF-κB的阳性对照。使用该阳性对照和抗p50Ab进行超迁移实验，与所述阳性对照一同使用过量的“非放射性(cold)”探针(作为“非放射性竞争物(coldcompetitor)”)。对上述来自用PBS、Δ¹²-PG_J3或9,10-二氢-15d-PG_J2处理不同时间(0～6小时)的BCR-ABL LSC的核提取物进行Western印迹分析，其中用抗p65和抗β-肌动蛋白抗体探查。在针对PPAPγ活化的报告子试验中，用pGalRE-Luc报告基因转染表达与酵母GAL4DNA结合结构域融合的人PPAPγ配体结合结构域的HEK293T细胞。使用该特点明确的报告子系统进行这些研究以探明Δ¹²-PG_J3活化PPAPγ的活性。我们的研究显示，0.01μM～1.0μM浓度的Δ¹²-PG_J3无法活化PPAPγ，这与用作阳性对照的罗格列酮不同。

用Δ¹²-PGJ₃(0.05mg/kg)处理移植了FV LSC的小鼠对该小鼠内的血液学参数没有负面影响。检测用Δ¹²-PGJ₃(0.05mg/kg)处理的小鼠的全血计数。经处理的小鼠和未经移植的对照小鼠就白细胞计数、红细胞计数或血小板计数而言没有差异。检测FV感染小鼠用CyPG处理后的血液学参数变化。FV感染的Balb/c小鼠用Δ¹²-PGJ₃(0.05mg/kg)腹膜内处理7天，然后处死小鼠并在Advia血液分析仪上分析血液学参数。将FV感染的Δ¹²-PGJ₃处理的小鼠与感染的载体对照做比较。N=5/组，全部数据都是平均值±标准误，*P<0.05。在体内实验中，使用3%w/v羟丙基-β-环糊精作为载体。检测用载体、9,10-二氢-15d-PGJ₂(0.05mg/kg)或15d-PGJ₂(0.05mg/kg)处理的FV感染的小鼠的脾尺寸；N=3/组。检测未感染的、感染的和15d-PGJ₂处理的Balb/c小鼠的血液学参数。N=5/组。所有数据都是平均值±标准误，*P<0.05。

显示15d-PGJ₂根除FV-LSC。15d-PGJ₂靶向FV感染小鼠的脾中的FV-LSC。FV感染的小鼠用0.05mg/kg的15d-PGJ₂或9,10-二氢-15d-PGJ₂处理7天。在感染后第14天通过流式细胞术分析所述脾LSC(M34⁺Sca1⁺Kit⁺)细胞。通过流式细胞术检测发现，采用15d-PGJ₂的处理导致LSC数量显著减少。此外，15dPGJ₂显著减少了能够形成转化的CFU弗兰德病毒集落的转化的白血病细胞的数量。15d-PGJ₂不影响弗兰德病毒的病毒复制，因此在这些实验中，单一进程的15dPGJ₂处理并不消除LSC，其通过进行中的病毒感染再生。使用未感染的和感染的载体对照来做比较。N=3；*P<0.05。来自感染小鼠的脾细胞用载体、9,10-二氢-15d-PGJ₂和15d-PGJ₂处理，并铺板在含有FCS不含生长因子的甲基纤维素培养基中以检测用15d-PGJ₂或9,10-二氢-15d-PGJ₂处理小鼠是否影响CFU-FV集落的形成，其显示因子非依赖性生长。在铺板后第10～14天对所述集落计数。N=3只小鼠/组，*P<0.05。

为了探明15d-PGJ₂，在病毒感染无法再生LSC的系统中根除FV LSC的能力，在Stk^-/-小鼠中移植体外增殖的FV-LSC。Stk^-/-小鼠对弗兰德病毒感染具有抗性，因此由所述经移植的小鼠发展的白血病是通过移植的LSC而非FV感染造成的。用15dPGJ₂处理小鼠导致根除脾中的FV LSC，从而使该疾病消退。将分选自FV感染小鼠的脾的LSC移植到Stk^-/-小鼠(Balb/c背景)内。6周后，所述小鼠每天通过腹膜内注射载体(羟丙基-β-环糊精)、15d-PGJ₂(0.05mg/kg)或9,10-二氢-15d-PGJ₂(0.05mg/kg)处理1周。在LSC移植后第51天处死小鼠用于分析。通过比较脾大对载体、15d-PGJ₂或9,10-二氢-15d-PGJ₂处理的移植小鼠进行脾分析。检测了相较于对照(未移植小鼠)的处理后的脾重量以及经处理后小鼠的外周血中的WBC计数，并对处理后的LSC移植小鼠和未移植小鼠的脾进行流式细胞术分析。所有数据都是平均值±标准误，相较于对照或9,10-二氢-15d-PGJ₂处理组而言*p<0.05。N=5/组。

Δ¹²-PGJ₃无法诱导MEL细胞凋亡，因为MEL细胞的p53基因中有突变。为了探明MEL细胞对化疗剂是否普遍具有抗性，我们测试了MEL细胞在用标准抗白血病药物处理时是否会经凋亡致死。用不同的常用抗白血病药物，例如红比霉素(DNR)、米托蒽醌(MIT)和阿糖胞苷(CYT)，以1μM的终浓度处理24小时。使用p53活化剂Nutlin(5μM)作为对照以证明MEL细胞中缺乏p53活化和凋亡。药物处理24小时后，采用来自马里兰州盖瑟斯堡的岛津分子技术公司(DojindoMolecular Technologies,Inc.)的CCK-8试剂盒通过MTT试验检测细胞增殖。除了Nutlin，所有化合物都引起显著凋亡。结果以三个独立观测的平均值±SEM表示。

实施例2–通过激活DP的分子靶向LSC

图8和9中显示的数据表明G-蛋白偶联受体(称作DP)类的作用，其在由Δ¹²-PGJ₃所致的LSC凋亡中起作用。此外，还采用所述受体的合成激动剂进行实验。

图8的数据显示Δ¹²-PGJ₃靶向伊马替尼抗性BCR-ABL(GFP)+细胞。在该试验中，小鼠用BCR-ABL+LSC移植并在一周后开始用伊马替尼以25mg/kg/天腹膜内处理1周。在伊马替尼处理后的1周清除期之后，解剖脾并用25nMΔ¹²-PGJ₃或载体(PBS)离体处理全部脾细胞24小时。通过流式细胞术分析GFP+LSC。如图8所述，Δ¹²-PGJ₃处理甚至可以靶向对伊马替尼处理具有抗性的LSC。

进行的一项实验显示，由Δ¹²-PGJ₃引起的BCR-ABL+LSC凋亡受到合成的DP拮抗剂的抑制。在该试验中，用MK0824(DP1拮抗剂；10nM；卡曼化学品公司(Cayman Chem))、CAY10471(DP2拮抗剂；10nM；卡曼化学品公司)或KU55933(ATM激酶抑制剂；10nM；卡巴开公司(Calbiochem))预处理培养在Methocult培养基中的分选的BCR-ABL+LSC和MSCV-HSC2小时，然后用25nMΔ¹²-PGJ₃或DMSO处理。孵育36小时后，通过膜联蛋白V染色来定量凋亡细胞。MSCV-HSC对照细胞的活力不受任何上述处理的影响。平均值±标准误，n=3。CAY10471是雷马曲班类似物(经批准的治疗过敏性鼻炎的人用药物)，其包含增强其对人CRTH2/DP2受体的效力和选择性的修饰。CAY10471结合人CRTH2/DP2、DP1和TP受体，其Ki值分别为0.6、1200和>10,000nM。

MSCV-HSC(正常HSC)不受任何上述处理影响。另一方面，BCR-ABL LSC对由25nMΔ¹²-PGJ₃引起的凋亡极敏感，而该效果通过使用DP拮抗剂而得到抑制。从该数据可见，该凋亡通路涉及DP和ATM激酶(毛细血管扩张共济失调症突变激酶蛋白)的活化。在探明Δ¹²-PGJ₃处理是否会导致任何粒细胞脱粒的相关研究中，大鼠嗜碱性细胞系(RBL-23)用100nMΔ¹²-PGJ₃处理，通过定量所释放的组胺和脱粒第二标志物己糖胺酶跟踪脱粒。我们的结果清楚显示，Δ¹²-PGJ₃不引起脱粒，而伊屋诺霉素(熟知的脱粒刺激物)导致大量组胺和己糖胺酶的生成。

参见图9，该数据显示通过合成的DP激动剂引起的BCR-ABL+LSC凋亡。在该实验中，将500,000个BCR-ABL+LSC铺板于24孔板，然后用25nM PGD2Me或100nM ZK118182(皆为DP激动剂)处理24小时。通过流式细胞术分析GFP+细胞。这些激动剂购自密歇根州的卡曼化学品公司(Cayman Chemicals)。基于该结果和先前的数据，非常清楚的是，通过合成的激动剂引起的DP活化可诱导LSC凋亡。因此，使用作为成熟建立的DP激动剂的合成化合物能够靶向LSC。

实施例3–Δ¹²-PGJ₃和相关激动剂不影响正常人造血作用。参见图10，该图显示，Δ¹²-PGJ₃和相关的激动剂不影响正常人造血作用。在上述的一个试验中，数据显示Δ¹²-PGJ₃对终末分化的造血细胞集落形成的作用。这些集落被称作集落形成细胞或CFC。就所述实验而言，仅添加多谱系骨髓集落形成的必要生长因子。参见图10，使用含有多种生长因子并补充有列在该图的X轴上的化合物的培养基。Δ¹²-PGJ₃无作用。合成的DP激动剂ZK也没有作用。因此，Δ¹²-PGJ₃和相关的激动剂不影响正常人造血作用。参见图11，Δ¹²-PGJ₃不影响正常骨髓细胞分化(以形成BFUe)的能力。在该实验中，使人骨髓细胞(CD34+；华盛顿州西雅图的瑞奇生物公司(Reach Bio))在含有Epo(3U/ml)+SCF(50ng/ml)的甲基纤维素(干细胞技术公司(Stem Cell Technology)，H-4230)中用PBS、Δ¹²-PGJ₃(50nM和100nM)培养8天。在第8天，用联苯胺对BFUe集落染色。实施例4–Δ¹²-PGJ₃的功效和与伊马替尼的对比数据进行涉及急性转化期CML的细胞离心涂片(011711)和吉姆萨(Geimsa)染色的实验。使急性转化期CML在含有BIT、LDL、L-Glu的IMDM中培养，用PBS或100nMΔ¹²-PGJ₃处理12小时。收集细胞并通过细胞离心涂片制片。细胞离心涂片的载玻片用瑞氏-吉姆萨(WrightGeimsa)染色，并在材料(Material)显微镜上记录照片(100×)。该研究证实急性转化期的CML细胞死亡。

参见图12，这对图中的数据显示DP介导来自患者(#011711)的急性转化期CML细胞的Δ¹²-PGJ₃依赖性凋亡。在该实验中，使110,000个/孔的原代AML细胞在上述特定培养基中培养6和12小时。收集细胞并用冰冷PBS冲洗一次。使所述细胞重悬于200ul1x凋亡缓冲液中，向每管添加膜联蛋白V PE。在PBS中冲洗细胞并在600ul PBS中重悬，然后转移至流式管中并在FC-500上分析凋亡(膜联蛋白V+细胞)。该试验的结论是，Δ¹²-PG_J3或合成的DP激动剂诱导BC-CML原代患者细胞凋亡。DP激动剂阻断该应答，证明Δ¹²-PG_J3的作用是DP依赖性的。参见图13，该图显示DP介导来自患者(#100810)的AML细胞的所述Δ¹²-PGJ₃依赖性凋亡。在该实验中，使110,000个/孔AML细胞在前述培养基中培养6和12小时。收集细胞并在PBS中冲洗一次，然后在200ul PBS中重悬，并用FC受体抗体在室温封闭10分钟。添加以下抗体：CD38、CD123、CD34、CD117(BD生物科学公司)，在冰上保持1小时。细胞在PBS中冲洗一次，然后在200ul凋亡缓冲液中重悬，添加膜联蛋白V并孵育15分钟。通过流式细胞术对凋亡细胞(膜联蛋白V+细胞)计数。该实验的结论是，通过分析所述CD34+CD38-CD123+CD117+细胞的膜联蛋白V+部分，检测出Δ¹²-PGJ₃诱导原代人AML细胞的凋亡，并且其能够特异性杀伤LSC。采用其它AML患者样品(AML患者#123009、#033107、#041909、#101308)进行类似研究，所得结果(参见图15)与上述结果相同。Δ¹²-PGJ₃靶向全部这些样品中的LSC。更重要的是，用CAY10471(DP拮抗剂)预处理LSC完全阻断了由Δ¹²-PGJ₃引起的凋亡。参见图15中所示的实验结果，使AML细胞(来自患者#100810、#123009、#033107、#041909、#101308)以110,000个/孔在上述培养基中培养6小时(有或没有100nMΔ¹²-PGJ₃(100nM)，或采用CAY10471(10nM)预处理然后用D12-PGJ₃(100nM)处理))。收集细胞并在PBS中冲洗一次，然后在200ul PBS中重悬，并用FC受体抗体在室温封闭10分钟。添加以下抗体：CD38、CD123、CD34(BD生物科学公司)，在冰上保持1小时。细胞在PBS中冲洗一次，然后在200ul凋亡缓冲液中重悬，添加膜联蛋白V并孵育15分钟。通过流式细胞术对凋亡细胞(膜联蛋白V+细胞)计数。该实验的结论是，通过分析所述CD34+CD38-CD123+细胞的膜联蛋白V+部分，检测出Δ¹²-PGJ₃诱导原代人AML细胞的凋亡，并且其能够特异性杀伤LSC。

检测用Δ¹²-PGJ₃处理后的人AML样品中的生存素表达。用Trizol(英杰公司(Invitrogen))从经过指示处理(6小时)的AML细胞分离总RNA，使用超级转录物II(Superscript II，英杰公司)生成cDNA，然后使用SYBR绿PCR预混物(SYBRgreen PCR master mix)和扩增76nt PCR产物的引物通过RT-PCR定量cDNA。使用针对GAPDH的Taqman探针(应用生物系统公司(Applied biosystems))。生存素是凋亡抑制剂。Δ¹²-PGJ₃减少生存素的表达，表明DP激动剂阻断抑制凋亡的反调节通路。检测Δ¹²-PGJ₃处理的AML中的MCL-1表达。MCL-1是Bcl-2家族的抗凋亡基因。如上所述从原代AML细胞分离总RNA和cDNA。用实时PCR检测MCl-1表达。(Hs01050896-m1，应用生物系统公司(Applied Biosystems))。采用Δ¹²-PGJ₃的处理减少MCL1表达，这与凋亡的增加相关联。

参见图14，该图显示BCR-AB^L+LSC移植CML鼠模型中Δ¹²-PG_J3和伊马替尼(Gleevec)的比较。在该实验中，分别以75mg/kg和0.025mg/kg使用伊马替尼和Δ¹²-PG_J3。采用CML患者护理标准处理CML鼠模型，即用伊马替尼治疗1周，导致生存延长，但白血病快速复发。相反，采用Δ¹²-PG_J3处理导致生存延长，且白血病不复发。

实施例5–Δ¹²-PGJ₃作为AML化疗剂

AML是成人白血病中最常见类型之一。遗憾的是，AML的五年相对生存率相较于其它白血病形式而言是最低的。AML是干细胞疾病，其中LSC占据该疾病等级的顶端。LSC能自我更新并生成非干细胞子代，这制造出大批白血病细胞。尽管化疗剂能够有效靶向大批白血病细胞，但LSC具有活性机制以躲避这些药物的杀伤。因此，无法消除LSC引起所述疾病的复发。由于该性质，LSC的特异性靶向是成功治疗的根本。尽管已经认识到需要以抗LSC为基础的新的治疗，但仍缺乏靶向LSC的基于机理药物的鉴定。显然需要新途径。发现源自ω-3脂肪酸的代谢物Δ¹²-PGJ₃，其有效根除两种慢性白血病小鼠模型中的LSC。在本文所述的实验中，这些发现广泛显示Δ¹²-PGJ₃通过诱导AML鼠模型和人AML白血病样品中的凋亡而有效靶向AML LSC。相反，Δ¹²-PGJ₃对正常造血干细胞或造血祖细胞的分化没有影响。Δ¹²-PGJ₃具有诱导LSC和白血病细胞中p53表达的作用。LSC中的p53高水平表达与自我更新不相容，并导致凋亡。这些数据表明，Δ¹²-PGJ₃是用于治疗AML的化疗剂。

实施例6–由DP激动剂(内源性和外源性)和DP拮抗剂引起的人原代AML细胞的凋亡参见图16中所示的结果，采用分离自患者的原代AML干细胞进行实验。这些结果有力支持的事实是，Δ¹²-PGJ₃(和其它DP激动剂)甚至对来自AML患者的人原代白血病干细胞都有效。分离自AML患者的骨髓的人原代AML细胞(72%的所述细胞是CD133+)在DP拮抗剂(CAY10471和MK0524，皆为10nM)的存在或缺失下用不同浓度的Δ¹²-PGJ₃(5、50、100nM)体外处理6和24小时。在一个相同实验中，所述细胞还用合成的DP激动剂ZK118182(100nM)处理。使用流式细胞术检测细胞的凋亡(通过膜联蛋白V染色)。这些结果与上述采用小鼠AML干细胞的结果一致，这进一步支持了DP激动剂作为白血病治疗剂的应用。

其它实施方式

可对所述组合物、药盒和方法步骤的全部或部分进行任何改进。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，皆通过引用其全文纳入本文。除非另有说明，本文涉及的任何和所有实施例，或者示例性的语言(例如，“例如”)的使用是为了阐述本发明，而不是对本发明范围的限制。本文中关于本发明或所述优选实施方式的性质或益处的任何陈述不意在限制，而附加的权利要求不应被视为受这些陈述的限制。更具体的是，说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明实践所必需的非要求权利的要素。根据申请原则，本发明包括所附权利要求书所涉及主题的所有改进和等同形式。而且，所有可能的变型中上述要素的任意组合包括在本发明范围内，除非另有说明或者清楚指出相反。

Claims (14)

1.一种包含药学上可接受的运载体和分离的或合成的Δ¹²-前列腺素J₃(Δ¹²-PGJ₃)的组合物。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含第二抗癌药物。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第二抗癌药物是伊马替尼。

4.分离的或合成的Δ¹²-前列腺素J₃在制备通过抑制具有白血病干细胞(LSC)的对象中的LSC生长来治疗对象内白血病的组合物中的应用，其中所述组合物还包含药学上可接受的运载体。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LSC是慢性骨髓性白血病干细胞或急性骨髓性白血病细胞。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述对象对伊马替尼具有抗性。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述对象是人。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述组合物还包含治疗有效量的第二抗癌药物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第二抗癌药物是伊马替尼。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述组合物的给予诱导所述对象内的LSC凋亡。

11.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述组合物的给予消除所述对象内的LSC。

12.一种用于治疗对象内白血病的药盒，所述药盒包含：

(a)包含药学上可接受的运载体和治疗有效量的分离的或合成的Δ¹²-前列腺素J₃的组合物，其用于诱导所述对象内的LSC死亡；

(b)使用说明书；和

(c)包装。

13.如权利要求12所述的药盒，其特征在于，所述药盒还包含治疗有效量的第二抗癌药物。

14.如权利要求13所述的药盒，其特征在于，所述第二抗癌药物是伊马替尼。