MX2011008044A

MX2011008044A - Medio de cultivo para celulas madre epiteliales y organoides que comprenden las celulas madre.

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Publication number: MX2011008044A
Application number: MX2011008044A
Authority: MX
Inventors: Johannes Carolus Clevers; Toshiro Sato; Meritxell Huch Ortega
Original assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2012-01-12
Also published as: JP2012254081A; WO2010090513A3; PL3061808T3; JP5458112B2; KR20120003855A; EP3441458B9; US8642339B2; EP3441458B1; EP2393917A2; CA2751332A1; US10947510B2; EP3441458A1; HRP20160791T1; ES2579909T3; HUE062459T2; MX379945B; IL214381A; HUE028647T2; JP2012516685A; HRP20230650T1

Abstract

La invención se refiere a un método para cultivar células madre epiteliales, fragmentos de, tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales, o células de adenoma, y cultivar las células o fragmentos en presencia de un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP), un factor de crecimiento mitogénico y un agonista de Wnt cuando se cultivan células madre epiteliales y fragmentos de tejido aislados. La invención se refiere a un medio de cultivo celular que comprende un inaltobidor de BMP, un factor de crecimiento mitogénico, y un agonista de Wnt, al uso de dicho medio de cultivo, y a organoides cripta-vellosidad, organoides gástricos y organoides pancreáticos que se forman en el medio de cultivo.

Description

MEDIO DE CULTIVO PARA CELULAS MADRE EPITELIALES Y ORGANOIDES QUE COMPRENDEN LAS CELULAS MADRE Campo de la Invención La invención se refiere a un medio de cultivo novedoso para cultivar células madre epiteliales, especialmente células madre epiteliales intestinales y colónicas, y para el cultivo de organoides que comprenden las células madre. La invención se refiere además a la progenie de células y a organoides que fueron cultivados usando un medio de cultivo de la invención, y al uso de la progenie en ensayos de toxicidad o en medicina regenerativa.

Antecedentes de la Invención El epitelio auto-renovante del intestino delgado se ordena en criptas y vellosidades (Gregorieff y Clevers, 2005. Genes Dev 19, 877-90) . Las células son nuevamente generadas en las criptas y se pierden por apoptosis en las puntas de los vellosidades, con un tiempo de transformación epitelial resultante de cinco días en el ratón. Se ha sabido por mucho tiempo que las células madre auto-renovantes residen cerca del fondo de la cripta y producen las células de amplificación de tránsito (TA) de rápida proliferación de diferenciarse hacia todos los linajes. El número estimado de células madre es de entre 4 y 6 por cripta (Bjerknes y Cheng, 1999. Gastroenterology 116, 7-14) . Tres tipos de células REF.: 222322 diferenciadas, enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas, se forman a partir de células TA y continúan su migración en bandas coherentes a lo largo del eje cripta-vellosidad . Cada vellosidad recibe células de varias criptas diferentes. El cuarto tipo principal de célula diferenciada, la célula de Paneth, reside en el fondo de la cripta.

Recientemente se identificó un gen, Lgr5, el cual es expresado específicamente en un quinto tipo de célula, células Columnares de Base de Cripta (CBC) en ciclos, que son células pequeñas que son intercaladas entre las células de Paneth (indicadas por flechas negras en la figura 8b) (Barker et al., 2007. Nature 449:1003-1007). Usando un ratón en el cual un cásete de recombinasa Cre inducible por GFP/tamoxifen se integró en el locus Lgr5, se demostró por rastreo de linaje que las células CBC Lgr5* constituyen células madre multipotentes que generan todos los tipos de células del epitelio incluso cuando son evaluadas 14 meses después de la inducción de Cre.

Se descubrió recientemente que también Lgr6 , aparte de Lgr5, pero no Lgr4, es un marcador único para células madre adultas . Aunque Lgr5 es expresado en células madre de cerebro, riñon, hígado, retina, estómago, intestino, páncreas, seno, folículo piloso, ovario, médula adrenal y piel, Lgr6 es expresado en células madre de cerebro, pulmón, seno, folículo piloso y piel.

Se cree generalmente que un contacto íntimo entre células madre epiteliales y fibroblastos subepiteliales se requiere para anclar y soportar las células madre epiteliales y para proporcionar la orientación correcta necesaria para generar una estructura tridimensional y adecuadamente polarizada.

Aunque se ha descrito una variedad de sistemas de cultivo para cultivar células madre epiteliales primarias, incluyendo células madre de epitelio intestinal (Bjerknes y Cheng. 2006. Methods Enzymol 419: 337-83), hasta la fecha no se ha establecido ningún sistema de cultivo a largo plazo que mantenga la pluripotencia de las células madre epiteliales. Además, no se conoce ningún sistema de cultivo que conserve la fisiología cripta-vellosidad básica de criptas que han sido aisladas de colon o intestino, o que conserve la fisiología básica de fragmentos pancreáticos aislados o fragmentos de tejido gástrico.

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona por lo tanto un método para cultivar células madre epiteliales, fragmentos de tejido epitelial aislados que comprenden las células madre epiteliales, o células de adenoma, el método comprende proporcionar una matriz extracelular, incubar una célula madre epitelial, un fragmento de tejido aislado que comprende las células madre epiteliales o una célula de adenoma con la matriz extracelular, cultivar la célula madre, fragmento de tejido aislado o célula de adenoma en presencia de un medio de cultivo de células, que comprende un medio basal para células animales o humanas al cual se le añade inaltobidor de Proteína Morfogenética de Hueso (BMP) , entre 5 y 500 ngramos/ml o al menos 5 y no más de 500 ngramos/ml de un factor de crecimiento mitogénico, con lo cual se añade un agonista de nt si células madre epiteliales y fragmentos de tejido aislados se cultivan.

Se encontró sorprendentemente por los presentes inventores que un método de la invención permite cultivar células madre epiteliales, fragmentos aislados del intestino delgado, colon, estómago y páncreas que comprende las células madre y células de adenoma, mientras se conserva la presencia de las células madre que retienen un fenotipo no diferenciado y capacidades de auto-mantenimiento. Por ejemplo, criptas aisladas que se cultivan de acuerdo con un método de la invención se desarrollan en organoides cripta-vellosidad, que comprenden un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad. El crecimiento de criptas aisladas fue alentado por células madre que están presentes en las criptas . Los organoides resultantes sufren varios eventos de fisión de cripta. Todavía más sorprendente fue la observación de que un método de la invención permite el crecimiento de células madre epiteliales individuales y aisladas para formar organoides cripta-vellosidad en ausencia de un nicho de células madre. Los fragmentos gástricos aislados de la región pilórica del estómago se comportaron como organoides de cripta intestinal. La parte superior abierta de la unidad estaba sellada y el lumen se llenó con células apoptóticas. Los organoides gástricos recién formados sufrieron eventos de brote continuos (reminiscentes de fisión glandular) mientras conservaban su polaridad con un lumen central. Además, cultivar fragmentos pancreáticos dio como resultado la aparición de estructuras tipo islotes pancreáticos que expresan insulina y otros marcadores específicos de islotes pancreáticos, simulando los islotes pancreáticos de Langerhans .

El epitelio que reviste la región pilórica del intestino delgado y grueso abarca salientes luminales, vellosidades e invaginaciones, criptas. Cada célula junto con el eje cripta-vellosidad es polarizada, con lo cual las células en la parte superior de los vellosidades intestinales, o en las posiciones superiores de criptas colónicas, son las más diferenciadas y se pierden continuamente en el lumen. La proliferación continua de células madre que residen en la base de las criptas, yla proliferación masiva de células progenitoras que residen en medio de las criptas, asegura un reemplazo adecuado de las células derramadas .

Las células madre se encuentran en muchos órganos de humanos y ratones adultos . Aunque puede haber una gran variación en las características exactas de las células madre adultas en tejidos individuales, las células madre adultas comparten las siguientes características: conservan un fenotipo no diferenciado; su progenie puede diferenciarse hacia todos los linajes presentes en el tejido pertinente; conservan capacidades de auto-mantenimiento a lo largo de su vida y son capaces de regenerar el tejido pertinente después de lesión. Las células madre residen en una ubicación especializada, el nicho de células madre, que suministra los contactos y señales entre células adecuados para el mantenimiento de la población de células madre.

Las células madre epiteliales son capaces de formar los distintos tipos de células de las cuales está compuesto el epitelio. Algunos epitelios, tales como la piel o intestino, muestran una rápida transformación celular, indicando que las células madre residentes deben estar proliferando continuamente. Otros epitelios, tales como el hígado o páncreas, muestran una transformación muy lenta bajo condiciones normales.

Las criptas pueden ser aisladas del duodeno, intestino grueso y delgado, incluyendo yeyuno, íleon y colon, y la región pilórica del estómago por protocolos que se conocen por las personas capacitadas. Por ejemplo, las criptas pueden ser aisladas por incubación de tejido aislado con agentes quelantes que liberen células de sus interacciones dependientes de calcio y magnesio con la membrana de basamento y tipos de células estromales. Después de lavar el tejido, la capa de células epiteliales es raspada de la submucosa con un portaobjetos de vidrio y picada. Esto es seguido por incubación en tripsina o, más preferido, EDTA y/o EGTA y separación de fragmentos tisulares no digeridos y células individuales de criptas usando, por ejemplo, etapas de filtración y/o centrifugación. Otras enzimas proteolíticas , tales como colagenasa y/o dispasa I, se pueden usar en lugar de tripsina. Se usan métodos similares para aislar fragmentos del páncreas y estómago.

Los métodos para aislar células madre de tejido epitelial se conocen en la técnica. Un método preferido se basa en el hecho de que las células madre expresan Lgr5 y/o Lgr6 en su superficie, que pertenecen a la gran superfamilia de receptor acoplado a proteínas G (GPCR) . La subfamilia Lgr es única al portar un ectodominio rico en leucina grande importante para la unión a ligando. Los ligandos para Lgr5 y Lgr6 aún no se describen en la literatura. Un método preferido por lo tanto comprende preparar una suspensión celular a partir de tejido epitelial, poner en contacto la suspensión celular con un compuesto de unión a Lgr5 y/o 6, aislar el compuesto de unión a Lgr5 y/o 6, y aislar las células madre del compuesto de unión. Se prefiere que una sola suspensión celular que comprenda las células madre epiteliales se genere mecánicamente a partir de las criptas aisladas ya que se encontró que en esta etapa células madre epiteliales tratadas con tripsina produjeron índices de supervivencia bastante bajos.

Los compuestos de unión a Lgr5 y/o 6 que se prefieren comprenden anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente y se unen al dominio extracelular ya sea de Lgr5 o Lgr6, tales como anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales de ratón y rata. Usando este anticuerpo, células madre de expresión de Lgr5 y/o Lgr6 pueden ser aisladas, por ejemplo con la ayuda de esferas magnéticas o a través de clasificación celular activada por fluorescencia, como es claro para una persona capacitada.

En un método preferido de la invención, las células madre epiteliales son aisladas de las criptas, fragmentos gástricos o fragmentos pancreáticos. Por ejemplo, las células madre epiteliales son aisladas de criptas que se aislan del intestino. Las células madre epiteliales que se prefieren son aisladas del intestino delgado, incluyendo duodeno, yeyuno e íleon, páncreas o estómago.

Las células madre aisladas son cultivadas de preferencia en un microambiente que imita al menos en parte un nicho celular en el cual las células madre residen naturalmente. Este nicho celular es imitado al cultivar las células madre en presencia de biomateriales, tales como matrices, soportes y substratos de cultivo que representan señales reguladoras clave que controlan el destino de las células madre. Estos biomateriales comprenden biomateriales naturales, semi-sintéticos y sintéticos, y/o mezclas de los mismos. Un soporte proporciona una red bidimensional o tridimensional. Los materiales sintéticos adecuados para el soporte comprenden polímeros seleccionados de sólidos porosos, nanofibras e altodrogeles tales como, por ejemplo, péptidos incluyendo péptidos de auto-ensamble, altodrogeles compuestos de fosfato de polietilenglicol , fumarato de polietilenglicol, poliacrilamida, metacrilato de polialtodroxietilo, acetato de policelulosa y/o copolímeros de los mismos (véase, por ejemplo, Saha et al., 2007. Curr Opin Chem Biol. 11(4): 381-387; Saha et al., 2008. Biophysical Journal 95: 4426-4438; Little et al., 2008. Chem. Rev 108, 1787-1796). Como se conoce por una persona capacitada, las propiedades mecánicas tales como, por ejemplo, la elasticidad del soporte, influencian la proliferación, diferenciación y migración de células madre. Un soporte que se prefiere comprende copolímeros biodegradables que son reemplazados por componentes de origen natural después de su transplante en un sujeto, por ejemplo para promover la regeneración tisular y/o sanación de heridas. Se prefiere además que este soporte no induzca sustancialmente una respuesta inmunogénica después de su transplante a un sujeto. Este soporte se complementa con ligandos naturales, semi-sintéticos o sintéticos, los cuales proporcionan las señales que se requieren para proliferación y/o diferenciación, y/o migración de células madre. En una modalidad preferida, los ligandos comprenden fragmentos de aminoácido definidos. Ejemplos de estos polímeros sintéticos comprenden agente tensioactivo de copolímero de bloques Pluronic18 F127 (BASF) y Etaltosorb* (Johnson and Johnson) .

Un nicho celular es en parte determinado por las células madre y células circundantes, y la matriz extracelular (ECM) que se produce por las células en el nicho. En un método preferido de la invención, criptas aisladas o células madre epiteliales son fijadas a una ECM. La ECM está compuesta de una variedad de polisacáridos , agua, elastina y glicoproteínas , en donde las glicoproteínas comprenden colágeno, entactina (nidógeno) , fibronectina y laminina. La ECM es secretada por células de tejido conectivo. Se conocen diferentes tipos de ECM, que comprenden diferentes composiciones incluyendo diferentes tipos de glicoproteínas y/o diferentes combinaciones de glicoproteínas. Estas ECM pueden ser provistas al cultivar células productoras de ECM, tales como por ejemplo células de fibroblasto, en un receptáculo, antes de la remoción de las células y la adición de criptas o células madre epiteliales aisladas. Ejemplos de células productoras de matriz extracelular son condrocitos, que producen principalmente colágeno y proteoglucanos , células de fibroblasto, que producen principalmente colágeno tipo IV, laminina, procolágenos intersticiales y fibronectina, así como miofibroblastos colónicos que producen principalmente colágenos (tipo I, III y V), proteoglucano de sulfato de condroitina, ácido altoalurónico, fibronectina y tenascina-C. Como alternativa, esta ECM se proporciona comercialmente . Ejemplos de matrices extracelulares disponibles comercialmente son proteínas de matriz extracelular (Invitrogen) y Matrígel™ (BD Biosciences) . El uso de una ECM para cultivar células madre incrementó la supervivencia a largo plazo de las células madre y la presencia continua de células madre no diferenciadas. En ausencia de una ECM, cultivos de células madre no pudieron ser cultivados durante periodos más largos y ninguna presencia continua de células madre no diferenciadas fue observada. Además, la presencia de una ECM permitió el cultivo de organoides de tejido tridimensionales, los cuales no podrían haber sido cultivados en ausencia de una ECM.

Una ECM que se prefiere usar en un método de la invención comprende al menos dos glicoproteínas distintas, tales como dos tipos diferentes de colágeno o un colágeno y laminina. Las ECM pueden ser una matriz extracelular de altodrogel sintético o una ECM de origen natural. Una ECM que más se prefiere se proporciona por Matrigel™ (BD Biosciences) , que comprende laminina, entactina y colágeno IV.

Un medio de cultivo de células que se usa en un método de la invención comprende cualquier medio de cultivo de células. Un medio de cultivo de células que se prefiere es un medio sintético definido que se regula a un pH de 7.4 (de preferencia entre 7.2 y 7.6 o al menos 7.2 y no más de 7.6) con un regulador de pH a base de carbonato, mientras que las células se cultivan en una atmósfera que comprende entre 5% y 10% de C02 , o al menos 5% y no más de 10% de C02 , de preferencia 5% de C02. Un medio de cultivo de células que se prefiere se selecciona de DMEM/F12 y RPMI 1640 suplementado con glutamina, insulina, penicilina/estreptomicina y transíerrina . En una modalidad más preferida se usa Advanced DMEM/F12 o Advanced RPMI, el cual se optimiza para cultivo libre de suero y ya incluye insulina. En este caso, el medio Advanced DMEM/F12 o Advanced RPMI se complementa de preferencia con glutamina y penicilina/estreptomicina . Se prefiere además que el medio de cultivo de células se complemente con un factor de crecimiento semisintético y/o sintético purificado y natural y no comprenda un componente no definido tal como suero bovino fetal o suero de becerro fetal. Los suplementos tales como, por ejemplo, B27 (Invitrogen) , N-acetilcisteína (Sigma) y N2 (Invitrogen) estimulan la proliferación de algunas células y pueden además ser añadidos al medio, si se requiere.

Un componente que se añade al medio de cultivo basal es un inaltobidor de BMP. Las BMPs se unen como un ligando dimérico a un complejo de receptores que consiste en dos serina/treonina cinasas receptoras diferentes, receptores tipo I y tipo II. El receptor tipo II fosforila al receptor tipo I, dando como resultado la activación de esta cinasa receptora. El receptor tipo I posteriormente fosforila substratos receptores específicos (SMAD) ; dando como resultado una vía de transducción de señales que lleva a actividad de transcripción.

El inaltobidor de BMP se define como un agente que se une a una molécula de BMP para formar un complejo en donde la actividad BMP se neutraliza, por ejemplo al prevenir o inaltobir la unión de la molécula de BMP a un receptor de BMP. Como alternativa, el inaltobidor es un agente que actúa como un antagonista o agonista inverso. Este tipo de inaltobidor se une a un receptor de BMP e impide la unión de una BMP al receptor. Un ejemplo de este último agente es un anticuerpo que se une a un receptor de BMP y evita la unión del BMP al receptor unido a anticuerpo.

El inaltobidor de BMP inaltobe una actividad dependiente de BMP en una célula hasta cuando mucho 90%, muy preferiblemente cuando mucho 80%, más preferiblemente cuando mucho 70%, muy preferiblemente cuando mucho 50%, más preferiblemente cuando mucho 30%, muy preferiblemente cuando mucho 10%, más preferiblemente 0%, en relación a un nivel de una actividad BMP en ausencia del inaltobidor. Como se conoce por una persona capacitada, una actividad de BMP puede determinarse al medir la actividad transcripcional de BMP, por ejemplo como se ejemplifica en Zilberberg et al., 2007. BMC Cell Biol. 8:41.

Se conocen varias clases de proteínas de unión a BMP naturales, incluyendo Noggin (Peprotech) , Cordina y proteínas tipo cordina (R&D sytems) que comprenden dominios de cordina, folistatina y proteínas relacionadas con folistatina (R&D sytems) que comprenden un dominio de folistatina, DAN y proteínas tipo DAN (R&D sytems) que comprenden un dominio de nudo de cisteína DAN, esclerosina/SOST (R&D sytems) , decorina (R&D sytems) y alfa-2 macroglobulina (R&D sytems) .

Un inaltobidor de BMP que se prefiere usar en un método de la invención se selecciona de Noggin, DAN y proteínas tipo DAN incluyendo Cerberus and Gremlin (R&D sytems) . Estas proteínas difusibles son capaces de unirse a un ligando BMP con grados variables de afinidad e inaltobir su acceso a receptores de señalización. La adición de cualquiera de estos inaltobidores de BMP al medio de cultivo basal impide la pérdida de células madre, que de otra manera ocurre después de aproximadamente 2-3 semanas de cultivo.

Un inaltobidor de BMP que se prefiere más es Noggin. Noggin se añade de preferencia al medio de cultivo basal a una concentración de al menos 10 ng/ml, preferiblemente al menos 20 ng/ml, muy preferiblemente al menos 50 ng/ml, más preferiblemente al menos 100 ng/ml. Una concentración que se prefiere más es de aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml. Durante el cultivo de células madre, el inaltobidor de BMP se añade de preferencia al medio de cultivo cada segundo día, mientras que el medio de cultivo se refresca de preferencia cada cuarto día.

Un componente más que se añade al medio de cultivo basal es un agonista nt. La vía de señalización de Wnt se define por una serie de eventos que ocurre cuando una proteína Wnt se une a un receptor de superficie celular de un miembro de la familia del receptor Frizzled. Esto se traduce en la activación de las proteínas de la familia Dishevelled que inaltobe un complejo de proteínas que incluye axina, GSK-3, y la proteína APC para degradar ß-catenina intracelular . La ß-catenina nuclear enriquecida resultante incrementa la transcripción por los factores de transcripción de la familia TCF/LEF.

Un agonista de Wnt se define como un agente que activa transcripción mediada por TCF/LEF en una célula. Los agonistas de Wnt se seleccionan por lo tanto de verdaderos agonistas de Wnt que se unen y activan un miembro de la familia del receptor Frizzled incluyendo cualquiera y todas las proteínas de la familia Wnt, un inaltobidor de degradación de ß-catenina intracelular y activadores de TCF/LEF. El agonista de Wnt estimula una actividad Wnt en una célula por al menos 10%, muy preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, muy preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, muy preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 100%, en relación con un nivel de la actividad Wnt en ausencia de la molécula. Como se conoce por una persona capacitada, una actividad Wnt puede determinarse al medir la actividad transcripcional de Wnt, por ejemplo por construcciones de reporteros de Tcf luciferasa pTOPFLASH y pFOPFLASH (Korinek et al., 1997. Science 275:1784-1787).

Un agonista de Wnt comprende una glicoproteína secretada que incluye Wnt-l/Int-1; Wnt-2/Irp (proteína relacionada con Int-1) ; Wnt-2b/13; Wnt-3/Int-4 ; Wnt-3a (R&D sytems) ; Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6 (Kirikosalto H et al. 2001. Biochem Biophys Res Com 283: 798-805); Wnt-7a (R&D sytems); Wnt-7b; Wnt-8a/8d; Wnt-8b; Wnt-9a/14; Wnt- 9b/14b/15 ; Wnt-lOa; Wnt-10b/12; Wnt-11; y Wnt-16. Una perspectiva general de las proteínas Wnt humanas se proporciona en "THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS" , R/D Systems Catalog, 2004. Agonistas de Wnt adicionales incluyen la familia R-spondin de proteínas secretadas, que está implicada en la activación y regulación de la vía de señalización de Wnt y que comprende de 4 miembros (R-spondin l (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA) , R-spondin 2 ( (R&D sytems) , R-spondin 3, y R-spondin-4) ; y Norrin (también llamada Proteína de Enfermedad de Norrie o NDP) (R&D sytems) , que es una proteína reguladora secretada que funciona como una proteína Wnt ya que se une con alta afinidad al receptor Frizzled-4 e induce la activación de la vía de señalización de Wnt (Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol. 8:12) . Un agonista de molécula pequeña de la vía de señalización de Wnt, un derivado de aminopirimidina, se identificó recientemente y también se incluye expresamente como un agonista de Wnt (Liu et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44, 1987-90) .

Los inaltobidores de GSK conocidos comprenden moléculas de ARN de interferencia pequeñas (siRNA; Cell Signaling) , litio (Sigma) , kenpaulona (Biomol International; Leost, M. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 5983-5994), 6-bromoindirrubina-30-acetoxima (Meijer. L. et al. (2003) Chem. Biol..10, 1255-1266), SB 216763 y SB 415286 (Sigma-Aldrich) , y miembros de la familia FRAT y péptidos derivados de FRAT que impiden la interacción de GSK-3 con axina. Una perspectiva general se proporciona por Meijer et al., (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471-480, que se incorpora en la presente a manera de referencia. Métodos y ensayos para determinar un nivel de inaltobición de GSK-3 se conocen por una persona capacitada y comprende, por ejemplo, los métodos y ensayo como los descritos en Liao et al 2004, Endocrinology, 145(6): 2941-9).

En una modalidad preferida, el agonista de Wnt se selecciona de uno o más de un miembro de la familia Wnt, R-spondin 1-4, Norrin y un inaltobidor de GSK. Se encontró por los inventores que la adición de al menos uno de los agonistas de Wnt al medio de cultivo basal es esencial para la proliferación de células madre epiteliales o criptas aisladas.

En una modalidad preferida más, el agonista de Wnt comprende o consiste en R-spondin 1. R-spondin 1 se añade de preferencia al medio de cultivo basal a una concentración de al menos 50 ng/ml, muy preferiblemente al menos 100 ng/ml, más preferiblemente al menos 200 ng/ml, muy preferiblemente al menos 300 ng/ml, más preferiblemente al menos 500 ng/ml. Una concentración que se prefiere más de R-spondin 1 es aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml. Durante el cultivo de células madre, el miembro de la familia Wnt se añade de preferencia al medio de cultivo cada segundo día, mientras I que el medio de cultivo se refresca de preferencia cada cuarto día.

En una modalidad preferida, un agonista de Wnt se selecciona del grupo que consiste en: -spondin, nt-3a y Wnt-6. Muy preferiblemente, R-spondin y Wnt-3a se usan ambos como agonista de Wnt. Esta combinación se prefiere particularmente toda vez que esta combinación tiene sorprendentemente un efecto sinérgico en la formación de organoides. Las concentraciones preferidas son aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml para R-spondin y aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml para Wnt3a.

Un componente adicional que se agrega al medio de cultivo basal es un factor de crecimiento mitogénico seleccionado de una familia de factores de crecimiento que comprenden Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF; (Peprotech) . Factor de Crecimiento de Transformación Alfa (TGF-alfa; Peprotech) , Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico (bFGF; Peprotech) , Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF; R&D Sytems) , y Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF; Peprotech) . EGF es un potente factor mitogénico para una variedad de células ectodérmicas y mesodérmicas cultivadas y tiene un profundo efecto en la diferenciación de células específicas in vivo e in vitro y de algunos fibroblastos en cultivo celular. El precursor de EGF existe como una molécula unida a membrana que es cortada proteolíticamente para generar la hormona péptida de 53 aminoácidos que estimula células. Un . factor de crecimiento mitogénico que se prefiere es EGF. EGF se añade de preferencia al medio de cultivo basal a una concentración de entre 5 y 500 ng/ml o de al menos 5 y no más de 500 ng/ml. Una concentración que se prefiere es al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45 ó 50 ng/ml y no más de 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 ó 100 ng/ml. Una concentración que se prefiere más es al menos 50 y no más de 100 ng/ml. Una concentración que se prefiere todavía más es alrededor de 50 ng/ml o 50 ng/ml. Pueden usarse las mismas concentraciones para un FGF, de preferencia para FGF10 o FGF7. Si se usa más de un FGF, por ejemplo FGF7 y FGF10, la concentración de un FGF es como la definida arriba y se refiere a la concentración total de FGF usada. Durante el cultivo de células madre, el factor de crecimiento mitogénico se añade de preferencia al medio de cultivo cada segundo día, mientras que el medio de cultivo se renueva de preferencia cada cuarto día. Puede usarse cualquier miembro de la familia bFGF. De preferencia, se usa GFG7 y/o FGF10. FGF7 también se conoce como KGF (Factor de Crecimiento de Queratinocitos) . En una modalidad preferida más, una combinación de factores de crecimiento mitogénicos tales como, por ejemplo, EGF y KGF o EGF y BDNF, se añade al medio de cultivo basal. En una modalidad que se prefiere más, una combinación de factores de crecimiento mitogénicos tales como, por ejemplo, EGF y KGF, o EGF y FGF10, se añade al medio de cultivo basal.

Una modalidad adicional de un método de acuerdo con la invención comprende un medio de cultivo que comprende un inaltobidor de Rock (Rho-cinasa) . Se encontró que la adición de un inaltobidor de Rock previene anoikis, especialmente cuando se cultivan células madre individuales . El inaltobidor de Rock se selecciona de preferencia de dicloraltodrato de (R) - (+) -trans-4- (1-aminoetil) -N- (4-piridil) ciclohexancarboxamida monoaltodratado (Y-27632; Sigma-Aldrich) , 5- (1, 4-diazepan-l-ilsulfonil) isoquinolina (fasudil o HA1077; Cayman Chemical), y dicloraltodrato de (S) - ( +) -2-metil-l- [ (4-metil-5-isoquinolinil) sulfonil] -hexaaltodro-lH-1 , 4 -diazepina (H-1152; Tocris Bioscaltoence) . El inaltobidor de Rho-cinasa, por ejemplo Y-27632, se añade de preferencia al medio de cultivo cada segundo día durante los primeros siete días de cultivo de las células madre. Una concentración preferida para Y27632 es 10 µ?.

En una modalidad preferida más, un método de acuerdo con la invención comprende un medio de cultivo que comprende además un agonista de Notch. La señalización de Notch ha demostrado jugar un papel importante en la determinación del destino celular, así como en supervivencia y proliferación celular. Las proteínas receptoras Notch pueden interactuar con un número de ligandos unidos a superficie o secretados, incluyendo pero no limitados a Delta 1, Jagged 1 y 2 y tipo Delta 1, tipo Delta 3, tipo Delta 4. Después de la unión a ligando, los receptores Notch son activados por varios efectos de corte e incluyen miembros de la familia de proteasas ADAM, así como un corte intramembranoso regulado por la gamma secretasa presinilina. El resultado es una translocación del dominio intracelular del Notch al núcleo en donde activa transcripcionalmente genes hacia el extremo 3'. Un agonista de Notch que se prefiere se selecciona de Jagged 1 y Delta 1, o un fragmento activo o derivado de los mismos. Un agonista de Notch que se prefiere más es péptido DSL (Dontu et al., 2004, Breast Cáncer Res 6: R605-R615) , con la secuencia CDDYYYGFGCNKFCRPR . El péptido DSL (ANA spec) se usa de preferencia a una concentración de entre 10 µ? y 100 nM o al menos 10 µ? y no más de 100 nM. La adición de una muestra de Notch, especialmente durante la primera semana de cultivo, incrementa la eficiencia del cultivo por un factor de 2-3. El agonista de Notch se añade de preferencia al medio de cultivo cada segundo día durante los primeros siete días del cultivo de las células madre.

Un agonista de Notch se define como una molécula que estimula una actividad Notch en una célula en al menos 10%, muy preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, muy preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, muy preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 100%, en relación con un nivel de una actividad de Notch en ausencia de la molécula. Como se conoce por una persona capacitada, una actividad de Notch puede determinarse al medir la actividad transcripcional de Notch, por ejemplo por una construcción reportera 4xwtCBFl-luciferasa como la descrita (Hsieh et al., 1996. Mol. Cell. Biol . 16. 952-959).

La invención proporciona además un medio de cultivo de células, que comprende un medio basal para células animales o humanas a las cuales se añade un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP) , un agonista de Wnt y entre 5 y 500 nanogramos/ml o al menos 5 y no más de 500 nanogramos/ml de un factor de crecimiento mitogénico seleccionado del grupo que consiste en EGF, TGFa , KGF, FGF10 y un FGF. De preferencia, un factor mitogénico se selecciona de los grupos que consisten en EGF, TGF-a y KGF o de EGF, TGF-a y FGF7 o de EGF, TGF-a y EGF o de EGF y KGF o de EGF y FGF7 o de EGF y un FGF o de TGFa y KGF o de TGF y FGF7 o de TGFa y un FGF. EGF puede ser reemplazado por TGFa. Varios medios de cultivo preferidos se identifican más adelante dependiendo del organoide que será obtenido . Un medio de cultivo de células de acuerdo con la invención permite la supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de células madre epiteliales o criptas aisladas en una matriz extracelular. El término medio de cultivo de células es sinónimo de medio, medio de cultivo o medio celular.

En un método preferido de acuerdo con la invención, un primer medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP, tanto Factor de Crecimiento Epidérmico como Factor de Crecimiento de Queratinocitos como factores de crecimiento mitogénicos y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína . KGF podría ser reemplazado por un FGF, o por FGF10. [Leul5] -gastrina I, exendin y/o nicotinamida pueden también añadirse a este primer medio.

En otra modalidad preferida, el medio de cultivo, llamado un segundo medio de cultivo es idéntico al primer medio excepto que no hay Noggin y de preferencia ninguna [Leul5] -gastrina 1, exendin y/o nicotinamida. Este segundo medio de cultivo comprende por lo tanto, tanto Factor de Crecimiento Epidérmico como Factor de Crecimiento de Queratinocitos como factores de crecimiento mitogénicos y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína. KGF también puede ser reemplazado por un FGF, o por FGF10. Estos dos medios de cultivo de células soportan fragmentos pancreáticos que comprenden células madre pancreáticas que se cultivan en estos medios en una matriz extracelular Matrigel para formar organoides pancreáticos que comprenden estructuras tipo islotes pancreáticos sobre una matriz extracelular. El segundo medio sin Noggin es un medio mínimo mientras que el primero con Noggin lleva a un medio mejorado para expandir fragmentos pancreáticos. Un medio de expansión es el medio que de preferencia promueve la supervivencia y/o proliferación de células durante al menos dos días de cultivo .

Se ha diseñado un tercer medio que es capaz de promover, inducir la diferenciación de células hacia un organoide pancreático dentro de al menos 5 días . Un marcador de diferenciación que se prefiere hacia la formación de un organoide pancreático es neurogenina-3 cuya expresión podría ser detectada por RT-PCR o por inmunoaltostoquímica . Un medio de diferenciación como por ejemplo un tercero o cuarto medio se dice que es funcional cuando neurogenina-3 pudo ser detectada por RT-PCR o por inmunoaltostoquímica después de al menos cinco días de cultivo en el medio. Esta etapa de diferenciación se lleva a cabo de preferencia después de una primera etapa de expansión en un medio como el primero o segundo medio como se definió arriba. Este tercer medio es idéntico al segundo medio identificado arriba excepto que no hay FGF o KGF o FGF10. Este tercer medio comprende factor de crecimiento epidérmico y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína .

Se ha diseñado un cuarto medio que es idéntico al primer medio en donde el cuarto medio también se complementa con [Leul5] -gastrina 1 y/o exendin. Este tercer medio es un medio de diferenciación mínimo, mientras que el cuarto medio es un medio de diferenciación mejorado. Un medio de diferenciación es un medio que induce o promueve de preferencia una diferenciación especifica de células durante al menos cinco días de cultivo. En el caso de organoides pancreáticos, la diferenciación puede medirse al detectar la presencia de un marcador específico asociado con el linaje pancreático como se definió anteriormente en la presente. Ejemplos de otros marcadores asociados con el linaje pancreático incluyen: la secreción de insulina que es detectable por RTPCR o inmunoaltostoquímica después de al menos 7, 8, 9, 10 días de cultivo en un medio de diferenciación .

Por lo tanto, en un método preferido para obtener y/o cultivar un organoide pancreático, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en una primera etapa ya sea en el primero o segundo medio, posteriormente en una segunda etapa ya sea en el tercero o cuarto medio. La primera etapa puede tener una duración de al menos dos semanas y puede ser más larga. Una primera etapa se puede llevar a cabo durante más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más de 10 meses. La segunda etapa puede tener una duración de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 días o más. Cada etapa se lleva a cabo de preferencia usando una matriz extracelular como la definida en la presente. Las concentraciones preferidas de cada compuesto presentes en cada medio ya han sido definidas en la presente en la descripción o en los ejemplos. En una modalidad preferida, si se va a usar un organoide pancreático para medicina regenerativa, se empieza a partir de células epiteliales o a partir de un fragmento pancreático aislado. En otra modalidad preferida, si se va a usar un organoide pancreático como un sistema de descubrimiento de fármacos, se empieza a partir de adenoma. En consecuencia, un organoide pancreático que puede obtenerse mediante un método de la invención es un aspecto más de la invención. En consecuencia, en un aspecto más, la invención proporciona un primero, segundo, tercero, cuarto medio como los definidos en la presente.

Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que un se ha obtenido un organoide pancreático que es funcional y está vivo después de al menos diez meses de cultivo (véase parte experimental) . La funcionalidad se caracteriza de preferencia por la secreción de insulina. Ya que la cantidad final de organoides de páncreas obtenida se correlaciona con la duración del cultivo, la persona capacitada entiende que la invención es una invención pionera y abre potencialmente nuevas posibilidades por ejemplo en medicina regenerativa.

En consecuencia, en un método preferido para obtener y/o cultivar un organoide pancreático, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en contacto con una matriz extracelular en una primera etapa en un medio que comprende EGF, KGF o FGF y R-spondin 1 como un agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína, posteriormente en una segunda etapa en un medio que comprende EGF y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2, y N-acetilcisteina.

En un método preferido adicional de acuerdo con la invención, se usa un medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 y/o Wnt3a como agonista de Wnt. Este medio de cultivo de células soporta el cultivo de criptas de intestino delgado aisladas en cultivos tridimensionales que comprenden Matrigel como matriz extracelular .

En un método preferido más de acuerdo con la invención, un medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 como agonista de Wnt, Jagged-péptido DSL como agonista de Notch y el inaltobidor de Rho cinasa Y-27632. Este medio de cultivo de células soporta el cultivo de células madre epiteliales individuales aisladas en cultivos tridimensionales que comprenden Matrigel como matriz extracelular.

En un método que se prefiere todavía más de acuerdo con la invención, un medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico y/o BDNF como factores de crecimiento mitogénicos, R-spondin 1 y/o Wnt-3a como agonistas de Wnt, complementado con por lo menos uno de B27, N2 y N-acetilcisteína . Wnt-3a es un agonista de Wnt que se prefiere en este método preferido. Este medio de cultivo de células soporta el cultivo de criptas de colon aisladas en cultivos tridimensionales que comprenden Matrigel como matriz extracelular . Este medio es capaz de promover supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de células durante al menos dos días de cultivo. Un marcador de diferenciación preferido hacia la formación de una cripta colónica puede seleccionarse del siguiente grupo: fosfatasa alcalina que indica la presencia de enterocitos, Muc2 que indica la presencia de células caliciformes y Neurogenic 3 o Chromogranin que indican la presencia de células endocrinas. La expresión de cada uno de estos marcadores podría detectarse por RTPCR o por inmunoaltostoquímica . Un medio funcional para promover supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de células para obtener una cripta de colon es tal que al menos uno de los marcadores identificados podría ser detectado después de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, .10 días de cultivo o más. Un medio que se prefiere comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico como factor de crecimiento mitogénico y R-spondin 1 y/o Wnt-3a como agonistas de Wnt, complementado con al menos uno de B27, N2 y N-acetilcisteína. Este medio es llamado el quinto medio de la invención que representa un aspecto más de la invención.

Por lo tanto en un método preferido para obtener y/o cultivar una cripta colónica, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en un medio como el identificado arriba, de preferencia en el quinto medio. Este medio se lleva a cabo de preferencia usando una matriz extracelular como la definida en la presente. Las concentraciones preferidas de cada compuesto presente en el medio ya han sido definidas en la presente en la descripción o en los ejemplos. En consecuencia, una cripta colónica obtenible por un método de la invención es un aspecto más de la invención. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que una cripta colónica había sido obtenida la cual es funcional y está viva después de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses de cultivo (véase parte experimental) . La funcionalidad se caracteriza de preferencia por la presencia de al menos uno de los marcadores como los identificados arriba. La invención es una invención pionera y abre potencialmente nuevas posibilidades por ejemplo en medicina regenerativa.

En consecuencia, en un método preferido para obtener y/o cultivar una cripta colónica, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en contacto con una matriz extracelular en un medio que comprende Noggin, EGF y R-spondin 1 y/o Wnt-3 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína .

En un método preferido adicional de acuerdo con la invención, un medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado ya sea con Wnt-3a o KGF, y comprende además B27, N2, N-acetilcisteína. Este medio es llamado el sexto medio y representa en consecuencia un aspecto más de la invención. KGF puede ser reemplazado por un FGF o por un FGF10. Este medio comprende de preferencia Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico y FGF10 como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, y comprende además B27, N2 , N-acetilcisteína. FGF10 se prefiere como un FGF toda vez que da mejores resultados que por ejemplo FGF7 (figura 32) . Este medio de cultivo de células soporta el cultivo de fragmentos gástricos aislados u organoides gástricos en cultivos tridimensionales que comprenden Matrigel como matriz extracelular.

Este sexto medio es un medio para expandir un fragmento gástrico. Un medio de expansión es un medio que promueve de preferencia supervivencia y/o proliferación de células durante al menos dos días de cultivo. Un medio adicional, es decir, un séptimo medio ha sido diseñado que es capaz de promover, inducir la diferenciación de células hacia un organoide gástrico o fragmento gástrico dentro de al menos dos días . Este séptimo medio es idéntico al sexto medio identificado arriba excepto que la concentración de Wnt-3a se reduce en comparación con la que está presente en el sexto medio. La concentración se reduce en al menos 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600% o más en comparación con la concentración de Wnt-3a presente en el sexto medio. Este séptimo medio comprende Factor de Crecimiento Epidérmico y R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, Noggin y FGF10 complementado con B27, N2 , N-acetilcisteína y Gastrina. Gastrina se usa de preferencia a una concentración de 1 nM.

El séptimo medio es un medio de diferenciación. Un medio de diferenciación es un medio que de preferencia induce o promueve una diferenciación específica de células durante al menos dos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días de cultivo o más. En el caso de un organoide gástrico o fragmento gástrico, la diferenciación puede medirse al detectar la presencia de un marcador específico asociado con el linaje gástrico. Ejemplos de marcadores asociados con el linaje gástrico incluye: MUC5AC (un marcador tipo célula de. cavidad), GASTRINA y/o SOMATOSTATINA (ambos marcadores de células endocrinas) . La presencia de por lo menos uno de estos marcadores se lleva a cabo de preferencia usando RT-PCR y/o inmunoaltostoquímica y/o inmunofluorescencia. La presencia de al menos uno de estos marcadores se detecta preferiblemente después de al menos 6 días en las condiciones de diferenciación, muy preferiblemente al menos 10 días. Un medio de diferenciación como por ejemplo un séptimo medio se dice que es funcional cuando al menos uno de los marcadores identificados arriba puede ser detectado por RT-PCR o por inmunoaltostoquímica después de al menos 6 días de cultivo en el medio. Esta etapa de diferenciación se lleva a cabo de preferencia después de una primera etapa de expansión en un medio como el sexto medio definido arriba.

Por lo tanto, en un método preferido para obtener y/o cultivar un fragmento gástrico, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en una primera etapa ya sea en el sexto medio, posteriormente en una segunda etapa ya sea en el séptimo medio. Cada etapa se lleva a cabo de preferencia usando una matriz extracelular como la definida en la presente. La primera etapa puede tener una duración de al menos 3 días o puede durar más. Una primera etapa se puede llevar a cabo durante más de 3 , 4 , 5 , 6, 7, 8, 9 o más. La segunda etapa puede tener una duración de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 días o más. Las concentraciones preferidas de cada compuesto presente en cada medio ya han sido definidas en la presente en la descripción o en los ejemplos. En consecuencia, un fragmento gástrico que puede obtenerse mediante un método de la invención es un aspecto más de la invención.

En consecuencia, en un método preferido para obtener y/o cultivar un fragmento gástrico, células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenomas se cultivan en contacto con una matriz extracelular en una primera etapa en un medio que comprende Noggin como inaltobidor de BMP, Factor de Crecimiento Epidérmico y FGF10 como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, y que comprende además B27, N2, N-acetilcisteína, posteriormente en una segunda etapa en un medio que comprende factor de crecimiento epidérmico y R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, Noggin y FGF10 complementado con B27, N2 y N-acetilcisteína, en donde la concentración de Wnt-3 se reduce en la segunda etapa en comparación con la concentración de Wnt-3a presente en la primera etapa.

En un método preferido adicional de acuerdo con la invención, un medio de cultivo comprende Noggin como inaltobidor de BMP y Factor de Crecimiento Epidérmico como factor de crecimiento mitogénico. Este medio de cultivo de células soporta el cultivo de fragmentos de adenoma asilados o células de adenoma individuales aisladas en cultivos tridimensionales que comprenden Matrigel como matriz extracelular .

Un ligando, tal como por ejemplo nt3a, puede añadirse frescamente a un medio de cultivo. Como alternativa, un ligando se expresa en una línea celular al transfectar o infectar una línea de células con una construcción de expresión adecuada que i exprese al ligando. Esta línea de células se cultiva y el medio de cultivo que comprende el ligando secretado se cosecha en intervalos de tiempo adecuados. Por ejemplo, las células producirán Wnt3a tan pronto como alcancen confluencia y dejen de crecer. Medio de cultivo de células que no fueron transíectadas o infectadas con la construcción de expresión se usan como un control. El medio acondicionado se cosecha y prueba, por ejemplo en un ensayo en el que expresión de luciferasa es controlada por elementos que responden a TCF para probar la presencia de un agonista de Wnt tal como Wnt3a (Korinek et al., 1997, Science 275:1784-1787). El medio se diluye cuando se usa en los cultivos para regenerar tejido. Como se conoce por la persona capacitada, la adición de un exceso de ligando algunas veces es tan dañina para el cultivo como lo es la adición de muy poco ligando. Por lo tanto, la dilución real del medio acondicionado dependerá de la cantidad de ligando que se determine en la prueba.

La invención proporciona además el uso de un medio de cultivo de acuerdo con la invención para cultivar células madre epiteliales o estructuras organoides aisladas que comprenden estas células madre en una matriz extracelular, con lo cual las células madre de preferencia no comprenden células madre embrionarias humanas. Se prefieren las células madre adultas humanas. Además, células madre epiteliales clasificadas individuales del intestino delgado, colon y estómago también son capaces de iniciar estos organoides tridimensionales en un medio de cultivo de acuerdo con la invención. La invención proporciona además el uso de un medio de cultivo de acuerdo con la invención para cultivar fragméntos pancreáticos que comprenden células madre que forman organoides pancreáticos que comprenden estructuras tipo islotes pancreáticos.

Se prefiere que estas células madre sean células madre epiteliales de páncreas, estómago, intestinales o colónicas, con lo cual las células madre más preferidas son células madre de intestino delgado. Un medio de cultivo de acuerdo con la invención permitió el establecimiento de condiciones de cultivo a largo plazo bajo las cuales criptas individuales sufren varios eventos - de fisión de cripta, mientras genera simultáneamente dominios epiteliales tipo vellosidad en los cuales todos los tipos de células diferenciadas están presentes. El uso de un método de cultivo de acuerdo con la invención permitió periodos de cultivo de al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses y al menos diez meses .

Las criptas cultivadas sufren cambios morfológicos dramáticos después de llevarlas a cultivo. La abertura superior de criptas recién aisladas es sellada y esta región se infla gradualmente y se llena con células apoptóticas, muy parecidas a las células apoptóticas que son desprendidas en la punta de la vellosidad. La región de cripta se encontró que sufre eventos de brote continuos que crean criptas adicionales, un proceso reminiscente de la fisión de cripta. Las extensiones tipo cripta comprenden todas tipos de células epiteliales diferenciadas, incluyendo células proliferativas , células de Paneth, enterocitos y células caliciformes. Ningún miofibroblasto u otras células no epiteliales se identificaron en los organoides en ninguna etapa.

La expansión de las estructuras de cripta en brote creó organoides, que comprenden >40 estructuras tipo cripta que rodean un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad y se llenan con cuerpos de células apoptóticas. Los organoides cripta-vellosidad comprenden un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad. El lumen es abierto a intervalos de tipo consecutivos para liberar el contenido en el medio. Los organoides pueden ser pasados y mantenidos en cultivo durante al menos seis meses sin perder las características esenciales. El pasaje incluye de preferencia fragmentación manual de organoides.

Una estructura organoide cripta-vellosidad similar se forma cuando células madre epiteliales individuales son cultivadas. Después de casi una semana, se forman estructuras que simulan fuertemente las estructuras organoides cripta-vellosidad que se obtiene con criptas intactas. El análisis altostológico de estos organoides reveló también la conservación de la arquitectura cripta-vellosidad básica, la presencia de todos los tipos de células diferenciados y la ausencia de elementos no epiteliales.

En un aspecto, la invención proporciona por lo tanto organoides cripta-vellosidad, que comprenden un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad que resultan del cultivo de células madre epiteliales o criptas aisladas en un medio de cultivo de la invención. De preferencia, el organoide cripta-vellosidad puede obtenerse usando un método de la invención.

En un aspecto más, la invención proporciona organoides pancreáticos generados o que pueden obtenerse al cultivar fragmentos pancreáticos de acuerdo con un método de la invención. Aproximadamente 20% de los organoides pancreáticos forman una estructura de brote 7 días después del inicio del cultivo. Los ductos pancreáticos proliferan rápidamente, en contraste con el tejido acinar, el cual sólo crece muy lentamente. Después del pasaje de los organoides pancreáticos, estructuras tipo islotes pancreáticos que secretan insulina se observan que simulan los islotes pancreáticos de Langerhans que están presentes en tejido de páncreas saludable. La invención proporciona además un organoide gástrico que comprende un lumen central. De preferencia el organoide gástrico puede obtenerse mediante un método de la invención.

Factores de crecimiento adicionales que pueden añadirse a un medio de cultivo, por ejemplo para incrementar la presencia de islotes pancreáticos en los organoides o para soportar más el cultivo de fragmentos aislados tales como fragmentos gástricos, comprenden ciclopamina (Sonic-hedgehog inaltobitor; Tocris Bioscience) , Activina, GLP (péptido tipo Glucagón) y su derivado (Exendin 4; California Peptide Research) , gastrina (Genscript) , un agonista de Notch (Jagged peptide, Ana Spec) , Nicotinamida y un agonista de Wnt tal como Wnt-3a. nt-3a es atractivo para ser usado cuando se empiece el cultivo con una sola célula.

La invención proporciona además una colección de organoides cripta-vellosidad, gástricos o pancreáticos, que cada uno comprenden más de 10, de preferencia más de 20, muy preferiblemente más de 40 organoides. Los organoides cripta- vellosidad rodean un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad. El lumen es relleno con cuerpos de células apoptóticas . Las células en los organoides cripta-vellosidad son polarizadas, con células madre residiendo en la base de las estructuras. La parte superior de las estructuras tipo cripta comprenden células apoptóticas que son derramadas en el lumen. Esta colección de organoides cripta-vellosidad comprende de preferencia por lo menos 10% de células viables, preferiblemente al menos 20% de células viables, muy preferiblemente al menos 50% de células viables, más preferiblemente al menos 60% de células viables, muy preferiblemente al menos 70% de células viables, más preferiblemente al menos 80% de células viables, muy preferiblemente al menos 90% de células viables . La viabilidad de las células puede evaluarse usando tinción de Hoechst o tinción con yoduro de propidio en FACS.

En un aspecto más, la invención proporciona el uso de organoides cripta-vellosidad, organoides gástricos u organoides pancreáticos de acuerdo con la invención en un análisis de descubrimiento de fármacos, ensayo de toxicidad o en medicina regenerativa.

Para propósitos de alta emisión, los organoides cripta-vellosidad, gástricos o pancreáticos se cultivan en placas de varios pocilios tales como, por ejemplo, placas de 96 pocilios o placas de 384 pocilios. Bibliotecas de moléculas se usan para identificar una molécula que afecte los organoides. Las bibliotecas que se prefieren comprenden bibliotecas de fragmentos de anticuerpos, bibliotecas de despliegue de fagos péptidos, bibliotecas de péptidos (por ejemplo, LOPAP™, Sigma Aldrich) , bibliotecas de lípidos (BioMol) , bibliotecas de compuestos sintéticos (por ejemplo LOP AC™, Sigma Aldrich) o bibliotecas de compuestos naturales (Specs, TimTec) . Además, pueden usarse bibliotecas genéticas que induzcan o repriman la expresión de uno o más genes en la progenie de las células de adenoma. Estas bibliotecas genéticas comprenden bibliotecas de ADNc, bibliotecas antisentido y siARN u otras bibliotecas de ARN de no codificación. Las células son de preferencia expuestas a varias concentraciones de un agente de prueba durante cierto periodo de tiempo. Al final del periodo de exposición, los cultivos se evalúan. El término "que afecta" se usa para cubrir cualquier cambio en una célula, incluyendo, pero no limitado a, una reducción en, o pérdida de, proliferación, un cambio morfológico y muerte celular. Los organoides cripta-vellosidad, gástricos o pancreáticos también se pueden usar para identificar fármacos que se dirijan específicamente a células de carcinoma epiteliales, pero no a los organoides cripta-vellosidad, gástricos o pancreáticos.

Los organoides cripta-vellosidad, gástricos ' o pancreáticos pueden reemplazar además el uso de líneas celulares tales como células Caco-2 en ensayos de toxicidad de fármacos potencialmente nuevos o de suplementos alimenticios conocidos o novedosos.

Además, los organoides cripta-vellosidad, gástricos o pancreáticos pueden usarse para cultivo de un patógeno tal como un norovirus que actualmente carece de un modelo de cultivo de tejido o animal adecuado.

Los cultivos que comprenden organoides cripta-vellosidad son útiles en medicina regenerativa, por ejemplo en reparación post-radiación y/o post-cirugía del epitelio intestinal, en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que sufran de enfermedad inflamatoria intestinal tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, y en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que sufran de síndrome del intestino delgado. Uso adicional está presente en la reparación del epitelio intestinal en pacientes con enfermedades hereditarias del intestino delgado/colon. Los cultivos que comprenden organoides pancreáticos también son útiles en medicina regenerativa, por ejemplo como implantes después de resección del páncreas o parte del mismo y para el tratamiento de diabetes tal como diabetes I y diabetes II.

En una modalidad alternativa, las células madre epiteliales expandidas son reprogramadas en destinos tisulares relacionados tales como, por ejemplo, células pancreáticas que incluyen células ß pancreáticas y células hepáticas. Hasta el momento, no ha sido posible regenerar células pancreáticas o células madre hepáticas de células madre adultas. Los métodos de cultivo de la presente invención harán posible analizar factores que trans-diferencien la célula madre epitelial estrechamente emparentada con una célula pancreática, incluyendo una célula ß pancreática, y una célula hepática.

Será claro para una persona capacitada que también se puede usar terapia génica en un método dirigido a reparar tejido dañado o enfermo. Por ejemplo, se puede hacer uso de un vehículo de suministro génico adenoviral o retroviral para suministrar información genética tal como ADN y/o AR a células madre. Una persona capacitada puede reemplazar o reparar genes particulares seleccionados en terapia génica. Por ejemplo, un gen normal puede insertarse en una ubicación no específica dentro del genoma para reemplazar un gen no funcional. En otro ejemplo, una secuencia génica anormal puede reemplazarse por una secuencia génica normal a través de recombinación homologa. Como alternativa, mutación inversa selectiva puede regresar un gen a su función normal. Un ejemplo más es alterar la regulación (el grado al cual un gen está apagado o encendido) de un gen particular. De preferencia, las células madre son tratadas ex vivo mediante un enfoque de terapia génica y posteriormente se transfieren al mamífero, de preferencia un ser humano que requiera tratamiento .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para cultivar una célula de adenoma epitelial, que comprende proporcionar una matriz extracelular, fijar una célula de adenoma epitelial a la matriz extracelular, cultivar la célula en presencia de un medio de cultivo de células, que comprende un medio basal para células animales o humanas a las cuales se añade un inaltobidor de Proteína orfogenética de Hueso (BMP) , y entre 5 y 500 nanogramos/ml o al menos 5 y no más de 500 ngramos/ml de un factor de crecimiento mitogénico seleccionado de EGF, TGF-alfa y KGF. KGF puede ser reemplazado por un FGF o FGF10.

Una célula de adenoma de colon epitelial comprende una alteración en un gen que codifica para proteína APC, que se traduce en degradación menos eficiente de ß-catenina intracelular por un complejo de proteínas que comprenden APC. Otras mutaciones comunes en adenomas de colon comprenden mutaciones en ß-catenina o Axina2. El resultado general es una señalización de TCF/LEF incrementada debido a una cantidad incrementada de ß-catenina en el núcleo. Un medio de cultivo sin un agonista de Wnt se encontró que era suficiente para proliferación de células de adenoma.

La célula de adenoma puede ser aislada del adenoma epitelial por métodos conocidos en la técnica, que comprenden el uso de agentes disociativos tales como EDTA. Como alternativa, células de adenoma Lgr5 o Lgr6 positivas individuales pueden ser aisladas del adenoma usando un compuesto de unión a Lgr5, seguido por esferas magnéticas o análisis FACS.

La invención proporciona además progenie de una célula de adenoma epitelial que fue cultiva en presencia de un medio de cultivo de células, que comprende un medio basal para células animales o humanas al cual se le añade un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP) y entre 5 y 500 nanogramos/ml o al menos 5 y no más de 500 nanogramos/ml de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) . Las células de adenoma cultivadas no son capaces de desarrollar una estructura tridimensional polarizada tal como una arquitectura tipo cripta-vellosidad. Más bien, células de adenoma de estructuras tipo globo en las cuales las células se orientan aleatoriamente hacia la periferia o el lumen central. No hay signos de diferenciación en otros tipos de células epiteliales. Este resultado indica un papel de APC en la organización tridimensional de la arquitectura tipo cripta-vellosidad.

Además, la invención proporciona el uso de la progenie de las células de adenoma para un análisis de descubrimiento y fármacos seleccionados para identificar un fármaco que afecte específicamente células de adenoma en comparación con células epiteliales normales expandidas que se cultiven en el mismo medio de cultivo. Para propósitos de alta emisión, la progenie de células de adenoma se cultiva en placas de varios pocilios tales como, por ejemplo, placas de 96 pocilios o placas de 384 pocilios. Bibliotecas de moléculas se usan para identificar una molécula que afecte la progenie. Las bibliotecas que se prefieren comprenden bibliotecas de fragmentos de anticuerpo, bibliotecas de despliegue de fagos y péptidos, bibliotecas de péptidos (por ejemplo, LOPAP™, Sigma Aldrich) , bibliotecas de lípidos (BioMol) , bibliotecas de compuestos sintéticos (por ejemplo, LOP AC™, Sigma Aldrich) o bibliotecas de compuestos naturales (Specs, TimTec) . Más aún, se pueden usar bibliotecas genéticas que induzcan o repriman la expresión de uno o más genes en la progenie de las células de adenoma. Estas bibliotecas genéticas comprenden bibliotecas de ADNc, bibliotecas antisentido y siARN u otras bibliotecas de ARN de no codificación. Un compuesto que afecta células de adenoma es posteriormente, o en paralelo, probado para afectar células epiteliales normales o expandidas. El término "afectar" se usa para cubrir cualquier cambio en una célula, incluyendo una reducción en, o pérdida de, proliferación, un cambio morfológico y muerte celular. La progenie también se puede usar para identificar fármacos que se dirijan específicamente a células de carcinoma epitelial, en comparación con células de adenoma epitelial, incluyendo reversión de las células de carcinoma.

Será claro que la progenie también se puede usar en un enfoque de alta emisión para la determinación de estabilidad metabólica in vitro y perfiles metabólicos de candidatos a fármaco.

La invención proporciona además el uso de la progenie de células de adenoma de acuerdo con la invención, de organoides pancreáticos, de organoides gástricos o de organoides cripta-vellosidad de la invención, en ensayos de toxicidad. Esta progenie y organoides cripta-vellosidad son fáciles de cultivar y simulan muy estrechamente células epiteliales primarias que, por ejemplo, líneas de células epiteliales tales como Caco-2 (ATCC HTB-37) , 1-407 (ATCC CCL6) y XBF (ATCC CRL 8808) que actualmente se usan en ensayos de toxicidad. Se anticipa que los resultados de toxicidad obtenidos con cultivos de adenoma primarios o con organoides cripta-vellosidad simulan más estrechamente los resultados obtenidos en pacientes. Una prueba de toxicidad a base de células se usa para determinar una toxicidad específica de órganos. Los compuestos que se prueban en esta prueba comprenden agentes quimiopreventivos para cáncer, químicos ambientales, suplementos alimenticios y tóxicos potenciales . Las células son expuestas a varias concentraciones de un agente de prueba durante cierto periodo de tiempo. Las escalas de concentración para los agentes de prueba en el ensayo" se determinan en un ensayo preliminar usando una exposición de cinco días y diluciones logarítmicas a partir de la concentración soluble más alta. Al final del periodo de exposición, los cultivos se evalúan para inaltobición de crecimiento. Los datos se analizan para determinar la concentración que inaltobió el punto final en 50 por ciento (TC50) .

En este documento y sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que elementos que siguen la palabra están incluidos, pero elementos no mencionados específicamente no son excluidos. Además, el verbo "consiste" puede reemplazarse por "consiste esencialmente en" significando que un producto como el definido en la presente puede comprender componentes adicionales a aquellos específicamente identificados, los componentes adicionales no alternado la característica única de la invención. Además, un método como el definido en la presente puede comprender etapas adicionales a las identificadas especialmente, estas etapas adicionales sin alterar las características únicas de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un", "una" o "uno" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y sólo uno de los elementos . El artículo indefinido "un" , "uno" o "una" entonces significa normalmente "por lo menos uno" . La palabra "alrededor de" o "aproximadamente" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10) significa de preferencia que el valor se le puede dar el valor de 10 más o menos 1% del valor.

Todas las referencias de patente y literaturas citadas en la presente descripción se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad.

Los siguientes ejemplos se ofrecen por motivos ilustrativos únicamente, y no se intenta que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Breve descripción de las figuras Figuras la y Ib. Requerimiento de factor de crecimiento de cultivo de criptas.

Figura la: 500 criptas fueron sembradas con EGF (E; 0-50 ng/ml) y R-spondin 1 (R: 0.500 ng/ml) por triplicado; organoides de criptas fueron contados 7 días después de la siembra. Figura Ib: 500 criptas/organoides de cripta se cultivaron con EGF (50 ng/ml) y R-spondin 1 (500 ng/ml) con las cantidades indicadas de Noggin y seguidas por 3 pasajes. Organoides de cripta fueron contados en cada pasaje. El experimento se repitió tres veces con resultados comparables.

Figuras 2a, 2b, 2c, 2d y 2e. Establecimiento de sistema de cultivo de criptas intestinales.

Figura 2a: curso de tiempo de una cripta individual aislada que crece para formar un organoide. La imagen de contraste de interferencia diferencial revela células de Paneth que contienen gránulos en fondos de criptas (flechas) . Figuras 2b y 2c : criptas aisladas individuales forman eficientemente organoides de cripta. A lo largo de fisión de cripta repetida, las estructuras generan numerosos organoides de cripta tipo pulpo en el día 14. Figura 2d: imagen confocal reconstruida 3D de un solo organoide después de un cultivo de 3 semanas. Células madre Lgr5-GFP* (gris claro) se ubican en la punta de dominios tipo cripta. Contratinción para ADN: ToPro-3 (gris oscuro). Figura 3e: representación esquemática de un organoide de cripta. El organoide consiste en un lumen central revestido por epitelio tipo vellosidad y un número de dominios tipo cripta circundantes. Las células gris oscuro en la punta del dominio de cripta indica la posición de células madre Lgr5+, que están presentes en cada dominio de cripta. La barra de escala indica 50 µp?.

Figura 3: Análisis agrupado del perfil de expresión génica El análisis agrupado de niveles de expresión usando criptas de intestino delgado y colon recién aisladas así como organoide de intestino delgado mostró alto grado de similitud entre organoides de intestino delgado y el tejido del que se derivan, criptas de intestino delgado. Las criptas colónicas se agruparon en una rama separada, indicando un patrón de expresión génica diferente de este tejido estrechamente emparentado. Cabe mencionar que sólo 1.2% de todos los genes expresados fueron enriquecidos significativamente en organoides en relación con criptas de intestino delgado, mientras que - viceversa - 2% fueron enriquecidas en criptas de intestino delgado. El análisis de la vía de ingenuidad de estos genes diferenciales reveló la presencia específica de una firma de linfocitos en criptas recién aisladas, mientras que ninguna vía significativa puede identificarse en el pequeño número de genes enriquecidos en los organoides (no mostrados) . Se concluye que el último grupo representa ruido biológico, mientras que la firma linfocítica se deriva a partir de células inmunes intraepiteliales contaminantes, pérdidas después del cultivo.

Figuras 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f y 4g. Los organoides de criptas conservan características cripta-vellosidad básicas .

Figuras 4a, 4b, 4c, 4d y 4e: el código de activación de nt se conserva en dominios de criptas. Figura 4a: ß-catenina nuclear (gris oscuro, flechas) sólo se vio en dominios de cripta. Imagen de resolución más alta en la figura 5. Asterisco, matrigel; Lu, lumen. Figura 2b: EphB2 (gris claro) es expresado en un gradiente en células CBC y células TA. Nótese que las células madre Lgr5-GFP+ son indicadas por la flecha blanca. Figura 4c : células apoptóticas caspasa-3+ (gris oscuro, flechas) que se derraman en el lumen central revestido por enterocitos. Figura 4d: 40 cromosomas en una dispersión de células a partir de un cultivo de criptas de >3 meses de edad. Figuras 4e-g: rastreo de linaje de células madre Lgr5+ in vitro. Figura 4e: criptas de ratones reporteros Lgr5-EGFP-ires-Cre£i?T2/Rosa26-lacZ fueron estimuladas por tamoxifen in vitro durante 12 horas y se cultivaron durante los días indicados. La tinción con LacZ (gris oscuro) muestra que células LacZ+ individuales dispersas (día 1) generaron criptas LacZ+ completas in vitro (días 2-14) . Los recuadros muestran ampliación más alta de organoides de criptas teñidos. Figura 4f: el análisis altostológico muestra que un dominio de cripta LacZ+ completo (gris oscuro/negro) se alimenta en el dominio de vellosidad. Figura 4g: el porcentaje de organoides de criptas con células LacZ+ permaneció continuo con el tiempo, indicando que las células Lgr5+ poseen actividad de células madre a largo plazo. Se sembraron 500 criptas por triplicado y los organoides de cripta LacZ+ fueron contados. Las barras de error son desviación estándar de triplicados. El experimento se repitió tres veces con resultados similares.

Figuras 5a, 5b y 5c. Imagen de más alta resolución de la figura 4a, figuras llm y llp.

Figuras 6a y 6b. No hay evidencia de fibroblastos subepiteliales en organoides de cripta.

Figura 6a: la inmunotinción para actina de músculo liso (S A; gris oscuro, ejemplos indicados por flechas negras) demuestra la presencia de fibroblastos epiteliales debajo de la capa epitelial. Figura 6b: la ausencia de células SMA+ en matrigel (asterisco) indica la ausencia de fibroblastos subepiteliales en el sistema de cultivo. Barra de escala: 50 m.

Figuras 7a, 7b, 7c y 7d. Una cripta de un ratón reportero Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP se estimuló por tamoxifen in vitro durante 12 horas y se crearon imágenes durante los días indicados. Las células Lgr5+ son color gris claro y están indicadas por las flechas blancas. Figura 7d: organoides de 7 días de edad derivados de criptas Lgr5-EGFP-ires-CrefíJ?T2/Rosa26-YFP fueron estimulados por tamoxifen in vitro durante 12 horas, y cultivados y se crearon imágenes durante los días indicados. La fluorescencia YFP (gris claro) muestra que células YFP+ individuales dispersas (día 1) generaron mucha progenie in vitro durante los siguientes cinco días. El dominio de vellosidad estalló durante el día 1-1.5, seguido por nueva formación de dominio de vellosidad (círculo blanco) . Nótese que las células YFP+ están migrando hacia el dominio de vellosidad.

Figuras 8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f y 8g. Células madre Lgr5+ clasificadas individuales generan estructuras cripta-vellosidad completas. Figura 8a: células Lgr5-GFP+ preparadas a partir de un intestino Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 (abajo) en comparación con compañero de carnada tipo silvestre (arriba) . Células GFP+ fueron divididas en dos poblaciones; GFPalto y GFPlow. Figura 8b: el análisis microscópico confocal de una cripta recién aislada muestra GFPalt° en células CBC (puntas de flecha negras) y GFPlow sobre CBC (puntas de flecha blancas). Figura 8c : células GFPalt0 clasificadas. Figura 8d: 1000 células GFPalto clasificadas (izquierda) y células GFPbajo (derecha) después de cultivo de 14 días. Figuras 8e-f: catorce días después de la clasificación, células GFPalto individuales forman organoides crípticos, con células Lgr5-GFP+ (células gris claro) y células de Paneth (flechas blancas) ubicadas en fondos de cripta. Barra de escala: 50 µp?. Figura 8f: ampliación más alta de fondo de cripta en figura e. Figura 8g: para visualizar células proliferantes, los organoides se cultivaron con el análogo de timidina EdU (gris claro, ejemplos indicados por flechas blancas) durante 1 hora, después de lo cual se fijaron. Nótese que sólo los dominios de cripta incorporaron EdU. Contratinción: DAPI (gris oscuro) . 1 Figuras 9a, 9b, 9c y 9d. Eficiencia formadora de colonias de células individuales clasificadas en pocilios individuales. El promedio se da para 4 experimentos individuales, de los cuales en cada experimento 100 células fueron verificadas visualmente y luego seguidas para crecimiento. Figura 9b: un ejemplo de una sola célula GFPalto que creció exitosamente. Figura 9c : los números de células por organoide individual promediados para 5 organoides en crecimiento. Figura 9d: suspensión celular individual derivada a partir de un organoide derivado de célula individual se volvió a colocar en placas y se cultivó durante 2 semanas .

Figura 10. Potencia formadora de colonia de una sola célula clasificada en un pocilio individual. Un ejemplo de una sola célula GFPalto de crecimiento exitoso. Las flechas apuntan a una partícula de polvo como una marca. Barra de escala: 50 µp.

Figuras lia, 11b, 11c, lid, lie, llf, llg, llh, lli, 11j , llk, 111, llm, lln, lio y 11-p. Composición de organoides derivados de una sola célula madre. Figuras 11a-d: imagen confocal reconstruida tridimensional para figura lia: villina en gris claro (ápice de enterocitos que revisten lumen central), figura 11b: tinción con Muc2 indicada por las flechas blancas (células caliciformes), figura 11c: lisozima en gris claro (células de Panet ) , figura lid: cromogranina A en gris claro (células enteroendocrinas) . El núcleo fue contrateñido con DAPI. Figuras lle-g: Tinción de sección de parafina. Figura lie: Fosfatasa alcalina en negro (ápice de enterocitos que revisten lumen central). Figura llf: PAS en gris oscuro (células caliciformes) , figura llg: lisozima en gris oscuro (células de Paneth) , figura llh: sinaptofisina en gris oscuro (células enteroendocrinas) . Figuras lli-p: secciones de microscopía electrónica de organoides de cripta demuestran la presencia de enterocitos (figura i) , células caliciformes (figura j), células de Paneth (figura k) y células enteroendocrinas (figura 111) . Figuras llm/o: la imagen de cripta de baja potencia ilustra la ausencia de células estromales. Figuras lln-o: ampliación más alta de figura m. Figura lln: maduración de borde en cepillo hacia el compartimiento luminal del organoide, como se indica por la diferencia de longitud de microvellos (flechas negras) . Figura llp: imagen de baja potencia de dominio de vellosidad. Lu, lumen de organoide de cripta relleno con cuerpos apoptósicos y revestido por enterocitos polarizados. G, células caliciformes; EC, células enteroendocrinas; P, células de Paneth; asterisco, matrigel. Barra de escala: 5 µ?? (figuras m, p) , 1 µp\ (figuras n, o) .

Figuras 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f y 12g. Comparación de imágenes microscópicas electrónicas entre cripta in vivo y cripta cultivada in vi tro. Figuras 12a-b: intestino normal en la base de la cripta con el tejido conectivo debajo (flechas) . Para comparación véanse figuras 12c-g de los organoides también tomados en la base de una cripta. Figura 12d: imagen de alta ampliación desde la membrana apical; hay hendiduras intercelulares (flechas) entre las membranas de dos células adyacentes. Nótese el desmosoma (cabeza de flecha) seguido por una hendidura intercelular. Figura 12e: Alta ampliación a partir del sitio basal en donde la membrana de dos células adyacentes puede ser seguida por hendiduras intracelulares . Estas imágenes son comparables con las figuras 12a y b del intestino de un ratón normal. La causa de estas hendiduras intercelulares puede ser choque osmótico durante la fijación de aldehido. Figuras 12f-g: todas las células que constituyen el organoide están en un estado saludable y carecen de grandes vacuolas u otros señales de estrés. Se puede observar figuras de mitosis (figura 12c) y en cada célula muchos poros nucleares (figura 12f, flechas) y mitocondrias intactas. ER y Golgi (figura 12g) se pueden ver sin ninguna evidencia de altonchazón. No hay señal de cariorexis, cariolisis o cariopiknosis . Por lo tanto, ningún signo de lisis celular o apoptosis se observa. Las células en el lumen del organoide muestran las características apoptóticas esperadas como las que se pueden observar en el intestino de un ratón normal. La figura 12f muestra otro ejemplo de una célula enteroendocrina . Mi: células mitóticas, Lu: lumen, EC: células enteroendocrinas , G: Golgi.

Figura 13. Criptas derivadas de colon pueden mantenerse en cultivo también. Criptas aisladas individuales derivadas de colon eficientemente forman organoides de cripta usando las mismas condiciones de cultivo que las usadas para criptas de intestino delgado. A través de fisión de cripta repetida, las estructuras generan numerosos organoides de cripta tipo pulpo el día 14.

Figuras 14a, 14b, y 14c. La adición de BDNF incrementa eficiencia de cultivo. Figura 14a: Criptas de colon aisladas individuales fueron cultivadas en presencia de EGF, Noggin, R-spondin y BDNF. Figuras 14b y 14c: Imágenes de. organoides de cripta de colon tomadas el día 0 (14a), 4 (14b) y 14 (14c) después del inicio de cultivo.

Figura 15. La adición de Wnt3a incrementa más la eficiencia de cultivo de organides de cripta de colon. Criptas colónicas aisladas individuales fueron cultivadas en presencia de EGF, Noggin, R-spondin. El uso de medio acondicionado Wnt3a (+ nt3a) incrementó eficiencia de cultivo hasta en 30% en comparación con cultivo de organoides de colon en medio de control (- nt3a) .

Figuras 16a, 16b, 16c y 16d. Adenoma aislado de ratones APC-/- puede crecer in vitro. Adenomas aislados individuales de ratones APC-/- fueron disociados y cultivados usando condiciones como las descritas arriba con excepción de que R-spondin no se incluyó en los medios de cultivo. Figura 16a: organoides de adenoma como los mostrados aquí el día 4 crecen generalmente como un quiste simple, que contiene un lumen central que contiene células apoptóticas. Figura 16b: una ampliación más grande de un organoide de adenoma. Figura 16c : un organoide de adenoma fue teñido con ß-catenina (gris oscuro) y hematoxilina (gris claro en lumen) . La capa exterior del organoide consiste en células epiteliales con una tinción de ß-catenina nuclear. El lumen interior contiene células muertas que han absorbido hematoxilina, que tiñen gris oscuro. Figura 16d: una ampliación más grande de la capa exterior de células epiteliales que muestra ß-catenina nuclear clara.

Figuras 17a y 17b. La adición de Wnt3a incrementa la eficiencia de formación de organoides. Figura 17a: células Lgr5-GFPalto fueron clasificadas y cultivadas con o sin nt3a (100 ng/ml) además de condición de cultivo de célula individual convencional (EGF, noggin, R-spondin, ligando Notch y Y-27632, como se describió arriba para células individuales) . Estas imágenes de cajas con organoides cultivados en presencia o ausencia de Wnt3a son representativas. Figura 17b: 100 células/pocilio fueron sembradas y el número de organoides se contó 14 días después de siembra. El número de organoides/caja se representa en esta gráfica.

Figura 18. Modelo para función de R-spondin 1.

La señalización de Wnt/ß-catenina se inicia después de la unión de un ligando nt canónico a Frizzled y en asociación con receptores LRP5/6. En ausencia de R-spondin 1, la señalización de Wnt es limitada por la cantidad de LRP6 en la superficie celular, la cual se mantiene baja por la internalización mediada por DKKl/Kremenl . R-spondin 1 incrementa la señalización de Wnt al antagonizar el cambio de LRP6 mediado por KDDl/Kremenl, traduciéndose en niveles superficiales de célula incrementados de LRP6. Esta figura se tomó de PNAS 104:14700, 2007.

Figura 19. Células Paneth se ubican adyacentes a células madre Lgr5+ en los intestinos delgados. Las criptas fueron aisladas del intestino delgado de ratones suprimidos en Lgr5-EGFP-i es-CreERT2. Ejemplos de criptas representativas se presentan aquí. Las células GFP+ son Lgr5+ (gris claro, indicado por flechas negras) y éstas se ubican generalmente adyacentes a células de Paneth (indicadas por *) · Figura 20. En ausencia de células de Paneth, la eficiencia de formación de organoide se reduce.

Criptas aisladas se incubaron con 1 uM de Newport Green-DCF (Molecular probé) en PBS+ 0.1% en Pluronic 127 (Sigma) durante 3 minutos a temperatura ambiente, seguidas por lavado con PBS . Después de esto, las criptas fueron incrustadas en Matrigel y cultivadas usando las condiciones estándares como las descritas arriba.

Figuras 21a, 21b y 21c. Eficiencia de cultivo organoide gástrico. Figura 21a imagen GFP (flechas, indicando células GFP positivas) y DIC de glándulas gástricas aisladas de la región pilórica del estómago de ratones Lgr5-GFP. Los núcleos son teñidos con DAPI. Ampliación 63x (Figura 21b) 100 glándulas gástricas/pocilio fueron sembradas por duplicado con EGF (E) , R-spondin 1 (R) , Noggin (N) , EGF + R-spondin 1 (ER) , EGF + Noggin (EN) , EGF + R-spondin 1 + Noggin + Wnt3A + KGF (ERN K) . El número de organoides gástricos se contó 2, 5 y 7 días más tarde. Los resultados se muestran como media±SEM de 2 experimentos independientes. Figura 21b: 100 glándulas gástricas/pocilio fueron sembradas por duplicado con proteína recombinante Wnt3A (ENRWK) o medio acondicionado con Wnt3A (ENRWCMK) complementado con los demás factores de crecimiento descritos en la figura 21a. El número de organoides brotantes se contó el día 7 después de la siembra y el día 2 después del primer pasaje.

Figuras 22a y 22b. Formación de organoides gástricos in vitro. Figura 22a: glándulas gástricas aisladas que crecen en organoides. Imágenes de contraste de interferencia diferencial de los días 1, 2, 5 y 7 después de la siembra. Ampliación lOx (días 1, 2, 5). Día 7 ampliación 4x, recuadro lOx. Figura 22b: los cultivos fueron pasados cada 4-7 días mediante disociación mecánica. Los cultivos han sido dejados crecer durante al menos un mes. Imágenes representativas que muestran estructuras de brote que salen de los organoides en diferentes pasajes. Pasaje 1 (Pl) , pasaje 2 (P2) y pasaje 4 (P4) que representan los días 8, 11, 20 respectivamente.

Figuras 23a, 23b, 23c y 23d. Marcadores de glándulas gástricas. Figura 23a: cultivos gástricos de ratones Lgr5-LacZ. La expresión de Lac Z se detectó en el brote gástrico en el día 5 después de siembra (véase flecha, indicando células LacZ positivas (gris oscuro) , indicando la presencia de células Lgr5 positivas. Ampliación 20x. Figura 23b: la tinción con Ki67 (negro) muestra células proliferantes positivas en la base de la estructura tipo glándula. Figura 23c : células apoptóticas de caspasa-3 (gris oscuro) presentes dentro del lumen del organoide. Figura 23d: células positivas para mucina gástrica 5AC (gris oscuro) presentes en los organoides gástricos. Lu, lumen de organoide. Ampliación 20x.

Figuras 24a, 24b y 24c. Ductos pancreáticos pueden formar organoides tipo pancreático in vitro. Ductos pancreáticos recién aislados fueron cultivados en presencia de EGF, Noggin, R-spondin-1 y KGF. Imágenes de contraste de interferencia diferencial de los días 0, 4 y 14 después de la siembra.

Figuras 25a, 25b y 25c. Estructuras tipo islote pancreático se forman después de aproximadamente 3 semanas de cultivo in vitro. Imágenes de contraste por interferencia diferencial del día 21 después de la siembra.

Figuras 26a, 26b, 26c, 26d, 26e, 26f, 26g, 26h y 26i. Ratones Axin-LacZ fueron inyectados con vehículo solo (Figura 26a) o R-spondin (figura 26b) . Después de 2 días, el páncreas se aisló y la presencia de la expresión de LacZ se determinó por tinción con X-gal. El panel medio de la figura 26b muestra una ampliación más grande de un ducto que muestra tinción positiva para LacZ, indicando la expresión de Axin-LacZ a lo largo del revestimiento del ducto pancreático. El panel izquierdo muestra que células de ducto pequeño en células de ductos centroacinares o intercaladas expresaron Axin2-LacZ (ejemplos de los cuales se indican por flechas negras) . Las ampliaciones se muestran en la esquina de cada imagen. La ligación de ducto pancreático se llevó a cabo en ratones tipo silvestre. En momentos diferentes después de PDL, el páncreas fue aislado y secciones de tejido obtenidas del PDL y área no PDL fueron teñidas con H&E. Las ampliaciones se muestran para cada punto de tiempo (figura 26c) . La ligación de ductos pancreáticos se llevó a cabo en ratones wt y Axin2-LacZ. 7 Días después de PDL, el páncreas fue aislado y la expresión de Axin2-LacZ se determinó por tinción con X-gal de secciones de tejido fijas (figura 26d) o fragmentos de órgano montados enteros (figura 26e) . Los círculos blancos indican porción ligada del páncreas. La expresión de Ki67 (ejemplos indicados por flechas) en secciones de tejido de páncreas 5 días después de PDL. Se muestran ampliaciones (figura 26f) . Incorporación de BrdU (ejemplos indicados por flechas) en tejido de páncreas 2 días después de tratamiento in vivo con R-spondin. Se muestran ampliaciones (figura 26g) . La expresión de ARNm de Lgr5 fue determinada por Q-PCR en tejido de páncreas obtenido de ratones que sufrieron PDL o una operación falsa. En el páncreas PDL, el área PDL y área no PDL fueron sometidas a Q-PCR. Se muestra el incremento en veces de la expresión de Lgr5 en comparación con proteína de unión a caja TATA (tbp) , un gen constitutivo (figura 26h) . Trece días después de PDL, el páncreas fue aislado y la expresión de Lgr5-LacZ se determinó por tinción con X-gal de secciones de tejido fijas. Ejemplos de células teñidas se indican por flechas negras (figura 26i) .

Figuras 27a, 27b, 27c, 27d y 27e Imágenes de fragmentos ductales pancreáticos cultivados in vitro en E tomadas en diferentes puntos de tiempo después de ser aisladas de un ratón tipo silvestre (figura 27a, panel superior) . Las células centroacinares no crecieron durante periodos de más de 7 días, después de lo cual se desintegraron (figura 27a, panel inferior) . Los fragmentos pancreáticos fueron cultivados en presencia o ausencia de EGF (50 ng/ml) , R-spondin (1 g/ml) , FGF10 (100 ng/ml) o Noggin (100 ng/ml) . Imágenes de los cultivos se tomaron 7 y 14 días después del inicio de cultivo con fragmentos pancreáticos recién aislados. Los cultivos sin EGF no sobrevivieron^ durante más de 10 días (figura 27b) . Fragmentos pancreáticos aislados de ratones Axin2-LacZ fueron cultivados en ausencia o presencia de R-spondin (1 pg/ml) durante 3 días. La tinción con X-gal mostró expresión con Axin-LacZ que responden a Wnt en las células ductales después de 3 y 14 días sólo en presencia de R-spondin (ejemplos indicados por flechas blancas) . No se detectó tinción con X-gal en las células acinares o de islotes (figura 27c) . Los fragmentos ductales fueron aislados de ratones Lgr5-LacZ y cultivados durante 3 días en ausencia o presencia de R-spondin. La expresión de Lgr5-LacZ, según se indica por tinción con X-gal, muestra células Lgr5+ en las puntas de los brotes, similar a su expresión después de PDL (figura 27d) . Tinción FACS de células obtenidas de fragmentos pancreáticos cultivados en presencia de un agonista de Wnt, R-espondin. Células fueron teñidas para EpCAM, un marcador de células epiteliales pan, y LacZ (fluoresceína-di-galactopiranósido, FDG) . El porcentaje de células Lgr5+ se incrementa significativamente cuando fragmentos pancreáticos se cultivan en presencia de una señal Wnt (figura 27e) .

Figura 28 Se aisló páncreas de ratones 7 días después del tratamiento con PDL y células pancreáticas fueron teñidas con EpCAM-APC y substrato fluorescente para LacZ (kit FluoroReporter) , clasificadas y cultivadas en EM que incluía 50% de medio acondicionado Wnt3A y 10 mM de Y 27632 durante 4 días. Se cambió el medio de cultivo por medio EM sin Wnt y Y-27632 después de 4 días. Se tomaron imágenes de los días indicados y se muestra una ampliación 40x.

Figuras 29a, 29b, 29c, 29d, 29e y 29f Organoides pancreáticos, fueron transferidos de EM a DM. El efecto de remoción de FGF10 del medio de expansión, dando como resultado DM, diferenciación inducida en islotes. Organoides pancreáticos fueron cultivados durante 10 días en DM después de lo cual estructuras tipo islotes pudieron ser detectadas in vi tro. Se muestran imágenes de los cultivos en presencia y ausencia de FGF10 (figura 29a) y muestran expresión incrementada de ciertos marcadores de diferenciación, Ngn3 y somatostatina, medida por PCR. Hprt es un gen constitutivo (figura 29b) . En varios puntos de tiempo después de la transferencia a DM, la expresión de un número de marcadores fue evaluada por PCR (figura 29c) . El cambio en morfología de quistes pancreáticos a estructuras tipo células ß (figura 29d) acompañó la aparición de ciertos marcadores de células ß, tales como insulina y péptido C según se detecta por inmunofluorescencia (figura 29e) . La presencia de R-spondin en DM es esencial para la regeneración de progenitores de células ß, como se indica por tinción inmunofluorescente positiva para Ngn3 (ejemplos se indican por flechas blancas (figura 29f) .

Figura 30 Fragmentos de páncreas humano fueron aislados frescamente y cultivados en EM. Se tomaron imágenes de los cultivos en los puntos de tiempo indicados después del inicio del cultivo.

Figuras 31a, 31b, 31c, 3Id y 3le Cultivos de cripta in vi tro producen ligandos Wnt Figura 31a. Representación esquemática de la vía Wnt. Cuando se secretan ligandos Wnt, pueden activar autocrina o paracrina la vía de señalización Wnt. El puercoespín es importante para secreción de ligandos Wnt adecuados. Los inaltobidores de IWP se traducen en una inaltobición de la secreción de ligando Wnt.

Figura 31b. Organoides de ratón cultivados bajo condiciones normales como se indica en el ejemplo 1.

Figura 31c. La incubación de cultivos de organoides de ratón con 1 µ? de IWP se traduce en muerte celular de cultivos de organoides .

Figura 3Id. La adición de medio acondicionado con Wnt3a incrementa los cultivos de organoides de ratón.

Figura 31e. La muerte de organoides inducida por IWP se rescata por la adición de medio acondicionado Wnt3a.

Se muestra una ampliación de lOx (figuras 31b, 31c, 31d y 3le) .

Figuras 32a, 32b, 32c, 32d, 32e, 32f, 32g y 32h. Establecimiento de cultivo de criptas intestinales humanas.

Organoides humanos cultivados de intestino delgado (figuras 32a, 32b, 32c y 32d) y colon (figuras 32e, 32f, 32g y 32h) después de 3 días (figuras 32a, 32c, 32e y 32g) y 5 días (figuras 32b, 32d, 32f y 32h) en medio complementado con EGF, Noggin y R-spondin con (figuras 32a, 32b, 32e y 32f) y sin (figuras 32c, 32d, 32g y 32h) medio acondicionado nt3a.

Figuras 33a, 33b, 33c, 33d, 33e y 33f. Establecimiento del cultivo de organoides gástricos.

Figura 33a. Un total de 100 glándulas gástricas/pocilio se sembraron por duplicado con EGF (E) ; R-spondin 1 (R) ; Noggin (N) ; EGF + R-spondin 1 (ER) ; EGF + Noggin (EN) ; EGF + R-spondin 1 + Noggin (ERN) ; EGF + R-spondin 1 + Noggin + Wnt3A (ERNW) ; EGF + R-spondin 1 + Noggin + Wnt3A + FGF10 (ERNWF) ; EGF + R-spondin 1 + Noggin + medio acondicionado de control + FGF10 (ERNCCMF) o EGF + R-spondin 1 + Noggin + medio acondicionado Wnt3A + FGF10 (ERNWCMF) . El número de organoides gástricos se contó 2, 5 y 7 días más tarde. Los resultados se muestran como media+SEM de 2 experimentos independientes .

Figura 33b. Un total de 100 glándulas gástricas/pocilio se separaron por duplicado con medio acondicionado Wnt3A (ENRWCM) o medio acondicionado nt3A complementado con FGF10 (ENRWCMF) . El número de organoides en brote se contó después de 7, 15 (pasaje 2) y 60 días (pasaje 10) en cultivo.

Figura 33c. Un total de 100 glándulas gástricas/pocilio se sembraron en el medio acondicionado nt3A ( CM) + EGF + Noggin y R-spondin complementado ya sea con FGF7/KGF (K) o tanto 100 como 1000 ng/ml han sido probados . El número de organoides en brote se contó después de 4 días (pasaje 7) en cultivo. Se ha mostrado un experimento representativo.

Figura 33d. Glándulas gástricas aisladas se desarrollan en; organoides. Imágenes de contraste de interferencia diferencial de días 1, 2, 3, 4, 7 después de siembra. Después de una semana, los cultivos requirieron división 1:5 ó 1:6. El subcultivo y mantenimiento se han llevado a cabo como se describió en la sección de materiales y métodos complementarios . Imágenes representativas de los cultivos después de 15 días, 3 meses, 4.5 y 6 meses en cultivo; (ampliación 10 x) .

Figura 33e. Ejemplo de un cultivo de 5 días de edad hecho en medios acondicionados de control. Nótese que el cultivo no crece y no ha podido formar dominios de glándula. Bajo estas condiciones el cultivo sobrevivió no más de 7 días .

Figura 33f. Tinción con E-Cadherin de montaje entero en un organoide gástrico de 3 meses de edad.

Figuras 34a, 34b, 34c, 34d, 34e, 34f, 34g, 34h y 34i. Células Lgr5+ve individuales construyen organoides gástricos de larga vida in vitro.

Figura 34a. Análisis confocal de una unidad gástrica pilórica frescamente aislada de un estómago de ratón Lgr5-EGFP-ires-CreERT2. Las flechas muestran distintas poblaciones GFPalto (gris) , GFPlo (negro)1 y GFP-ve (blanco) .

Figura 34b. Células Lgr5-EGFP+ve son discriminadas de las poblaciones GFPlo y GFP-ve de acuerdo con su nivel de expresión de GFP. FSC, dispersión hacia adelante.

Figura 34c. Ejemplo representativo de un organoide en crecimiento que se origina de una sola célula Lgr5+ve. Las flechas muestran la formación de brotes de dominio tipo glándula el día 7. Ampliaciones originales: días 1-4; ampliación 40x, días 5-6; ampliación 20x, días 7-8; ampliación lOx y día 9; ampliación 5x.

Figura 34d. Organoides derivados de células Lgr5+ve individuales han sido disociados y divididos cada 5-7 días. Imágenes representativas de un cultivo de 3 meses de edad. Ampliaciones originales: panel izquierdo; ampliación 4x, panel derecho; ampliación lOx.

Figura 34e. Análisis confocal de células que expresan EGFP de Lgr5 en un cultivo gástrico de 14 días de edad hecho a partir de una sola célula GFPalto. Nótese que las células Lgr5 -GFP+ve se ubican en el fondo de los dominios de glándula (flecha blanca; ampliación lOx) .

Figura 34f. Organoides cultivados con el análogo de timidina EdU (rojo) durante 1.5 horas. Sólo dominios de ligando incorporan EdU (flechas blancas; ampliación 20x) . Contratinción, 4 , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; nuclear).

Figura 34g. Un cultivo de 2 semanas de edad de un cultivo unicelular de ratón reportero Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP se estimuló con tamoxifen in vitro durante 20 horas, y se formaron imágenes los días indicados. La fluorescencia YFP (amarillo) muestra que células amarillas individuales dispersas (día 1.5) generan mucha progenie in vitro. Nótese que las células YFP+ve migran hacia el lumen central (círculo de puntos blancos) .

Figura 34h. Análisis de expresión de genes específicos gástricos de cultivos de 2 meses de edad derivados de células individuales Lgr5+ve. Los cultivos mantenidos en medio Wnt3A alto (panel izquierdo) o bajo (panel medio) . Nótese que los cultivos derivados gástricos son negativos para genes específicos de intestino (panel derecho) .

Figura 34i. Cultivos mantenidos en medio Wnt3A bajo durante al menos 10 días. Panel superior: imagen confocal de tinción con ECad (rojo, organoides derivados de epitelio) . Contratinción, Hoescht 33345 (azul) . Paneles inferiores: secciones de parafina teñidas para Tff2 (café, células de cuello de moco) , ácido peryódico- Scaltof f (rojo, células de cavidad), MUC5AC (café, células de cavidad) y cromogranina A (café, células enteroendocrinas ) .

Descripción Detallada de la Invención Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo de criptas y vellosidades de intestino delgado in vitro Materiales y métodos Ratones: Se usaron ratones no consanguíneos de 6-12 semanas de edad. La generación y genotipificación del alelo Lgr5-EGFP-Ires-CreERT21 se ha descrito previamente1. Ratones reporteros Rosa26-lacZ o YFP fueron obtenidos de Jackson Labs .

Aislamiento de criptas, disociación y cultivo de células. Las criptas fueron liberadas de intestino delgado de murino por incubación en EDTA 2 mMEDTA/PBS durante 30 minutos a 4°C. Las criptas aisladas fueron aisladas y sedimentadas. Quinientas criptas fueron mezcladas con 50 µ? de Matrigel (BD Bioscience) y colocadas en placas de 24 pocilios. Después de la polimerización de Matrigel, se añadieron 500 µ? de medio de cultivo de cripta (Advanced DMEM/F12 con factores de crecimiento (10-50 ng/ml EGF (Peprotech) , 500 ng/ml de R-espondin l11 y 100 ng/ml de Noggin (Peprotech) ) . , Para experimentos de clasificación, criptas aisladas fueron incubadas en medio de cultivo durante 45 minutos a 3 °C, seguidas por resuspensión con una pipeta de vidrio. Las células disociadas fueron pasadas a través de un filtro de células de 20 µt?. Células GFPalto, GFPbajo o GFP" fueron clasificadas mediante citometría de flujo (MoFlo, Dako) . Células epiteliales viables individuales fueron reguladas por dispersión hacia adelante, dispersor lateral y parámetro de ancho de pulso, y tinción negativa para yoduro de propidio. Las células clasificadas fueron recogidas en medio de cultivo de criptas e incrustadas en Matrigel que incluía péptido Jagged-1 (Ana Spec, 1 µ?) a 1 célula/pocilio (en placa de 96 pocilios, 5 µ? de Matrigel) . Medio de cultivo de cripta (250 µ? para placa de 48 pocilios, 100 µ? para placa de 96 pocilios) que incluía Y-27632 (10 µ?) fue puesto encima. Los factores de crecimiento se añadieron un día sí y otro no, y el medio completo se cambió cada 4 días. Para el pasaje, los organoides fueron retirados de Matrigel y disociados mecánicamente en dominios de una sola cripta, y transferidos a Matrigel nuevo. El, pasaje se llevó a cabo cada 1-2 semanas con relación de división 1:5.

Reactivos: EGF recombinante de murino y Noggin fueron comprados de Peprotech. R-spondin l11 recombinante humana, Y-27632 (Sigma) , 4 -altodroxitamoxifen (Sigma) y Edu (Invitrogen) se usaron para experimentos de cultivo. Los siguientes anticuerpos fueron usados para inmunotinción: anti-lisozima (Dako), anti-sinaptofisina (Dako) , anti-BrdU (Roche), anti- ß-catenina (BD Bioscience) , anti-E-cadherina (BD Bioscience) , anti-actina de músculo liso (Sigma) , anti-EphB2 y B3 (R&D) , anti-villina, anti-Muc2, anti-cromogranina A (Santa Cruz) , anti-caspasa-3 (Cell Signaling) .

Aislamiento de criptas: Intestinos delgados aislados fueron abiertos longitudinalmente, y lavados con PBS frío. El tejido se picó en pedazos de alrededor de 5 mm, y se lavó más con PBS frío . Los fragmentos de tej ido fueron incubados en EDTA 2 mM con PBS durante 30 minutos en altóelo. Después de la remoción de medio EDTA, los fragmentos de tejido se suspendieron vigorosamente con una pipeta de 10 mi con PBS frío. El sobrenadante fue la fracción vellosa y se descartó; el sedimento se resuspendió con PBS. Después de suspensión y centrifugación vigorosa adicionales, el sobrenadante se enriqueció para criptas. Esta fracción fue pasada a través de un filtro de células de 70 um (BD bioscience) para retirar material velloso residual. Criptas aisladas fueron centrifugadas a 300 rpm durante 3 minutos para separar criptas de células individuales. La fracción final consistía en criptas esencialmente puras y se usó para cultivo o disociación de células individuales .

Inducción con tamoxifen y tinción con X-gal: Para activar CreERT2, las criptas se incubaron con 4-altodroxitamoxifen a baja dosis (100 nM) durante 12 horas y se cultivaron en medio de cultivo de cripta. La tinción con X-gal se llevó a cabo como se describió previamente1. No se vio tinción sin tratamiento con 4-altodroxitamoxifen.

Análisis de microscopía electrónica: Como se describió previamente1 Matrigel que incluía organoides de cripta se fijó en fijador de Karnovsky (2% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído, cacodilato de sodio 0.1 M, 2.5 mM de CaCl2 y 5 mM de MgCl2, pH 7.4) durante 5 horas a temperatura ambiente. Las muestras fueron incrustadas en resina Epon y se examinaron con un microscopio Paltollips CM10 (Eindhoven, Los Países Bajos) .

Análisis de microdisposición: Análisis de expresión génica de criptas colónicas, criptas de intestino delgado y organoides. Criptas de intestino delgado recién aisladas de dos ratones se dividieron en dos partes. El ARN se aisló directamente de una parte (RNeasy Mini Kit, Qiagen) , la otra parte se cultivó durante una semana, seguida por aislamiento de ARN. Se preparó ARNc marcado siguiendo las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies) . Moléculas de ARNc marcadas diferencialmente de criptas y organoides de intestino delgado fueron altobridadas por separado para los dos ratones en un 4X44k Agilent Whole Mouse Genome dual colour Microarrays (G4122F) en dos experimentos de cambio de colorante, dando como resultado cuatro disposiciones individuales. Además, criptas colónicas aisladas fueron altobridadas contra criptas de intestino delgado marcadas diferencialmente en dos experimentos de cambio de colorante, traduciéndose en cuatro disposiciones individuales. La señal de microdisposición e información de fondo fueron recuperadas usando Feature Extraction (V.9.5.3., Agilent Technologies). Todos los análisis de datos se llevaron a cabo usando ArrayAsist (5.5.1, Stratagene Inc.) y Microsoft Excel (Microsoft Corporation) . Las intensidades de señal bruta se corrigieron al restar el fondo local. Los valores negativos se cambiaron por un valor positivo cerca de cero (desviación estándar de fondo local) para permitir así el cálculo de relaciones entre intensidades para características sólo presentes en un canal (criptas u organoides de intestino delgado) o (.criptas de intestino delgado o criptas colónicas) . La normalización se llevó a cabo al aplicar un algoritmo de Lowess y las características individuales se filtraron si ambas intensidades (criptas u organoides de intestino delgado) o (criptas de intestino delgado o criptas colónicas) eran cambiadas o si ambas intensidades eran menos de dos veces la señal de fondo. Además, las características no uniformes fueron filtradas. Los datos están disponibles en GEO (Gene Expression Omnibus, número GSE14594) después de publicación. La agrupación jerárquica no supervisada se llevó a cabo en intensidades normalizadas (señal procesada en Feature Extraction) de criptas y organoides de intestino delgado/colon usando Cluster 3 (distancia: bloque de ciudad, correlación: enlace promedio) y se visualizaron con TreeView. Los genes se consideraron cambiados significativamente si estaban consistentemente en todas las disposiciones más de 3 veces enriquecidos en organoides o criptas.

Análisis de formación de imágenes: Las imágenes de organoides de criptas se tomaron ya sea con microscopía confocal (Leica, SP5) , microscopio invertido (Nikon DM-IL) o estereomicroscopio (Leica, MZ16-FA) . Para inmunoaltostoquimica, las muestras se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 1 hora a temperatura ambiente, y secciones de parafina se procesaron con técnica estándar1. La inmunoaltostoquimica se llevó a cabo como se describió previamente1. Para inmunotinción de montaje entero, organoides de criptas fueron aislados de Matrigel usando Dispase (Invitrogen) , y se fijaron con 4% de PFA, seguidos por permeabilización con 0.1% de Triton-X. La tinción con EdU se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante (Click-IT, Invitrogen) . El ADN fue teñido por DAPI o ToPro-3 (Molecular Probé) . Se adquirieron imágenes tridimensionales con microscopía confocal (Leica, SP5) y se reconstruyeron con Volocity Software (Improvision) .

Resultados El epitelio intestinal es el tejido de más rápida auto-renovación en mamíferos adultos. Se ha demostrado recientemente la presencia de alrededor de seis células madre Lgr5+ en ciclos en los fondos de criptas de intestino delgado1. Se han establecido ahora condiciones de cultivo a largo plazo bajo las cuales criptas individuales sufren varios eventos de fisión de cripta, mientras se genera simultáneamente dominios epiteliales tipo vellosidad en los cuales todos los tipos de células diferenciados están presentes. Células madre Lgr5* clasificadas individuales también pueden iniciar estos organoides cripta-vellosidad. Experimentos de rastreo indican que la jerarquía de células madre Lgr5+ se mantiene en organoides. Se concluye que las unidades cripta-vellosidad intestinales son estructuras de auto-organización, que pueden construirse a partir de una sola célula madre en ausencia de un nicho celular no epitelial .

El epitelio auto-renovante del intestino delgado está ordenado en criptas y vellos2. Las células son recién generadas en las criptas y se pierden por apoptosis en las puntas de los vellosidades, con un tiempo de transformación de 5 días en el ratón. Se han sabido por mucho tiempo que las células madre auto-renovantes residen cerca del fondo de la cripta y producen las células de amplificación de tránsito (TA) que proliferan rápidamente. El número estimado de células madre es de entre 4 y 6 por cripta. Enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas se desarrollan a partir de células TA y continúan su migración en bandas coherentes a lo largo del eje cripta-vellosidad. El cuarto tipo principal de célula diferenciada, la célula de Paneth, reside en el fondo de la cripta. Se ha identificado recientemente un gen, Lgr5, que es expresado específicamente en células Columnares de Base de Cripta en ciclos que están intercaladas entre las células de Paneth1. Usando un ratón en el cual un cásete de Cre recombinasa inducible por GFP/tamoxifen fue integrado en el locus Lgr5, se demostró por rastreo de linaje que las células Lgr5+ constituyen células madre multipotentes que generan todos los tipos de células del epitelio1, incluso cuando se evalúan 14 meses después de la inducción de Cre3.

Aunque se ha descrito una variedad de sistemas de cultivo4"7, no se ha estableado un sistema de cultivo a largo plazo que mantenga la fisiología cripta-vellosidad básica2.

Las preparaciones de cripta de ratón fueron suspendidas en un Matrigel . El crecimiento de criptas requirió EGF y R-spondin 1 (figura la) . El pasaje reveló un requerimiento de Noggin (figura Ib) . Las criptas cultivadas se comportaron de una manera estereotípica (figura 2a) . La abertura superior fue rápidamente sellada, y el lumen se llenó con células apoptóticas . La región de cripta sufrió eventos de brote continuos, reminiscentes de fisión de criptas17. Células de Paneth siempre estuvieron presentes en el sitio de brote. La mayoría de las criptas pudieron ser cultivadas (figura 2b) . La expansión adicional creó organoides, que comprendían >40 dominios de cripta que rodeaban un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad ("dominio de vellosidad") (figuras 2c, 2d y 2e) . La tinción con E-cadherina reveló una sola capa celular (datos no mostrados) . Semanalmente , los organoides fueron disociados mecánicamente y vueltos a colocar a 1/5 de la densidad antes de la colocación en placas. Los organoides fueron cultivados durante >6 meses sin perder las características descritas abajo. El análisis de expresión por microdisposición reveló que los organoides permanecían altamente similares a criptas de intestino delgado recién aisladas, cuando se compararon por ejemplo con criptas de colon frescas (figura 3) .

El cultivo de criptas Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 reveló células madre Lgr5-GFP+ intercaladas con células de Paneth en la base de la cripta. La activación de Wnt, como se evidencia por ß-catenina nuclear (figura 4a, figura 5) y expresión de los genes objetivo Wnt Lgr5 (figura 2d) y EphB218 (figura 4b) se confinó a las criptas. Células apoptóticas fueron derramadas en el lumen central, un proceso reminiscente del derrame de células apoptóticas en puntas de vellosidad in vivo (figura 4c) . Las dispersiones en metafase de organoides de >3 meses de edad revelaron consistentemente 40 cromosomas/célula (n=20) (figura 4d) . Sorprendentemente, no se encontró evidencia alguna de la presencia de miofibroblastos u otras células no epiteliales (figura 6) .

Se cultivaron criptas de ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 cruzados con el reportero Rosa.26-ha.cZ activable por Cre para permitir el rastreo de linaje. Directamente después de la inducción por tamoxifen a baja dosis, se notaron células marcadas individuales (figuras 4e, 4g) . Más de 90% de éstas generaron criptas completamente azules (figuras 4e, 4f y 4g) , implicando que las células Lgr5-GFP+ de hecho retuvieron propiedades de células madre. Criptas del ratón reportero Rosa26-YFP13 activables por Cre permitieron el rastreo de linaje por análisis confocal . Directamente después del tratamiento con tamoxifen, se notaron células marcadas individuales que indujeron rastreo de linaje durante los siguientes días, tanto en criptas recién aisladas (figuras 7a, 7b y 7c) como en organoides establecidos (figura 7d) .

Recientemente, estructuras epiteliales de glándulas mamarias fueron establecidas a partir de células madre individuales in vitro21. Cuando células Lgr5-GFPalto individuales fueron clasificadas, murieron inmediatamente.

El inaltobidor de Rho cinasa Y-27632, redujo significativamente esta muerte celular. Se encontró que un péptido agonista de Notch24 soportaba el mantenimiento de criptas proliferativas23. Bajo estas condiciones, números significativos de células Lgr5-GFPalto sobrevivieron y formaron grandes organoides de cripta. Los organoides se formaron raramente cuando células altojas GFPbajo fueron sembradas (figura 8d) . Varias células Lgr5 -GFPalto fueron intercaladas con células de Paneth en fondos de criptas (figuras 8e y 8f) . La incorporación de EdU (análogo de timidina) reveló células en fase S en las criptas (figura 8g) .

Se clasificaron células a 1 célula/pocilio, se verificó visualmente la presencia de células individuales y se siguió el crecimiento resultante. En cada uno de cuatro experimentos individuales, se identificaron y siguieron 100 células individuales. En promedio, aproximadamente 6% de las células Lgr5-GFPalto crecieron en organoides, mientras que las células restantes murieron típicamente dentro de las primeras 12 horas, presuntamente debido a estrés físico y/o biológico inherente al procedimiento de aislamiento. Las células Gppbajo raramente crecieron (figura 9a) . La figura 9b y figura 10 ilustran el crecimiento de un organoide a partir de una sola célula Lgr5-GFPalto. A los cuatro días de cultivo, las estructuras consistían en aproximadamente 100 células, lo que coincidió con el ciclo de células de 12 horas de células de cripta proliferativas25 (figura 9c) . Después de dos semanas, los organoides fueron disociados en células individuales y replaqueados para formar nuevos organoides (figura 9d) . Este procedimiento pudo ser repetido al menos cuatro veces sobre una base de 2 semanas, sin pérdida aparente de eficiencia de replaqueo.

Los organoides derivados de una sola célula madre parecieron indistinguibles de aquellos derivados de criptas enteras. Células de Paneth y células madre fueron ubicadas en fondos de cripta (figuras 8e, 8f , figuras 11 c, llg) . Enterocitos completamente polarizados como se evidencia por bordes en' cepillo maduros de Villina+ y fosfatasa alcalina apical revistieron el lumen central (figuras 11 a, lie, lli) . Células caliciformes (Muc2+, figura 11b; PAS+, figura llf) y las células enteroendocrinas (cromogranina A+( figura lid; sinaptofisina+, figura llh) fueron dispersas a lo largo de la estructura del organoide. Cuatro tipos de células maduras fueron reconocidas mediante microscopía electrónica (figuras lli, 11j, llk y 111). Células no epiteliales (estromales/mesenquimáticas) estuvieron ausentes, una observación confirmada por imágenes EM (figuras lli, 11j , llk, 111, llm, lln, lio y llp, figuras 12c, 12d, 12e, 12f y 12g) . Tanto las criptas (figuras llm, lio) como el epitelio luminal central (figura llp) consistieron en una sola capa de células epiteliales polarizadas que descansaba directamente en el soporte de Matrigel. Imágenes de alta resolución de estas fotografías por EM se dan en la figura 5. Organoide teñido para E-cadherina en rojo y contrateñido con núcleos en azul, revela la naturaleza unicapa del epitelio del organoide (datos no mostrados) .

Se sabe bien que las criptas epiteliales están en contacto íntimo con miofibroblastos subepiteliales26"28 y se cree generalmente que estas células crean un nicho celular especializado en fondos de cripta27,29,30. Este nicho podría crear un ambiente único para anclar y soportar las células madre intestinales. Se muestra ahora que el epitelio auto-renovante puede ser establecido por un conjunto limitado de señales de crecimiento que se presentan uniformemente. A pesar de esto, las células madre aisladas generan autonómicamente asimetría de una forma altamente estereotípica. Esto lleva rápidamente a la formación de estructuras tipo cripta con células madre generadas de novo y células de Paneth ubicadas en sus fondos y rellenas con células TA. Estas estructuras tipo cripta se alimentan en dominios luminales tipo vellosidad que consisten en enterocitos postmitóticos , en donde las células apoptóticas se desprenden en el lumen, reminiscente de pérdida celular en puntas de vellosidades. La observación paradójica de que células individuales expuestas a un ambiente promotor de crecimiento uniforme pueden generar estructuras asimétricas es particularmente evidente después del escrutinio de la vía Wnt. Aunque todas las células están expuestas a R-spondin 1, sólo células en criptas presentan características de señalización Wnt activa, es decir, ß-catenina nuclear y la expresión de genes objetivo, Wnt. Aparentemente, una respuesta diferencial a señalización de Wnt en lugar de exposición diferencial a señales Wnt extracelulares descansa en el corazón de la formación de un eje cripta-vellosidad.

En resumen, se concluye que una sola célula madre intestinal Lgr5+ve puede operar independientemente de impulsos posicionales a partir de este ambiente y que puede generar una estructura epitelial de auto-organización continuamente en expansión reminiscente de intestino normal. El sistema de cultivo descrito simplificará el estudio de biología de cripta-vellosidad conducida por células madre. Además, puede abrir nuevas vías para medicina regenerativa y terapia génica .

Ejemplo 2 Cultivo de criptas y vellosidades de colon in vitro Materiales y métodos Medio acondicionado Wnt3a Una línea de células que expresaba ligando Wnt3a y la misma línea de células, sin el ligando Wnt3a (medio de control) se cultivan durante un periodo de 3-4 semanas. Las células producirán Wnt3a tan pronto como dejen de crecer en confluencia. El medio será cosechado y probado en el ensayo TOPflash, un ensayo de luciferasa usando una construcción de elementos sensibles a TCF-luc (TOP) y la misma construcción, pero con mutaciones en los elementos de respuesta a TCF (FOP) . La relación entre TOP/FOP debe ser de más de 20 para que el medio sea usado en cultivos. El medio se diluye 25-50% cuando se usa en los cultivos para regenerar tejido.

Colón recién aislado fue abierto y lavado con PBS o DMEM, y cortado en piezas pequeñas. Los fragmentos se incubaron con EDTA 2 mM/PBS durante 1 hora a 4°C con oscilación suave. Después de la remoción de la solución de EDTA, los fragmentos de tejido se suspendieron vigorosamente en 10 mi de PBS frío con una pipeta de 10 mi. El primer sobrenadante que contenía restos fue descartado y el sedimento se suspendió con 10-15 mi de PBS. Después la suspensión vigorosa adicional de los fragmentos de tejido el sobrenadante se enriquece en criptas colónicas . Los fragmentos fueron sedimentados y mezclados con Matrigel y cultivados como sistema de cultivo de organoides de intestino delgado. El Matrigel se incubó durante 5-10 minutos a 37°C. Después de la polimerización de Matrigel, se añadieron 500 µ? del medio de cultivo de tejidos (50% de Advanced-DMEM/F12/50% de medio acondicionado Wnt-3a complementado con 200 ng/ml de N-acetilcisteína, 50 ng/ml de EGF, 1 g/ml de R-spondinl, 100 ng/ml de Noggin, 100 ng/ml de BDNF (Peprotech) . El medio completo se cambió cada 2-3 días. Para el pasaje, los organoides fueron retirados del Matrigel usando una pipeta de 1000 µ? y se disociaron mecánicamente en fragmentos pequeños y se transfirieron a Matrigel fresco. El pasaje se llevó a cabo en relación de división 1:4 al menos una vez cada dos semanas. Bajo estas condiciones los cultivos han sido mantenidos durante al menos 3 meses.

Resultados Los organoides colónicos crecen más lentamente y menos eficientemente en comparación con organoides de intestino delgado. Con la misma condición de factores de crecimiento de intestino delgado, menos de 5% de criptas colónicas aisladas de colon distal crecieron y formaron estructuras de organoide (figura 13) . Fue difícil cultivar criptas colónicas de la parte proximal del colon. Ya que se encontró sobrerregulación de trkB, el receptor de BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro) , en el análisis de microdisposición (células Lgr5-GFP alto de colon contra células Lgr5 -GFP de colon) , se determinó el efecto de BDNF para organoides colónicos . Se observó constantemente alrededor de eficiencia de cultivos de dos veces más alta en cultivo de BDNF+ que en cultivo BDNF- . Típicamente, un organoide de colon podría contener aproximadamente 10 dominios de cripta (figura 14) . De acuerdo con su origen, no se pudo detectar ninguna célula de Paneth. En comparación con organoides de intestino delgado, la cripta colónica no posee células de Paneth productoras de Wnt-3a en la base de la cripta, por lo tanto la complementación de Wnt-3 incrementa la eficiencia de cultivo de criptas colónicas pero no la de criptas de intestino delgado. Típicamente, se obtuvo hasta 30% de eficiencia de cultivo cuando se añadió medio acondicionado nt-3a (figura 15) .

En conclusión, tanto criptas derivadas de intestino delgado como derivadas de colon pueden mantenerse y propagarse in vitro usando las condiciones descritas arriba, haciendo a este el primer método de cultivo alguna vez descrito como resultando en la generación de epitelio intestinal en un sistema artificial.

Ejemplo 3 Cultivo de adenomas in vitro Materiales y métodos (Véase ejemplo 1) Resultados Los adenomas han sido altostóricamente difíciles de cultivar in vitro. Ya que las condiciones descritas arriba se usaron para cultivar exitosame te criptas saludables delgadas de intestino delgado así como colónicas, se determinó si condiciones similares podrían sostener adenomas in vitro. Después de aislamiento de adenoma de ratones APC-/- usando EDTA 2.5 mM, adenomas individuales fueron cultivados bajo condiciones similares a las descritas arriba. De manera importante, estas condiciones fueron adecuadas para mantener crecimiento de los adenomas in vitro, sin embargo, R-spondin se había vuelto redundante. Esto se puede explicar fácilmente por el hecho de que ya no es necesario inducir más la vía de señalización Wnt, toda vez que la ausencia de APC en estas células se traduciría automáticamente en ß-catenina nuclear. Esto hace a R-spondin, un agonista de Wnt, redundante en cultivo de adenomas in vitro. La figura 16a y en ampliación más grande la figura 16b, muestran que, en contraste con organoides de cripta normal, en los cuales se puede ver a la cripta brotar con el lumen central, los organoides de adenoma simplemente crecen como quistes. Las células muertas son derramadas en el lumen, como se puede concluir de la presencia de una gran cantidad de células muertas dentro del lumen. En organoides de cripta normal, ß-catenina nuclear sólo se ve en la base de dominio de cripta (véase figura 4a) . En organoides de adenoma (figura 16c y una ampliación más grande en 16d) , ß-catenina nuclear se observó en cada célula epitelial, consistente con la mutación APC genética. Estos organoides pueden ser pasados indefinidamente .

Se probó además si células clasificadas Lgr5+ individuales derivadas de los adenomas en ratones Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/APCflox/flox eran capaces de formar organoides de adenoma similares in vitro usando las condiciones de cultivo mencionadas arriba (sin R-spondin) . De hecho, éste fue el caso y los organoides obtenidos eran altamente comparables en estructura con aquellos que se obtuvieron usando adenomas completos como material de partida para el cultivo in vitro (datos no mostrados) .

Ejemplo 4 Prueba del efecto de otros agonistas de Wnt Para determinar si otros agonistas de Wnt tienen el mismo efecto que R-spondin, en particular facilitar la formación de organoides cripta-vellosidad in vitro, Wnt3a soluble se añadió a células individuales clasificadas Lgr5+ y el efecto en la formación de cripta-vellosidad in vitro se evaluó.

Materiales y métodos Células Lgr5-GFPalto se clasificaron y cultivaron con o sin Wnt3a (100 ng/ml) además de condición de cultivo de células individuales convencional (EGF, Noggi, R-spondin, ligando Notch y Y-27632, como se describió arriba para células individuales) . Se sembraron 100 células/pocilio y se contó el número de organoides 14 días después de la siembra.

Las criptas aisladas fueron incubadas con 1 uM de Newport Green-DCF (MolecularProbes) en PBS+ 0.1% de Pluronic 127 (Sigma) durante 3 minutos a temperatura ambiente, seguida por lavado con PBS. Después de esto, las criptas fueron incrustadas en Matrigel y cultivadas usando las condiciones estándares como las descritas arriba.

Resultados La adición de nt3a en ausencia de R-spondin no tuvo ningún efecto en formación de colonia: muy pocas a ningunas colonias fueron formadas en ausencia de R-spondin. Sin embargo, en presencia de R-spondin, una eficiencia incrementada de formación de organoides se observó sólo en presencia de Wnt3a (figura 17) . Esto indica que ambos factores soportan entre sí su capacidad de estimular y soportan la diferenciación de células madre en todas las células necesarias para la formación de una capa de células epiteliales completa. La altopótesis actual es que R-spondin es responsable de la inaltobición de internalización de un co-receptor de Frizzled, LRP6, antes de la señalización a través de Frizzled. Después de la unión del factor Wnt a Frizzled y el co-receptor LRP6, la vía de señalización Wnt es activada31. Cuando LRP6 está presente en la superficie celular, la activación de Wnt tendrá lugar (figura 18) . Por lo tanto, si R-spondin no está presente en el medio de cultivo, Wnt3a no será capaz de activar la vía Wnt, toda vez que LRP6 se internaliza y no está disponible para señalización en combinación con el factor Wnt, evitando así la activación de la vía Wnt.

Wnt3a es un factor soluble que, bajo circunstancias fisiológicas, se produce por células de Paneth. Estas células se ubican generalmente adyacentes a las células madre (figura 19) y se crea la altopótesis de que estas células soportan el mantenimiento de la diferenciación continua de la capa de células epiteliales intestinales. Otros factores de Wnt que también son secretados por células de Paneth son Wnt6, 9b y 11. Se anticipa que Wnt6 tendrá el mismo efecto en diferenciación de células madre que nt3a. Estos descubrimientos soportan la noción de que las células de Paneth son importantes para la formación de un nicho de células madre. Estos datos son sorprendentes, toda vez que un nicho de células madre ha sido especulado extensamente, pero hasta el momento ningún dato experimental ha soportado la existencia de este nicho. Soporte adicional para la presencia de un nicho de células madre proviene de un experimento en el cual células de Paneth fueron eliminadas selectivamente. Las criptas se aislaron del intestino delgado de ratón y se cultivaron, in vitro en presencia de un quelador de zinc32 que erradica específicamente a células de Paneth. Esto se usó a concentraciones tan bajas y durante un tiempo tan corto que sólo afectó las células de Paneth y ninguna otra célula dentro de la cripta. Después del tratamiento con el quelador de zinc, se evaluó la formación de organoides. Una reducción significativa de formación de organoides se observó cuando células de Paneth ya no estuvieron presentes en las criptas originales (figura 20) . En presencia de Wnt3a, esta reducción fue parcialmente restablecida (datos no mostrados) . Esto soporta un papel para la célula de Paneth en el mantenimiento de un nicho de células madre, lo cual soporta la diferenciación de las células madre Lgr5+ en la cripta.

Ejemplo 5 Las condiciones de cultivo soportan el crecimiento de organoides de estómago también El estómago consiste en 3 regiones topográficas (fondo, cuerpo y antro) y 2 áreas glandulares funcionales (oxíntica y pilórica) . El área de la glándula oxíntica comprende 80% del órgano mientras que el área pilórica comprende el 20% del órgano. El epitelio gástrico de mamífero se organiza en unidades gástricas que consisten en un epitelio de superficie plana, en una cavidad corta y una glándula grande. La cavidad es revestida por células de secreción de moco mientras que la glándula está compuesta de células secretoras separadas en tres regiones: el istmo, el cuello y la base. El epitelio gástrico se renueva constantemente. Estudios de trazo llevados a cabo en nuestro laboratorio han demostrado que células LGR5 positivas ubicadas en la base de la glándula cumplen la definición de carencia de tallo (Barker et al., bajo preparación). Hasta el momento, cultivos de una sola capa gástrica no han sido capaces de recapitular las características de la unidad gástrica, que se forma por varias células gástricas diferenciadas. Además, los sistemas de método de cultivo 3D reportados sólo reconstruyen células de mucosa de superficie gástrica altamente diferenciadas, sin mostrar ninguna célula endocrina. Además, estos cultivos sólo han sido llevados a cabo durante un periodo de 7 días, indicando así una falta de capacidad de auto-renovación (Ootani A, Toda S, Fujimoto K. Sugihara H. Am J Pathol , Junio de 2003; 162 (6) : 1905-12) . Aquí hemos desarrollado un método para aislar unidades gástricas de la región pilórica del estómago de murino y se ha hecho posible desarrollar un sistema de cultivo 3D que muestra mantenimiento de vida más larga.

Materiales y métodos Aislamiento de unidad gástrica Estómagos aislados fueron abiertos longitudinalmente y lavados en Advanced-DMEM/F12 frío (Invitrogen) . Bajo el estereoscopio, la región pilórica se extirpó y se aisló del cuerpo, y el estómago anterior y la mucosa pilórica se separaron cuidadosamente de la capa muscular con pinzas. Luego, el tejido se picó en pedazos de alrededor de 5 mm y se lavó más con regulador de pH de aislamiento frío (Na2HP04 28 mM + KH2P04 40 mM + NaCl 480 mM + KC1 8 mM + sucrosa 220 mM + D-sorbitol 274 mM + DI-ditiotreitol 2.6 mM) . Los fragmentos de tejido se incubaron en EDTA 5 mM con regulador de pH de aislamiento durante 2 horas a 4°C bajo oscilación suave. Después de la remoción de solución de EDTA, los fragmentos de tejido se suspendieron vigorosamente en 10 mi de regulador de pH de aislamiento frío con una pipeta de 10 mi. El primer sobrenadante que contenía células muertas se descartó y el sedimento se suspendió con 10-15 mi de regulador de pH de aislamiento frío. Después de suspensión vigorosa adicional de los fragmentos de tejido el sobrenadante se enriquece en unidades gástricas. Cada 10-20 suspensiones el sobrenadante se reemplaza por regulador de pH de aislamiento frío fresco y se mantiene en altoelo y se verifica para la presencia de unidades gástricas. Este procedimiento se repite hasta que la liberación completa de las unidades gástricas, normalmente 4-5 veces. Las suspensiones de unidad gástrica enriquecidas se centrifugan a 600 rpm durante 2-3 minutos para separar las unidades-gástricas aisladas de células individuales y el sedimento se usa para cultivo .

Cultivo gástrico Unidades gástricas completas que contenían las regiones de glándula, istmo y cavidad fueron aisladas de la región pilórica de estómago de murino al incubar con EDTA 5 mM a 4°C durante 2 horas como se indicó en la sección anterior. Las unidades gástricas aisladas fueron contadas y sedimentadas. Se mezclaron 100 unidades gástricas con 25 µ? de Matrigel (BD Bioscience) , se sembraron en placas de cultivo de tejido de 48 pocilios y se incubaron durante 5-10 minutos a 37°C hasta la polimerización completa de Matrigel. Después de la polimerización, se añadieron 250 µ? de medio de cultivo de tejidos (Advanced-DMEM/F12 complementado con B27, N2, 200 ng/ml de N-acetilcisteina, 50 ng/ml EGF, 1 g/ml de R-spondinl, 100 ng/ml de Noggin, 100 ng/ml de Wnt3A, 50 ó 100 ng/ml de KGF) . El medio completo se cambió cada 2 días. Para el pasaje, los organoides fueron retirados del Matrigel usando una pipeta de 1000 µ? y se disociaron mecánicamente en pequeños fragmentos y se transfirieron a Matrigel fresco. El pasaje se llevó a cabo en una relación de división de 1:4 una vez o dos veces por semana. Bajo estas condiciones los cultivos se habían mantenido durante al menos 1 mes.

Reactivos Advanced DMEM/F12 y los suplementos N2 y B27 Serum-Free Supplement se compraron de Invitrogen y N-acetilcisteína de Sigma. EGF recombinante de murino, Noggin y KGF humano se compraron de Peprotech, y proteína recombinante Wnt3A de Stem Cell Research. De los factores de crecimiento mencionados, concentraciones diferentes sólo han sido probadas para R-spondin 1 y KGF. A 50 ng/ml R-spondin 1 inaltobe el crecimiento de cultivo. KGF se puede usar ya sea a 50 ó 100 ng/ml pero la eficiencia de brote es más alta en la condición de 100 ng/ml. Medio acondicionado Wnt3A se preparó como se describió previamente (Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan AW, eissman IL, Reyna T. Yates JR 3rd. Nusse R. Nature. 22 de Mayo de 2003; 423 (6938) : 448-52) .

Inmunoaltostoquímica y análisis de formación de imágenes Para tinción con X-gal, los organoides fueron directamente fijados en el Matrigel con glutaraldehído al 0.25% (Sigma) en 100 mM de MgCl2 en PBS, durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Después, los cultivos se lavaron 3 veces con solución de lavado (0.01% de desoxicolato de sodio + 0.02% de NP40 + 5 mM de MgCl2 en PBS) y se incubaron durante 16 horas a 37 °C con 1 mg/ml de X-Gal (Invitrogen) en presencia de 0.21% de K4Fe(CN)6 y 0.16% de K3Fe(CN)6. Después de lavar en PBS, los cultivos fueron post-fijados con 2% de PFA en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Todos los reactivos se adquirieron de Sigma.

Para inmunoaltostoquímica, los organoides fueron aislados del Matrigel usando tripsina (Tryple Select, Invitrogen) , fijados con 4% de PFA durante 1 hora a temperatura ambiente e incrustados en parafina. Secciones de parafina fueron procesadas con técnicas estándares y la inmunoaltostoquímica se llevó a cabo como se describió previamente. Se usaron los siguientes anticuerpos Ki67 anti-ratón (clon MM1, Monosan) (1:200), caspasa-3 cortada con anti-conejo (Cell Signaling Technology) (1:400) y mucina gástrica anti-humana 5AC (Novocastra clone 45M1) (1:200). La recuperación del antígeno de regulador de pH de citrato se llevó a cabo en todos los casos. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina de Mayer. Las imágenes de organoides gástricos y glándulas gástricas aisladas se tomaron ya sea con microscopio invertido (Nikon DM-IL) o microscopía confocal (Leica SP5) .

Resultados Hasta el momento, los cultivos gástricos han sido hechos en monocapas. Sin embargo, los cultivos en monocapa carecen de la capacidad de recapitular las características de la unidad gástrica completa, la cual se forma por varias células gástricas diferenciadas (células de mucosa de cavidad, células enteroendocrinas y células libres de moco proliferativas) . Recientemente nuestro laboratorio ha demostrado mediante rastreo de linaje in vivo, que las células Lgr5 positivas presentes en el fondo de las criptas intestinales son verdaderas células madre intestinales (Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A. Korving J, Begthel H, Peters PJ, Clevers H. Nature . 2007;449:1003-7). Al igual que el epitelio intestinal, el epitelio gástrico es renovado constantemente. Las células Lgr5 positivas se han encontrado en el fondo de las unidades de glándula gástrica pilórica y, estudios de rastreo han demostrado que estas células LGR5 positivas satisfacen la definición de un carácter madre al mostrar auto-renovación y capacidad de multipotencia (Barker et al. bajo preparación). Ya que ha sido posible cultivar criptas intestinales a partir de células Lgr5+ individuales en estructuras 3D, se determinó si condiciones similares podrían sostener el crecimiento de unidades gástricas pilóricas in vitro.

Después del aislamiento de unidades de glándulas gástricas usando 5 mM de EDTA, glándulas gástricas (figura 21a) fueron suspendidas en Matrigel. El crecimiento de cultivo gástrico requirió EGF (50 ng/ml) , Noggin (100 ng/ml) , R-spondin 1 (1 ug/ml) y nt3A (100 ng/ml) (figura 21b) . KGF (50 ó 100 ng/ml) fue esencial para la formación de eventos de brote y, por lo tanto, la expansión de los cultivos. Así, las unidades pilóricas cultivadas se comportaron como los organoides de cripta intestinal. La parte superior abierta de la unidad es sellada y el lumen es llenado con células apoptóticas . Los organoides . gástricos recién formados sufrieron eventos de brote continuos (reminiscentes de fisión glandular) mientras conservaban su polaridad con el brote de glándulas gástricas con un lumen central. Cuando medio acondicionado Wnt3A, el cual muestra 10-100 veces actividad nt más alta cuando se compara con la proteína recombinante Wnt3A recombinante, se usó un incremento significativo en la eficiencia de formación de brotes fue detectado (figura 21c) , revelando una dependencia de dosis de Wnt para la formación de brotes y morfogénesis.

Los organoides han sido cultivados durante al menos 1 mes sin perder las propiedades descritas. Semanalmente, los organoides son pasados 1:4 por disociación mecánica (figura 22) . El cultivo de unidades gástricas pilóricas Lgr5-LacZ reveló la presencia de células madre Lgr5 positivas en los organoides gástricos (figura 23a) . Como se evidencia por la tinción con Ki67, células proliferativas se ubican en la base de las estructuras tipo glándula (figura 23b) mientras que células caspasa 3 positivas apoptóticas se encuentran extruidas en el lumen (figura 23c) . La mucina gástrica 5AC (MUC5AC) es un marcador específico de las células de cavidad gástrica, también llamadas células foveolares. Las células MUC5AC positivas se encuentran en los organoides, indicando la presencia de al menos un linaje de células gástricas diferenciado (figura 23d) . Sin embargo, no se ha detectado ninguna célula derivada de endocrino. Por lo tanto, se requieren factores adicionales. Estos podrían incluir péptido de liberación de gastrina, activadores o inaltobidores de las familias Hedgehog y Notch, otros activadores de la vía Wnt y otros inaltobidores de la familia BMP, activadores de la familia TGF.

Ejemplo 6a Organoides de páncreas- pueden cultivarse in vitro Materiales y métodos Páncreas recién aislado se cortó en pedazos pequeños y se incubó en DMEM (Invitrogen) con mezcla de enzimas digestivas (300 U/ml de Colagenasa tipo XI (Sigma) , 0.01 mg de dispasa 1 (Roche) y 0.1 mg de DNasa) durante 10 minutos en agitador orbital (80 rpm, 37°C) . Después de la incubación, los fragmentos de tejido fueron levemente disociados por pipeteo mecánico. Los fragmentos no digeridos fueron sedimentados durante 1 minuto con gravedad normal, y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. El sobrenadante se pasó a través de un filtro de células de 70 um, y el residuo se lavó con DMEM. Los fragmentos que permanecían en el filtro de células fueron cosechados por enjuague del filtro de células invertido con DMEM y sedimentados. Los fragmentos consistían principalmente en tejido acinar pancreático y ductos pancreáticos incluidos. El sedimento se mezcló con Matrigel y se cultivó como sistema de cultivo de organoides de intestino delgado (véanse materiales y métodos del ejemplo 1) . El Matrigel se incubó durante 5-10 minutos a 37°C. Después de la polimerización de Matrigel, se añadieron 500 µ? de medio de cultivo de tejidos (Advanced-DMEM/Fl2 complementado con B27, N2 , 200 ng/ml de N-acetilcisteína, 50 ng/ml de EGF, 1 pg/ml de R-spondin 1, 100 ng/ml de Noggin, 50 ó 100 ng/ml de KGF (Peprotech) . Los factores de crecimiento se añadieron cada 2 días . El medio completo se cambió cada 4 días. Para el pasaje, los organoides se retiraron del Matrigel usando una pipeta de 1000 µ? y se disociaron mecánicamente en pequeños fragmentos que se transfirieron a Matrigel fresco. El pasaje se llevó a cabo en relación de tinción 1:4 una o dos veces a la semana. Bajo estas condiciones los cultivos se habían mantenido durante al menos 2 meses .

Resultados El tejido pancreático formó una estructura de quiste simple 3-4 días después del cultivo en presencia de EGF. Noggin y R-spondin incrementaron sinérgicamente el tamaño de la estructura del quiste, pero no afectaron la morfogénesis de los organoides. KGF indujo significativamente formación de brotes así como eficiencia de cultivo. Usando la combinación óptima de factores de crecimiento (EGF, Noggin, R-spondin 1 y KGF) , más de 80% del ducto pancreático creció en la mejor combinación de factores de crecimiento.

Una vez que los ductos pancreáticos habían sido tomados en cultivo, los ductos sellaron rápidamente ambos extremos de la estructura y formaron una estructura simple. Aproximadamente 20% de los organoides empezaron a formar una estructura de brote 7 días después del inicio del cultivo (figura 24) . Los ductos pancreáticos proliferan rápidamente, en contraste con el tejido acinar, que sólo crece muy lentamente .

De manera interesante, después del pasaje de los organoides, aproximadamente 2-3 semanas después del inicio del cultivo, una estructura tipo islotes pancreáticos fue observada (figura 25) . Estas estructuras tipo islote generalmente no se observan antes del pasaje. Los islotes sobreviven durante al menos 7 días, pero proliferan muy lentamente o no lo hacen en absoluto. Estas estructuras tipo islote simulan los islotes pancreáticos de Langerhans que están presentes en tejido de páncreas saludable. Estos islotes contienen, entre otros, células alfa y células beta que producen glucagón e insulina respectivamente. Las estructuras tipo islote observadas contienen células que expresan insulina, neurogenina 3 y Pdx-1. Varios factores de crecimiento serán probados para determinar si incrementan la presencia de células ß pancreáticas en los organoides que se derivan de tejido de páncreas. Los factores de crecimiento candidatos comprenden ciclopamina (inaltobidor de Sonic-hedgehog) , actinina, GLP (péptido tipo glucagón) y su derivado (Exendin-4), gastrina y Nicotinamida.

Ejemplo 6b Organoides de páncreas pueden cultivarse in vitro Materiales y métodos Páncreas recién aislado se cortó en pedazos pequeños, y se incubó en DMEM (Invitrogen) con mezcla de enzimas digestivas (300 U/ml de Colagenasa tipo XI (Sigma) , 0.01 gm/ml de dispasa 1 (Roche) y 0.1 mg/ml de DNasa) durante 10 minutos en agitador orbital (80 rpm, 37 °C) . Después de la incubación, los fragmentos de tejido se disociaron levemente mediante pipeteo mecánico. Los fragmentos no digeridos fueron sedimentados durante 1 minuto con gravedad normal . Los fragmentos no digeridos fueron digeridos además con la mezcla de enzimas digestivas durante 10 minutos. Este procedimiento de digestión se repitió hasta que los fragmentos no digeridos consistieran principalmente en ductos de páncreas . Las estructuras de ductos de páncreas fueron recogidas manualmente de fragmentos no digeridos bajo el microscopio. Los ductos del páncreas fueron mezclados con Matrigel y cultivados como sistema de cultivo de organoides de intestino delgado (véase materiales y métodos del ejemplo 1) . El Matrigel se incubó durante 5-10 minutos a 37°C. Después de la polimerización del Matrigel, se añadieron 500 µ? de medio de cultivo de tejidos (Advanced-DMEM/F12 complementado con lx de Glutamax, Penicilina/Estreptomicina, 10 mM de Hepes, B27, N2 , 10 mM de N-acetilcisteína, 10 nM [Leu15] -gastrina 1, 100 nM de Exendin4, 10 mM de Nicotinamida, 50 ng/ml de EGF, 1 pg/ml de R-spondin 1, 100 ng/ml de Noggin, 50 ó 100 ng/ml de FGF7 (KGF) o FGF10 (Peprotech) . El medio de cultivo se cambió cada 2 días. Para el pasaje, los organoides se retiraron del Matrigel usando una pipeta de 1,000 µ? y se disociaron mecánicamente en fragmentos pequeños que se transfirieron a Matrigel fresco. El pasaje se llevó a cabo en relación de división 1:4 una vez o dos veces por semana. Bajo estas condiciones los cultivos habían sido mantenidos durante al menos 10 meses.

Resultados - Tejido pancreático formó estructura de quiste simple 3-4 días después de cultivo en presencia de EGF. Noggin y R-spondin incrementaron sinérgicamente el tamaño de la estructura de quiste, pero no afectaron la morfogénesis de los organoides. FGF7 (KGF) /FGF10 indujo significativamente formación de brotes así como eficiencia de cultivo. Usando la combinación óptima de factores de crecimiento (EGF, Noggin, R-spondin 1 y FGF7 (KGF) /FGF10 ) , más de 80% de ducto pancreático creció en la mejor combinación de factores de crecimiento .

Una vez que los ductos pancreáticos habían sido tomados en cultivo, los ductos sellaron rápidamente ambos extremos de la estructura y formaron una estructura simple. Aproximadamente 80% de los organoides empezaron a formar una estructura de brote 7 días después del inicio del cultivo (figura 24) . Los ductos pancreáticos proliferan rápidamente, en contraste con el tejido acinar, que sólo crecen muy lentamente. Interesantemente, después del pasaje de los organoides, aproximadamente 2-3 semanas después del inicio del cultivo, estructuras tipo islotes pancreáticos fueron observadas (figura 25) . Estas estructuras tipo islote generalmente no se observan antes del pasaje. Los islotes sobreviven durante al menos 14 días, pero proliferan muy lentamente o no lo hacen en absoluto. Estas estructuras tipo islote simulan los islotes pancreáticos de Langerhans que están presentes en tejido de páncreas saludable. Estos islotes contienen, entre otros, células alfa y células beta que producen glucagón e insulina respectivamente. Las estructuras tipo islote observadas contienen células que expresan insulina, neurogenia 3 y Pdx-1. Varios factores de crecimiento serán probados para determinar si incrementan la presencia de células ß pancreáticas en los organoides que se derivan de tejido de páncreas. Los factores de crecimiento candidatos comprenden ciclopamina (inaltobidor de Sonic-hedgehog) , actinina, GLP (péptido tipo glucagón) y su derivado (Exendin 4) , gastrina y nicotinamida .

Ejemplo 7 Expansión no impedida de progenitores pancreáticos adultos in vitro al conducir una respuesta regenerativa Wnt/Lgr5 Materiales y métodos Ratones, reactivos y tejidos Tejido pancreático se obtuvo de los siguientes ratones: Axin-LacZ knock in (Lustig et al. Mol. Cell. Biol . 2002), Lgr5-LacZ Knockin (Barker et al. 2007), Lgr5-GFP (Barker et al. 2007). Ratones Axin-LacZ fueron inyectados IP con 100 pg de R-spondin 1 humana (amablemente proporcionada por A. Abo. Nuvelo Inc. CA, E.U.A.) y se sacrificaron 48 horas más tarde para análisis de expresión de LacZ en el páncreas .

La ligación de ductos pancreáticos se llevó a cabo como se describió en ratas ( ang et al., 1995) con algunas modificaciones menores: El procedimiento experimental para PDL fue el siguiente: Los animales son anestesiados con una mezcla de fluanisona; fentanil; midazolam inyectada intraperitonealmente a una dosis de 3.3 mg/kg, 0.105 mg/Kg y 1.25 mg/Kg respectivamente. Los animales son puestos en posición supina y la superficie abdominal es rasurada y limpiada con solución antiséptica (solución de yodo) . Después, se lleva a cabo una incisión media en la pared abdominal anterior superior del xipisterno y el páncreas es expuesto. Bajo un microscopio de disección, el lóbulo esplénico pancreático es ubicado y el ducto pancreático se liga con un monofilamento de estructura de polipropileno 7-0 a aproximadamente 1 mm distal a la unión con el ducto del lóbulo gástrico. Después de la cirugía el analgésico buprenorfina se administra s.c. a una dosis de 0.01-0.05 mg/Kg. Luego, la pared abdominal y piel se cierran con 5-0 suturas de seda.

Páncreas aislado recientemente se trató como se describió bajo el ejemplo 6, dando como resultado fragmentos pancreáticos que se cultivaron bajo condiciones como las descritas abajo. El ducto pancreático principal y la primera rama de ductos se aislan mecánicamente. Los fragmentos fueron cortados en pedazos pequeños e incubados en DMEM (Invitrogen) con mezcla de enzimas digestivas (300 U/ml de colagenasa tipo XI (Sigma) , 0.01 mg/ml de dispasa I (Roche) y 0.1 mg/ml de DNasa) durante 30 minutos en agitador orbital (80 rpm, 37°C) . Después de la digestión, la mayoría de las células acinares fueron liberadas de los fragmentos. Los fragmentos no digeridos consisten principalmente en células de ductos pancreáticos que se sedimentaron durante 1 minuto con gravedad normal, y el sobrenadante se descartó. Después de tres veces de lavar con PBS, los fragmentos no digeridos fueron incubados con 2 mM de EDTA/PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente . Los fragmentos fueron vigorosamente pipeteados y sedimentados durante 1 minuto con gravedad normal . El sobrenadante enriquecido con células de ducto fue transferido a los tubos nuevos y lavado con PBS durante tres veces . Las células de ducto fueron sedimentadas y mezcladas con el Matrigel . El Matrigel se incubó durante 5-10 minutos a 37 °C. Después de la polimerización del Matrigel, se añadieron 500 µ? de medio de expansión (Advanced-DMEM/F12 complementado con lx de Glutamax, penicilina/estreptomicina, 10 mM de Hepes, B27, N2, 1 mM de N-acetilcisteína, 10 nM de [Leu15] -gastrina 1, 100 nM de exendin4, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/ml de EGF, 1 µg/ml de R-spondin 1, 100 ng/ml de Noggin, 50 ó 100 ng/ml de FGF7 (KGF) o FGF10 (Peprotech) . El medio completo se cambió cada 2 días. Para el pasaje, los organoides fueron retirados del Matrigel usando una pipeta de 1,000 µ? y se · disociaron mecánicamente en fragmentos pequeños y se transfirieron a Matrigel fresco. El pasaje se llevó a cabo en relación de división 1:4 una vez por semana. Bajo estas condiciones los cultivos se habían mantenido durante al menos 2 meses. Para diferenciación, se cambió el medio de expansión por medio de diferenciación (Advanced-DMEM/F12 complementado con Glutamax, penicilina/estrptomicina, 10 mM de Hepes, B27, N2, 200 ng/ml de N-acetilcisteína, 10 nM de [Leu15] -gastrina 1, 100 nM de exendin4 , 50 ng/ml de EGF, 1 pg/ml de R-spondin 1, 100 ng/ml de Noggin) .

FGF10 se obtuvo de Peprotech. BrdU se obtuvo de Sigma .

Q-PCR Se aisló ARN mediante ARN easy mini kit (Qiagen) , y se transfirió de manera inversa usando transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (Promega) . El ADNc se amplificó en un termociclador.

Los cebadores usados se muestran a continuación: mmTBP (hacia adelante) : TATTGTATCTACCGTGAATCTTGG mmTBP (hacia atrás) : CAGTTGTCCGTGGCTCTC Lgr5 (hacia adelante) : TCCAACCTCAGCGTCTTC Lgr5 (hacia atrás) : TGGGAATGTGTGTCAAAG (Tm=57°C) PCR Todos los cebadores fueron diseñados para flanquear o abarcar secuencias de intrón para poder distinguir ADN genómico .

Hprt (F) AAGTTTGTTGTTGGATATGC (R) CATCTTAGGCTTTGTATTTGG (Tm) 57°C, 106pb Ngn3 (F) TCCTCGGAGCTTTTCTACGA (R) TGTGTCTCTGGGGACACTTG (Tm) 60°C, 239 pb/373 pb (banda genómica) Pax6 (F) AACAACCTGCCTATGCAACC (R) ACTTGGACGGGAACTGACAC TM 60°C, 206 pb Glucocinasa (F) AAGATCATTGGCGGAAAG (R) GAGTGCTCAGGATGTTAAG (Tm) 57 °C 193 pb Cromogranina A (F) GCTGACAGCAGAGAAGCGGCT (R) GACAGGTCTCTAGCTCCTGG (Tm) 60°C 231 pb Glut2 (Slc2a2) (F) AAGTTGGAAGAGGAAGTCAG (R) AGACCTTCTGCTCAGTCG (Tm) 57°C 124 pb Insulina (F) TTTGTCAAGCAGCACCTTTG (R) TCTACAATGCCACGCTTCTG (Tm) 57°C, 214 pb Somastatina (F) GAGGCAAGGAAGATGCTGTC (R) GGGCATCATTCTCTGTCTGG (Tm) 57°C, 214 pb Glucagón (F) TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT (R) AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA (Tm) 57°C, 149 pb Análisis de imágenes Las imágenes de organoides de cripta se tomaron ya sea mediante microscopía confocal con un Leica SP5, un microscopio invertido (Nikon DM-IL) o un estereomicroscopio (Leica, MZ16-FA) . Para inmunoaltostoquímica, las muestras se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 1 hora a temperatura ambiente, y las secciones de parafina se procesaron con técnicas estándares (Barker et al . Nature 2007) . La inmunoaltostoquímica se llevó a cabo como se describió previamente (Barker et al, Nature 2007) . Para inmunotinción de monte completo, organoides de páncreas fueron aislados de Matrigel usando dispasa (Invitrogen) , y fijados con 4% de PFA, seguidos por permeabilización con 0.1% de Tritón X-100. Después los anticuerpos fueron usados para inmunoaltostoquímica; anti-BrdU (Amersham) , anti-Ki67 (Dako) , anti- Insulina (Sigma) , anti-C-péptido (Cell signaling) , anti-Ngn3 (Developmental hybridoma studies bank) .

ADN fue teñido con DAPI o ToPro-3 (Molecular Probes) . Imágenes tridimensionales fueron adquiridas con microscopía confocal. La tinción con X-gal se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 5 en inmunoaltostoquímica y análisis de formación de imágenes.

FACS Organoides pancreáticos fueron cultivados en presencia o ausencia de R-spondin (1 g/ml) se retiraron de Matrigel mecánicamente o enzimáticamente (TrypLE) . Los organoides aislados fueron digeridos más por TrypLE durante 10 minutos a 37 °C. Las células disociadas fueron pasadas a través de un filtro de células de 40 um (BD bioscience) y teñidas con anti-EpCAM conjugado a APC (eBioscience) . LacZ fue teñido con el kit FluoReporter (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células viables individuales fueron reguladas con ancho de pulso, parámetros de dispersor lateral y tinción con yoduro de propidio.

Expansión in vi tro de células pancreáticas Axin2- LacZ positivas individuales Se aisló páncreas de ratones 7 días después del tratamiento con PDL, y los ductos pancreátivos fueron aislados como se describió arriba. Ductos pancreáticos aislados fueron incubados con TrypLE Express (Invitrogen) durante 20 minutos a 37°C, seguidos por el paso a través de un receptor de células de 40 um (BD bioscience) . Las células fueron teñidas con EpCAM-APC y substrato fluorescente para LacZ (FluoroReporter kit) como se describió en el ejemplo 7. Las células se analizaron y células epiteliales viables individuales fueron clasificadas por citómetro de flujo (MoFlo; Dako Cytomation) , y recogidas en el medio EM. Las células clasificadas fueron sedimentadas, mezcladas con Matrigel y cultivadas con medio EM que incluía 50% de medio acondicionado Wnt y 10 mM de Y-27632 durante 4 días. El medio de cultivos se cambió por medio EM sin Wnt y Y-27632 después de 4 días .

Resultados Células madre Lgr5+ dependientes de Wnt individuales derivadas del intestino delgado pueden cultivarse para formar organoides tipo intestino de expansión continua (Sato et al. 2009). En páncreas adulto saludable, la vía Wnt es inactiva y - consecuentemente - Lgr5 no es expresado. Después de lesión por ligación de ductos parcial (PDL) , se encontró que la vía Wnt se vuelve activada robustamente, mientras que la expresión de Lgr5 aparece en los brotes de ductos regenerativos . Bajo condiciones modificadas del sistema de cultivo intestinal, fragmentos de ducto aislados frescamente inician la expresión de Lgr5 y forman quistes en brote que se expanden 10 veces semanalmente durante >30 semanas. La remoción de estímulos de crecimiento convierte estos quistes en estructuras con morfología de islotes inmaduras, expresando marcadores endocrinos y de células ß. Células estimuladas con Wnt individuales de páncreas lesionado también pueden iniciar estos cultivos a largo plazo. Se concluye que el límite de Hayflick no aplica a células progenitoras adultas cuando se cultivan bajo condiciones optimizadas. Así, los métodos de cultivo que favorecen la expansión de células madre adultas específicas de órganos pueden representar una alternativa a la generación de tejidos a base de ES o iPS.

Aunque el desarrollo de los compartimientos exocrinos y endocrinos del páncreas embrionario se entienden en gran detalle (Jensen, 2004), mucho menos se sabe acerca de la generación de células de islotes en el páncreas postnatal (Bonner- eir y Weir, 2005; Bouwens and Rooman, 2005) . El rastreo del linaje genético ha proporcionado prueba de que células ß pre-existentes , en lugar de células madre/progenitoras , generan nuevas células ß en ratones adultos tanto bajo condiciones fisiológicas normales como después de pancreatectomía parcial (Dor et al., 2004; Teta et al . , 2007) . La existencia de células progenitoras multipotentes en el revestimiento ductal del páncreas de ratones adultos ha sido descrita recientemente, la cual puede activarse en páncreas lesionado para incrementar la masa de células ß funcionales (Xu et al. 2008). Lesión controlada se obtuvo al llevar a cabo PDL en el páncreas de ratones adultos que portaban un reportero promotor de Ngn3 , que modifique para un cambio maestro de progenitores de células de islotes embrionarias (Apelqvist et al., 1999; Gradwohl et al., 2000; Gu et al., 2002; Schwitzgebel et al., 2000) y que es silencioso en páncreas postnatal normal (Gu et al., 2002). La diferenciación de estos progenitores de células ß depende de Ngn3 y da origen a todos los tipos de células de islotes, incluyendo células ß que responden a glucosa (Xu et al., 2008) . Actualmente se desconoce qué señales conducen a la aparición de estos progenitores después de lesión. Estos descubrimientos parecen ser importantes toda vez que pueden guiar al diseño de enfoques in vitro para la expansión de progenitores .

Para determinar si la señalización de Wnt juega un papel en la inducción de progenitores de células ß, la expresión del alelo Axin2-LacZ fue seguida en el páncreas de adulto. El alelo Axin2-LacZ ha probado representar un reportero general confiable para señalización Wnt (Lustig et al.. Mol. Cell. Biol . 2002). Como se esperaba, el reportero fue inactivo en páncreas adulto (figura 26a) . Sin embargo, cuando se inyectó el agonista Wnt Rspol (Kim et al., 2005) en ratones Axin2-LacZ para activar la vía de señalización de Wnt, se notó la presencia de células que responden a Wnt a lo largo de los ductos, pero no en acinos o islotes del páncreas (figura 26b) . Ya que los progenitores de células ß han sido detectados previamente sólo después de lesión del páncreas, se probó entonces si una respuesta Wnt era activada fisiológicamente en estas células después de lesión al llevar a cabo PDL. La figura 26c muestra la tinción con H&E de secciones de tejido de páncreas aisladas del área PDL y no PDL. Como se ha reportado previamente (Abe et al. 1995), las células acinares se vuelven apoptóticas después de 5 días y son reemplazadas por estructuras de ducto recién formadas por un mecanismo que no se entiende completamente. Después de 7 días, un incremento en número de islotes (neogénesis de islotes) así como en tamaño de islotes también es observado (como se indica por un asterisco) . Esto indica que el PDL fue exitoso. De hecho, el reportero Axin2-LacZ fue activado específicamente a lo largo de los ductos de la parte ligada del páncreas, mientras que la parte no ligada no mostró esta respuesta (figuras 26d y 26e) . Además, la respuesta proliferativa, determinada por tinción con Ki67, estuvo principalmente restringida a los ductos de la parte ligada, mientras que en ductos de la parte no ligada ningún Ki67 nuclear pudo ser detectado (figura 26f) . Esto simuló la detección de células BrdU positivas proliferativas en el páncreas después de tratamiento con R-spondin (figura 26g) .

Se ha mostrado previamente en los intestinos que cierta población de células sensibles a Wnt son células madre (Barker et al, 2007) . Un marcador para esa población de células fue Lgr5. El gen Lgr5 es, al igual que Axin2, un gen que responde a Wnt. No obstante en el intestino y la piel sólo es expresado en células madre estimuladas con Wnt pero no en células de amplificación por tránsito (Barker et al., 2007; Jaks et al, 2008)). Se considera por lo tanto que es un marcador de células madre genuino. Se creó la altopótesis de que, en forma similar a las células Lgr5+ en los intestinos, las células Lgr5+ en el páncreas también puede ser el origen de los progenitores de células ß detectados después de lesión. Para probar esta altopótesis, se llevó a cabo PDL en el páncreas de ratones Axin-LacZ y Lgr5-LacZ y se determinó la expresión de ARNm de Lgr5 y la tinción de LacZ. Interesantemente, Lgr5 se volvió rápidamente detectable por qPCR en un curso de tiempo post-PDL (figura 26h) . Además, PDL en ratones Lgr5-LacZ knockin se tradujo en actividad específica del reportero en los brotes de ductos regenerativos (indicado por los asteriscos) , como se muestra por tinción con X-gal (figura 26i) . La aparición de la expresión de Lgr5 en sitios de regeneración activa sugirió que Lgr5 podría no sólo marcar células madre en auto-renovación fisiológica (por ejemplo, en el intestino, estómago o folículo piloso) , sino que su expresión también puede presagiar la activación de Wnt por células madre regenerativas/progenitoras después de lesión.

Dada la aparición del marcador de célula madre Lgr5 dependiente de Wnt, se razonó que los progenitores de páncreas adulto pueden ser expandidos en las condiciones de cultivo de organoides de intestino definidas previamente (Sato et al, 2009) . Cultivos de poblaciones heterogéneas de células de páncreas han sido establecidos previamente e incluyen típicamente factores de crecimiento tales como EGF (Githens et al. In vitro Cell Dev Biol . 1989), FGF10 (Miralles et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 1999) y HGF (Lefebvre et al. Diabetes. 1998, Suzuki et al., Diabetes 53, 2004) y suplementos de suero tales como gastrina (Rooman et al. Gastroenterology 2001), nicotinamida (Rooman et al. Diabetologia . 2000) y otros. Un número de estos cultivos se tradujo en la generación in vitro de células con fenotipos tipo células ß (Bonner-Weir et al., 2000; Seaberg et al., 2004; Suzuki et al., 2004) que bajo ciertas condiciones fueron capaces de invertir altoperglucemia cuando se transplantaron en ratones diabéticos (Hao et al., 2006; Ramiya et al., 2000). Gran parte de estos enfoques inician con poblaciones de células mixtas que sufren senescencia con el tiempo. Parece justo decir que no existe actualmente ningún sistema de cultivo a largo plazo robusto que mantenga una expansión robusta de progenitores de páncreas adulto definidos y no transformados durante largos periodos de tiempo que conserven la capacidad de diferenciarse a lo largo de linaje endocrino.

Se intentó primero cultivar fragmentos de ducto purificados en Medio de Expansión (EM) . Como se muestra en la figura 27a, fragmentos de ducto pequeño inmediatamente sufrieron expansión en la estructura tipo quiste sufriendo brote continuo, mientras que los islotes (datos no mostrados) y acinos (panel inferior) . se desintegraron gradualmente. Los cultivos se expanden 10 veces por semana (y son pasajeros semanalmente) durante más de 30 semanas. Varios factores de crecimiento han sido probados para determinar las señales requeridas para expansión óptima de células pancreáticas in vitro (figura 27b) . Claramente, en ausencia de EGF, los cultivos se desintegraron después de 7 días. También la ausencia de R-spondin o FGF10 redujo la viabilidad de los cultivos después de 14 días. En contraste, Noggin, un inaltobidor de BMP, no tuvo ningún efecto en el crecimiento prolongado o de fragmentos pancreáticos. La adición de nicotinamida, exendin 4, gastrina al medio de expansión no fue esencial pero se tradujo en un incremento en la eficiencia de cultivo (datos no mostrados) .

Ya que se demostró que la señalización de Wnt fue activada después de PDL, se determinó el efecto de la adición de un agonista de Wnt a fragmentos pancreáticos recién aislados in vitro en crecimiento prolongado. Cuando los ductos fueron aislados de ratones Axin2-LacZ, los quistes de brote completos tiñeron azul sólo en presencia del agonista de Wnt R-spondin 1 (figura 27c) , simulando la situación in vivo después de PDL (figuras 26d y 26e) . Ninguna tinción azul se observó en islotes recién aisladas o acinos de páncreas Axin2-LacZ. En línea con las observaciones in vivo después de PDL, sólo los brotes de quistes Lgr5-LacZ tiñeron de azul (figura 27d) . Además, el cultivo de organoides Lgr5-LacZ pancreáticos durante 14 días en presencia de R-spondin incrementó el porcentaje de células Lgr5+ significativamente (figura 21e) . Importantemente, cuando fragmentos pancreáticos fueron cultivados en ausencia de R-spondin en EM, los organoides dejan de proliferar dentro de 1 mes, mientras que en presencia de R-spondin, pueden ser expandidos durante un periodo de tiempo limitado. Estas observaciones implican que los progenitores sensibles a Wnt ubicados cerca de los ductos activaron el crecimiento de los quistes de brote, que posteriormente se mantuvieron por células de expresión de Lgr5 con propiedades tipo células madre.

Para probar esta noción directamente, se clasificaron células Axin2-LacZ positivas de ratones 7 días después de PDL y se encontró que estas células iniciaban eficientemente quistes en brote que eran indistinguibles de quistes iniciados en ductos (figura 28) . Las células individuales requieren la presencia de Wnt3a en el medio. La comparación de la eficiencia de cultivo en presencia o ausencia de Wnt3a después de disociación de una sola célula mostró que las células individuales cultivadas en ausencia de Wnt3a inicialmente crecen como pequeñas estructuras de quiste, pero dejan de proliferar después de 2-4 días. Este no es el caso para cultivos de páncreas iniciados a partir de fragmentos de páncreas aislados. Interesantemente, el Wnt3a pudo ser retirado después de 4 días, indicando que ya sea que esta señal ya no era necesaria para estimular crecimiento o que la producción de nt3a fue iniciada por células derivadas de las células clasificadas individuales con la que había iniciado el cultivo.

Se intentó después evaluar el potencial de los quistes en brote para generar células de linaje endocrino. Para este . fin, se probó un número de cambios al EM para definir un medio de diferenciación (DM) . Una serie de factores se probó para su efecto en la diferenciación a los linajes endocrinos. La remoción de FGF10 pareció ser crucial para la inducción de diferenciación. Sólo en ausencia de FGF10 aparecieron las estructuras tipo islote (figura 29a) , lo cual correspondió con la expresión de varios marcadores de diferenciación para progenitores de células ß (Ngn3) , células ß (insulina) , glucagón (células a) y somatostatina (células d) aparecen (figuras 29b y 29c) . Además, marcadores de diferenciación, tales como glucocinasa, Pax6 y cromogranina A fueron sobrerregulados iniciando 10 días después de exposición al medio DM. Por lo tanto, DM consistió óptimamente en al menos EGF y R-spondin y no tuvo ningún FGF7 o 10 presente. La expresión sostenida de Lgr5 , un marcador de células madre, bajo condiciones de diferenciación puede explicarse por la presencia de R-spondin, un agonista de Wnt, en DM, toda vez que Lgr5 es un gen sensible a Wnt. Cuando las células fueron cultivadas en presencia de nicotinamida en EM, también fue importante retirar esto del medio así como obtener diferenciación completa. Cuando quistes en brote después de cualquier periodo de cultivo se transfirieron de EM a D , los quistes sufrieron un proceso, de "involución" estereotípico: El doblez hacia adentro progresivo de la pared llevó al impacto del quiste en un cuerpo compacto más pequeño con simulación morfológica de una islote (figura 29d) . La morfología tipo islote se confirmó por marcadores para islotes vde células ß tales como insulina y péptido C (figura 29e) . Para confirmar la dependencia de esta etapa del proceso de regeneración en la señalización de Wnt, fragmentos pancreáticos fueron cultivados en DM en ausencia o presencia de R-spondin. Importantemente, los progenitores de células ß, como se demuestra por la expresión de Ngn3 , sólo fueron detectables en presencia de R-spondin (figura 29f) .

Ejemplo 8 Expansión in vitro de fragmentos de páncreas humano Durante el desarrollo de páncreas embrionario, neurogenina 3+ o células de expresión de insulina fueron vistas en la red de ductos pancreáticos, y se sugirió que las células de ductos pancreáticos dan origen a progenitores endocrinos y consecuentemente células endocrinas maduras. Se ha demostrado que células de ducto pancreático humano se diferencian en células productoras de insulina sensibles a glucosa in vitro (Bonner-Weir, S et al 2000 PNAS) , y este descubrimiento altozo a las células de ductos pancreáticos una fuente atractiva para terapia de reemplazo de células beta. Sin embargo, ha sido difícil expandir células de ductos sin perder la capacidad de diferenciación endocrina. En el sistema de cultivo reportado previamente, células de ducto de páncreas humano pierden propiedad epitelial o sufren senescencia después de 2 semanas hasta 5 semanas (Trautmann B et al. Páncreas vol. 8, 248-254). Por lo tanto, no existe un sistema de cultivo robusto para expandir células de ductos de páncreas humanos, que conserven la capacidad de diferenciación endocrina. Tomando ventaja del establecimiento del sistema de cultivo de organoides de páncreas de ratón, aquí, se intentó establecer un sistema de cultivo de organoides de páncreas humano.

Crecimiento de progenitores pancreáticos humanos in vitro Páncreas humano se obtuvo de Leiden University Medical Center, Los Países Bajos. Importantemente, bajo las mismas condiciones que las descritas para fragmentos de páncreas de ratón arriba (ejemplo 7) , fragmentos de páncreas recién aislados humanos también pueden cultivarse in vitro (figura 30) .

Bajo estas condiciones de expansión, la eficiencia de cultivo de los fragmentos pancreáticos fue de aproximadamente 80%, significando que 80% de los fragmentos pancreáticos recién aislados se expandieron eficientemente in vitro durante un periodo de tiempo más largo. En comparación con páncreas de ratón, el tejido acinar forma más fácilmente estructuras de quiste, sin embargo, esta estructura dejó de proliferar dentro de 4 semanas. Células de ductos de páncreas de una red ductular más grande producen más eficientemente estructuras de quiste y eventualmente forman organoides con brote. Los organoides de páncreas fueron divididos en una relación 1:5 una vez a la semana y se mantuvieron in vitro al menos 5 semanas sin perder capacidad de proliferación.

En resumen, se estableció un sistema de cultivo de organoides de páncreas humano y se tuvo éxito en la expansión de células de ducto de páncreas al menos 3,300 veces del volumen original. Se están optimizando las condiciones de cultivo de diferenciación endocrina para células de ducto de páncreas humano, y este enfoque in vifcro, una vez optimizado, podría tener implicaciones importantes para elaborar una terapia de reemplazo de células beta disponible para un número más grande de personas con diabetes mellitus tipo 1 y 2.

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Ejemplo 9 Cultivo de criptas de intestino delgado o colon humanos in vitro Como se describió en . los ejemplos 1 y 2 por primera vez es posible generar condiciones de cultivo a largo plazo para que epitelio de intestino delgado y colon de ratón. Organoides cripta-vellosidad crecen a través de la suplementación de un conjunto de factores de crecimiento divididos y una matriz extracelular . Los organoides contienen células madre intestinales que se dividen activamente y dan lugar a todos los principales linajes de células diferenciadas presentes en el intestino. En este ejemplo se demuestra que estas condiciones de cultivo no son exclusivas del epitelio intestinal de ratón, sino que también se pueden usar para cultivar epitelio intestinal humano.

Materiales y métodos Cultivos de organoides de colon de ratón Cultivos de organoides de ratón se altocieron como se describió en el ejemplo 1. Se usó la producción de inaltobidor de Wnt (IWP-2) para inaltobir la secreción de nt (Chen et al, Nat Chem Biol . 2009 Feb;5(2) :100-7) .

Cultivos de organoides de colon humano Criptas de colon humano fueron aisladas de una muestra colónica normal extirpada y se cultivaron como estructuras organoides durante 7 días usando el sistema de cultivo de organoides establecido (Sato et al, 2009 Nature, mayo 14 ; 459 (7244 ): 262-5) . Dado que este protocolo se ha optimizado para cultivos de organoides derivados de ratón, se altozo un pequeño cambio al añadir medio acondicionado Wnt3a, con el fin de asegurar un crecimiento óptimo de los organoides "de colon humano. Para obtener este medio condicionado, nt3a se expresa en una línea celular mediante la transferencia de una construcción de expresión adecuada que codifica para el ligando. Esta línea celular se cultiva y el medio de cultivo que comprende el ligando secretado se cosecha en intervalos de tiempo adecuados. Por ejemplo, las células comienzan la producción de Wnt3a en el momento en que confluyen y dejan de crecer. Medio de cultivo de células que no fueron transíectadas o infectadas con la construcción de expresión vacía se usó como un control negativo. El medio acondicionado fue recogido y probado, por ejemplo en un ensayo en donde la expresión de luciferasa es controlada por elementos sensibles a TCF para cuantificar la presencia de un agonista de Wnt tal como nt3a (Korinek et al., 1997. Science 275 : 1784-1787) .

Resultados La proliferación del epitelio intestinal depende de la vía de señalización de Wnt. La ubicación exacta de la fuente de Wnt no es, sin embargo, clara (Gregorieff y Clevers, 2005, Genes Dev. 15 de abril; 19 (8) : 877-90) . Ya que los organoides intestinales de ratón crecieron de manera independiente de nicho (Sato et al., 2009 Nature, 14 de mayo; 459 (7244) : 262-5) se supuso que estos organoides pueden producir sus propios ligandos Wnt. Para probar esto, se inaltobió la secreción de Wnt a través de incubación con un inaltobidor de puercoespín. El puercoespín es importante para la secreción de Wnt (figura esquemática 31a) . La Incubación con 1 \xm de IWP (Chen et al., Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2) : 100-7) resultó en la muerte de los organoides (figuras 31b y 31c) . Los organoides pudieron ser rescatados al añadir medio acondicionado Wnt3a, lo que indica que los organoides de hecho producen ligandos Wnt (figuras 31d y 31e) .

A continuación se intentó cultivar organoides intestinales humanos. Resultó que la adición de Wnt3a al medio era necesaria porque sin éste, los organoides de cripta nunca formaron estructuras en brote y murieron dentro de 5 a 10 días para el intestino delgado y en 3-4 días para el colon (Figura 32) . En general, los organoides de cripta intestinal humana crecieron de una manera comparable a los cultivos de organoides de ratón. Típicamente, se obtuvo hasta 80% de eficiencia de cultivo en función de la actividad de medio acondicionado Wnt-3a. Los cultivos intestinales humanos han estado en cultivo durante un máximo de tres meses. El efecto de Wnt-3a en colon humano se esperaba, ya que se observó que también mejoraba los efectos en cultivo de organoides de colon de ratón. El requisito de Wnt-3a en intestino delgado y colon humanos puede provenir de una menor producción de Iigandos Wnt endógenos por los organoides humanos, debido a los números más bajos de células de Paneth presentes en el intestino humano, en comparación con el intestino de ratón. Hasta el momento, no hubo sistema de cultivo intestinal humano reproducible a largo plazo, y nuestro sistema de cultivo es útil no sólo para entender la biología de las células madre intestinales humanas, sino también para aplicar pruebas clínicas orientadas clínicamente, tales como detección de fármacos.

Ejemplo 10 Condiciones de cultivo optimizadas para el crecimiento de organoides de estómago Como se describió en el ejemplo 5, se ha identificado un medio de cultivo que puede ser usado para cultivar epitelio del estómago durante largos periodos . A continuación se describen las condiciones optimizadas para estos cultivos de organoides de estómago.

Materiales y métodos Aislamiento de unidad gástrica, disociación unicelular y clasificación de células EGFP+ve Glándulas gástricas fueron aisladas de las regiones del píloro de ratón como se describió anteriormente, con algunas modificaciones (Bjerknes y Cheng, 2002, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Septiembre; 283 (3) :G767-77) . Brevemente, bajo el microscopio, el estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor, se lavó con solución salina y el píloro fue aislado. La capa muscular del estómago se retiró y el epitelio restante se dividió en pedazos de 5 mm y se incubaron durante 3-5 horas en una solución salina de pH regulado (Na2HP04 28 mM, H2P04 40 mM, NaCl 480 mM, KC1 8 nim, sacarosa 220 mM, D-Sorbitol 274 mM, DL-ditiotreitol 2.6 mM) , que contenía 10 mM de EDTA (para el cultivo o tinción) o EGTA 5 mM (para el aislamiento de ARN) a 4°C. Después de la remoción del agente quelante, los fragmentos de tejido fueron suspendidos con fuerza en la solución de pH regulado con una pipeta de 10 mi. Después de la suspensión y centrifugación, el sedimento se enriqueció en glándulas gástricas. Tras el aislamiento de las glándulas, las células fueron recogidas y resupendidas en medio SMEM libre de calcio (Invitrogen) , complementadas con 10 mg/ml de tripsina y 0.8 unidades/µ? de DNasa I (para el análisis de microdisposición) o resuspendidas en TrypleExpress (GIBCO) suplementado con 0 8Unidades/ul de DNAase (para fines de cultivo) . En ambos casos, después de la incubación a 37°C durante 20-25 minutos, las células fueron centrifugadas, y se filtraron a través de una malla de 40 mieras. Células EGFPalto y EGFPIo fueron ordenadas por citometría de flujo (MoFIo, Beckman Coulter) . Las células epiteliales viables individuales fueron cerradas por la dispersión hacia adelante y el parámetro de ancho de pulso. Donde se indique, las células fueron ya sea cerradas para la tinción negativa de yoduro de propidio, recogidas en Trizol LS (Invitrogen) y el AR fue aislado de acuerdo con el protocolo de los fabricantes, o recolectadas en medio de cultivo gástrico, incrustadas en Matrigel (BD Bioscience) y cultivadas de acuerdo con el protocolo que se detalla a continuación Cultivo gástrico Para el cultivo, las glándulas gástricas aisladas fueron contadas y un total de 100 glándulas se mezclaron con 50 ul de Matrigel (BD Bioscience) y se colocaron en placas de 24 pocilios. Después de la polimerización de Matrigel, medio de cultivo gástrico (Advanced DMEM/F12 complementado con B27, N2 y nAcetilcisteína (Invitrogen) que contenía factores de crecimiento (50 ng/m de EGF (Peprotech) , 1 ug/ml de R-spondinl, 100 ng/ml de Noggin (Peprotech), 100 ng/ml de FGF10 (Preprotech) y medio acondicionado Wnt3a) fue puesto encima. Para el cultivo de células individuales, un total de 100 células EGFPaito ordenadas/pocilio fueron recogidas en medio de cultivo gástrico e incrustadas en Matrigel (BD Bioscience) . Después de la polimerización de atrigel, medio de cultivo gástrico fue puesto encima. Durante los primeros 2 días después de la siembra, el medio también fue suplementado con 10 µ? de inaltobidor de ROCK, Y-27632 (Sigma Aldrich) , para evitar anoikis . Factores de crecimiento fueron añadidos cada segundo día y el medio completo se cambió cada 4 días. Para el pasaje, organoides gástricos fueron retirados de Matrigel, disociados mecánicamente y transferidos a Matrigel fresco. El pasaje se realizó cada 1 a 2 semanas con una relación de división 1:5-1:8. Para confirmar el requerimiento de nt3a, proteína recombinante Wnt3a de ratón (Stem cell technologies ) se complementó en lugar del medio acondicionado Wnt3a. Para los experimentos de rastreo in vi tro, organoides gástricos de 2 semanas de edad fueron incubados con 100 nM de 4-altodroxitamoxifeno en medio de cultivo gástrico durante 20 horas para activar Lgr5-CreERT2. YFP fue posteriormente visualizado y registrado en organoides vivos usando microscopía confocal (Leica, SP5) .

Medio acondicionado Wnt3a El medio Wnt3a se preparó siguiendo el protocolo descrito en cualquier parte ( illert et al, 2003, Nature. Mayo 22;423 (6938) :448-52) . El ensayo TOP/FOP se utilizó para probar la actividad de Wnt del medio Wnt3a acondicionado y el medio de control acondicionado, según lo descrito por van de Wetering y sus colegas (van de Wetering et al., 2001 Cáncer Res. Enero 1 ; 61 (1) : 278-84) . Una relación TOP/FOP > 50 se consideró alto medio nt y se diluyó 1:1 con el medios de cultivo de organoides gástricos. Una dilución 1:10 de este alto medio Wnt3a (relación TOP/FOP ~ 5) se consideró bajo medio Wnt y se usó con fines de diferenciación.

Inmunoaltostoquímica de organoides gástricos Para inmunoaltostoquímica, organoides gástricos se lavaron una vez con PBS y se fijaron inmediatamente con paraformaldehído al 4% durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Cuando se indica, los organoides gástricos fueron incrustados en parafina y procesados mediante técnicas estándares. Para la tinción de montaje entero, las muestras fueron permeabilizadas con PBS, 0.5 5% de Triton-X100-1% de BSA y se incubaron durante la noche con los anticuerpos primarios. Después de varios lavados en PBS 0.3% de Tritón X100, las muestras fueron incubadas con el anticuerpo secundario. La tinción con EdU se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Click-IT; Invitrogen) . Los núcleos fueron teñidos con yodo TOPR03 o Hoescht33342. Las imágenes de las glándulas gástricas y organoides gástricos fueron adquiridas mediante microscopía confocal (Leica, SP5) . La reconstrucción tridimensional se realizó usando el software Volocity (Improvision) .

RT-PCR Se extrajo el ARN de cultivos de células gástricas o tejido recién aislado usando el RNeasy Mini RNA Extraction Kit (Qiagen) y se transcribió de forma inversa con transcriptasa inversa de virus de la leucemia murina de Moloney (Promega) . El ADNc se amplificó en un termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Londres, Reino Unido) como se describió previamente (Huch et al, 2009) . Los cebadores usados se muestran abajo (símbolo del gen seguido por cebadores hacia adelante (5'-3') y hacia atrás (5 '-3')).

L'gr5: GGAAATGCTTTGACACACATTC, GGAAGTCATCAAGGTTATTATAA Gif: TGAATCCTCGGCCTTCTATG, CAGTTAAAGTTGGTGGCACTTC Pgc: CCAACCTGTGGGTGTCTTCT, TTAGGGACCTGGATGCTTTG Muc6 TGCATGCTCAATGGTATGGT, TGTGGGCTCTGGAGAAGAGT Muc5ac: CCATGAAGTGGGAGTGTGTG, TTGGGATAGCATCCTTCCAG Ghrl: GCCCAGCAGAGAAAGGAATCCA, GCGCCTCTTTGACCTCTTCC Gast: GCCAACTATTCCCCAGCTCT, GGCTCTGGAAGAGTGTTGCT Stt: GAGGCAAGGAAGATGCTGTC, GGGCATCATTCTCTGTCTGG Muc2 : GAACGGGGCCATGGTCAGCA, CATAATTGGTCTTGCATGCC Cdx2 : CTTGCTGCAGACGCTCAAC, TCTGTGTACACCACCCGGTA Hprt: AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA, TTGCGCTCATCTTAGGCTTT Resultados Para determinar el crecimiento óptimo de las unidades gástricas in vitro se aislaron unidades de glándulas gástricas que se suspendieron en Matrigel y se cultivaron en condiciones diferentes . Las condiciones de crecimiento del cultivo gástrico fueron similares a las de los cultivos de intestino delgado (incluyendo EGF, Noggin y R-spondin 1) , a excepción de una estrecha dependencia en Wnt3a en forma de medio acondicionado. Este requisito se confirmó usando proteína nt3a purificada (figura 33a) . Además, FGF10 ha demostrado ser un componente esencial para la conducción de los eventos de brote y para la expansión de los cultivos en organoides de unidades múltiples (figura 33b) . FGF10 puede ser usado para reemplazar FGF7 (KGF) , que se ha usado en el ejemplo 5, e incluso se traduce en un aumento de 2 veces del porcentaje de organoides en brote 4 días después del inicio del cultivo (figura 33c) . Los organoides gástricos recién formados sufrieron continuos eventos de brotación, mientras conservaban su polaridad, con brotes de dominio de glándula gástrica distribuidos alrededor de un lumen central (figura 33d) . En ausencia de medio acondicionado nt3a, los organoides gástricos se deterioraron rápidamente (figura 33e) . Cada semana, los organoides fueron disociados mecánicamente y divididos en una quinta parte de su densidad antes de plaqueo. Las unidades pilóricas cultivadas fueron estructuras epiteliales de una sola capa, como se evidencia por tinción con E-Cad (figura 33f) . Hemos cultivado con éxito organoides gástricos durante al menos 8 meses sin pérdida detectable de las propiedades anteriormente descritas.

Para determinar si las células Lgr5+Ve gástricas (figura 34a) eran capaces de generar y mantener unidades de glándulas gástricas pilóricas in vitro se clasificaron células Lgr5-EGFP altas (figura 34b) . Cuando células Lgr5-EGFP altas fueron clasificadas, un promedio de 8% de las células se convirtieron en organoides, mientras que el resto de las células murieron dentro de las primeras 24 h. Las células Lgr5-EGFPalto clasificadas empezaron a dividirse rápidamente y pequeñas estructuras tipo quistes ya eran visibles después de 5 días. Durante los días siguientes, las estructuras (tipo quiste) recién formadas comenzaron a generar dominios tipo glándulas (figura 34c) . Después de 9-11 días de cultivo, los organoides gástricos fueron disociados manualmente y divididos para generar nuevos organoides. Los organoides gástricos derivados de las células individuales se han vuelto a plaquear con éxito una vez por semana durante al menos 3 meses, sin perder las propiedades descritas anteriormente (figura 34d) . Desde el día 7 en adelante, la expresión de Lgr5-EGFP se restringió a la base de los dominios tipo glándula (figura 34e) . Como lo demuestra la tinción con EdU, las células en proliferación se ubicaron en la base de estos dominios tipo glándula (figura 34f ) , mientras que células caspasa 3 -positivas apoptóticas se encontraron extruidas en el lumen (datos no mostrados) . El rastreo de linaje fue estudiado en organoides establecidos derivado de células Lgr5+ve individuales aisladas de un ratón reportero Lgr5 -EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP . Después de la inducción con tamoxifeno, el gen reportero YFP+ve se activó rápidamente en células Lgr5+ve individuales dentro de los dominios tipo glándula. Durante los próximos días, el dominio de expresión de YFP se expandió considerablemente en los organoides en crecimiento, lo que confirma la contribución de las células madre Lgr5+ve al crecimiento de organoides in vitro (figura 34g) . Los organoides derivados de cultivos unicelulares fueron estructuras epiteliales de una sola capa, como lo demuestra la tinción con E-cadherina (figura 34i) . Además de Lgr5, los cultivos expresaron los marcadores epiteliales gástricos: factor intrínseco gástrico, mucina 6 y pepsinógeno C. No se observó a los linajes de cavidad o enteroendocrino en estas condiciones de cultivo (esto es diferente del ejemplo 5 donde el linaje de células de cavidad fuer observado) . Sin embargo, en ese ejemplo se usó proteína Wnt3a en lugar del medio acondicionado Wnt, que es menos activo. La reducción de la concentración de medio acondicionado Wnt se traduce en diferenciación en el linaje de células de cavidad, ver más abajo) . La reducción de la concentración de Wnt3A en el medio de cultivo resultó en la formación de estructuras gástrica comparables que albergan células de cavidad polarizadas, como lo demuestra la expresión de la mucina gástrica 5AC (MUC5AC) y ácido peryódico-Scaltoff (PAS) , células del cuello mucoso, como lo demuestra la expresión de Tff2 y algunas células enteroendocrinas inmaduras dispersas (cromogranina A) (figuras 34h y 34i) . La adición de factores de crecimiento adicionales como: RA, IGF y exendin4 puede traducirse en una diferenciación más madura de los cultivos de estómago hacia los diferentes linajes de células. En conjunto, estas observaciones in vivo e in vitro demuestran que Lgr5 está marcando una población antes no vista de células madre adultas multipotentes y auto-renovantes en el estómago pilórico .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un organoide cripta-vellosidad, caracterizado porque comprende un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad o un organoide de cripta colónica.

2. Un método para cultivar células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales, o células de adenoma, caracterizado porque comprende proporcionar una matriz extracelular; incubar con la matriz extracelular una célula madre epitelial, un fragmento de tejido aislado que comprende las células madre epiteliales, o una célula de adenoma con la matriz extracelular; cultivar la célula madre, fragmento de tejido aislado o célula de adenoma en presencia de un medio de cultivo celular, que comprende un medio basal para células animales o humanas al cual se le añade : un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP) ; entre 5 y 500 ngramos/ml de un factor de crecimiento mitogénico, con lo cual se añade un agonista de Wnt si se cultivan células madre epiteliales y fragmentos de tejido aislados .

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inaltobidor de BMP es Noggin, el factor de crecimiento mitogénico es factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de queratinocitos , y el agonista de Wnt es R-Spondin 1.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inaltobidor de BMP se selecciona de Noggin, DAN y proteínas tipo DAN, incluyendo Cerberus y Gremlin.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2 ó 4, caracterizado porque el agonista de Wnt' se selecciona uno o más de Wnt, R-Spondin 1-4, Norrin, y un inaltobidor de GSK.

6. El método de conformidad con las reivindicaciones 2 y 3-5, caracterizado porque el agonista de Wnt comprende R-spondin 1 y Wnt-3a, y/o el factor de crecimiento mitogénico es EGF.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque el medio de cultivo comprende además un inaltobidor de Rock (Rho-cinasa) , seleccionado de Y-27632, Fasudil y H-1152.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque el medio de cultivo comprende además un agonista de Notch.

9. Un método para obtener y/o cultivar una cripta del colon, preferiblemente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque - células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en contacto con una matriz extracelular en un medio que comprende Noggin, EGF y R-Spondin 1 y/o Wnt-3 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-Acetilcisteína.

10. El método preferiblemente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para la obtención y/o cultivo de un organoide pancreático, caracterizado porque - células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en contacto con una matriz extracelular en un primer paso en un medio que comprende EGF, KGF o FGF, y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2 y N-Acetilcisteín , - posteriormente, en un segundo paso en un medio que comprende EGF y R-spondin 1 como agonista de Wnt, complementado con B27, N2, y N-Acetilcisteína.

11. Un método para obtener y/o cultivar un fragmento gástrico, preferiblemente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, caracterizado porque: - células madre epiteliales, fragmentos de tejido aislados que comprenden las células madre epiteliales o células de adenoma se cultivan en contacto con una matriz extracelular en un primer paso en un medio que comprende Noggin como inaltobidor de BMP, factor de crecimiento epidérmico y FGF10 como factor de crecimiento mitogénico, R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, y que comprende además B27, N2, N-Acetilcisteína, - posteriormente, en un segundo paso en un medio que comprende factor de crecimiento epidérmico y R-spondin 1 y Wnt-3a como agonista de Wnt, Noggin y FGF10 complementado con B27, N2 , y N-Acetilcisteína, en donde la concentración de Wnt-3 se reduce en el segundo paso en comparación con la concentración de Wnt-3a que está presente en el primer paso.

12. Un medio de cultivo celular, caracterizado porque comprende un medio basal para células animales o humanas al que se le añade : un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP) ; un agonista de Wnt, y entre 5 y 500 nanogramos/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) .

13. Uso del medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 12 para el cultivo de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido aislados en "una matriz extracelular .

1 . Un organoide cripta-vellosidad, caracterizado porque comprende un lumen central revestido por un epitelio tipo vellosidad o un organoide de cripta colónica que se puede obtener por el método de conformidad con las reivindicaciones 2 a 9.

15. Un organoide pancreático caracterizado porque comprende estructuras tipo islotes, de preferencia obtenibles por el método de conformidad con las reivindicaciones 2 a 8 ó 10.

16. A organoide gástrico caracterizado porque comprende un lumen central, de preferencia obtenible por el método de conformidad con las reivindicaciones 2 a 8 u 11. 17 Uso de los organoides cripta-vellosidad o cripta del colon de conformidad con la reivindicación 1 ó 14 , los organoides pancreáticos de conformidad con la reivindicación 15, o los organoides gástricos de conformidad con la reivindicación 16, en un estudio de descubrimiento de fármacos, ensayo de toxicidad, o en medicina regenerativa. 18 Uso de un medio de cultivo celular que comprende un medio basal para células animales o humanas al que se le añade: un inaltobidor de proteína morfogenética ósea (BMP) ; y entre 5 y 500 nanogramos/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para el cultivo de células de adenoma .