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CN103534240B - 选择性fak抑制剂 - Google Patents

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CN103534240B
CN103534240B CN201280018816.6A CN201280018816A CN103534240B CN 103534240 B CN103534240 B CN 103534240B CN 201280018816 A CN201280018816 A CN 201280018816A CN 103534240 B CN103534240 B CN 103534240B
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Abstract

一种用作FAK抑制剂的式(I)的化合物，其中R1或R2为环胺基且R5为具有含羰基取代基的芳族基团。

Description

选择性FAK抑制剂
技术领域
本发明涉及抑制粘着斑激酶（FAK）（也称为酪氨酸蛋白激酶2（PTK2））的2,4,5-取代的嘧啶并且涉及含有此类化合物的药物组合物。本发明还涉及使用此类化合物用于预防和/或治疗增生性疾病（如癌症）的方法。
背景技术
定向细胞迁移在许多生理和病理过程（包括胚胎发育、伤口愈合、血管生成、肿瘤侵入和转移）中是很重要的。刺激细胞定向移动的细胞外信号转导可以通过许多方法来诱发，包括结合至细胞外基质蛋白的跨膜整联蛋白和生长因子（例如EGF、IGF和VEGF）对其同源受体的胞外结构域的作用。
FAK是介导来自跨膜整联蛋白和生长因子受体两者的信号的非受体酪氨酸激酶。已经报道，FAK在协调这些不同的细胞外信号、以通过它们的外部环境定向移动细胞的方式来整合它们中发挥核心作用(TomarandSchlaepfer.CurrentOpinioninCellBiology:2009,21,676-683)。
整联蛋白聚集或生长因子受体(例如EGFR、IGF-1R、Her2和VEGFR)的活化在Y397促进FAK自磷酸化。然后磷酸化的Y397FAK结合至c-Src(本文称为Src)并且在Y576和Y577发生Src介导的FAK磷酸化以产生活性FAK-Src复合物。然后活性FAK-Src通过许多生化途径促进发信号，这对以下过程有影响：如细胞粘附、迁移、侵入，细胞存活、增殖，获得化疗耐受性和转移等(BruntonandFrame.CurrentOpinioninPharmacology:2008,8,437-432andChatzizachariasetal.ExpertOpinioninTherapeuticTargets:2007,11(10),1315-1328)。
细胞粘附
解决FAK在细胞粘附中的作用的功能性研究表明其有助于粘着斑装配(RichardsonandParsons.Nature:1996,380,538-540)和粘着斑翻转（focaladhesionturnover）(Finchametal.Oncogene:1995,10(11),2247-2252)。在人类和小鼠细胞系中通过RNAi抑制FAK（导致了降低的FAK蛋白水平）在体外已经证明降低了细胞对纤连蛋白/层粘连蛋白涂覆的孔板的粘附力(Tsutsumietal.InternationalJournalofOncology:2008,33(1),215-224)。
细胞迁移
有较强的证据表明FAK是细胞迁移的关键调节因子(AngelucciandBologna.CurrentPharmaceuticalDesign:2007,13,2129-2145和Mitraetal.NatureReviewsMolecularCellBiology:2005,6,56-68)。源自FAK-/-小鼠胚胎的细胞由于受损的粘附翻转显示出降低的迁移(etal.Nature:1995,377,539-544)。此外，从粘着斑移位FAK降低了细胞迁移(GilmoreandRomer.MolecularBiologyoftheCell:1996,7(8),1209-1224)，而在CHO细胞中的过表达刺激迁移(Caryetal.JournalofCellScience:1996,7,1787-1794)。另外，在人类和小鼠细胞系中通过RNAi抑制FAK（导致降低的FAK蛋白水平）在体外趋触性迁移测定中已经显示降低了细胞迁移(Tsutsumietal.InternationalJournalofOncology:2008,33(1),215-224)。
细胞侵入
已经证明FAK活化增强了基质降解侵入行为。FAK-Src通过细胞凋亡易感性蛋白(CAS)发信号(Liaoetal.JournalofExperimentalandClinicalCancerResearch:2008,27:15)引起表达基质金属蛋白酶(MMP)，包括MMP2和MMP9。FAK-Src活化也通过磷酸化endophilinA2来促进细胞表面表达MMP14。然后MMP14通过切割pro-MMP2将MMP2活化成其活性形式(SiesserandHanks.ClinicalCancerResearch:2006,12(11),3233-3237)。高度侵袭性的癌细胞形成称为侵袭伪足(invadopodia)的特化的富含肌动蛋白的细胞外基质降解膜突出物，其富含基质降解蛋白酶如MMP。已经证明FAK和Src两者都有助于侵袭伪足的形成(Chanetal.JournalofChemicalBiology:2009,185(2),357-370)。
细胞存活
已经证明FAK在细胞存活中起重要作用。已经证明FAK的活化会抑制失巢凋亡(对不适当的细胞外基质环境做出应答的凋亡)(FrischetalJournalofCellBiology.1996,134(3),793-799和XuetalCellGrowthandDifferentiation.1996,7(4),413-418)。研究表明FAK在成纤维细胞和上皮细胞中激活多个下游通路以抑制失巢凋亡(Zouqetal.JournalofCellScience:2008,122,357-367)。在人类肠隐窝细胞中，通过FAK与β1整联蛋白的结合发信号，并且随后结合Src通过PI3-K/Akt-1信号传导上调抗-凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1的表达。PI3-K/Akt-1信号传导还下调促凋亡激活剂Bax和Bak的表达，引起促凋亡增敏剂Bad的磷酸化并拮抗p38β的活化。FAK/Src的分离导致持续的/增强的p38β活化，该p38β是凋亡/失巢凋亡驱动剂(Bouchardetal.Apoptosis:2008,13,531-542)。
细胞增殖
降低FAK或β1整联蛋白的表达并因此破坏β1-FAK信号轴导致降低了分布于肺中的微转移细胞的初始增殖。使用3D培养的D2细胞观察到在FAKY397和Y861的磷酸化与增殖能力之间具有较强相关性(ShibueandWeinberg.PNAS2009,106(25),10290-10295)。已经证明转染以过表达FAK的HL-60细胞翻倍的速率比对照HL-60细胞快1.5倍。研究发现在过表达FAK的细胞中，细胞周期蛋白D3表达和CDK活性的显著诱导。活化PI3-K/Akt-1信号传导(在许多研究中与FAK活化有关的过程)被确定为细胞周期蛋白表达/活化的一种可能原因(Yamamotoetal.CellularSignaling:2003,15.575-583)。
获得化疗耐受性
使顺铂敏感性卵巢癌细胞系OAW42暴露于顺铂治疗和随后恢复的重复循环，导致了化学耐受性OAW42-R细胞的形成。旨在确定该化学耐受性的原因的研究发现，FAK在敏感性和化学耐受性细胞两者中具有构成性活性(constituentlyactive)。然而，通过用顺铂治疗在OAW42细胞中诱导了Y397FAK磷酸化的抑制，但在OAW42-R细胞中则没有(Poulain及其同事.Gynaecologiconcology:2006,101,507-519)。还在体外和在体内使用FAK抑制剂TAE226（单独地以及与多西紫杉醇联用），在紫杉烷敏感性(SKOV3ip1和HeyA8)及紫杉烷耐受性(HeyA8-MDR)卵巢癌细胞系中研究了FAK抑制对化学耐受性的影响。TAE226具有如下结构：
并且在WO2004/080980和WO2005/016894中进行描述。在体外，TAE226在Y397和Y861位点抑制了FAK的磷酸化，以时间和剂量依赖方式抑制细胞生长，并且分别在紫杉烷敏感型和紫杉烷耐受型细胞系中将多西紫杉醇介导的生长抑制增强了10-倍和20-倍。在体内，与载体治疗的对照相比，通过TAE226对FAK抑制显著地降低了HeyA8、SKOV3ip1和HeyA8-MDR模型中的肿瘤负荷(46-64%)。然而，在所有三个模型中通过伴随给予TAE226和多西紫杉醇，观察到了最大疗效(降低85-97%)。另外，TAE226与多西紫杉醇的联用显著地延长了荷瘤小鼠的生存期(Halderetal.CancerRes:2007,67(22),10976-10983)。
转移潜能
几项研究已经研究了动物模型中FAK蛋白水平的作用及其与肿瘤进展的关系。在小鼠皮肤癌形成模型中，与FAK+/+野生型对照小鼠相比，使用FAK+/-小鼠，降低了与减少的乳头瘤形成相关的FAK蛋白表达(46%)(McLeanetal.CancerResearch:2001,61,8385-8389)。使用人乳腺癌细胞，研究人员发现在正位移植入裸鼠体内后，FAKsiRNA处理过的细胞被抑制向肺部转移(Benlimameetal.JournalofCellBiology:2005,171,505-516)。使用短发夹RNA(shRNA)针对4T1小鼠乳腺癌细胞中FAK的类似实验，在正位移植入乳腺垫后，抑制了向肺部的转移(Mitraetal.Oncogene:2006,25,4429-4440)。在4T1小鼠乳腺癌细胞中通过显性阴性表达抑制FAK，在小鼠中降低了肿瘤的生长和血管生成(Mitraetal.Oncogene:2006,25,5969-5984)。在乳腺癌的转基因模型的乳腺上皮细胞中使用Cre/loxP重组系统来破坏FAK功能，证明FAK表达对于恶变前增生转变成癌症以及它们随后的转移是需要的。所观察到的肿瘤发展的降低进一步与受损的乳腺上皮细胞增殖相关，表明FAK在乳腺肿瘤发展中起着关键作用(Lahlouetal.PNASUSA:2007,104(51),20302-20307)。
根据上述观察，已经在许多人类癌症中报道FAKmRNA和/或蛋白的过表达，包括结肠直肠癌(deHeer.EuropeanJournalofSurgicalOncology:2008,34(11),1253-1261)、前列腺癌(Tremblay,L.,W.Hauck,etal.InternationalJournalofCancer:1996,68(2),164-171)、乳腺癌(Watermannetal.BritishJournalofCancer2005,93(6),694-698)和黑色素瘤(Hessetal.CancerResearch:2005,65(21),9851-60)。另外，FAK过表达经常与这些癌症的更高侵入性的表型相关。
因此，有较强的证据表明，FAK抑制剂可以用于降低细胞粘附、细胞迁移、细胞侵入、细胞增殖和化学耐受性。此外，FAK抑制剂可以适用于诱导在不合适的细胞外基质环境中的细胞凋亡以及降低血管生成。
作为选择性FAK抑制剂的化合物能够靶向特异性生物途径，而不存在由对任何靶(如其他蛋白激酶)的抑制所引起的任何潜在问题。
相应地，选择性地抑制FAK的化合物将用于治疗增生性疾病，例如癌症。
经报道用于抑制FAK的两种化合物是PF-562,271和PF-573,228。
WO2004/056786、WO2004/056807、WO2005/023780、WO2007/063384和Robertsetal.CancerRes2008,68(6),1935-1944中描述了PF-562,271。
Slack-Davisetal.J.Biol.Chem.2007,282(20),14845-14852中描述了PF-573,228。
除了这些具体描述的化合物之外，在WO2008/129380、WO2008/115369、WO2009/105498、US2010/113475、WO2009/143389、WO2009/071535、WO2010/055117、WO2010/058030、WO2010/058032、WO2007/140222和WO2009/024332中公开了其他类别的FAK抑制剂。
发明内容
本发明人已经发现了一类特殊的化合物，它们是有效的选择性FAK抑制剂。这些化合物可以显示出FAK对激酶如IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)、IR(胰岛素受体)和CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)，以及对其他激酶如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的选择性。此外，本发明的化合物对细胞色素p450酶(特别是2C9和3A4同种型)的抑制可具有增强的选择性。此外，本发明的化合物可以更不容易与谷胱甘肽形成加合物。
在第一方面，本发明提供了下式(I)所示的化合物：
其中：
R1选自：H和
其中：
RN1选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN2选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN3选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN4选自H和CH3；
R2选自H和
其中：
RN5选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN6选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
并且其中R1和R2中仅一个是H；
R3选自O-C1-2烷基、C1-2烷基、卤素、氰基，其中所述C1-2烷基可以被一个或多个氟基团取代；
R4选自CF3、卤素、CF2H和CN；且
R5选自下式的组中：
其中：
R6选自H、(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1和(CH2)n2C(O)OZ2；其中：
n1为1；
RC1为H或Me；
RN6为H或CH3；
Z1为H、CH3或OCH3；
n2为1；且
Z2为CH3；
并且其中RN6和Z1中仅一个可以是CH3，
R7选自H和(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1，其中：
m1为0或1；
RM1为H；且
Y1为H、Me或OCH3；
并且R6和R7中仅一个为H；且
R8为H或当R7为C(=O)NH2时R8选自H和C1-2烷基。
本发明的第二方面提供包含第一方面的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
本发明的第三方面提供第一方面的化合物用于治疗方法中。
本发明的第四方面提供第一方面的化合物在制备用于治疗通过抑制FAK而改善的疾病的药物中的用途。本发明的第四方面还提供第一方面的化合物在治疗通过抑制FAK而改善的疾病的方法中的用途。
本发明的另一方面提供如本文所述的活性化合物(优选为药物组合物的形式)在人类或动物体的治疗方法中的用途。
本发明的另一方面提供在体外或在体内抑制FAK的方法，包括使细胞与有效量的如本文所述的活性化合物接触。
在下面将更详细地讨论每个基团R1～R8。
R1
R1可以具有下列结构之一：
当R1为H时，R2(如下所讨论)不为H。
RN1、RN2和RN3各自独立地选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)和C(=O)Me并且RN4选自H或甲基。
R2
R2可以具有下列结构之一：
当R2为H时，R1(所上面所讨论)不为H。
RN5和RN6独立地选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)和C(=O)Me。
R3
R3选自O-C1-2烷基、C1-2烷基、卤素、氰基，其中所述C1-2烷基可以被一个或多个氟基团取代。因此，R3可以为：
a)卤素：F、Cl、Br、I；
b)氰基：CN
c)C1-2烷基，可选地被一个或多个氟基团取代：CH3、CH2F、CHF2、CF3、CH2CH3、CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3、CHFCH3、CHFCH2F、CHFCHF2、CHFCF3、CF2CH3、CF2CH2F、CF2CHF2、CF2CF3；
d)O-C1-2烷基，其中所述C1-2烷基可选地被一个或多个氟基团取代：O-CH3、O-CH2F、O-CHF2、O-CF3、O-CH2CH3、O-CH2CH2F、O-CH2CHF2、O-CH2CF3、O-CHFCH3、O-CHFCH2F、O-CHFCHF2、O-CHFCF3、O-CF2CH3、O-CF2CH2F、O-CF2CHF2、O-CF2CF3。
R4
R4选自CF3、卤素(即F,Cl,Br,I)、CF2H和CN。
在一些实施方式中，卤素基团为Cl或Br。
R5
R5选自下式的组：
R6
R6选自H、(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1和(CH2)n2C(O)OZ2；其中：
n1为1；
RC1为H或Me；
RN6为H或CH3；
Z1为H、CH3或OCH3；
n2为1；且
Z2为CH3；
其中RN6和Z1中仅一个可以是CH3。
当R6为H时，R7(如以下所讨论)不为H。
如果R6为(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1，其可以选自：CH2C(O)NH2、CH2C(O)NHCH3、CH2C(O)NHOCH3、CH2C(O)NCH3OCH3、CHCH3C(O)NH2、CHCH3C(O)NHCH3、CHCH3C(O)NHOCH3和CHCH3C(O)NCH3OCH3。
如果R6为(CH2)n2C(O)OZ2，其为CH2C(O)OCH3。
R7
H和(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1，其中：
m1为0或1；
RM1为H；且
Y1为H、Me或OCH3；
当R7为H时，R6(如上所讨论)不为H。
当R7为(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1时，其可以选自C(O)NH2、C(O)NHCH3、C(O)NHOCH3、CH2C(O)NH2、CH2C(O)NHCH3和CH2C(O)NHOCH3。
R8
R8为H，除了当R7为C(=O)NH2时，其可以替代地是C1-2烷基，即甲基或乙基。
包括其他形式
包括在上述中的是这些取代基的众所周知的离子、盐、溶剂化物和保护的形式。例如，提及羧酸(-COOH)，还包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂化物以及常规的保护形式。类似地，提及氨基，包括氨基的质子形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物(例如，盐酸盐)以及氨基的常规保护形式。类似地，提及羟基，还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂化物，以及羟基的常规保护形式。
异构体、盐、溶剂化物、保护形式、和药物前体(前药，prodrug)
某些化合物能够以一种或多种特定的几何、光学、对映异构体、非对映异构体、差向异构体、立体异构体、互变异构体、构象异构体或端基异构体的形式存在，包括但不限于顺式-（cis-）和反式-（trans-）形式；E-和Z-形式；c-、t-、和r-形式；内-和外-形式；R-、S-和内消旋-形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇-、和烯醇化物-形式；顺式-（syn-）和反式-（anti-）形式；向斜-和背斜-形式；α-和β-形式；轴向和赤道形式（equatorialform）；船式-、椅式-、螺旋式-、信封式-和半椅式-形式；及它们的组合，下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
需注意的是，除了如下面所讨论的互变异构形式之外，结构异构体(或构造异构体)(即不同之处是原子之间的连接，而不仅仅是原子的空间位置的异构体)明确地排除在如本文中所用的术语“异构体”之外。例如，提及甲氧基-OCH3，不应被解释为提及其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地，提及邻-氯苯基不应被解释为提及其结构异构体间-氯苯基。但是，提及一类结构，可以良好地包括落在该类范围内的结构异构体形式(例如，C1-7烷基，包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻-、间-和对-甲氧基苯基)。
上述排除不涉及互变异构体，例如酮-、烯醇-、和烯醇化物形式，例如在下面的互变异构体对中：酮/烯醇(如下所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮、和硝基/酸式-硝基。
需要注意的是，具体地包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可以为任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以为任何同位素形式，包括16O和18O；等等。
除非另作说明，提及特定的化合物，包括所有此类异构体形式，包括(全部地或部分地)其外消旋体和其他混合物。此类异构体形式的制备(例如不对称合成)和分离(例如分步结晶和色谱方法)的方法为本领域所公知或者通过适应本文所传授的方法、或公知的方法以公知的方式容易获得。
除非另作说明，提及特定的化合物还包括其离子、盐、溶剂化物和保护形式，例如，如下所讨论。
可以方便地或希望地制备、纯化、和/或处理所述活性化合物的相应盐，例如，药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的例子在Bergeetal.J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中进行讨论。
例如，如果该化合物是阴离子型或具有可以变成阴离子的官能团(例如-COOH可以变成-COO-)，那么可以与适合的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的例子包括，但不限于，碱金属离子(例如Na+和K+)、碱土金属阳离子(例如Ca2+和Mg2+)和其他阳离子(例如Al3+)。合适的有机阳离子的例子包括，但不限于，铵离子(即NH4+)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些合适的取代铵离子的例子是源于以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己基胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄基胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的例子是N(CH3)4+。
如果该化合物是阳离子型或者具有可以变成阳离子的官能团(例如-NH2可以变成-NH3+)，那么可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的例子包括，但不限于，源于以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适的有机阴离子的例子包括，但不限于，源于以下有机酸的那些：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、棕榈酸、乳酸、苹果酸、双羟萘酸、酒石酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、肉桂酸、丙酮酸、水杨酸、对氨基苯磺酸（磺胺酸）、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、苯基磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、乙烷二磺酸、草酸、泛酸、羟乙磺酸、戊酸、乳糖酸和葡糖酸。合适的聚合物阴离子的例子包括，但不限于，源于以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。
可方便地或希望地制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂化物。本文中使用术语“溶剂化物”在普通含义上是指溶质(例如活性化合物，活性化合物的盐)与溶剂的复合物。如果溶剂是水，所述溶剂化物可以方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等等。
可以方便地或希望地制备、纯化和/或处理化学保护形式的活性化合物。如本文所使用的术语“化学保护形式”涉及其中一个或多个反应性官能团被保护以防止不希望的化学反应的化合物，即处于被保护基团或保护基团的形式(也称为被屏蔽基团或屏蔽基团、或被封闭基团或封闭基团)。通过保护反应性官能团，能够进行涉及其他未保护的反应性官能团的反应，而不影响被保护基团；通常可以在后续步骤中去除所述保护基团，而基本不影响分子中的其余部分。参见，例如，ProtectiveGroupsinOrganic Synthesis（有机合成中的保护基）(T.GreenandP.Wuts,Wiley,1999)。
例如，羟基可以作为醚(-OR)或酯(-OC(=O)R)而被保护，例如作为：叔丁基醚；苄基、二苯甲基(二苯基甲基)或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰酯(-OC(=O)CH3,-OAc)。
例如，醛或酮基团分别可以作为缩醛或缩酮而被保护，其中通过与例如伯醇反应将羰基(>C=O)转化为二醚(>C(OR)2)。在酸存在下，使用大量过量的水，可以容易地通过水解再生醛或酮基团。
例如，胺基可以例如作为酰胺或尿烷而被保护，例如作为：甲基酰胺(-NHCO-CH3)；苄氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5，-NH-Cbz)；作为叔丁氧酰胺(-NHCO-OC(CH3)3，-NH-Boc)；2-联苯基-2-丙氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5，-NH-Bpoc)，作为9-芴基甲氧基酰胺(-NH-Fmoc)，作为6-硝基藜芦基氧基酰胺(-NH-Nvoc)，作为2-三甲基甲硅烷基乙氧基酰胺(-NH-Teoc)，作为2,2,2-三氯乙氧基酰胺(-NH-Troc)，作为烯丙氧基酰胺(-NH-Alloc)，作为2(-苯基磺酰基)乙氧基酰胺(-NH-Psec)；或在合适的情况下，作为N-氧化物(>NO·)。
例如，羧酸基团可以作为酯而被保护，例如作为：C1-7烷基酯(例如，甲酯；叔丁基酯)；C1-7卤代烷基酯(例如，C1-7三卤代烷基酯)；三C1-7烷基甲硅烷基-C1-7烷基酯；或C5-20芳基-C1-7烷基酯(例如，苄基酯；硝基苄基酯)；或作为酰胺，例如，作为甲酰胺。
例如，硫醇基可以作为硫醚(-SR)而被保护，例如作为：苄基硫醚；乙酰氨基甲基醚(-S-CH2NHC(=O)CH3)。
可以方便地或希望地制备、纯化和/或处理药物前体形式的活性化合物。如本文中所使用的术语“药物前体”涉及当代谢(例如在体内)时产生希望的活性化合物的化合物。典型地，所述药物前体是非活性的或与所述活性化合物相比具有更低活性，但可提供有利的处理、给药或代谢特性。例如，一些药物前体是活性化合物的酯(例如，生理上可接受的代谢不稳定的酯)。在代谢过程中，酯基团(-C(=O)OR)被切割以产生活性药物。通过酯化例如母体化合物中的任一羧酸基团(-C(=O)OH)来形成此类酯，在适当时，提前保护了母体化合物中存在的任何其他反应性基团，然后如果需要的话进行脱保护。此类代谢不稳定酯的例子包括以下那些，其中R为C1-7烷基(例如-Me、-Et)；C1-7氨基烷基(例如氨乙基；2-(N,N-二乙基氨基)乙基；2-(4-吗啉代)乙基)；和酰氧基-C1-7烷基(例如酰氧基甲基；酰氧基乙基；例如新戊酰氧基甲基；乙酰氧基甲基；1-乙酰氧基乙基；1-(1-甲氧基-1-甲基)乙基-羰氧基乙基；1-(苯酰氧基)乙基；异丙氧基-羰氧基甲基；1-异丙氧基-羰氧基乙基；环己基-羰氧基甲基；1-环己基-羰氧基乙基；环己氧基-羰氧基甲基；1-环己氧基-羰氧基乙基；(4-四氢吡喃氧基)羰氧基甲基；1-(4-四氢吡喃氧基)羰氧基乙基；(4-四氢吡喃基)羰氧基甲基；和1-(4-四氢吡喃基)羰氧基乙基)。
此外，一些药物前体被酶活化以产生活性化合物或者以下的化合物，该化合物在经过进一步的化学反应后产生活性化合物。例如，所述药物前体可以为糖衍生物或其他糖苷偶联物，或者可以为氨基酸酯衍生物。
选择性
所述化合物抑制FAK对其他激酶如VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3、IGF-1R、IR和CDK的选择性可以通过生化测定结果来证明(参见，例如，以下描述的FAK激酶测定和VEGFR3测定)。
可以使用标准抑制测定来确定所述化合物针对FAK对细胞色素p450酶(特别是2C9和3A4同种型)的抑制的选择性。
可以通过Walker,etal.Biorg.Med.Chem.Letts.2008,18,6071-6077中描述的方案来确定，本发明的化合物可能与谷胱甘肽形成加合物的倾向性如何。
化合物用于抑制FAK对其他酶的选择性可以表示为其他酶的抑制(IC50)与FAK抑制(IC50)的比率。例如，为了确定化合物用于抑制FAK对VEGFR3的选择性，将针对VEGFR3的化合物的IC50除以针对FAK的化合物的IC50，以得到比率。该比率越高，该化合物越具选择性。
另外的实施方式
适当时，以下实施方式和优选项可以彼此相互组合。
在一些实施方式中，R2为H且R1为：
其中RN1选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)和C(=O)Me。在这些实施方式的一些中，可优选的是RN1为C(=O)Me。在这些实施方式中的其他部分中，可优选的是RN1为H、甲基或乙基。在这些实施方式的另一部分中，可优选的是RN1为H。
在其他实施方式中，R2为H且R1为：
其中RN2选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)。在这些实施方式中，可优选的是RN2选自H和甲基。在这些实施方式中，还可优选的是RN2为乙基。
在其他实施方式中，R2为H且R1为：
其中RN3选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)。在这些实施方式中，可优选的是RN3选自H和甲基。
在其他实施方式中，R2为H且R1为：
其中RN4选自H和甲基。在这些实施方式中，可优选的是RN4为H。
在一些实施方式中，R1为H且R2为：
其中RN5选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)。在这些实施方式中，可优选的是RN5选自H和甲基。
可优选的是R1选自：
在一些实施方式中，R1是H且R2为：
其中RN6选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)。在这些实施方式中，可优选的是RN6选自H和甲基。
可进一步优选的是R1为H且R2为：
在一些实施方式中，R3选自F、Me、Et、OMe和OCF3。在这些实施方式的一些中，R3为OMe。
在一些实施方式中，R4选自CF3、Cl、Br、CF2H和CN。
在进一步的实施方式中，R4选自CF3、Cl和CF2H。在进一步的实施方式中，R4选自CF3和Cl。可优选的是R4为CF3。
在一些实施方式中，可优选的是R5为下式的组：
在一些实施方式中，R7为H且R6为(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1。
在进一步的实施方式中，R7为H且R6选自CH2C(O)NH2、CH2C(O)NHCH3、CHCH3C(O)NH2和CHCH3C(O)NHCH3。
可优选的是R7为H且R6选自CH2C(O)NH2、CHCH3C(O)NH2和CH2C(O)NHCH3，且更优选地选自CH2C(O)NH2和CHCH3C(O)NH2。最优选地R6为CH2C(O)NH2。
在一些实施方式中，R6为H且R7为(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1。
在进一步的实施方式中，R6为H且R7选自C(O)NH2、C(O)NHCH3、CH2C(O)NH2和CH2C(O)NHCH3。
可优选的是R6为H且R7是C(O)NH2。
在一些实施方式中，其中R6为H且R7为C(O)NH2、R8为甲基。
在一些实施方式中，可优选的是R5为下式的组：
在本发明的选定的实施方式中，所述化合物可以具有式Ia：
其中R1a选自：
并且R3a选自Me、Et、OMe、OCF3和F。
在本发明的选定实施方式中，所述化合物可以具有式Ib：
其中R3b选自OMe和OCF3，且
R5b选自：
本发明的实施方式是这些实施例的化合物，包括化合物1～13。特别感兴趣的实施方式包括包括化合物3、6和11。
通用合成方法
本发明的化合物可以采用以下通用方法并使用在实验部分中详细描述的步骤来制备。所提到的反应条件是例示性的而非限制性的。
如上所述的式I的化合物可以通过以下概述的合成策略来制备，其中使用上述定义：
方案A
式F1的化合物可以与式F2的取代合成苯胺(如在方案C、D、E、F、G和H中制备)反应以形成式F3的中间体，其中L1和L2可以相同或不同并且包括Cl、Br、I、SMe、SO2Me和R4=CF3、卤素、CF2H或CN。
可以制备式F1的化合物，其中L1和L2是不同的(参见方案B)以允许区域选择性取代或当L1=L2时可以采用合适的反应条件(溶剂的选择、反应温度、添加路易斯酸，例如处于二乙醚中的ZnCl2)以使L1选择性地取代L2。其中获得区域化学混合物和二取代物，可以通过色谱法来分离区域异构体。
式F1的化合物，其中L1=L2为市售的(例如2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶、2,4-二氯-5-氟嘧啶、2,4,5-三氟嘧啶、2,4-二氯-5-溴嘧啶、2,4-二氯-5-碘嘧啶、2,4-二氯-5-氰基嘧啶)或者可以容易地由市售起始原料制备。当R4=CF3且L1和L2的分化是可取的时，可以采用方案B中概述的方法。
方案B
在氯化锌(II)的存在下，市售的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G1)可以选择性地与甲硫醇钠反应以得到2-硫甲基-4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G2)。如果需要2和4-位的进一步分化或者如果需要另外的活化，2-硫甲基-4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G2)可以进一步反应，例如通过在芬克尔斯坦条件(Finkelsteinconditions)下转化为2-硫甲基-4-碘-5-(三氟甲基)嘧啶(G3)和/或通过用mCPBA氧化以得到相应的砜。
方案C
市售的哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G5)和式F4的4-氟-2-取代的-1-硝基苯可以在SNAr反应中反应以得到式F5的4-(3-取代的-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。在催化剂(例如钯炭或氧化铂)存在下通过氢化作用进行后续还原，当R3为Cl、Br或I时，得到式F6的相应苯胺。
方案D
可以将市售的4-氧代哌啶-1-羧酸叔丁酯(G6)转化为乙烯基三氟甲磺酸酯G7为起始通过一系列反应来制备F6的相应4-哌啶类似物。在铃木型反应(Suzukitypereaction)中将G7与式F7的芳基硼酸或类似的硼酸酯偶联得到式F8的四氢吡啶。随后在催化剂(例如钯碳)存在下通过氢化还原得到式F9的苯胺基-哌啶。可替代地，可以在铃木偶联步骤中使用式F7的化合物的受保护的苯胺类似物，例如Boc或CBz保护的苯胺。这样就不必需要后续的还原步骤并且当R3为卤素时可能是有利的。
方案E
可以在铃木型反应中通过使市售的式F10的化合物(其中L3=I或Br)与吡啶-3-基硼酸(G8)反应以形成式F11的中间体来制备3-哌啶类似物。在催化剂(例如氧化铂)存在下用氢还原式F11的化合物得到式F12的中间体，可以使用Boc酸酐来保护该式F12的中间体以得到式F13的化合物。
方案F
可以在铃木型反应中通过使市售的式F14的化合物(其中L3=I或Br)与吡啶-2-基硼酸(G9)反应以形成式F15的中间体来制备2-哌啶类似物。在催化剂(例如氧化铂)存在下用氢还原式F15的化合物得到式F16的中间体，可以使用Boc酸酐来保护该式F16的中间体以得到式F17的化合物。
方案G
可以在布赫瓦尔德型反应(Buchwaldtypereaction)中通过将市售的哌嗪-1-羰酸叔丁酯(G5)和式F18的化合物(其中L3=I或Br)偶合以得到式F19的中间体来制备式F20的化合物。可以在催化剂(例如钯炭或氧化铂)存在下用氢还原式F19的化合物，得到式F20的苯胺。
方案H
可以使式F21的化合物反应以形成式F22的酯，其中X=Br或I，R8=H或Me且Y选自单键、-CH2-和-CHCH3-。当RO1=t-Bu时可以使用Boc酸酐，或当RO1=Me时可以在酸(如硫酸)存在下使用甲醇，来形成所需的酯。在薗头型偶合反应(Sonagashiratypecoupling)中，式F22的酯可以与式F23的末端乙炔反应以得到式F24的乙炔，其中R9=TMS、TES或(CH3)2C*OH。然后可以去除R9以生成式F25的化合物。当R9=TMS或TES时，可以采用碳酸钾或氟化四正丁基铵来引发这种转化。当R9=(CH3)2C*OH时，可以使用处于回流的甲苯中的氢化钠。
方案I
在薗头型偶合反应中，式F3的嘧啶可以与式F25的末端乙炔反应，得到式F26的乙炔。在过渡金属催化剂存在下，可以使用氢气将式F26化合物中的乙炔还原为式F27的烷烃。催化剂的确切选择和所采用的条件依赖于R4的性质。例如，在R4=CF3时，可以使用10%Pd/C，在R4=Cl时，采用氧化铂。然后可以将式F27的酯进行脱保护以得到式F28的羰酸。在RO1=Me或Et时，可以采用氢氧化锂溶液。在RO1=t-Bu时，可以采用酸性溶液，例如处于二氯甲烷中的三氟乙酸溶液。可以理解的是，在酸性条件下，在R1和R2中的Boc保护基团也将被切割。
方案J
在肽偶联剂(例如HATU)存在下，使用合适的胺或氨盐，可以将式F28的羧酸转化为式F29的酰胺。
方案K
可替代地，当RO1=Me时，在升高的温度下，可以通过与胺反应直接将式F27的酯转化为式F29的酰胺。
方案L
在需要具有稠合至右手侧芳香环的内酰胺的分子时，可以在薗头型偶合反应中，使式F30的化合物与式F23的末端乙炔反应以得到式F31的乙炔，其中R9=TMS、TES或(CH3)2C*OH。然后可以去除R9以生成F32的化合物。当R9=TMS或TES时，可以采用碳酸钾或氟化四正丁基铵来引发这种转化。当R9=(CH3)2C*OH时，可以使用处于回流的甲苯中的氢化钠。
然后可以将式F32的化合物偶联至式F3的化合物上，并且如上和如下所述进行进一步精制。
方案M
然后可以在酸性条件下(例如使用处于二氯甲烷溶液中三氟乙酸)，对在R1或R2中(在RN1、RN2、RN3、RN4和RN5的位置)存在Boc保护基团的式F29化合物或含内酰胺的类似物进行脱保护，以得到相应的式F33的母体哌嗪或哌啶化合物。
方案N
然后可以通过胺官能团的衍生化，对式F33的化合物进行进一步地改性。例如，其中RN1、RN2、RN3、RN4、RN5或RN6=Me的式F34的化合物，可以在三乙酰氧基硼氢化钠存在下，使用甲醛通过还原性烷基化来制备。可以在三乙酰氧基硼氢化钠存在下，使用乙醛通过还原性烷基化来制备RN1、RN2、RN3、RN5或RN6=Et的衍生物。其中RN1、RN2、RN3、RN5或RN6=乙酰基的式F34的化合物，可以通过使式F33的化合物与合适的酰化剂(例如乙酸酐)反应来制备。
用于形成其中R3=CF3且R7=H的式F27的化合物的替代策略是制备式F37的化合物，如方案N中所概述。
方案N
在薗头条件下，使其中R8=H的式F25的酯与4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(G3)偶合得到式F35的乙炔。使用MCPBA氧化得到式F36的砜。在催化剂(例如10%钯炭)存在下，使用氢还原乙炔得到式F37的化合物。
在酸性条件下，例如在三氟乙酸存在下，式F37的化合物可以与式F2的苯胺反应以得到式F27的化合物，然后可以如上所述进一步精制该式F27的化合物。
本发明化合物的用途
本发明提供活性化合物，具体地为活性2,4,5-取代的嘧啶。
如本文中所使用的术语“活性”涉及能够抑制FAK活性的化合物，并具体地包括具有固有活性(药物)的化合物以及此类化合物的药物前体两者，所述药物前体本身可表现出很少的固有活性或无固有活性。
可以用于评估由特定化合物提供的FAK抑制的测定描述于以下实施例中。
本发明还提供抑制细胞中FAK抑制的方法，包括使所述细胞与有效量的活性化合物接触，优选地为药学上可接受组合物的形式。该方法可以在体外和体内适用。
本发明还提供抑制FAK活性的活性化合物以及抑制FAK活性的方法，该方法包括使细胞与有效量的活性化合物接触（无论在体外或体内）。
活性化合物还可以用作体外测定的一部分，例如，用于确定侯选宿主是否可能受益于用所讨论的化合物进行治疗。
本发明还提供活性化合物在人体或动物体的治疗方法中的用途。该方法可包括给予受试者治疗有效量的活性化合物，优选地为药物组合物形式。
如本文中在治疗病症的上下文中所使用的术语“治疗”，一般涉及治疗和疗法，无论人类或动物（例如在兽医应用中），其中达到一些期望的治疗效果，例如，抑制病症的进展，并且包括降低进展速率、停止进展速率、改善病症、和治愈病症。还包括作为预防措施的治疗(即预防)。
如本文中所使用的术语“治疗有效量”，涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其有效地用于产生一些所期望的治疗效果，与合理的效益/风险比率相匹配。
癌症
本发明提供作为抗癌剂的活性化合物。本领域普通技术人员能够容易地确定侯选化合物是否能够治疗任何特定细胞类型的癌症病症（单独或组合）。
癌症的例子包括，但不限于，骨癌、脑干神经胶质瘤、乳腺癌、肾上腺癌、肛门区的癌症、膀胱癌、内分泌系统的癌症、食道癌、头部或颈部癌症、肾或输尿管癌、肝癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、小肠癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肾盂癌、阴道癌、外阴癌、慢性或急性白血病、结肠癌、皮肤或眼内黑色素瘤、血液系统恶性肿瘤、霍奇金病、肺癌、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(CNS)、卵巢癌、胰腺癌、垂体腺瘤、原发性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、皮肤癌、脊髓轴肿瘤、胃癌和子宫癌。
可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠(包括例如肠、结肠)、胸部(乳房)、卵巢、前列腺、肝(肝脏)、肾(肾脏)、膀胱、胰脏、脑和皮肤。
在上文中所定义的抗癌治疗可以作为唯一的疗法应用或者除了本发明的化合物外还可以包括常规手术或放射疗法或化学疗法。此类化学疗法可以包括一种或多种以下类别的抗肿瘤剂：-
(i)如医学肿瘤学中使用的其他抗增殖药物/抗肿瘤药物以及它们的组合，例如烷基化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢药物(例如吉西他滨和抗叶酸盐，诸如氟嘧啶类如5氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨以及紫杉烷类如紫衫醇和多西紫杉醇(泰索帝)和马球激酶抑制剂)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，例如抗雌激素(例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和碘酰芬(iodoxyfene))、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和环丙孕酮乙酸盐)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如甲地孕酮乙酸盐)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5*-还原酶的抑制剂如非那雄胺；
(iii)抗侵入剂(例如c-Src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO01/94341)、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(dasatinib,BMS-354825；J.Med.Chem.,2004,47,6658-6661)和4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-腈(bosutinib,SKI-606；Cancerresearch(2003),63(2),375-81)，和金属蛋白酶抑制剂如马立马司他，尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂受体功能的抑制剂或类肝素酶的抗体)；
(iv)生长因子功能的抑制剂：例如此类抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗[HerceptinT]、抗-EGFR抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux,C225]和由Sternetal.Criticalreviewsinoncology/haematology,2005,Vol.54,pp11-29公开的任何生长因子或生长因子受体抗体)；此类抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(gefitinib,ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib,OSI774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI1033)，erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼，肝细胞生长因子家族的抑制剂，血小板源性生长因子家族的抑制剂如伊马替尼，丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(BAY43-9006))，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号抑制剂，肝细胞生长因子家族的抑制剂，c-kit抑制剂，abl激酶抑制剂，IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；极光激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；
(v)抗血管生成剂如抑制血管内皮生长因子作用的那些，[例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(AvastinT)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651中的实施例2)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212中的实施例240)，瓦他拉尼(PTK787；WO98/35985)和SU11248(sunitinib；WO01/60814)，如公开于国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856和WO98/13354中的那些化合物以及通过其他机制起作用的化合物(例如利诺胺，整联蛋白avb3功能的抑制剂和血管生成抑制因子)]；
(vi)血管损伤剂，如考布他汀A4和公开于国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对以上列举的靶的那些如ISIS2503、抗-ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如用于替换异常基因(如异常p53或异常BRCA1或BRCA2)的方法，GDEPT(基因定向酶药物前体治疗)方法如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及用于提高患者的化疗或放疗耐受性的方法如多药耐药性基因治疗；和
(ix)免疫治疗方法，包括例如用于增加患者肿瘤细胞的免疫原性的体外和体内方法，例如用细胞因子(如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)转染；减少T细胞无反应性的方法；使用转染的免疫细胞(如细胞因子转染的树突细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和使用抗个体基因型抗体的方法。
特别感兴趣的是与多西紫杉醇的组合。感兴趣的是包括与吉西他滨、顺铂和喜树碱药物前体伊立替康的其他可能的组合。
给药
所述活性化合物或包含所述活性化合物的药物组合物可以通过任何方便的给药途径给予受试者，不论是全身性/外周性或在需要起作用的位点，包括，但不限于，口服(例如通过摄食)；局部给药(包括例如透皮、鼻内、眼、颊和舌下)；肺部给药(例如通过吸入或吹入疗法，使用例如气溶胶，例如通过口或鼻)；直肠给药；阴道给药；胃肠外给药，例如，通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入储留药物(depot)，例如皮下或肌内。受试者可以为真核生物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科(例如小鼠)、犬科(例如狗)、猫科(例如猫)、马科(例如马)、灵长类动物、类人猿(例如猴子或猿)、猴子(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)、或人类。
配方
虽然所述活性化合物可以单独给药，但优选以药物组合物(例如配制品)的方式提供，所述药物组合物包含至少一种如上定义的活性化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填料、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他材料和可选的其他治疗剂或预防剂。
因此，本发明进一步提供如上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方法，该方法包括将至少一种如上定义的活性化合物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、佐剂、稳定剂或如本文所述其他材料一起进行混合。
如本文中所使用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内，适合用于接触受试者(例如人类)的组织而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型（与合理的效益/风险比率相匹配）。在与配制品的其他成分相容的意义上，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。
合适的载体、赋形剂等可以在标准药物文本中找到，例如,Remington’sPharmaceuticalSciences,18thedition,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,1990。
该配制品可方便地以单位剂量的形式提供并且可以通过药学领域中任何熟知的方法来制备。此类方法包括使所述活性化合物与一种或多种辅助成分构成的载体进行结合的步骤。一般说来，通过均匀地且紧密地使所述活性化合物与液体载体或细分的固体载体或该两者相结合并且然后如有必要时将产物成形来制备该配制品。
配方的形式可以是液体、溶液、悬浮液、乳液、酏剂、糖浆、片剂、锭剂、颗粒、粉末、胶囊、扁囊剂、丸剂、安瓿、栓剂、子宫托、软膏、凝胶、糊剂、乳膏剂、喷雾剂、水雾剂（mist）、泡沫、洗剂、油、大丸剂、干药糖剂或气溶胶。
适合于口服(例如通过摄食)的配制品可以作为离散的单位提供，例如胶囊、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒；作为处于水溶液或非水溶液中的液体或悬浮液；或作为水包油型液体乳液或油包水型液体乳液；作为大丸剂；作为干药糖剂；或作为糊剂提供。
片剂可以通过常规方法来制造，例如，可选地与一种或多种辅助成分一起进行压制或模制。压缩片剂可以在适合的机器中通过压缩自由流动形式的活性化合物（如粉末或颗粒）来制备，可选地与一种或多种粘合剂(例如聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨糖醇、黄蓍胶、羟丙基甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅)；崩解剂(例如淀粉羟基乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸)混合。模压片可以在合适的机器中通过模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制造。该片剂可以可选地被包衣或刻痕且可以被配制以提供缓释或控释其中的活性化合物，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线。片剂可以可选地提供有肠溶衣，以提供在胃以外的肠道的部分中释放。
适合于局部给药(例如透皮、鼻内、眼、颊和舌下)的配制品可以配制为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油。可替代地，配制品可以包含贴剂或敷料，如用活性化合物和可选的一种或多种赋形剂或稀释剂浸渍的绷带或胶布（adhesiveplaster）。
适合于在口中局部给药的配制品包括锭剂，其在调味基料(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含所述活性化合物；软锭剂，其在惰性基料(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中包含所述活性化合物；和漱口药，其在适合的液体载体中包含所述活性化合物。
适合于向眼中局部给药的配制品还包含滴眼剂，其中所述活性化合物溶解或悬浮于适合的载体中，特别是用于该活性化合物的水性溶剂。
适合于鼻部给药的配制品（其中载体为固体），包括粗粉，其具有例如在约20～约500微米范围内的粒度，其以用鼻子吸入的方式给药，即通过从放置接近鼻子的该粉末的容器中通过鼻腔通道快速吸入。其中载体为液体的适合给药的配制品，像例如鼻喷雾剂、滴鼻剂、或通过喷雾器给予气溶胶，包括所述活性化合物的水溶液或油溶液。
适合于通过吸入给药的配制品包括以使用适合的推进剂(例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包中喷出气溶胶而提供的那些。
适合于通过皮肤局部给药的配制品包括软膏、乳膏和乳液。当配制成软膏时，所述活性化合物可以可选地与链烷基料或可与水混溶的软膏基料一起使用。可替代地，所述活性化合物可以与水包油型乳膏基料一起配制成乳膏。如果需要，乳膏基料的水相可以包括例如至少约30%w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及它们的混合物。该局部配制品可以可取地包括增强所述活性化合物通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。此类皮肤渗透增强剂的例子包括二甲亚砜和相关类似物。
当配制为局部乳液时，油相可以可选地仅包含乳化剂（emulsifier）(或者称为乳化剂（emulgent）)，或者其可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与亲油性乳化剂包括在一起，该亲油性乳化剂充当为稳定剂。还优选包含油和脂肪两者。共同地，乳化剂与或不与稳定剂组成所谓的乳化蜡，并且该蜡与油和/或脂肪一起组成所谓的乳化软膏基料，其形成乳膏配制品的油性分散相。
适合的乳化剂和乳液稳定剂包括土温60、Span80、十六十八醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。合适于配制品的油或脂肪的选择是基于实现所需的化妆品性质，因为所述活性化合物在可能用于药物乳液配制品中的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏可以优选为不油腻、不染色且可洗掉的产品，并且具有合适的稠度以避免从管或其他容器中泄漏。可以使用直链或支链的一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯、硬脂酸异鲸蜡基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己基酯或称为CrodamolCAP的支链酯的混合物，其中最后三种是优选的酯。根据所需要的特性，这些可以单独使用或组合使用。
可替代地，可以使用高熔点脂类，如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。
适合于直肠给药的配制品可以提供为具有适合的基料的栓剂，所述基料包含例如可可脂或水杨酸酯。
适于阴道给药的配制品可以提供为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或包含除了所述活性化合物之外本领域中认为适合的载体的喷雾剂配制品。
适用于肠胃外给药(例如通过注射，包括皮肤、皮下、肌内、静脉内和皮内)的配制品包括：水性和非水性的等渗性、无热原的、无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使得配制品与预定接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可含有助悬剂和增稠剂；和脂质体或设计成将化合物靶向血液组分或一个或多个器官的其他微粒系统。合适用于此类配制品的等渗载体的例子包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸盐林格注射液。典型地，溶液中活性化合物的浓度为约1ng/ml～约10μg/ml，例如约10ng/ml～约1μg/ml。所述配制品可以提供在单位剂量或多剂量密封的容器中，例如，安瓿瓶或小管，并且可以在仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下进行贮存。可以由无菌粉末，颗粒和片剂来制备临时注射溶液和悬浮液。配制品可以为脂质体形式或设计成将所述活性化合物靶向血液组分或一个或多个器官的其他微粒系统的形式。
剂量
可以理解的是所述活性化合物和包含所述活性化合物的组合物的合适剂量在患者之间可以不同。确定最佳剂量一般涉及平衡本发明的疗效水平相对于治疗的任何危险或有害的副作用。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、给药的途径、给药时间、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、组合使用的其他药物、化合物和/或材料、以及患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和前病史。化合物的量及给药途径最终将由医生来判断，尽管一般地该剂量在作用位点将达到局部浓度，其可以达到预期的效果而不会造成实质性损害性的或有害的副作用。
在整个治疗过程中，可以一次性地、连续地或间歇地(例如在适当的时间间隔以分开的剂量)实行体内给药。确定最有效的给药方法和给药剂量的方法为本领域技术人员所公知，并且将随用于治疗的配制品、治疗的目的、受治疗的靶细胞和受治疗的患者而不同。可以用由治疗医生选择的剂量水平和模式来进行单次给药或多次给药。
一般来说，所述活性化合物的合适剂量范围为约100μg～约250mg/受试者千克体重/天。在所述活性化合物为盐、酯、药物前体等的情况下，给药量是基于母体化合物来计算的并且因此按比例增加有待使用的实际重量。
具体实施方式
以下为实施例，它们仅提供用于说明本发明而不旨在限制如本文所述的本发明的范围。
缩写
为方便起见，使用众所周知的缩写来表示许多化学部分，包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(nPr)、异丙基(iPr)、正丁基(nBu)、叔丁基(tBu)、正己基(nHex)、环己基(cHex)、苯基(Ph)、联苯基(biPh)、苄基(Bn)、萘基(naph)、甲氧基(MeO)、乙氧基(EtO)、苯甲酰基(Bz)、和乙酰基(Ac)。
为了方便起见，使用众所周知的缩写来表示许多化合物，包括但不限于，甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、异丙醇(i-PrOH)、甲基乙基酮(MEK)、醚或二乙醚(Et2O)、乙酸(AcOH)、二氯甲烷(二氯甲烷，DCM)、三氟乙酸(TFA)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、间-氯过氧苯甲酸(mCPBA)、叔丁氧羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCl)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、四正丁基氟化铵(TBAF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、和1,2-二氯乙烯(DCE)。
通用实验细节
除非另作说明，以下概括都适用。
1NMR波谱是在BrukerAvanceDRX300(300MHz)、BrukerUltrasheildplus(400MHz)或VarianUnityInova600(600MHz)光谱仪上记录的。信号的多重性通过下列缩写指定：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；br，宽峰；m，多重峰。所有观察到的耦合常数J以赫兹为单位报告。13CNMR是在BrukerAvanceDRX300(75MHz)、BrukerUltrasheildplus(100MHz)或VarianUnityInova600(150MHz)光谱仪上以宽带去耦模式记录的。
LC/MS数据是使用FinniganLCQAdvantageMax(LCMS-A)、WatersZQ3100system(LCMS-B)或Agilent6100系列单四极LC/MS(LCMS-C)生成的。
LCMS方法A(LCMS-A)
仪器：FinniganLCQAdvantageMax
泵：FinniganSurveyorLC泵
FinniganSurveyor自动进样品
FinniganSurveyorPDA检测器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：Gemini3μC1820x4.0mm110A
进样体积：10μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：10-100%B经过10min
检测：100-600nm
MS条件：
离子源：离子阱
离子模式：ES正
温度：300℃
毛细管V-25
检测：离子计数
扫描范围：80-1000Amu
扫描时间：0.2sec
采集时间：10min
LCMS方法B(LCMS-B)
仪器：WatersZQ3100-质量检测器
Waters2545-泵
WatersSFOSystemFluidicsOrganizer
Waters2996二极管阵列检测器
Waters2767样品管理器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：XBridgeTMC185μm4.6x100mm
进样体积：10μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：10-100%B经过10min
流速：1.5mL/min
检测：100-600nm
MS条件：
离子源：单-四极杆
离子模式：ES正
源温度：150℃
脱溶剂温度：350℃
检测：离子计数
毛细管(KV)-3.00
锥(V)：30
提取器(V)：3
RF透镜(V)：0.1
扫描范围：100-1000Amu
扫描时间：0.5sec
采集时间：10min
气流
去溶剂化L/hr-650
LCMS方法C(LCMS-C)
仪器：Agilent6100系列单四极LC/MS
Agilent1200系列HPLC
泵：1200系列G1311A四元泵
自动进样器：1200系列G1329A恒温自动进样器
检测器：1200系列G1314B可变波长检测器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：LunaC8(2)5μ50X4.6mm100A
柱温：30℃
进样体积：5μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：5-100%B经过10min
检测：254nm或214nm
MS条件：
离子源：四极杆
离子：多重模式-ES（Multimode-ES）
干燥气体温度：300℃
蒸发器温度：200℃
毛细管电压(V)：2000(正)
毛细管电压(V)：4000(负)
扫描范围：100-1000
步长：0.1sec
采集时间：10min
在Merck硅胶60F254铝-支承孔板上进行分析型薄层色谱，其在UV光或酸性茴香醛或碱性高锰酸钾浸渍下使用荧光猝灭进行可视化。使用TeledyneIscoCombiFlashRf纯化系统使用标准RediSep卡套柱（cartridge）或使用BiotageIsolera纯化系统使用Grace或Biotage二氧化硅卡套柱进行快速色谱法。
在必要的情况下，无水溶剂是使用Braun纯化系统制备的或购自Sigma-Aldrich。
实施例1：2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(1)
(a)4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I1)
在氮气氛下在90℃下将处于二甲亚砜(20mL)中的5-氟-2-硝基茴香醚(3.00g，17.5mmol)、哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4.57g,24.5mmol)和碳酸钾(3.63g,26.3mmol)的混合物加热1.5小时。将反应混合物冷却并用水（100mL）稀释。过滤所得的沉淀物并且干燥以得到亮黄色的固体。将此固体悬浮在5:1的石油醚/二乙醚(50mL)溶液中，超声处理2分钟，过滤并且干燥以得到标题化合物(I1)，为亮黄色固体(3.95g,66%)；1HNMR(300MHz,d6-DMSO)δ1.42(s,9H)，3.46(brs,8H)，3.90(s，3H)，6.52(s,1H),6.57(d,1H,J=9.5Hz)和7.89(d，1H，J=9.3Hz)。LCMS方法B：rt7.45min;m/z338.2[M+H]+。
(b)4-(4-氨基-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I2)
向处于甲醇(20mL)和乙酸乙酯(80mL)中的4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I1)(1.90g，5.63mmol)的溶液中加入10%Pd/C(0.500g)。将混合物排空并且用氢气反填充三次，然后在氢气氛下搅拌18小时。通过Celite（硅藻土）塞过滤该粗反应混合物，用乙酸乙酯洗涤并在真空下蒸发滤液，然后在高真空下干燥，得到暗红色粘稠油状物。将该油状物悬浮在2:1的二乙醚和石油醚（15mL）溶液中，然后超声处理3分钟。在真空下蒸发所得混合物，并在高真空下干燥，得到标题化合物(I2)，为暗红色固体(1.55g,89%)；1HNMR(300MHz，d6-DMSO)δ1.47(s,9H),2.97(t,4H,J=4.7Hz),3.57(t,4H,J=4.7Hz),3.83(s,3H),6.40(dd,1H,J=8.3,2.1Hz),6.50(d,1H,J=2.0Hz)和6.64(d,1H,J=8.3Hz)。LCMS方法B：rt5.02min;m/z308.3[M+H]+。
(c)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I3)
在干燥N2气流下，向处于1:1二氯乙烷/叔丁醇(50mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(0.800g，3.68mmol)的搅拌冷却(0℃)溶液中加入氯化锌溶液(1M，在二乙醚中；4.42mL,4.42mmol)。在0℃下搅拌1小时后，经过30分钟逐滴加入处于1:1二氯乙烷/叔丁醇(15mL)中的4-(4-氨基-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I2)的溶液(1.13g,3.68mmol,1eq.)，然后经过30分钟逐滴加入处于1:1二氯乙烷/叔丁醇(5mL)中的三乙胺的溶液(0.565mL,0.410mmol,1.1eq.)。然后在室温下将所得混合物剧烈搅拌18小时。在减压下蒸发挥发物，然后在高真空下干燥残余物。加入乙酸乙酯和水，并且用乙酸乙酯（3×30mL）萃取水层。用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥（硫酸镁），过滤并蒸发，以得到粗产物，为暗黄色泡沫。在硅胶上（0-20％乙酸乙酯/石油醚）通过快速柱色谱法纯化该粗产物，以得到标题化合物(I3)，为黄色固体（1.25g，69％）；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.48(s,9H),3.11(t,4H,J=5.2Hz),3.59(t,4H,J=5.0Hz),3.88(s,3H),6.54(s,1H),6.57(d,1H,J=9.4Hz),7.83(s,1H),8.17(d,1H,J=8.5Hz)和8.53(s,1H)。LCMS方法B：rt9.24min；m/z488.3[M+H]+。
(d)4-(3-甲氧基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I5)
向处于二甲基甲酰胺(2.5mL)和三乙胺(0.450mL)中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I72)(0.350g,0.717mmol)的溶液中加入2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4：根据Peng，C.etal.；Adv.Synth.Catal.2008,350,2359–2364的步骤或如下所述制备)(0.137g，0.789mmol)、反式-二氯双(三苯基膦)钯(II)(0.025g,0.036mmol)、CuI(0.014g,0.072mmol)和三苯基膦(0.019g,0.072mmol)。在搅拌的同时在120℃下在微波辐射下将反应混合物加热15分钟。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释，然后将所得混合物用乙酸乙酯（3×15mL）萃取。用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥（硫酸镁），过滤并蒸发，以得到棕色固体。在硅胶上（10-50％乙酸乙酯/石油醚）通过快速柱色谱纯化该固体，以得到标题化合物(I5)，为橙色结晶固体（0.360g，80%）;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.49(s,9H),3.11(s,4H),3.60(s,4H),3.71(d,3H,J=1.0Hz),3.89(s,3H),3.96(s,2H),6.55(s,1H),6.59(s,1H),7.26-7.45(m,3H),7.68(d,1H,J=7.6Hz),7.83(s,1H),8.27(d,1H,J=7.3Hz),和8.60(s,1H)。LCMS方法B:rt9.55min;m/z626.4[M+H]+。
(e)4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I6)
向处于乙酸乙酯(25mL)和二甲基甲酰胺(5mL)中的4-(3-甲氧基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I5)(0.358g,0.572mmol)的溶液中加入10%Pd/C(0.200g)。将该混合物排空并用氢气反填充三次，然后在氢气氛下搅拌18小时。通过Celite（硅藻土）塞过滤该反应混合物，用乙酸乙酯洗涤，然后在真空中蒸发滤液并且在高真空下干燥，以得到标题化合物(I6)，为粘稠黄色油状物（0.360g，100％）;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.48(s,9H),3.00-3.20(m,8H),3.59(t,4H,J=4.8Hz),3.67(s,3H),3.75(s,2H),3.90(s,3H),6.55-6.57(m,2H),7.19-7.26(m,4H),7.75(s,1H),8.26(d,1H,J=9.4Hz)和8.50(s,1H)。LCMS方法B：rt6.55min;m/z630.5[M+H]+。
(f)2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I7)
向处于四氢呋喃(17mL)、甲醇(3mL)和水(5mL)中的4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I6)(0.360g,0.572mmol)的溶液中加入氢氧化锂(0.042g，1.77mmol)，并且在室温下将所得混合物搅拌20小时。在真空下蒸发反应挥发物，并且用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液稀释所得残余物。用乙酸乙酯（3×20mL）萃取水相，然后用饱和的氢氧化钠水溶液(20mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥（硫酸镁），过滤，在真空下蒸发并干燥，以得到标题化合物(I7)，为黄色泡沫(0.356g,100%)；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.48(s,9H),2.96-3.06(m,8H)3.56-3.62(m,6H),3.77(s,3H),6.47-6.51(m,2H),7.00-7.11(m,2H),8.00(brs,2H)和8.43(s,1H)。LCMS方法B：rt9.00min;m/z616.4[M+H]+。
(g)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I8)
在氮气氛下，向处于干燥的四氢呋喃(16mL)和二甲基甲酰胺(7mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I7)(0.352g,0.672mmol)、1-羟基苯并三唑(0.093g,0.686mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.121g,0.629mmol)的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(0.498mL,2.86mmol)。在室温下将反应混合物搅拌10分钟，然后加入碳酸铵(0.263g,2.859mmol)，然后在室温下将所得悬浮液搅拌18小时。在真空中蒸发反应挥发物，然后用乙酸乙酯(15mL)和水(10mL)稀释所得残留物。分离各层并且用乙酸乙酯（2×15mL）萃取水层。然后用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥（硫酸镁）并且在真空下浓缩以得到黄色泡沫，在硅胶柱上（55-85％乙酸乙酯/石油醚）通过快速柱色谱纯化该黄色泡沫，以得到标题化合物(I8)，为黄色泡沫(0.276g,87%)；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.48(d,9H,J=1.1Hz),3.09(d,8H,J=3.9Hz),3.58(brs,4H),3.66(s,2H),3.88(d,3H,J=1.0Hz),5.48(brs,1H),5.78(brs,1H),6.54(d,1H,J=1.3Hz),6.57(s,1H),7.23-7.25(brs,4H),7.72(s,1H),8.13(d,1H,J=8.6Hz)和8.48(s,1H)。LCMS方法B：rt8.52min;m/z615.4[M+H]+。
(f)2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(1)
向处于二氯甲烷(8mL)中的4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I8)(0.276g,0.449mmol)的溶液中加入三氟乙酸(0.669mL,8.98mmol)，然后在氮气氛下将所得混合物搅拌18小时。在真空中蒸发溶剂以得到黄色残留物，将该黄色残留物溶解于3:1氯仿/2-丙醇和1M氢氧化钠水溶液。用3:1氯仿/2-丙醇(3×15mL)萃取水层，然后用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(硫酸镁)，过滤并且蒸发，以得到标题化合物(1)，为黄色泡沫(0.229g,99%)；1HNMR(300MHz,d6-DMSO)δ2.87-3.10(m,12H),3.46(s,2H),3.78(s,3H),4.32(d,1H,J=4.2Hz),6.48(dd,1H,J=2.2,8.7Hz),6.61(d,1H,J=2.1Hz),6.88(brs,1H),7.15-7.30(m,4H),7.38(brs,1H),7.46(brs,1H),8.51(s,1H)和8.81(s,1H)。LCMS方法B：rt5.65min；m/z515.4[M+H]+。
中间体I4的合成:2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)。
(a)2-(2-碘代苯基)乙酸甲酯(I9)
将2-(2-碘代苯基)乙酸(5.00g,19.1mmol)置于反应烧瓶中并溶解于甲醇(150mL)。加入硫酸(250μL)并搅拌反应混合物，然后在氮气下在80℃下加热16小时。将所得混合物冷却至室温，然后在减压下蒸发除去挥发物。将残留物吸收在乙酸乙酯(100mL)中，用10%NaHCO3(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且在减压下蒸发，以得到标题化合物(I9)，为澄清液体(5.20g,99%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(dd,J=7.9,1.0Hz,1H),7.35–7.27(m,2H),6.97(ddd,J=7.9,7.0,2.1Hz,1H)，3.81(s,2H),3.72(s,3H)。
(b)2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I10)
在氮气下，将2-(2-碘代苯基)乙酸甲酯(I9)(4.65g,16.8mmol)、PdCl2(PPh3)2(295mg,421μmol)和Cu(I)I(80.0mg,421μmol)置于烘箱干燥的反应烧瓶中。加入(三甲基甲硅烷基)乙炔(2.80mL,20.2mmol)、干燥脱气的THF(20mL)和三乙胺(20mL)，然后在室温下搅拌反应混合物16小时。在减压下去除挥发物以得到黑色残留物，将该黑色残留物吸附在硅胶上，然后在硅胶上进行色谱分离(0-5%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，以得到标题化合物(I10)，为浅棕色液体(4.63g,99%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(dd,J=7.5,0.8Hz,1H),7.32–7.14(m,3H),3.84(s,2H),3.71(s,3H),0.26(s,9H)。LCMS方法C：rt6.64min。
(c)2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)
将2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I10)(4.63g,19.0mmol)溶解在DCM(200mL)中，并且在0℃下加入TBAF(1.0M，在THF中)(28.5mL,28.5mmol,1.5eq)。在室温下搅拌所得溶液1小时，然后用10%NaHCO3(100mL)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，然后在减压下蒸发以得到深棕/黑色残留物。将该残留物吸附在硅胶上，然后在硅胶上进行色谱分离(0-10%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，以得到标题化合物(I4)，为红色液体(2.76g,83%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(dd,J=7.6,1.1Hz,1H),7.43–7.16(m,3H),3.88(d,J=9.6Hz,2H),3.77–3.52(m,3H),3.28(s,1H)。
中间体I15的合成：2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I15)
(a)4-氯-2-甲硫基-5-(三氟甲基)嘧啶(I11)
在冰浴中，在氮气下向处于THF(50mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(2.50g,11.5mmol)的溶液中滴加氯化锌(II)(1.0M，在乙醚中，13.8mL，13.8mmol)。在冰浴中将该混合物搅拌2小时，然后加入甲硫醇钠(0.888g,12.7mmol)。将混合物搅拌过夜，使反应缓慢地回到室温。在18小时后用2MHCl(15mL)淬灭反应，并且在减压下蒸发除去有机物。用盐水(15mL)稀释残留物水溶液，并用DCM(3×30mL)萃取。干燥（相分离器）合并的有机相并且小心挥发以得到淡黄色油状物。色谱分离(2×40g二氧化硅卡套柱,0-20%DCM/正己烷)，然后小心地蒸去溶剂(40℃400mmHg，然后室温200mmHg)以得到标题化合物(I11)，为无色的油状物(2.149g,82%产率)；1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),2.61(s,3H)。LCMS方法C：rt:7.95min;m/z229.1[M+H]+。注意：I11是挥发性的。
(b)4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I12)
将4-氯-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I11)(5.00g,21.9mmol)置于反应烧瓶中，然后加入碘化钠（9.80g，65.6mmol）和氢碘酸(58%)(70mL)。在暗处将反应混合物搅拌48小时，然后加水(200mL)稀释，因此沉淀出无色固体。通过过滤收集该沉淀，然后用10%NaHCO3溶液洗涤至中性。用水(100mL)洗涤所得固体，然后将其抽干2小时以得到标题化合物(I12)，为淡黄色固体(3.956g,57%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),2.58(s,3H)。LCMS方法C：rt6.30min;m/z321.0[M+H]+。
(c)2-(2-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I13)
在氮气下，将4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I12)(2.00g,6.24mmol)、PdCl2(PPh3)2(438mg,625μmol)、CuI(119mg,625μmol)和三苯基膦(164mg,625μmol)置于烘箱干燥的微波反应小瓶中。加入2-(2-乙炔苯基)乙酸甲酯(I4)(1.31g,7.49mmol)、THF(20mL)和三乙胺(10mL)，然后在微波辐射下在100℃下将所得混合物搅拌10分钟。在减压下蒸发挥发物，然后通过DCM将残留物吸附在硅胶上。在硅胶上将预吸附的物质进行色谱分离(0-25%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)以得到标题化合物(I13)，为橙色固体(1.571g,69%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J=0.8Hz,1H),7.68(dd,J=7.7,1.1Hz,1H),7.50–7.29(m,3H),3.93(s,2H),3.71(d,J=3.4Hz,3H),2.62(d,J=3.4Hz,3H)。
(d)2-(2-((2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I14)
将2-(2-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I13)(3.14g,8.57mmol)溶解在DCM(150mL)中，然后将所得溶液冷却至0℃。加入mCPBA(70%;4.65g,18.9mmol)，然后将反应混合物温热至室温，在室温下，继续搅拌过夜。用10%NaHCO3(200mL)洗涤粗混合物并且分离各层。干燥(MgSO4)有机相，然后在减压下蒸发以得到浅黄色固体。将该固体吸附在硅胶上，然后在硅胶上进行色谱分离(0-50%乙酸乙酯/石油醚40-60℃)，得到标题化合物(I14)，为黄色固体(2.876g,84%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.13(d,J=0.7Hz,1H),7.73(dd,J=7.6,0.9Hz,1H),7.54–7.46(m,1H),7.44–7.32(m,2H),3.94(s,2H),3.77–3.67(m,3H),3.43(s,3H)。LCMS方法C：rt5.90min；m/z421.0(M+Na),399.1(M+1),367.0(M-OMe),339.1(M-COOMe)。
(e)2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I15)
将2-(2-((2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I14)(1.50g,3.76mmol)吸收在DMF(30mL)中，然后加入10%Pd/C(750mg)。在室温下在H2(1atm)下将所得悬浮液搅拌16小时。通过Celite（硅藻土）过滤粗反应混合物，用MeOH洗涤。在减压下蒸发滤液得到黄色液体，将黄色液体吸附在硅胶上。在硅胶上对硅胶吸附的物质进行色谱分离(0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I15)，为黄色固体(1.38g，91%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.07(d,J=0.7Hz,1H),7.30–7.12(m,4H),3.72(s,2H),3.68(s,3H),3.41–3.35(m,2H),3.35(s,3H),3.20(dd,J=9.6,6.3Hz,2H)。LCMS方法C：rt5.92min；m/z425.1(M+Na),403.1(M+1),401.1(M-1),371.1(M-OMe)，343.1(M-COOMe)。
实施例2：2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)
(a)4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I16)
在-78℃下，将二异丙基酰胺锂(2M在庚烷/THF/乙苯中；15.1mL,30.1mmol)逐滴加入处于THF(50mL)中的4-氧代哌啶-1-羧酸叔丁酯溶液(3.00g,15.1mmol)中，然后将混合物搅拌30分钟。然后经过30分钟向反应中滴加处于THF(60mL)中的N-苯基-二(三氟甲烷磺酰亚胺)(6.46g,18.1mmol)溶液，并在-78℃下将混合物搅拌30分钟。然后将所得混合物温热至室温并且搅拌24小时。部分地去除溶剂(约80mL)，并且用饱和的NaHCO3溶液(50mL)淬灭反应混合物。向溶液中加入DCM(50mL)并且分离各层。然后用DCM(2×50mL)萃取水层。合并有机层并且用0.2M柠檬酸溶液(50mL)、1MNaOH(50mL)、盐水(50mL)洗涤，并且通过Na2SO4干燥。在减压下除去溶剂得到棕色油状物，在硅胶上通过柱色谱(0-10%处于石油醚中的二乙醚，40-60℃)纯化该棕色油状物，得到标题化合物(I16)，为橙色油状物(2.48g,50%)，当冷却至-18℃时其结晶；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.76(s,1H),4.05-4.04(m,2H),3.63(t,J=5.6Hz,2H),2.46–2.43(m,2H),1.47(s,9H)。
(b)(2-甲氧基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(I17)
在110℃下在氮气下，将2-甲氧基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(1.00g,4.01mmol)、Boc酐(1.75g,8.02mmol)和甲苯(10mL)搅拌20小时。在减压下蒸发挥发物，然后将残留物吸附在硅胶上。色谱分离(SiO2,0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)得到标题化合物(I17)，为无色固体(1.40g,100%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J=7.9Hz,1H),7.43(dd,J=8.0,0.8Hz,1H),7.26(dd,J=7.8,6.9Hz,1H),3.92(s,3H),1.53(s,9H),1.35(s,12H)。LCMS方法C：rt6.85min。
(c)4-(4-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲氧苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I18)
向处于DME(15mL)中的4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I16)(474mg,1.43mmol)、(2-甲氧基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(I17)(500mg,1.43mmol)和Pd(PPh3)4(165mg,0.143mmol)的溶液中加入3.5M的NaHCO3水溶液(2.00mL,5.0eq)，并且在80℃下将所得悬浮液加热16小时。当冷却至室温后加入乙酸乙酯(70mL)，并且用水(50mL)洗涤所得溶液。干燥(MgSO4)有机层并且蒸发至干燥。将残留物进行色谱分离(SiO2，0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)得到标题化合物(I18)，为淡黄色液体(520mg,90%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(d,J=8.1Hz,1H),7.09(s,1H),6.96(dd,J=8.4,1.3Hz,1H),6.88(d,J=1.7Hz,1H),5.98(s,1H),4.08(d,J=1.9Hz,2H),3.89(s,3H),3.64(t,J=5.6Hz,2H),2.52(s,2H),1.54(s,9H),1.51(s,9H)。LCMS方法C：rt6.87min;m/z349.1[M-t-Bu+2]+。
(d)4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲氧苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I19)
在氢气氛下，将处于甲醇(30mL)中的4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲氧苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I18)(500mg,1.23mmol)和10%Pd/C(50mg)的悬浮液搅拌16小时。通过Celite（硅藻土）过滤所得混合物，用乙酸乙酯(70mL)洗涤，然后将滤液蒸发至干燥。将残留物色谱分离(SiO2,0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)以得到标题化合物(I19)，为淡黄色液体(411mg,82%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J=7.4Hz,1H),6.99(s,1H),6.76(d,J=8.3Hz,1H),6.67(s,1H),4.21(s,2H),3.84(s,3H),2.77(t,J=12.2Hz,2H),2.57(ddd,J=12.1,9.0,3.3Hz,1H),1.79(d,J=12.6Hz,2H),1.68–1.54(m,2H),1.50(s,9H),1.47(s,9H)。
(e)2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I20)
将2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I15)(200mg,0.497mmol)和4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲氧苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I19)(303mg,0.745mmol)溶解在三氟乙醇(4mL)中。加入三氟乙酸(200μL)并且在100℃下在微波辐射下将所得混合物加热1小时。将粗反应混合物吸附在硅胶上，然后通过硅胶色谱法分离(0-20%MeOH/DCM)以得到标题化合物(I20)，为浅棕色液体(215mg,82%)；1HNMR(400MHz,d6-丙酮)δ8.64(s,1H),8.37(dd,J=8.3,3.7Hz,1H),7.29(ddd,J=13.2,6.9,1.7Hz,3H),7.22(ddd,J=8.9,6.1,1.7Hz,1H),7.10(d,J=1.5Hz,1H),6.97(dd,J=8.3,1.5Hz,1H),3.98(d,J=7.4Hz,3H),3.82(s,2H),3.74–3.60(m,5H),3.27(t,J=11.7Hz,2H),3.22–3.06(m,4H),3.00(s,1H),2.34–2.17(m,2H),2.12(dd,J=4.0,3.5Hz,2H),2.08(dt,J=6.6,2.2Hz,3H)。LCMS方法C：rt5.23min；m/z529.1[M+1]+。
(f)4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I21)
在氮气下在室温下，将处于DCM(10mL)中的2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I20)(300mg,0.567mmol)和Boc酸酐(247mg,1.13mmol)的溶液搅拌20小时。在减压下蒸发挥发物以得到棕色液体，将该液体吸收在硅胶上。色谱分离(SiO2,0-15%MeOH/DCM)得到标题化合物(I21)，为棕色液体(210mg，59%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(s,1H),8.40(d,J=8.3Hz,1H),7.95(s,1H),7.31–7.18(m,4H),6.87(dd,J=8.4,1.7Hz,1H),6.79(d,J=1.7Hz,1H),4.28(d,J=6.5Hz,2H),3.95(d,J=4.0Hz,3H),3.78(s,2H),3.70(s,3H),3.26–3.02(m,4H),2.84(t,J=12.2Hz,2H),2.66(t,J=3.4Hz,1H),1.87(d,J=12.7Hz,2H),1.66(dd,J=12.9,3.4Hz,2H),1.52(s,9H)。LCMS方法C：rt7.24min;m/z629.2[M+1]+,627.0[M-1]-。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I22)
在室温下，将处于THF(10mL)、水(2mL)和甲醇(1mL)中的4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I21)(210mg,0.334mmol)和LiOH.H2O(42mg,1.0mmol)的溶液搅拌20小时。在减压下蒸发挥发物，得到标题化合物(I22)，为浅黄色固体，300mg,过量的质量是由于无机盐的存在。LCMS方法C：rt7.31min；m/z615.1[M+1]+,613.2[M-1]-。
(h)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)
在室温下，将处于干燥DMF(4mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I22)(210mg,0.338mmol)、HATU(257mg,0.676mmol)、氯化铵(362mg,6.76mmol)和DIPEA(115μL)的溶液搅拌过夜。在减压下蒸发挥发物，并且用乙酸乙酯稀释残留物。用10%NaHCO3洗涤所得溶液，然后干燥(MgSO4)有机层。在减压下除去挥发物，并且将残留物色谱分离(SiO2,0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I23)，为无色固体(185mg,89%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),8.26(d,J=8.3Hz,1H),7.88(s,1H),7.25(dd,J=4.4,2.4Hz,2H),6.86(dd,J=8.3,1.7Hz,1H),6.76(d,J=1.7Hz,1H),5.49(d,J=39.2Hz,2H),4.24(s,2H),3.92(s,3H),3.70(s,2H),3.20–3.02(m,4H),2.80(m,2H),2.64(s,2H),1.84(d,J=12.8Hz,2H),1.62(dd,J=12.3,3.5Hz,2H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt6.64min;m/z636.2[M+Na]+,614.1[M+1]+,612.2[M-1]-,558.2[M-t-Bu+2]+。
(i)2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)
将三氟乙酸(1mL)加入到处于DCM(10mL)中的4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)(185mg,0.301mmol)的搅拌溶液中，并且在室温下将所得溶液搅拌2小时。加入DCM(20mL)和10%NaHCO3溶液(10mL)，然后干燥(MgSO4)有机层并且在减压下挥发至干燥，得到标题化合物(2)，为无色固体(125mg,81%)；1HNMR(400MHz,CD2Cl2)δ8.49(s,1H),8.31(d,J=8.3Hz,1H),7.91(s,1H),7.28–7.12(m,3H),6.94(bs,2H),6.85(d,J=8.2Hz,1H),6.78(dd,J=11.8,3.1Hz,1H),6.35(s,1H),5.94(s,1H),3.88(s,3H),3.65(s,2H),3.42(d,J=12.3Hz,2H),3.24–3.02(m,4H),2.91(t,J=11.3Hz,2H),2.75–2.61(m,1H),2.10–1.83(m,4H)。LCMS方法C：rt4.92min；m/z514.1[M+1]+,521.1[M-1]-。
实施例3:2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(3)
将甲醛溶液(37%aq.;32μL,0.39mmol)加入到处于干燥甲醇(2mL)中的2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)(40mg,78μmol)的搅拌溶液中。在氮气下加入三乙酰氧基硼氢化钠(83mg,0.39mmol)，并且在室温下将所得混合物搅拌2小时。用乙酸乙酯稀释粗混合物，并且吸附在硅胶上。色谱分离(SiO2,0-20%MeOH/DCM)得到标题化合物(3)，为固体(25mg,61%)；1HNMR(400MHz,CD2Cl2)δ8.53(s,1H),8.34(d,J=8.3Hz,1H),7.94(s,1H),7.29–7.15(m,4H),6.92(dd,J=8.3,1.4Hz,1H),6.82(d,J=1.7Hz,1H),6.12(bs,1H),5.84(bs,1H),3.91(s,3H),3.68(s,2H),3.60(d,J=10.6Hz,2H),3.24–3.03(m,4H),2.80(s,3H),2.79(m,2H),2.71(m,1H),2.42–2.20(m,2H),2.01(m,2H)。LCMS方法C：rt4.92min;m/z528.1[M+1]+,526.1[M-1]-。
实施例3A：2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)和2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(3)的替代性合成
(a)4-溴-2-甲氧基-1-硝基苯(I24)
在氮气氛下，将金属钠(3.14g,136mmol)分批加入到甲醇(300mL)中。一旦获得了均匀溶液，加入4-溴-2-氟-1-硝基苯(20.0g,91mmol)，然后将所得混合物在60℃下搅拌1h。蒸发挥发物并且将固体残留物悬浮在水(400mL)中。过滤所得悬浮液，用水(2×50mL)洗涤。空气干燥滤饼，得到标题化合物(I24)，为淡黄色固体(20.1g,95%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J=8.6Hz,1H),7.24(d,J=1.9Hz,1H),7.18(dd,J=8.6,1.9Hz,1H),3.97(s,3H)。LCMS方法C:rt5.85min。
(b)4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I25)
用三次真空/氮气循环将4-溴-2-甲氧基-1-硝基苯(I24)(2.364g,10.2mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(3.00g,9.70mmol)、碳酸钾(4.02g,29.1mmol)和DMF(60mL)的混合物进行脱气，然后在氮气下在Schlenk管中加入PdCl2(dppf)-DCM溶剂化物（450mg，6mol%）。以相同方式制备第二管(即总共6.00g的起始硼酸盐),在氮气下将两个管加热到85℃。在17小时后在氮气下将两个管冷却并且加入到5%w/v氯化锂水溶液(600mL)中。用乙醚(300mL)和乙酸乙酯(3×300mL)萃取所得混合物。用水(600mL)和盐水(600mL)洗涤合并的有机提取物，干燥（硫酸钠），然后蒸发至干燥。将残留物色谱分离(120g二氧化硅卡套柱,0-60%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I25)，为黄色固体(5.863g,91%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,J=8.5Hz,1H),7.04–6.97(m,2H),6.17(s,1H),4.12(d,J=2.5Hz,2H),3.98(s,3H),3.65(t,J=5.6Hz,2H),2.52(s,2H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt6.27min;m/z279.0[M-tBu+2H]+,235.1[M-Boc+2H]+。
(c)4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)
将4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I25)(5.609g,16.78mmol)溶解在1:1的乙醇:乙酸乙酯(500mL)中，并且加入Pd/C(2.50g)。在氢气下将混合物剧烈搅拌5小时，然后通过Celite（硅藻土）过滤。用乙酸乙酯(500mL)洗涤Celite（硅藻土），并且蒸发合并的滤液，得到标题化合物(I26)，为灰白色固体(4.93g,96%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.69–6.60(m,3H),4.22(s,2H),3.84(s,3H),2.78(t,J=12.4Hz,2H),2.54(tt,J=12.1,3.5Hz,1H),1.80(d,J=13.1Hz,2H),1.65–1.53(m,2H),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt4.91min;m/z251.1[M-tBu+2H]+,207.2[M-Boc+2H]+。
(d)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I27)
在氮气下，将处于1:1的叔丁醇:二氯乙烷(40mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(981mg,4.52mmol)的溶液冷却至0℃，然后向其中滴加处于乙醚(4.52mL,4.52mmol)中的1.0M氯化锌(II)的溶液。在一小时后在-10℃下,逐滴加入处于1:1的叔丁醇:二氯乙烷(50mL)中的4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)(1.26g,4.11mmol)和三乙胺(0.860mL,6.17mmol)的溶液，然后将混合物搅拌16小时使温度升至室温。将混合物浓缩、蒸发至硅石上并且色谱分离(120g二氧化硅卡套柱,0-10%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I27)，为白色固体(1.277g,64%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),8.28(d,J=8.3Hz,1H),8.01(s,1H),6.86(dd,J=8.3,1.8Hz,1H),6.76(d,J=1.8Hz,1H),4.25(brs,2H),3.91(s,3H),2.87–2.73(m,2H),2.64(tt,J=12.1,3.6Hz,1H),1.83(d,J=12.5Hz,2H),1.69–1.54(m,与水重叠),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt7.12min;m/z431.0[M-tBu+2H]+,387.1[M-Boc+2H]+;m/z485.1[M-H]-。
(e)4-(3-甲氧基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I28)
在微波管中用氮气将2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(0.472g,2.71mmol)、4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I27)(1.10g,2.26mmol)、三苯基膦(59mg,10mol%)、碘化铜(I)(43mg,10mol%)、二(三苯基膦)氯化钯(II)(79mg,5mol%)、DMF(12mL)和三乙胺(1.26mL,9.04mmol)的混合物脱气，然后在微波辐射下在120℃下加热15分钟。如上所述制备三个另外的管并且进行加热(即总计4.40g的I27)。合并冷却的混合物，然后倒入水(600mL)中。用二氯甲烷(3×250mL)萃取所得混合物，然后用水(2×300mL)、盐水(300mL)洗涤合并的有机相，通过硫酸钠干燥并且蒸发至干燥。将残留物色谱分离(120g二氧化硅卡套柱,0-50%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I28)，为黄色固体(5.52g,98%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),8.38(d,J=8.3Hz,1H),8.00(s,1H),7.69(dd,J=7.7,0.9Hz,1H),7.43(td,J=7.6,1.4Hz,1H),7.36(d,J=7.9Hz,1H),7.32(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),6.87(dd,J=8.4,1.8Hz,1H),6.76(d,J=1.8Hz,1H),4.26(s,2H),3.97(s,2H),3.91(s,3H),3.71(s,3H),2.81(t,J=12.6Hz,2H),2.64(tt,J=12.2,3.6Hz,1H),1.84(d,J=12.6Hz,2H),1.69–1.55(m,与水重叠),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt7.05min;m/z(625.1[M+H]+,569.1[M-tBu+2H]+;m/z623.2[M-H]-。
(f)4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I21)
将4-(3-甲氧基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I28)(5.52g,8.84mmol)溶解在DMF(250mL)中，然后加入三乙胺(1mL)和Pd/C(2.50g)，并且在氢气下在30℃下搅拌混合物。在16小时后，通过Celite（硅藻土）过滤混合物并且用DMF(250mL)洗涤该Celite（硅藻土）。将三乙胺(1mL)和Pd/C(2.50g)加入到合并的滤液中，然后在氢气下在30℃下搅拌混合物。在18小时后将所得混合物通过Celite（硅藻土）过滤，并用乙酸乙酯(300mL)洗涤Celite（硅藻土）。将滤液分成两部分；将每部份倒入水(800mL)中，并且用乙酸乙酯(3×300mL)萃取所得混合物。合并来自每一部分的乙酸乙酯萃取物，用水(2×500mL)和盐水洗涤、干燥（硫酸钠）并蒸发。将该两个处理物（workup）合并并且进行色谱分离(120g二氧化硅卡套柱,0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I21)，为白色固体(3.620g,65%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(s,1H),8.37(d,J=8.3Hz,1H),7.91(s,1H),7.29–7.18(m,与CHCl3重叠),6.85(dd,J=8.3,1.8Hz,1H),6.77(d,J=1.8Hz,1H),4.26(s,2H),3.93(s,3H),3.68(s,3H),3.19–3.01(m,4H),2.81(t,J=12.7Hz,2H),2.64(tt,J=12.0,3.5Hz,1H),1.85(d,J=13.3Hz,2H),1.70–1.57(m,与水重叠),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt7.14min;m/z629.2[M+H]+,573.1[M-tBu+2H]+;m/z627.2[M-H]。
(g)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)
将4-(3-甲氧基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I21)(3.62g,5.76mmol)溶解在THF(200mL)中，然后加入处于水(100mL)中的氢氧化锂一水合物(1.21g,28.8mmol)的溶液。在室温下将所得混合物搅拌18小时，然后浓缩。将残留物倒入饱和碳酸氢钠(200mL)和水(300mL)中。用乙酸乙酯(3×300mL)萃取所得混合物，并且用盐水洗涤合并的有机相，通过硫酸钠干燥并且蒸发。从甲苯中蒸发残留物，然后在氮气下在30℃下，将其溶解在THF(70mL)和DMF(12mL)中。剧烈搅拌该混合物，同时加入HOBT(1.012g,7.49mmol)、EDCI.HCl(1.330g,7.49mmol)和DIPEA(5.02mL,28.8mmol)。在五分钟后，加入碳酸铵(2.77g,28.8mmol)并且继续搅拌16小时。将所得混合物倒入饱和碳酸氢钠(300mL)中并且用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。用1:1的饱和盐水:水(2×300mL)、盐水(300mL)洗涤合并的有机相，通过硫酸钠干燥并且蒸发。将残留物色谱分离(120g二氧化硅卡套柱,0-80%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I23)，为白色固体(2.698g,76%经过两个步骤)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),8.28(d,J=8.3Hz,1H),7.86(s,1H),7.29–7.22(m,与剩余的CHCl3重叠),6.86(dd,J=8.3,1.9Hz,1H),6.76(d,J=1.9Hz,1H),5.37(d,J=15.9Hz,2H),4.25(s,2H),3.93(s,3H),3.71(s,2H),3.18–3.04(m,4H),2.81(t,J=12.5Hz,2H),2.64(tt,J=12.0,3.4Hz,1H),1.84(d,J=12.9Hz,2H),1.69–1.55(m,与水重叠),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt6.59min;m/z614.2[M+H]+,558.1[M-tBu+2H]+;m/z612.2[M-H]-。
(h)2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基l)苯基)乙酰胺(2)
将4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)(2.694g,4.39mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(150mL)中，并且加入TFA(15mL)。将所得混合物搅拌16小时，然后浓缩。将残留物悬浮在10%氢氧化钠(200mL)中，然后用乙酸乙酯(5×200mL)萃取。用盐水(300mL)洗涤合并的有机相，通过硫酸钠干燥并且蒸发，得到标题化合物(2)，白色固体(2.252g,100%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.26(d,J=8.3Hz,1H),7.85(s,1H),7.29–7.21(m,与CHCl3重叠),6.87(d,J=8.3Hz,1H),6.80(s,1H),5.43(d,J=10.1Hz,2H),3.92(d,J=1.3Hz,3H),3.70(s,2H),3.20(d,J=12.7Hz,2H),3.15–3.05(m,4H),2.75(t,J=12.2Hz,2H),2.61(tt,J=12.0,3.5Hz,1H),1.89–1.76(m,与水重叠),1.67(qd,J=12.7,3.9Hz,2H)。LCMS方法C：rt4.92min;m/z514.1[M+H]+,536.1[M+Na]+;m/z512.2[M-H]-。
(i)2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(3)
将2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)(2.249g,4.38mmol)溶解在甲醇(220mL)中，然后加入37%甲醛溶液(0.483mL,17.5mmol)。在五分钟后，加入三(乙酰氧基)硼氢化钠(4.641g,21.9mmol)并且在室温下继续搅拌2小时。蒸发挥发物并且将残留物悬浮在5%的氢氧化钠水溶液(200mL)中。用乙酸乙酯(5×200mL)萃取所得的混合物，然后用盐水(500mL)洗涤合并的有机相，通过硫酸钠干燥并且蒸发。从乙醚中蒸发残留物，然后在高真空下除去痕量溶剂，得到标题化合物(3)，为白色固体(2.196g,95%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.24(d,J=8.2Hz,1H),7.85(s,1H),7.28–7.22(m,与CHCl3重叠),6.88(dd,J=8.3,1.9Hz,1H),6.81(d,J=1.8Hz,1H),5.41(s,2H),3.90(s,3H),3.70(s,2H),3.16–3.06(m,4H),2.99(d,J=12.1Hz,2H),2.48(tt,J=10.5,5.9Hz,1H),2.34(s,3H),2.07(td,J=11.1,4.1Hz,2H),1.89–1.77(m,与水重叠)。LCMS方法C：rt4.94min;m/z528.1[M+H]+,550.1[M+Na]+;m/z526.2[M-H]-。
实施例4：2-(2-(2-(2-((4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(4)
将乙醛(18mg,0.39mmol)加入到处于干燥甲醇(2mL)中的2-(2-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(2)(40mg,78μmol)的搅拌溶液中。在氮气下加入三乙酰氧基硼氢化钠(83mg,0.39mmol)，并且在室温下将所得混合物搅拌2小时。用乙酸乙酯稀释粗混合物并且吸附至硅胶上。色谱分离(SiO2,0-20%MeOH/DCM)，得到标题化合物(4)，为浅色固体(10mg,24%)；1HNMR(400MHz,CD2Cl2)δ8.52(s,1H),8.34(d,J=8.3Hz,1H),7.92(s,1H),7.28–7.14(m,4H),6.92(d,J=8.3Hz,1H),6.82(d,J=1.7Hz,1H),5.91(bs,1H),5.87(bs,1H),3.91(s,3H),3.66(s,2H),3.63(m,2H),3.20–3.01(m,6H),2.73(d,J=11.7Hz,2H),2.42–2.21(m,3H),2.02(d,J=18.0Hz,4H),1.37(t,J=7.3Hz,3H)。LCMS方法C：rt4.96min;m/z542.2[M+1]+,540.1[M-1]-。
实施例5：3-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯酰胺(5)
(a)3-碘苯甲酰胺(I29)
在室温下，向处于MeCN(100mL)中的3-碘苯甲酸(2.00g,8.06mmol)和DIPEA(5.62mL,32.3mmol)的搅拌溶液中加入HOBT(1.63g,12.1mmol)和EDCI.HCl(2.32g,12.1mmol)。在搅拌10分钟后，加入碳酸铵(4.65g,48.4mmol)，然后将所得溶液搅拌过夜。在真空中除去挥发物以产生粗固体，将该粗固体悬浮在水(100mL)中。将所得悬浮液超声处理10分钟，然后通过过滤收集固体。用水(20mL)洗涤滤饼并且干燥，得到标题化合物(I29)，为棕色固体(1.65g，83%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(t,J=1.6Hz,1H),7.83(ddd,J=7.9,1.7,1.1Hz,1H),7.73(ddd,J=7.8,1.7,1.1Hz,1H),7.16(t,J=7.8Hz,1H),6.18–5.49(m,J=137.3Hz,2H)。LCMS方法C：rt=5.04min;m/z=248[M+1]+。
(b)3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酰胺(I30)
在氮气氛下，将处于THF(100mL)和三乙胺(4.64mL,33.3mmol)中的3-碘苯甲酰胺(I29)(1.65g,6.66mmol)、Cu(I)I(127mg,0.666mmol)和三苯基膦(524mg,2.00mmol)的溶液超声处理10分钟。然后加入PdCl2(PPh3)2(642mg,0.67mmol)和TMS乙炔(1.88mL,13.3mmol)，并且在室温下将反应搅拌3天。在真空下蒸发挥发物，并且将残留物在硅胶上进行色谱分离(0-50%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I30)(1.53g)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(t,J=1.5Hz,1H),7.67(ddd,J=7.8,1.8,1.2Hz,1H),7.53–7.48(m,1H),7.29(td,J=7.8,0.5Hz,1H),0.15(s,9H)。
(c)3-乙炔基苯甲酰胺(I31)
在室温下，将碳酸钾(1.84g,13.3mmol)加入到处于甲醇(15mL)中的3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酰胺(I30)(1.45g,6.66mmol)的搅拌溶液中。将所得悬浮液搅拌30分钟，然后加入水(100mL)和EtOAc(100mL)。通过过滤收集所得沉淀物，并且在空气干燥后将其悬浮在丙酮和甲醇的1:1混合物(15mL)中。在超声处理后，将所得悬浮液过滤，得到标题化合物(I31)(335mg,35%)，其可直接使用而无需另外的纯化。
(d)2-甲氧基-4-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯胺(I32)
向处于DCM(60mL)中的4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲氧基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I18)(6.7g,0.016mol)的溶液中加入TFA(6.0mL,0.081mol)，并且在室温下将所得溶液搅拌14小时。加入另外的5mLTFA，并且将反应搅拌另外6小时。在真空下除去挥发物，将残留物用CH3CN/H2O吸收并且冻干，得到标题化合物(I32)，为TFA盐，为棕色油状物(6.38g,91%)；1HNMR(400MHz,d4-MeOH)δ7.31(dd,J=7.3,2.8Hz,1H),7.21(t,J=2.0Hz,1H),7.13–7.09(m,1H),6.20(tt,J=3.4,1.6Hz,1H),3.83(dd,J=5.7,2.4Hz,2H),3.43(t,J=6.1Hz,2H),2.77(ddd,J=8.0,3.9,1.9Hz,2H)。LCMS方法C：rt1.38min;m/z201.1[M+H]+。
(e)4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I33)
在室温下，经过5分钟向处于甲醇(50mL)中的2-甲氧基-4-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯胺(I32)(6.38g,14.8mmol)的搅拌溶液中逐滴加入处于甲醇(20mL)中的(Boc)2O(3.27g,15.0mmol)的溶液，并且将所得溶液搅拌1小时。在真空下浓缩混合物，并且将残留物吸收在2MNaOH(50mL)溶液中。用CH2Cl2(4×50mL)萃取水层，并且用盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取物，然后干燥(MgSO4)。在真空下将溶剂除去，得到标题化合物(I33)，为棕色油状物(1.97g,43%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.85–6.80(m,1H),6.67(d,J=8.1Hz,1H),5.90(s,1H),4.05(d,J=2.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.62(t,J=5.7Hz,1H),2.49(s,2H),1.49(s,9H)。
(f)4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)
在氮气下，向处于DMF(2mL)中的10%Pd/C(0.068g)的悬浮液中加入处于EtOH(50mL)中的4-(4-氨基-3-甲氧苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I33)(2.0g,6.5mmol)的溶液，然后在室温下，在氢气氛下将所得悬浮液搅拌24小时。通过Celite（硅藻土）过滤反应混合物，用乙酸乙酯(100mL)洗涤。将滤液蒸发至干燥，得到标题化合物(I26)，为浅棕色固体(1.42g,72%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.66–6.58(m,3H),4.21(s,2H),3.76–3.66(m,4H),2.53(tt,J=12.1,3.5Hz,1H),1.84–1.75(m,2H),1.55(tdd,J=11.5,6.4,3.1Hz,1H),1.47(s,9H)。
(g)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I34)
在0℃下在氮气下，将氯化锌(1.0M在Et2O中)(8.56mL,8.56mmol)加入到处于1:1DCE/t-BuOH(10mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(1.06mL,7.85mmol)的溶液中。在0℃下将混合物搅拌1小时，然后加入处于1:1DCE/tBuOH(30mL)中的4-(4-氨基-3-甲氧苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)(1.97g,7.13mmol)的溶液。然后在0℃下逐滴加入处于1:1DCE/t-BuOH(10mL)中的三乙胺(600μL,0.432mmol,1.1eq)的溶液。在最终加入后，在0℃下将该反应混合物剧烈搅拌另外30分钟，然后室温下搅拌24小时。在真空下除去溶剂，提供棕色油状残留物，在硅胶上通过柱色谱法(0-45%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)纯化该残留物，得到淡黄色油状物，当静置时该淡黄色油状物凝固。用水、1:1水/MeOH和MeOH顺序地研磨该固体，然后将沉淀物过滤，得到白色固体。将该固体在水中重结晶，得到标题化合物(I34)，为白色固体(0.92g,30%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),8.28(d,J=8.3Hz,1H),8.01(s,1H),6.86(dd,J=8.4,1.7Hz,1H),6.76(d,J=1.8Hz,1H),4.25(s,2H),3.91(s,3H),2.81(t,J=11.8Hz,2H),2.64(tt,J=12.1,3.6Hz,1H),1.83(d,J=13.5Hz,2H),1.69–1.57(m,2H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt7.00min;m/z=487.0[M+H]+,431.0[M-t丁基+H]+,485.0[M-H]-。
(h)4-(4-((4-((3-氨甲酰基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I35)
在氮气下，向已经用氮气脱气10分钟的处于DMF(2mL)中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I34)(0.098g,0.20mmol)、3-乙炔基苯甲酰胺(I31)(0.038g,0.26mmol)、PdCl2(PPh3)2(9mg,0.01mmol)、三苯基膦(0.010g,0.04mmol)和碘化铜(I)(0.009g,0.05mmol)的混合物中加入三乙胺(0.090mL,0.65mmol)。用氮气将混合物脱气，然后在微波辐射下加热至120℃持续25分钟。当冷却至室温时将所得混合物放置过夜，然后加入另外部分的3-乙炔基苯甲酰胺(I26)(0.047g,0.32mmol)。在用氮气脱气后，在微波辐射下在120℃下将反应加热25分钟。在减压下蒸发挥发物，并且用硅胶柱色谱法(20-70%EtOAc/石油醚，40-60℃)纯化残留物，得到标题化合物(I35)，为黄色固体(0.073g,61%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),8.35(d,J=8.3Hz,1H),8.04(dd,J=1.4,1.4Hz,1H),8.02(s,1H),7.93(ddd,J=7.9,1.8,1.2Hz,1H),7.80(m,1H),7.53(m,1H),6.88(dd,J=8.3,1.6Hz,1H),6.76(d,J=1.8Hz,1H),4.27(m,2H),3.91(s,3H),2.81(m,J=12.2Hz,2H),2.64(tt,J=12.2,3.4Hz,1H),1.84(m,2H),1.65(m,2H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt6.59min;m/z496.1[(M-Boc)+H]+,540.0[(M-t-Bu)+H]+。
(i)4-(4-((4-(3-氨甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I36)
在氢气氛下，将处于DMF(3mL)中的4-(4-((4-((3-氨甲酰基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I35)(0.073g,0.12mmol)和10%活性碳载钯(0.042g)的混合物搅拌20小时。将所得混合物过滤并且将滤液在减压下蒸发至干燥。将残留物在硅胶上进行色谱分离(20-100%丙酮/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I36)(0.070g,95%)。
(j)3-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(5)
在室温下，将处于THF(3mL)中的4-(4-((4-(3-氨甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I36)(0.070g,0.12mmol)和TFA(0.200mL,2.61mmol)的混合物搅拌16小时。在减压下将混合物浓缩并且与甲苯共沸。然后用SCX卡套柱(MeOH,0.5%NH3/MeOH)纯化残留物。将甲醇氨洗脱液浓缩，然后溶解在热乙腈中，使该乙腈冷却至室温。将该冷却的乙腈溶液过滤并且将滤液浓缩，吸收在热乙腈(2mL)和水(1mL)中，然后冷冻干燥，得到标题化合物(5)，为白色固体(49.4mg,85%)。将该物质的一部分通过质量导向的自动制备型HPLC进一步纯化，得到标题化合物(5)，为白色固体(4.5mg)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.90(m,1H),8.57(s,1H),8.41(s,1H),7.93(s,1H),7.77(s,1H),7.71(m,1H),7.62(dd,J=7.5,7.5Hz,1H),7.34(m,2H),6.94(dd,J=7.3,1.6Hz,1H),6.82(ddd,J=7.9,3.4,1.5Hz,1H),3.82(s,3H),3.12(m,2H),3.05(m,4H),2.89(m,1H),2.68(m,2H),2.20(m,1H),1.78(m,2H),1.64(m,2H)。LCMS方法C：rt4.89min;m/z500.1[M+H]+。
实施例6：3-(2-(2-((2-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(6)
在N2气氛下，向处于无水甲醇(2.00mL)中的3-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(5)(0.021g,0.042mmol)的溶液中加入37%甲醛水溶液(0.012mL,0.16mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.044g,0.21mmol)。然后将混合物搅拌1.5小时。在减压下将所得混合物浓缩并且用EtOAc(10mL)稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。进一步用EtOAc(10mL)萃取水溶液，并且用盐水(10mL)和水(10mL)洗涤合并的有机层，然后用相分离卡套柱干燥。在减压下将有机物浓缩并且用硅胶柱色谱(0-30%MeOH/EtOAc+1%2M乙醇NH3)纯化。然后将产物吸收在少量的热乙腈和水中，并且冷冻干燥，得到标题化合物(6)，为白色固体(0.016g,74%)；1HNMR(400MHz,d6-丙酮)δ8.62(s,1H),8.27(dd,J=8.3,4.1Hz,1H),8.15(s,1H),7.90(s,1H),7.78(d,J=7.5Hz,1H),7.41(m,3H),6.99(d,J=1.7Hz,1H),6.89(dd,J=8.2,1.6Hz,1H),6.55(s,1H),3.98(s,3H),3.20(m,4H),2.90(m,2H),2.57(m,1H),2.22(s,3H),1.98(td,J=11.2,3.8Hz,2H),1.78(m,4H)。LCMS方法C：rt4.97min;m/z514.2[M+H]+。
实施例7:3-(2-(2-((4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(7)
在N2气氛下，向处于甲醇(2.00mL)中的3-(2-(2-((2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(5)(0.021g,0.04mmol)的溶液中加入乙醛(0.010mL,0.18mmol)，随后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.044g,0.21mmol)。然后在室温下将混合物搅拌5小时。在减压下将所得混合物浓缩，并且用硅胶柱色谱(0-30%MeOH/EtOAc+1%2M乙醇NH3)纯化。使用质量导向的自动制备型HPLC进一步纯化产物，得到标题化合物(7)(3.5mg,16%);1HNMR(400MHz,d6-丙酮)δ8.62(s,1H),8.24(m,2H),7.91(s,1H),7.78(ddd,J=7.5,1.4,1.4Hz,1H),7.41(m,3H),7.01(d,J=1.7Hz,1H),6.89(dd,J=8.3,1.7Hz,1H),6.60(m,1H),3.97(s,3H),3.21(m,4H),3.12(m,2H),2.55(m,3H),2.16(m,2H),1.85(m,4H),1.11(t,J=7.2Hz,3H)。LCMS方法C：rt4.98min;m/z528.2[M+H]+。
实施例8:2-(2-(2-(2-((2-乙基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(8)
(a)4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I37)
将双(频哪醇)二硼(0.511g,2.01mmol)、乙酸钾(0.592g,6.04mmol)、dppf(56mg,5mol%)和PdCl2(dppf)二氯甲烷溶剂化物(83mg,5mol%)加载到Schlenk管中，然后用氮气吹扫。加入处于二氧杂环己烷(5mL)中的4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I16)(1.00g,3.02)的溶液，将混合物用3×真空/氮气循环进行脱气，然后在氮气下升温至80℃。在16小时后，将混合物冷却，并且加入水(100mL)中。用二氯甲烷(3×50mL)萃取所得混合物，并且用盐水(50mL)洗涤合并的DCM萃取物，通过硫酸钠干燥并且蒸发。色谱分离(40g二氧化硅卡套柱,0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I37)，为结晶的白色固体(383mg,62%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.45(s,1H),3.94(d,J=2.7Hz,2H),3.43(t,J=5.5Hz,2H),2.22(s,2H),1.45(s,9H),1.26(s)。LCMS方法C：rt6.48min;m/z254.2[M-tBu+2H]+,210.2[M-Boc+2H]+。
(b)(4-溴-2-乙基苯基)氨基甲酸苄酯(I38)
将4-溴-2-乙基苯胺(500mg,2.50mmol)溶解在甲苯(25mL)中，加入碳酸钠(397mg,3.75mmol)和氯甲酸苄基酯(0.428mL,3.00mmol)，并且在氮气下在室温下搅拌混合物。20小时后，加入水(25mL)，将水相分离并用乙酸乙酯(2×25mL)洗涤。用盐水洗涤合并的有机萃取物，通过硫酸钠干燥并且蒸发。色谱分离(40g二氧化硅卡套柱,0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I38)，为粉红色固体(708mg,85%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(s,1H),7.44–7.28(m,7H),6.43(s,1H),5.20(s,2H),2.54(q,J=7.6Hz,2H),1.21(t,J=7.6Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.46min;m/z258.0[M-PhCH2O+CH3OH]+。
(c)4-(4-(((苯甲氧基)羰基)氨基)-3-乙基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I39)
将碳酸钾(215mg,1.55mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I37)(160mg,0.517mmol)、(4-溴-2-乙基苯基)氨基甲酸苄基酯(I34)(182mg,0.543mmol)、PdCl2(dppf)-DCM溶剂化物(22mg,5mol%)和DMF(5mL)加载到Schlenk管中，并且用3×真空/氮气循环进行脱气。在氮气下将混合物加热至80℃，在18小时后，冷却并且倒入水(100mL)中。加入DCM(75mL)和盐水(50mL)，进一步用DCM(2×75mL)洗涤水相，并且用盐水洗涤合并的DCM萃取物、干燥并且蒸发。色谱分离(40g二氧化硅卡套柱,0-80%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I39)，为无色油状物(129mg,57%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),7.45–7.31(m,5H),7.22(dd,J=8.5,2.1Hz,1H),7.18(d,J=2.1Hz,1H),6.48(s,1H),5.99(s,1H),5.21(s,2H),4.06(d,J=2.5Hz,2H),3.63(t,J=5.7Hz,2H),2.58(q,J=7.6Hz,2H),2.50(s,2H),1.49(s,9H),1.22(t,J=7.6Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.67min;m/z337.1[M-Boc+2H]+,381.1[M-tBu+2H]+。
(d)4-(4-氨基-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I40)
将4-(4-(((苯甲氧基)羰基)氨基)-3-乙基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I39)(0.500g,1.14mmol)溶解在乙醇(20mL)中,并且加入处于乙醇(2mL)中的10%Pd/C(0.25g)的浆液。在氢气下将混合物搅拌18小时，然后通过Celite（硅藻土）过滤，用乙醇(30mL)洗涤该Celite（硅藻土）。蒸发合并的滤液，并且色谱分离(12g二氧化硅卡套柱，0-80%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I40)，为粉红色糖浆物(0.212g,61%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.90(d,J=2.0Hz,1H),6.87(dd,J=8.0,2.1Hz,1H),6.63(d,J=8.0Hz,1H),4.21(s,2H),3.55(s,2H),2.78(t,J=12.2Hz,2H),2.59–2.46(m,3H),1.78(d,J=13.2Hz,2H),1.66–1.53(m,与水重叠),1.48(s,9H),1.25(t,J=7.5Hz,3H)。LCMS方法C：rt5.33min;m/z249.2[M-tBu+2H]+,205.2[M-Boc+2H]+。
(e)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I41)
在氮气下在0℃下，搅拌处于1:1DCE:t-BuOH(5mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(166mg,0.766mmol)的溶液。加入处于乙醚(0.77mL,0.77mmol)中的1.0M氯化锌(II)的溶液，并且将混合物搅拌一小时。逐滴加入处于1:1DCE:t-BuOH(5mL)中的4-(4-氨基-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I40)(212mg,0.70mmol)的溶液，并且在30分钟后加入处于1:1DCE:t-BuOH(5mL)中的三乙胺(146μL,1.05mmol)的溶液，然后将混合物缓慢恢复至室温。在18小时后将混合物浓缩，然后色谱分离(12g二氧化硅卡套柱,0-50%乙酸乙酯/环己烷)，得到标题化合物(I41)，为淡粉色固体(283mg,84%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(d,J=0.6Hz,1H),7.60(d,J=8.3Hz,1H),7.15–7.07(m,3H),4.25(s,2H),2.80(t,J=12.1Hz,2H),2.69–2.59(m,3H),1.83(d,J=12.9Hz,2H),1.69–1.59(m,2H),1.49(s,9H),1.23(t,J=7.6Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.94min;m/z429.1[M-tBu+2H]+,385.1[M-Boc+2H]+;m/z483.1[M-H]-。
(f)4-(3-乙基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I42)
用氮气对4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I41)(283mg,0.584mmol)、2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(122mg,0.700mmol)、碘化铜(I)(17mg,15mol%)、三苯基膦(23mg,15mol%)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(41mg,10mol%)、三乙胺(0.33mL,2.3mmol)和DMF(3mL)的混合物进行脱气，然后在微波辐射下（120℃/15min)加热。将冷却的混合物倒入水(30mL)中并且用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。用盐水(2×50mL)洗涤合并的有机萃取物，通过硫酸钠干燥并且蒸发。色谱分离(12g二氧化硅卡套柱,0-80%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I42)，为棕色油状物(311mg,86%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),7.73–7.65(m,2H),7.46–7.28(m),7.15–7.08(m),4.25(s,2H),3.95(s,J=9.6Hz,2H),3.70(s,3H),2.80(t,J=12.1Hz,2H),2.70–2.59(m,3H),1.84(d,J=12.9Hz,2H),1.65(td,J=12.8,4.1Hz,2H),1.49(s,9H),1.25(t,J=7.6Hz,3H)。LCMS:rt7.01min;m/z623.1[M+H]+,567.1[M-tBu+2H]+,523.1[M-Boc+2H]+;m/z621.2[M-H]-。
(g)4-(3-乙基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I43)
将4-(3-乙基-4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I42)(311mg,0.499mmol)溶解在乙醇(20mL)中，然后加入处于乙醇(2mL)中的Pd/C(150mg)的浆液。在氢气下将混合物搅拌18小时，通过Celite（硅藻土）过滤，用乙醇(20mL)洗涤Celite（硅藻土）并且将滤液浓缩。将混合物吸收在乙醇(20mL)中，加入处于乙醇(2mL)中的Pd/C(150mg)的浆液，然后加入三乙胺(20μL)。在氢气下将混合物搅拌18小时，通过Celite（硅藻土）过滤，用乙醇(10mL)洗涤Celite（硅藻土）并且蒸发合并的滤液。将残留物吸收在DMF(10mL)中，加入处于DMF(2mL)中的Pd/C(150mg)的浆液，然后在氢气下搅拌混合物。16小时后通过Celite（硅藻土）过滤混合物，并且用乙酸乙酯(100mL)洗涤该Celite（硅藻土）。蒸发合并的滤液，得到淡绿色油状物。色谱分离(12g二氧化硅卡套柱,0-60%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I43)，为淡黄色油状物(177.1mg,57%产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(d,J=0.5Hz,1H),7.73(d,J=8.1Hz,1H),7.25–7.16(m,4H),7.12–7.07(m,2H),7.06(s,1H),4.25(brs,2H),3.72(s,2H),3.67(s,3H),3.14–3.01(m,4H),2.81(t,J=12.2Hz,2H),2.72–2.59(m,3H),1.84(d,J=13.0Hz,2H),1.69–1.56(m,与溶剂中的水重叠),1.49(s,9H),1.26(t,J=7.1Hz,3H)。LCMS:rt7.16min;m/z627.2[M+H]+;571.1[M-tBu+2H]+;m/z625.2[M-H]-。
(h)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I44)
将4-(3-乙基-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I43)(177mg,0.282mmol)溶解在THF(10mL)中，然后加入处于水(2mL)中的氢氧化锂一水合物(59.0mg,1.41mmol)的溶液。将混合物搅拌18小时，然后浓缩。将残留物悬浮在饱和碳酸氢钠(20mL)中，并且用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠)并且蒸发。在30℃下，将残留物溶解在THF(10mL)和DMF(1mL)中，并且加入HOBt(50mg,0.37mmol)、EDCI(65mg,0.37mmol)和DIPEA(0.246mL,1.41mmol)。10分钟后，加入碳酸铵(135mg,1.41mmol)，然后在30℃下将混合物搅拌18小时。将混合物浓缩，用饱和碳酸氢钠(25mL)稀释残留物并且用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。用盐水(25mL)洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠)并且蒸发。色谱分离(12g二氧化硅卡套柱,0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I44)，为白色固体(122mg,71%经过两个步骤)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(s,1H),7.56(d,J=8.1Hz,1H),7.28–7.22(m,与CHCl3重叠),7.22–7.15(m,1H),7.13–7.05(m,3H),5.38(s,1H),5.15(s,1H),4.25(s,2H),3.64(s,2H),3.11–2.99(m,4H),2.80(t,J=12.1Hz,2H),2.69–2.60(m,3H),1.84(d,J=12.3Hz,2H),1.69–1.60(m,2H),1.49(s,9H),1.23(t,J=7.6Hz,3H)。LCMS:rt6.65min;m/z612.2[M+H]+,556.1[M-tBu+2H]+;m/z610.2[M-H]-。
(i)2-(2-(2-(2-((2-乙基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(8)
将4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-乙基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I44)(120mg,0.20mmol)溶解在DCM(20mL)中，然后加入TFA(2mL)并且在室温下将混合物搅拌16小时。将混合物浓缩，并且将残留物悬浮在10%氢氧化钠(10mL)和盐水(10mL)中。用乙酸乙酯(4×20mL)萃取混合物，用盐水洗涤合并的萃取物，干燥（硫酸钠），蒸发，并且将残留物蒸发出醚以得到标题化合物(8)，为白色固体(93mg,93%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.47(s,1H),8.49(s,1H),7.37(s,1H),7.26–7.18(m,2H),7.17–7.09(m,4H),7.05(dd,J=8.2,1.9Hz,1H),6.89(s,1H),3.44(s,2H),3.09–2.88(m,6H),2.62–2.54(m,与DMSO重叠),1.70(d,J=11.4Hz,2H),1.52(qd,J=12.3,3.7Hz,2H),1.10(t,J=7.5Hz,3H)。LCMS方法C：4.96min;m/z512.2[M+H]+,534.2[M+Na]+;m/z510.2[M-H]-。
实施例9：2-(2-(2-(2-((2-乙基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(9)
将2-(2-(2-(2-((2-乙基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(8)(84mg,0.16mmol)溶解于甲醇(8mL)中，加入37%的甲醛溶液(53μL,0.66mmol)，并将该混合物在室温下搅拌10分钟。加入三(乙酰氧基)硼氢化钠(174mg,0.821mmol)，并且在两个小时后，浓缩该混合物。用10%氢氧化钠(15mL)和盐水(15mL)稀释残留物，并且用乙酸乙酯(4×25mL)萃取该混合物。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，用硫酸钠干燥，蒸发并且从DCM蒸发残留物，得到标题化合物(9)，为白色固体的(72mg，84%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.46(s,1H),8.49(s,1H),7.36(s,1H),7.21(t,J=4.6Hz,2H),7.18–7.10(m,4H),7.06(dd,J=8.2,1.6Hz,1H),6.88(s,1H),3.44(s,2H),3.07–2.90(m,4H),2.86(d,J=11.3Hz,2H),2.57(q,J=7.5Hz,2H),2.48–2.37(m,1H),2.19(s,3H),2.02–1.89(m,2H),1.79–1.59(m,4H),1.09(t,J=7.5Hz,3H)。LCMS方法C：rt5.04min;m/z526.2[M+H]+;m/z524.2[M-H]-。
实施例10：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(10)
(a)2-(2-乙炔基苯基)乙酰胺(I45)
向处于厚壁Schlenk管中的处于0℃甲醇(2mL)中的2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(0.200g,1.15mmol)的搅拌溶液中一次性地加入氮化镁(0.290g,2.87mmol)。立即密封该管并且在水浴中经过1小时将其温热至室温，然后在80℃下加热22小时。冷却至室温后，用EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(80mL)稀释所得到的混合物。分离各层并且水层用EtOAc(80mL)萃取、用2Maq.HCl中和并且用EtOAc(2x80mL)萃取。合并有机层，用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩得到黄色固体。硅胶色谱法分离(40gSi卡套柱，0-50%处于二氯甲烷中的EtOAc)得到标题化合物(I45)，为白色固体(0.093g,51%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.44(dd,J=7.6,1.0Hz,1H),7.40–7.28(m,3H),7.24(td,J=7.4,1.7Hz,1H),6.93(s,1H),4.32(s,1H),3.59(s,2H)。LCMS方法C：rt4.68min;m/z160.2[M+H]+。
(b)(4-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基甲酸苄酯(I46)
将4-溴-2-(三氟甲氧基)苯胺(1.0g,3.9mmol)溶解于干燥甲苯(25mL)中，加入碳酸钠(0.621g,5.86mmol)和氯甲酸苄酯(0.669mL,4.69mmol)，并且在氮气下在室温下将混合物搅拌22小时。然后将反应加热至80℃并且在该温度下搅拌17小时，然后进一步加热至回流并搅拌22小时。向冷却的混合物中加入水(100mL)，分离水相并且用乙酸乙酯(2x100mL)洗涤。用0.5M柠檬酸水溶液(70mL)、水(70mL)、盐水(70mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，得到粉红色固体。通过硅胶色谱法(40gSi卡套柱，0-20%处于40-60℃石油醚中的EtOAc)纯化该粗料，得到标题化合物(I46)，为白色固体(1.153g,76%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J=8.7Hz,1H),7.44–7.36(m,7H),6.95(s,1H),5.22(s,2H)。LCMS方法C：rt6.67min;m/z389.9[M-H]-。
(c)4-(4-氨基-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I47)
将2MNa2CO3水溶液(1.85mL,3.70mmol)加入到处于干1,4-二氧杂环己烷(15mL)中的4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I37)(～50%纯，0.915g，1.480mmol)、(4-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基甲酸苄酯(I46)(0.635g,1.63mmol)、LiCl(0.125g,2.96mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.052g,0.074mmol)和TBAB(0.048g,0.15mmol)的混合物中。在80℃下将该反应混合物搅拌17小时，然后通过Celite（硅藻土）过滤，用EtOAc和MeOH洗涤该Celite（硅藻土），并且在真空下浓缩滤液得到浅黄色胶状物。通过硅胶色谱法纯化粗料(40gSi卡套柱，0-15%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)得到浅黄色胶状物(0.515g)。向处于EtOAc(20mL)中的中间体溶液中添加处于EtOAc(5mL)中的10%Pd/C(80mg)的溶液。然后在氢气氛下在室温下将反应搅拌18小时，然后通过Celite（硅藻土）垫过滤，用EtOAc(100mL)洗涤该Celite（硅藻土）垫。在真空下除去溶剂得到粗产物，通过硅胶色谱法纯化该粗产物(40gSi卡套柱,0-30%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)，得到标题化合物(I47)，为淡黄色胶状物(80%纯度，0.220g，经过2个步骤，33%产率)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.98–6.95(m,1H),6.92(dd,J=8.2,1.8Hz,1H),6.74(d,J=8.2Hz,1H),4.30–4.13(m,2H),3.77(s,2H),2.77(t,J=12.5Hz,2H),2.54(tt,J=12.1,3.5Hz,1H),1.78(d,J=13.1Hz,2H),1.57–1.50(m,2H,被水信号掩盖),1.48(s,9H)。
(d)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I48)
在0℃下在1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷的混合物(10mL)中搅拌2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(0.110g,0.506mmol)。小心地加入处于二乙醚(0.578mL,0.578mmol)中的1.0MZnCl2溶液，在添加之后，在0℃下继续搅拌该反应30分钟。在0℃下滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(5mL)中的4-(4-氨基-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I47)(不纯物，～80%纯度,0.217g,0.482mmol)的溶液，然后加入处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(5mL)中的NEt3(0.081mL,0.58mmol)的溶液，并且将反应温热至室温并且搅拌18小时，然后在60℃下搅拌24小时。在真空下蒸去有机溶剂并且通过硅胶色谱法(40gSi卡套柱，0-40%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)纯化粗胶状物，得到标题化合物(I48)，为淡黄色油状固体(0.085g,33%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.38(s,1H),8.72(s,1H),7.52(d,J=8.1Hz,1H),7.33–7.29(m,2H),4.13–4.04(m,2H),2.88–2.72(m,3H),1.79(d,J=12.1Hz,2H),1.56–1.44(m,2H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt7.02min;m/z539.0,541.0[M-H]-。
(e)4-(4-((4-((2-(2-氨基-2-氧乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I49)
向处于干燥DMF(4mL)中的2-(2-乙炔基苯基)乙酰胺(I41)(0.029g,0.18mmol)和4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I48)(0.082g,0.15mmol)的氮脱气的溶液中加入三乙胺(0.085mL,0.61mmol)、三苯膦(6.0mg,0.023mmol)、反式-二氯双(三苯膦)钯(II)(0.011g,0.015mmol)和Cu(I)I(4.0mg,0.023mmol)。在微波辐射下在120℃下将反应混合物加热20分钟，在真空下浓缩至干燥并且通过硅胶色谱法(12gSi卡套柱,0-100%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)纯化，得到标题化合物(I49)，为淡黄色固体(0.073g,73%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.11(s,1H),8.74(s,1H),7.58(dd,J=7.7,6.2Hz,2H),7.53–7.47(m,1H),7.42–7.27(m,5H),6.99(s,1H),4.14–4.03(m,2H),3.67(s,2H),2.87–2.72(m,3H),1.79(d,J=12.8Hz,2H),1.50(qd,J=12.5,4.1Hz,2H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.63min;m/z564.0[M-Boc+2H]+。
(f)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I50)
在氮气氛下，将4-(4-((4-((2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I49)(72.0mg,0.108mmol)溶解于干燥DMF(7mL)中，并且加入处于EtOAc(2mL)中的10%Pd(OH)2/C(0.050g)的浆液。然后在氢气下将混合物剧烈搅拌24小时。完成后，通过Celite（硅藻土）垫过滤反应，用EtOAc(40mL)洗涤该Celite（硅藻土）垫。在真空下浓缩合并的滤液，得到淡黄色油状物。通过硅胶色谱法(12gSi卡套柱,0-100%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃)纯化该粗产物，得到标题化合物(I50)，为灰白色固体(0.064g,88%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.80(s,1H),8.60(s,1H),7.61(d,J=8.1Hz,1H),7.39(s,1H),7.32–7.26(m,2H),7.21(dt,J=6.7,3.4Hz,1H),7.18–7.08(m,3H),6.90(s,1H),4.09(d,J=12.1Hz,2H),3.45(s,2H),3.09–2.94(m,4H),2.88–2.72(m,3H)1.79(d,J=12.3Hz,2H),1.59–1.38(m,11H)。LCMS方法C：rt6.75min,m/z668.1[M+H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(10)
在氮气氛下，将4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲氧基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I50)(0.062g,0.093mmol)溶解于干燥DCM(6mL)中。向该溶液中加入三氟乙酸(0.142mL,1.86mmol)并且在室温下搅拌该反应20小时。在真空下除去挥发物，向残留物中加入EtOAc(50mL)和2MNaOH水溶液(50mL)并且分离各层。用EtOAc(2x70mL)萃取水层，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机物，dried(MgSO4)，过滤并真空浓缩，得到灰白色固体。通过硅胶色谱法(12gSi卡套柱,0-100%处于石油醚中的EtOAc，40-60℃，然后0-100%处于EtOAc中的甲醇，然后1%处于甲醇的氨)纯化该粗料，得到标题化合物(10)，为白色固体(0.042g,80%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.78(s,1H),8.59(s,1H),7.59(d,J=8.3Hz,1H),7.39(s,1H),7.29–7.17(m,3H),7.18–7.06(m,3H),6.90(s,1H),3.45(s,2H),3.09–2.92(m,6H),2.71–2.53(m,3H),1.71(d,J=11.7Hz,2H),1.49(qd,J=12.1,3.7Hz,2H)。LCMS方法C：rt5.07min;m/z568.1[M+H]+。
实施例11：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(11)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(4mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(10)(0.039g,0.069mmol)的悬浮液中加入37%甲醛(0.020mL,0.28mmol)水溶液，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.073g,0.34mmol)。在室温下将反应搅拌3小时。然后在真空下除去挥发物并且用EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3(30mL)水溶液稀释残留物。分离各层并且用EtOAc(2x30mL)萃取水层，用盐水(40mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩得到胶状物，将其吸收于DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用DCM重复该过程两次。然后将所得的胶状物悬浮于二乙醚(5mL)中且在真空下除去溶剂。重复该过程得到标题化合物(11)(0.037g,93%产率)，为白色蓬松固体：1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.79(s,1H),8.59(s,1H),7.60(d,J=8.3Hz,1H),7.39(s,1H),7.28(dd,J=8.4,1.9Hz,1H),7.26–7.23(m,1H),7.23–7.19(m,1H),7.18–7.08(m,3H),6.89(s,1H),3.45(s,2H),3.08–2.93(m,4H),2.90–2.83(m,2H),2.57–2.52(m,1H,被残留溶剂信号所掩盖),2.19(s,3H),1.96(td,J=11.5,2.0Hz,2H),1.80–1.72(m,2H),1.65(ddd,J=24.6,12.4,3.7Hz,2H)。LCMS方法C：rt5.11min;m/z582.1[M+H]+。
实施例12：2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(12)
(a)(4-溴-2-甲基苯基)氨基甲酸苄酯(I51)
在氮气下在室温下将2-溴-4-甲基苯胺(5.00g,26.9mmol)、氯甲酸苄酯(5.75mL,40.3mmol)、Na2CO3(4.27g,40.3mmol)和甲苯(100mL)搅拌20小时。用乙酸乙酯稀释所得的混合物并且用水(100mL)洗涤。干燥(MgSO4)有机层并且在减压下蒸发除去挥发物。加入石油醚40-60℃并且通过过滤收集产生的沉淀，得到标题化合物(I51)，为无色针状物(8.50g,99%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.80–7.67(m,1H),7.44–7.28(m,6H),6.40(s,1H),5.20(s,2H),2.21(s,3H)。LCMS方法C：rt6.36min;m/z320[M+1]+。
(b)4-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-甲基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I52)
在氮气下在80℃下，将处于DMF(30mL)中的(4-溴-2-甲基苯基)氨基甲酸苄酯(I51)(1.00g,3.12mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(37)(1.16g,3.74mmol)、PdCl2(dppf)-DCM复合物(310mg,0.374mmol)和碳酸钾(1.29g,9.36mmol)的悬浮液搅拌16小时。减压下蒸发挥发物并且将残留物吸附到硅胶上。在硅胶上(0-30%乙酸乙酯/石油醚40-60℃)进行色谱分离，得到标题化合物(I52)，为黄色液体(949mg,72%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.83–7.70(m,1H),7.41–7.34(m,5H),7.21(dd,J=8.5,1.9Hz,1H),7.16(d,J=1.8Hz,1H),6.56(s,1H),5.97(s,1H),5.20(s,2H),4.05(d,J=2.9Hz,2H),3.61(t,J=5.7Hz,2H),2.48(d,J=1.5Hz,2H),2.23(s,3H),1.50(d,J=2.6Hz,9H)。
(c)4-(4-氨基-3-甲基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I53)
在氢气(1atm)下在室温下，将处于MeOH(50mL)中的4-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-甲基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I52)(798mg,2.49mmol)和10%Pd/C(250mg)的悬浮液搅拌16小时。将得到的混合物通过Celite（硅藻土）过滤，用MeOH洗涤，然后通过减压蒸发除去挥发物，得到标题化合物(I53)(550mg,76%)，为紫色/棕色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.95(d,J=6.7Hz,3H),4.22(s,2H),2.77(s,2H),2.54(s,1H),2.29(s,3H),1.77(d,J=12.7Hz,2H),1.56(dd,J=12.6,3.7Hz,9H),1.47(s,9H)。LCMS方法Crt：5.09min;m/z235.1[M-tBu+2]+,191.2[M-Boc+2]+。
(d)2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I54)
在微波辐射下在120℃下，将处于2,2,2-TFE(3mL)中的2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I15)(450mg,1.11mmol)、4-(4-氨基-3-甲基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I53)(390mg,1.34mmol)和TFA(0.25mL)的溶液加热30分钟。将得到的混合物吸附在硅胶上，并且色谱分离(0-50%MeOH/DCM)，得到标题化合物(I54)(478mg,83%)，为粘性液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.14(bs,1H),8.76(bs,1H),8.51(s,1H),7.58(d,J=8.2Hz,1H),7.21(ddt,J=10.7,7.4,4.3Hz,4H),7.15–7.06(m,1H),3.65(s,2H),3.60(d,J=12.6Hz,2H),3.49(s,3H),3.15–3.02(m,6H),2.87–2.71(m,1H),2.32(s,3H),2.07(d,J=7.8Hz,4H)。LCMS方法C：rt5.24min;m/z513.2[M+1]+。
(e)2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I55)
将2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(54)(1.10g,2.15mmol)溶解于干燥MeOH(20mL)中并且加入甲醛溶液(37%aq;348μL,4.29mmol)。在氮气下加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.27g,10.7mmol)，并且在室温下将所得混合物搅拌16小时。加入乙酸乙酯(50mL)，并且用10%NaHCO3溶液(20mL)洗涤该混合物。分离有机层，干燥(MgSO4)，然后在减压下蒸发除去挥发物。色谱分离(SiO2,0-50%MeOH/DCM)，得到标题化合物(I55)(480mg,42%)，为膏状固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.83–7.73(m,1H),7.35(s,1H),7.32–7.19(m,3H),7.19–7.09(m,2H),7.07–6.97(m,1H),3.76(s,2H),3.70(s,3H),3.23(d,J=11.5Hz,2H),3.17–3.04(m,4H),2.61–2.51(m,1H),2.50(s,3H),2.35(s,3H),2.33–2.24(m,2H),2.02–1.84(m,4H)。LCMS方法C：rt5.25min;m/z527.2[M+1]+。
(f)2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(12)
在室温下，将处于THF(20mL)、水(4mL)和MeOH(2mL)混合物中的2-(2-(2-(2-((2-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I55)(476mg,0.906mmol)和LiOH.H2O(113mg,2.71mmol)搅拌24小时。减压下蒸发挥发物，得到浅黄色固体，将其溶解于干燥DMF(10mL)和干燥THF(10mL)中。加入HOBT(171mg,1.26mmol)、EDCI(196mg,1.26mmol)、碳酸铵(458mg,4.87mmol)和DIPEA(829μL,4.87mmol)，并且将得到的混合物在室温下搅拌16小时。减压下蒸发挥发物，并且将残留物吸收于乙酸乙酯中。用10%NaHCO3洗涤所得的溶液，分离各层并且将有机层干燥(MgSO4)。减压蒸发挥发物，并将残留物色谱分离(SiO2,0-100%MeOH/DCM)，得到标题化合物(12)(358mg,52%)，为膏状固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),7.58(d,J=8.9Hz,1H),7.34(s,1H),7.28–7.19(m,4H),7.14–7.09(m,2H),5.66(s,1H),5.49(s,1H),3.65(s,2H),3.13–3.04(m,4H),3.04–2.97(m,2H),2.54–2.41(m,1H),2.35(s,3H),2.30(s,3H),2.08(td,J=11.3,3.8Hz,2H),1.88–1.80(m,4H)。LCMS方法C：rt4.91min;m/z512.2[M+1]+,510.2[M-1]-。
实施例13：2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(13)
(a)(2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(I56)
在回流下将处于甲苯(15mL)中的2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(1.00g,4.22mmol)和Boc2O(1.14g,5.21mmol)的混合物加热16小时。加入另外部分的Boc2O(1.04g,4.8mmol)并将该混合物加热另外20小时，然后加入另外部分的Boc2O(1.4g,6.4mmol)。在回流下加热另外24小时后，加入催化量的DMAP，并在回流下将该混合物加热30分钟，然后在减压下进行浓缩，得到标题化合物(56)(1.42g,99%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(m,2H),7.14(dd,J=7.5,7.5Hz,1H),1.40(s,12H),1.35(s,9H)。
(b)4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氟苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I57)
在N2气氛下，向4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I16)(0.504g,1.52mmol)、(2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(I62)(0.496g,1.47mmol)和PdCl2(PPh3)2(0.055g,0.078mmol)的混合物中加入二氧杂环己烷(15mL)，并且用N2将混合物鼓泡5分钟，然后加入3.0M碳酸钠(1.5mL,4.5mmol)水溶液。在回流下将反应加热6小时，然后在减压下浓缩。将残留物在硅胶上进行色谱分离(0-25%EtOAc/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I57)(0.409g,71%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(m,3H),6.09(s,1H),4.08(m,J=2.8Hz,2H),3.63(dd,J=5.6,5.6Hz,2H),2.49(m,2H),1.42(s,18H)。
(c)4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氟苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I54)
在室温下在H2气氛下，将处于EtOAc(20mL)中的4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氟苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I53)(0.409g,1.04mmol)和10%Pd/C(0.043g)的混合物搅拌16小时。将混合物通过Celite（硅藻土）过滤并且在减压下浓缩滤液，得到标题化合物(I54)，为白色泡沫(0.376g,92%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.09(dd,J=8.1,8.1Hz,1H),6.95(m,2H),4.25(m,2H),2.79(dd,J=12.0,12.0Hz,2H),2.65(m,1H),1.82(m,2H),1.43(s,18H)。
(d)2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I58)
向处于2,2,2-三氟乙醇(15mL)中的4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氟苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I57)(0.376g,0.954mmol)和2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I15)(0.268g,0.667mmol)的混合物中加入TFA(0.8mL)。在微波辐射下在100℃下将得到的混合物加热20分钟，然后加热15分钟，然后在减压下浓缩得到标题化合物(I58)(0.344g)的粗样品，其未经纯化而直接使用。
(e)4-(3-氟-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I60)
将处于DCM(15mL)中的粗2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I59)(0.344g)、Boc2O(0.214g,0.98mmol)和催化量的DMAP的混合物搅拌20小时。然后加入三乙胺(0.10mL,0.72mmol)，并且在40℃下将混合物搅拌20小时。加入另外部分的三乙胺(1.50mL,10.8mmol)和Boc2O(0.260g,1.19mmol)，并在40℃下继续搅拌4小时。减压浓缩该混合物并且在硅胶上进行色谱分离(0-75%EtOAc/石油醚40-60℃)，得到标题化合物(I60)(0.206g,50%)，通过LCMS测得纯度为79%，该物质随后直接使用无需进一步纯化；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),8.28(dd,J=8.6,8.6Hz,1H),7.48(d,J=2.4Hz,1H),7.22(m,4H),7.00(m,2H),4.25(m,2H),3.75(s,2H),3.68(s,3H),3.11(m,4H),2.81(m,2H),2.64(m,1H),1.84(m,2H),1.62(dd,J=12.6,4.5Hz,2H),1.49(s,9H);LCMS方法C：rt7.05min;m/z617.2[M+H]+,561.1[(M-t-Bu)+H]+。
(f)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-氟苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I61)
向处于THF(5mL)中的4-(3-氟-4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I60)(0.206g)的溶液中加入2MLiOH(0.500mL,1.00mmol)的水溶液和水(0.5mL)，并且在室温下将所得的溶液搅拌16小时。加入LiOH(1.5M;0.5mL)水溶液并且在室温下将反应搅拌另外20小时。然后将混合物加热至50℃，并且加入甲醇(1mL)，然后搅拌20小时。在减压下蒸去挥发物，并将残留物与甲苯共沸两次，然后加入THF(4mL)、固体氢氧化锂(0.021g,0.87mmol)、水(1mL)和甲醇(1mL)。在室温下将得到的混合物搅拌5小时，然后加热至50℃持续16小时。在减压下蒸去挥发物并且用水稀释残留物。用EtOAc(2x20mL)萃取水溶液，然后用HCl水溶液酸化至pH为3。通过离心收集所得沉淀，为球粒，然后将其溶解在甲醇中，并且在减压下浓缩。将残留物与甲苯共沸，然后将其吸收于DMF(6mL)中，向其中加入EDCI(0.080g,0.42mmol)、HOBT(0.061g,0.45mmol)和DIPEA(0.29mL,1.67mmol)。在氮气下在室温下将混合物搅拌30分钟，然后加入碳酸铵(0.129g,1.66mmol)。在30℃下将所得的混合物搅拌20小时，然后在减压下蒸去挥发物。加入水(20mL)，并且用EtOAc(3x20mL)萃取所得到的悬浮液。在减压下浓缩合并的有机萃取物，并将残留物在硅胶上进行色谱分离(0-100%EtOAc/石油醚，40-60℃，然后70-100%EtOAc/石油醚，40-60℃)，得到标题化合物(I61)(0.049g,24%)；1HNMR(400MHz,d6-丙酮)δ8.71(s,1H),8.60(s,1H),7.98(dd,J=8.4,8.4Hz,1H),7.29(m,1H),7.17(m,5H),6.66(s,1H),6.22(s,1H),4.21(m,1H),3.63(s,2H),3.16(m,4H),2.09(m,2H),1.87(m,3H),1.59(qd,J=12.7,4.4Hz,2H),1.46(s,9H);LCMS方法C：rt6.46min;m/z602.1[M+H]+,624.1[M+Na]+,546.1[(M-t-Bu)+H]+,502.1[(M-Boc)+H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(I62)
向处于THF(3mL)中的4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-3-氟苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I61)(0.049g,0.081mmol)的溶液中加入TFA(0.20mL,2.6mmol)。然后将所得的混合物在室温下搅拌20小时，然后在40℃下搅拌24小时。通过减压蒸发除去挥发物，并且加入DCM(2mL)和TFA(1.00mL,13.1mmol)。在30℃下搅拌18小时后，在减压下浓缩该混合物，并将残留物与甲苯(10mL)共沸两次，得到标题化合物(I62)(0.037g,91%)。LCMS方法C：rt4.84min;m/z502.1[M+H]+。
(h)2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(13)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(3mL)中的2-(2-(2-(2-((2-氟-4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(I62)(0.037g,0.074mmol)的溶液中加入37%甲醛(0.022mL,0.30mmol)水溶液和三乙酰氧基硼氢化钠(0.081g,0.38mmol)。在室温下将得到的混合物搅拌1小时。在减压下蒸去挥发物，并将残留物吸收于饱和NaHCO3的水溶液(25mL)中。用EtOAc(2x25mL)萃取所得的混合物，然后用盐水(25mL)洗涤合并的有机层，干燥(相分离卡套柱)并在减压下蒸发至干燥。使用硅胶柱色谱(0-50%MeOH/EtOAc具有1%2M乙醇氨)纯化残留物，得到标题化合物(13)(0.020g,52%)；1HNMR(400MHz,d6-丙酮+d4-MeOH)δ8.54(s,1H),7.88(dd,J=8.5Hz,1H),7.16(m,6H),3.80(s,2H),3.63(s,2H),3.10(m,4H),2.95(m,2H),2.54(m,1H),2.27(s,3H),1.79(m,4H)。LCMS方法C：rt4.93min;m/z516.1[M+H]+。
生物学分析
可以使用生物化学测定和细胞测定来描绘本发明化合物的活性。
可以使用AlphaScreenTM技术生化测定来评价对FAK的主要效力。
可以使用表面等离子体共振(SPR)技术测定、使用BiacoreTMS51传感器来确定Ka、kd和作为结果的KD来进一步研究这种结合的动力学。当与蛋白的脱离速率极大地超过结合速率时，如针对高效化合物可以发生的，KD给予蛋白-配体结合亲和力的准确测量。
本发明的化合物在细胞内抑制FAK的能力可以使用ELISA-型测定（使用MesoScaleDiscoverySECTORImager6000仪器来进行）进行评价。在该测定中，确定了本发明的化合物抑制Y397-FAK磷酸化的能力。
可以使用合适的细胞系使用2D增殖测定来评价本发明的化合物对由非-FAK活性引起的细胞增殖的抑制作用的作用。这给出脱靶活性以及由其产生的潜在毒性的指示。因此，Y397-FAK磷酸化的抑制和2D增殖的抑制的比较给出了对FAK特异性介导作用以及由脱靶活性产生的潜在毒性的测量。
可以使用AlphaScreenTM技术生化测定来评价对VEGFR3的主要效力。
FAK生化AlphaScreenTM测定
将生物素标记的肽用作底物(氨基酸序列：Biotin-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)。在昆虫细胞中表达FAK酶，催化结构域(氨基酸411-686)N-末端标记有六个组氨酸氨基酸和烟草蚀纹病毒(TeV)切割序列。通过超声处理裂解细胞后，通过Ni-固定的金属亲和层析色谱来纯化该激酶，TeV切割留下N-端甘氨酸，并进行凝胶过滤。在Greiner（格雷纳）牌白色384-孔低容量板中运行该15μl测定反应。所有的反应都含有10mMHEPESpH7.4、25mMNaCl、10mMMgCl2、0.01%(v/v)吐温-20、50μMNa3VO4、0.01%(w/v)来自鸡蛋清白蛋白、111nM肽底物、80μMATP、和4ng/反应FAK酶，该酶在阴性对照反应中被省略。以体积为100nl的来自在DMSO中制成的稀释物系列加入化合物，阳性和阴性对照反应接收相同体积的DMSO，不含化合物。用粘接密封物密封孔板，并且在30℃下孵育90分钟。同时添加检测试剂以终止反应。将产物形成量化为PerkinElmerAlphaScreenＴＭ珠粒之间放大的发光（使用链霉亲和素涂布的供体和抗-磷酸酪氨酸(P-Tyr-100)受体的珠粒）。向每个反应中，加入5μl含有10mMHEPESpH7.4、25mMNaCl、100mMEDTA、0.01%(v/v)吐温-20和6.25μg/ml的各种珠粒类型。将孔板孵育6小时，然后在PerkinElmerEnVisionＴＭ酶标仪上以HTSAlphascreenＴM模式进行读取。IC50值是通过计算各反应相对于同一孔板上的对照的百分比抑制(%I)(%I=(I-CN)/(CP-CN)，其中CN/CP分别为阴性反应/阳性反应的平均值)来获得、然后将相对于化合物浓度[I]的%I数据拟合成%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A为下部渐近线，B为上部渐近线，C为IC50值，且D为斜率因子。
结果
化合物 IC50(nM)
1 1.9
2 7.1
3 2.2
4 3.6
5 7.2
6 2.1
7 9.4
8 5.2
9 3.6
10 2.7
11 2.2
12 3.6
13 5.6
FAKBiacoreTMSPR测定
使用BiacoreTMS51传感器确定化合物的结合参数。按照制造商的建议，通过伯胺偶联将抗-GST抗体固定至CM5芯片上。
在运转缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、0.005%表面活性剂P20、10mMMgCl2和1%DMSO)中，将N-端GST-融合的纯化的FAK酶捕获在斑点1和斑点2上。随后在每个循环的开始通过加载30nMPF-562,271来封闭斑点1。在25℃下将浓度系列的测试化合物注射到所述斑点上。将特异性结合计算为斑点2信号和斑点1信号之间的差异，随后进行溶剂校正。拟合至一点结合模型，产生动力学速率常数kd和ka以及平衡结合常数KD=kd/ka。
对于具有预期KD<5nM的化合物，仅将N-端GST-融合的纯化的FAK酶捕获至抗-GST抗体涂覆的芯片的斑点2上。在化合物的注射循环后，用10mM甘氨酸-HCl,pH2.2对该芯片表面进行再生，然后再次捕获该酶。如前所述，分析结合传感器图。
结果
化合物 KD(nM)
1 0.29
2 0.74
3 0.21*
4 1.5
6 2.9
8 0.81
9 1.5
10 0.79
11 1.7
*该结果是使用30分钟的延长洗涤步骤来测量的。
P397Y-FAK抑制MSD平台细胞生物标志物测定
可以在以下测定中测试本发明化合物的体外活性：
用在PBS中预稀释为1mg/mL浓度的小鼠单克隆FAK抗体[63D5](cat#ab72140,Abcam)以30μL/孔涂覆96-孔板(cat#MA6000,MesoScaleDiscovery)。用粘性薄膜密封孔板并且在4℃下孵育16小时。然后将抗体从孔板中弹出，并且加入150μL的3%[w/v]阻断剂A(cat#R93AA-1,MesoScaleDiscovery)。用粘性薄膜重新密封孔板，并且在室温下在设置为中速的震荡器上孵育2小时。用含有50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20的溶液将孔板洗涤三次，然后如下所述加入细胞裂解液。
在化合物处理前2天，将细胞以1:2分到T150细胞培养瓶中。在化合物处理前当天，将200μL含有20,000个细胞的介质接种至白色透明底部的TC处理的不透明的96-孔微孔板(cat#655098,GreinerBio-One)的每个孔中，将孔板在37℃和5%CO2下孵育36小时。然后由在DMSO中制备的稀释物系列加入1μL/孔的化合物。阴性对照孔接收相同体积的DMSO，不含化合物，且阳性对照孔接收2μM处于相同体积DMSO中的对照化合物。在37℃和5%CO2下将细胞处理1小时。然后将介质/化合物弹出，并且加入55μL/孔的冰冷的完全裂解缓冲液。完全裂解缓冲液是通过每10mL不完全裂解缓冲液(150mMNaCl、20mMTris-HClpH7.5、1mMEDTA、1mMEGTA、1%Triton-X100)中添加1片PhosSTOP完全磷酸酶抑制剂(cat#04906837001,Roche)和1片完全的Mini不含EDTA的蛋白酶抑制剂(cat#04693159001,Roche)来制备的。在冰上将孔板孵育30分钟，并每隔5分钟进行30秒的高速孔板振动。向如上所述的经涂覆的封闭的且洗涤的96-孔微孔板中转移40μL/孔的细胞裂解液。用粘性薄膜密封该96-孔板并且在4℃下孵育16小时。然后用以下溶液洗涤该孔板三次并拍干，该溶液含有50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20。加入25μL/孔的检测溶液(处于50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20中的1%[w/v]阻断剂A(cat#R93AA-1,MesoScaleDiscovery)，具有1:600兔多克隆FAK磷酸Y397抗体(cat#ab39967,Abcam)、1:1000抗-兔磺基-标记抗体(cat#R32AB-1MesoScaleDiscovery)和1:40重构的阻断剂D-M(cat#D609-0100,RocklandImmunochemicalsforResearch))，并且用粘性薄膜重新密封孔板，并且在设置为中速的孔板震荡器上在室温下孵育1小时。然后用以下溶液将孔板洗涤三次并拍干，该溶液含有50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20。然后加入150μL/孔的读出缓冲液T+表面活性剂(cat#R92TC-1,MesoScaleDiscovery)，并且使用MesoScaleDiscoverySECTOR成像仪6000仪器定量pFAK-397水平。
通过首先计算每种裂解液相对于相同孔板上的对照的百分比抑制(%I)(%I=(S-CP)/(CN-CP))来确定IC50值，其中S为样品结果，CN为仅用DMSO处理的阴性对照的平均结果，且CP为2μM处理的阳性对照的平均结果。%I为相对于化合物浓度[I]描绘的，并且使用以下等式对数据进行拟合，%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A为下部渐近线，B为上部渐近线，C为IC50值，且D为斜率因子。
MDA-231-LNA细胞的结果
化合物 IC50(nM) 在2μM下对照的%响应
1 9 122
2 12 91
3 7 102
4 13 108
6 264 80
9 59 112
10 114 116
11 16 117
12 390 77
13 14 90
2D细胞增殖测定
在进行细胞接种前两天，将细胞以1:4分到T75细胞培养瓶中。在本测定中可以使用多种癌细胞系。
在细胞接种的当天，向96-孔微孔板(Cat.#655180,greinerbio-one)中加入100μL/孔含有1000-5000个细胞的介质，除了其中加入100μl介质的孔G12和H12之外。在第二孔板中，在相同浓度下接种单排细胞。该第二孔板称为t=0孔板并且用于计算添加测试试剂前的相对细胞数。将含有细胞的孔板在37℃/5%CO2下孵育24小时。然后，通过在DMSO中制备的稀释物系列加入0.5μL/孔化合物。每组孔板中都包括具有已知效力的化合物，以评估测定性能。阴性对照孔接收相同体积的DMSO（不含化合物）。由仅含有介质的孔确定背景信号。在将化合物添加到其他孔板的当天，通过添加刃天青类试剂(见下文)来读取t=0的孔板。然后将添加了化合物的含有细胞的孔板在37℃和5%CO2下孵育3天。
在孵育3天后，通过添加20μl/孔的具有以下典型组成的刃天青类试剂来定量细胞增殖：刃天青,Sigma#R7017-1G,0.015%w/v；亚甲蓝,Sigma#MB-1(25g),0.0025%w/v；六氰合铁酸钾(III),Sigma#P8131-100G,0.033w/v；六氰合铁酸钾(II)三水合物,Sigma#P9387-100G,0.042%w/v；处于PBS缓冲液中。用刃天青类试剂将孔板孵育1-4小时(37℃,5%CO2)，然后在(579Ex/584Em)或其附近确定荧光。
每个处理孔相对于同一孔板上对照的增殖的百分比抑制(%I)是使用等式%I=(S-B)-(T0-B)/(CN-B)-(T0-B)来计算的，其中S为样品结果，B为背景荧光，T0为t=0的值且CN为仅用DMSO处理的阴性对照的平均结果。对于IC50确定，%I是相对于化合物浓度[I]进行描绘的，并且使用以下等式对数据进行拟合，%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A为下部渐近线，B为上部渐近线，C为IC50值，且D为斜率因子。
DA-231-LNA细胞的结果
化合物 IC50(μM)
1 1.43
2 2.77
3 6.62
4 1.91
5 3.06
6 2.24
7 4.93
8 2.48
9 2.90
10 1.69
11 2.58
12 4.83
13 2.76
VEGFR3生化测定
可以在以下测定中测试本发明化合物的体外活性：
使用生物素标记的肽作为底物(氨基酸序列：Biotin-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)。VEGFR3胞浆结构域(氨基酸798-1298)购买为N-端GST-融合蛋白(“该酶”)。在Greiner（格雷纳）牌白色384-孔低容量孔板中运行15μl的测定反应。所有反应都含有10mMHEPESpH7.4、10mMMgCl2、0.01%(v/v)吐温-20、50μMNa3VO4、0.01%(w/v)来自鸡蛋清的白蛋白、1mM二硫苏糖醇、111nM肽底物、500μMATP、和3.8ng/反应酶，阴性对照反应中省略了该酶。以体积为100nl的来自在DMSO中制备的稀释物系列加入化合物，阳性和阴性对照反应接收相同体积的DMSO（不含化合物）。用粘性密封物将孔板密封，并且在30摄氏度下孵育90分钟。如下所述在同一时间添加检测试剂来终止反应：将产物形成量化为PerkinElmerAlphaScreenTM珠粒之间放大的发光（使用链霉亲和素涂覆的供体和抗磷酸酪氨酸(P-Tyr-100)受体的珠粒）。向每个反应中加入5μl含有10mMHEPESpH7.4,25mMNaCl、100mMEDTA、0.01%(v/v)吐温-20和6.25μg/ml的每种珠粒类型。将孔板孵育6小时，然后在PerkinElmerEnVisionTM酶标仪上以HTSAlphascreenTM模式进行读取。IC50值是通过计算每个反应相对于同一孔板上的对照的百分比抑制(%I)(%I=(I-CN)/(CP-CN)，其中CN/CP分别为阴性反应/阳性反应的平均值)来获得，然后将相对于化合物浓度[I]的%I数据拟合成%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A为下部渐近线，B为上部渐近线，C为IC50值，且D为斜率因子。
在某些情况下，上述测定也以略作改变的形式运行(以下以*表示)。在这些情况下，VEGFR3胞浆结构域(氨基酸818-1177，缺少UniProt登记号P35916的949-1002)被表达并纯化为N-末端六-组氨酸-融合蛋白(“该酶”)，而不是使用N-端GST-融合蛋白。
结果
化合物 IC50(nM)
1 275*
2 3685*
3 538
5 5750*
6 10440
7 13260*
8 1176
9 1010
10 >66000
11 59763
12 240*
13 205

Claims (14)

1.一种式(I)的化合物：
其中：
R1选自：
其中：
RN1选自H、C1-3烷基和C(＝O)Me；
RN2选自H、C1-3烷基和C(＝O)Me；
R2是H，
R3选自O-C1-2烷基、C1-2烷基、卤素，其中所述C1-2烷基可被一个或多个氟基团取代；
R4是CF3；且
R5是：
其中：
R6选自H、(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1和(CH2)n2C(O)OZ2；其中：
n1为1；
RC1为H或Me；
RN6为H或CH3；
Z1为H、CH3或OCH3；
n2为1；且
Z2为CH3；
并且其中RN6和Z1中仅一个可以是CH3，
R7选自H和(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1，其中：
m1为0或1；
RM1为H；且
Y1为H、Me或OCH3；
并且R6和R7中仅一个为H；且
R8为H，或当R7为C(＝O)NH2时，R8选自H和C1-2烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为：
其中RN1为C(＝O)Me。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为：
其中RN1为H、甲基或乙基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为：
其中RN2选自H、甲基和乙基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的化合物，其中R3选自F、Me、Et、OMe和OCF3。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的化合物，其中R3为OMe。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R7为H且R6选自CH2C(O)NH2、CH2C(O)NHCH3、CHCH3C(O)NH2和CHCH3C(O)NHCH3。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R7为H且R6选自CH2C(O)NH2、CHCH3C(O)NH2和CH2C(O)NHCH3。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R7为H且R6选自CH2C(O)NH2和CHCH3C(O)NH2。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中R6为H且R7选自C(O)NH2、C(O)NHCH3、CH2C(O)NH2和CH2C(O)NHCH3。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中R6为H且R7为C(O)NH2。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中R8为甲基。
13.一种组合物，包含根据权利要求1～12中任一项所述的化合物、和药学上可接受的载体或稀释剂。
14.根据权利要求1～12中任一项所述的化合物在制备用于治疗通过抑制FAK而改善的疾病的药物中的用途。
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