[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN103492420A - 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法 - Google Patents

透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103492420A
CN103492420A CN201180067381.XA CN201180067381A CN103492420A CN 103492420 A CN103492420 A CN 103492420A CN 201180067381 A CN201180067381 A CN 201180067381A CN 103492420 A CN103492420 A CN 103492420A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
aldehyde
aldehyde derivatives
salt
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201180067381.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103492420B (zh
Inventor
韩世光
梁贞娥
尹升奎
许元僖
朴起兑
金慧珉
郑现太
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy Industry Foundation of POSTECH
Original Assignee
Academy Industry Foundation of POSTECH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academy Industry Foundation of POSTECH filed Critical Academy Industry Foundation of POSTECH
Publication of CN103492420A publication Critical patent/CN103492420A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103492420B publication Critical patent/CN103492420B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种HA-蛋白质结合物及其制备方法，在该结合物中，HA-醛衍生物与蛋白质的N端结合，在所述HA-醛衍生物内，醛基被引入到透明质酸或其盐中。所述HA-蛋白质结合物包括展现良好的生物接合率和长期药效的蛋白质药物，而且由于所述透明质酸特异性地与所述蛋白质的N端进行结合，而具有良好的蛋白质药物活性。此外，通过改变所述HA-醛衍生物的醛取代率来自由控制所述透明质酸的肝靶向特性，从而所述HA-醛衍生物可有效地用作用来治疗肝脏疾病的蛋白质药物，而且也有助于需绕过肝脏的蛋白质药物的长期药效。因此，所述HA-蛋白质结合物可有效地应用于蛋白质的药物传递系统中。

Description

透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及透明质酸蛋白质结合物及其制备方法。
背景技术
至今，对持续长时间的蛋白质药物的药效的剂型的研究是通过与生物相容性的可生物降解的聚合物的结合反应来进行研发剂型。根据剂型的形状及所要结合的有效药用成分，上述蛋白质药物的药效的持续时间可延长至几周。为研发这种剂型，除了维持剂型的药效及增加药效的持续时间外，也要考虑与有效药用成分结合的聚合物的生物相容性。此外，还需考虑由与聚合物结合而引起的蛋白质药物的活性的降低等的问题。
如研究这种剂型的例子，目前正在积极地进行通过将有效药用成分与生物相容性的可生物降解的聚乙二醇（PEG）或透明质酸（HA）进行结合来应用于药物传递系统中的研究。
然而，用于结合PEG与有效药用成分的反应，即用于PEG化修饰（PEGylation）反应的PEG是获美国食品和药物管理局（FTA）批准的具代表性的用于活的生物体的聚合物，但有报道称，当重复注射作为药物传送载体的PEG-脂质（liposome）结合物时，将会出现加速血液清除（accelerated blood clearance，ABC）现象，即向体内给药的药物消失得越快。对用于治疗肝脏疾病的蛋白质药物α-干扰素（IFNα）而言，实际投入生产的是每周一次的注射剂型的PEG化产品。由于用来治疗丙型肝炎的PEG化干扰素药物显示出严重的副作用，就会发生很多患者放弃他们的治疗的情况。此外，干扰素药物展现的抗病毒效果在CV基因型1患者中只占约50％。因此，需要研发新的药物。使用PEG的药物传递载体只会增加体内保留时间，而并未展现出向特定组织的传递特性，因此需要靶向部位（moiety），可使之传递至特定组织内以治疗特定疾病。
而且，当HA与有效药用成分结合时，将所得结合物特异性地传递至肝脏组织内。然而，所述HA与有效药用成分之间的结合反应的生物接合率低，从而展示出了所述生物接合率的极限。
此外，当如PEG或HA的聚合物与所述蛋白质药物结合时，所述聚合物可以与蛋白质的胺基酸序列中各种反应性基团进行非特异性反应，从而会破坏所述蛋白质的三级结构，进而会降低所述蛋白质药物的生物活性。
发明内容
技术问题
本发明涉及提供用于制备透明质酸-蛋白质结合物的方法，通过该方法，在维持蛋白质药物的最高生物活性的同时，能够展现高的生物接合率并可适用于各种水溶性有效药用成分中，而且本发明还提供由该方法制得的HA-蛋白质结合物及其用途。
技术方案
本发明的一方面提供用于制备HA-蛋白质结合物的方法。该方法包括在HA或其盐中引入醛基的HA-醛衍生物与蛋白质的N端反应。
本发明的另一方面提供HA-蛋白质结合物，该HA-蛋白质结合物是通过在HA或其盐中引入醛基的HA-醛衍生物与蛋白质的N端结合而成。
下面，将更为详细地描述本发明的示例性实施例的HA-蛋白质结合物及其制备方法。
HA为一种高分子量的线性多糖，其包含作为重复单元的、由D-葡糖醛酸（GlcA）与N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）通过β1,3-糖苷键结合而成的二糖。所述HA的二糖重复单元可用下面化学式1表示。
[化学式1]
Figure BDA00003654211400021
根据本发明，将所述术语“透明质酸”或HA解释为包括含有作为重复单元的、化学式1的二糖的HA，以及包括含有作为重复单元的、从化学式1的二糖骨架衍生出的衍生物的HA衍生物。所述HA衍生物是指具有在化学式1的二糖结构中羧基、羟基、乙酰基或二糖重复单元的末端被其他取代基取代的结构的HA。例如，所述取代基可以为选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基（alkylcarbonyl group）、羧基、羟基以及乙酰基中的至少一个取代基。
透明质酸包括所述HA或其衍生物的盐。例如，该透明质酸盐可以包括钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等，但本发明不限于这些盐。
本发明涉及提供用于制备HA-蛋白质结合物的方法，该方法包括在HA或其盐中引入醛基的HA-醛衍生物与蛋白质的N端反应。
在本领域中使用的用于结合HA和蛋白质的方法是，将蛋白质的胺基与HA的羧基结合的方法。然而，这种方法存在以下问题，由于通常会通过使用接头（linker）来形成所述蛋白质的胺基与所述HA的羧基之间的键，从而使反应复杂且反应效率，即生物接合率会降低，而且所述HA的羧基可与在蛋白质的胺基酸序列及蛋白质的N端上以复数存在的赖氨酸的胺基进行非特异性反应。
与此相反，在本发明中，通过代替HA的羧基而使用HA-醛衍生物，可显著地提高在HA-蛋白质结合反应中的生物接合率和反应特异性。
将在本发明中所用的术语“HA-醛衍生物”解释为包括所有的在HA或其盐中引入醛基的HA或其盐的衍生物。
根据一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物可以为在HA或其盐的葡糖醛酸骨架中引入至少一个醛基的衍生物。
根据本发明的HA-醛衍生物，在所述HA或其盐的葡糖醛酸的骨架中包括醛基。因此，与使用在所述HA的二糖重复单元的末端形成醛基的HA-醛衍生物相比，可易于控制所述醛基的取代率。根据本发明的一个示例性实施例，所述表达“醛基的取代率”是指用醛基取代或修饰HA或其盐的特定官能团。将所述醛基的取代率定义为，在总的HA的重复单元中由醛基取代的重复单元的比率。根据定义，取代率可用大于0且小于1的值，或大于0%且小于100%的值，或大于0mol%且小于100mol%的值表示。由于通过控制所述醛基的取代率可判断所述HA-醛衍生物能否靶向或绕开肝脏，所述醛基具有根据与HA结合的药物的种类可控制肝靶向性的优点。
根据一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物可以为在HA或其盐的葡糖醛酸骨架打开的环的末端上具有至少一个醛基的衍生物。例如，这种HA-醛衍生物包括含有至少一个用以下化学式2表示的重复单元的聚合物。
[化学式2]
Figure BDA00003654211400041
用于制备所述HA-醛衍生物的方法不受特别限制。例如，所述葡糖醛酸可以为开环，并且可用公知方法在所述开环的末端形成至少一个醛基，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。
根据一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物是由所述HA或其盐与氧化剂反应而获得的，该HA-醛衍生物在所述HA或其盐的葡糖醛酸骨架上打开的环的末端上包含至少一个醛基。在下面反应式1中用示意图展示了用于形成所述HA-醛衍生物的方法的实施例。
[反应式1]
Figure BDA00003654211400042
在本说明书中公开的反应式中，m和n表示重复单元的重复次数。其中，m和n可分别为1～10,000范围内的整数。
如反应式1所示，所述HA或其盐中的一些重复单元可从用化学式2表示的结构中衍生而出。
根据一个示例性实施例，所述氧化剂可引发葡糖醛酸的开环反应。例如，所述氧化剂包括如高碘酸钠、高碘酸钾等的高碘酸盐，但本发明不限于此。当高碘酸盐用作氧化剂时，通过在暗处将HA或其盐与高碘酸盐反应2小时，可获得10%取代率的HA衍生物。此外，通过在暗处将HA或其盐与高碘酸盐反应24小时，可获得50%取代率的HA衍生物。通过控制与氧化剂反应的所需时间，来控制所述HA的醛取代率。此时，根据与HA结合的蛋白质药物的种类可适当选取并控制所述醛取代率，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。
根据本发明的另一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物可以为在HA或其盐的葡糖醛酸骨架上存有羧基的位置上引入醛基的衍生物。本领域的技术人员可任意选取用于在HA的羧基的位置上引入醛基的方法。例如，这种HA-醛衍生物包括含有至少一个用以下面化学式3表示的重复单元的聚合物，但本发明不限于此。
[化学式3]
Figure BDA00003654211400051
用于制备这种HA-醛衍生物的方法不受特别限制。例如，本发明的技术人员可通过利用公知方法在HA或其盐的葡糖醛酸骨架上存有羧基的位置上引入所述醛基。
根据一个示例性实施例，通过HA或其衍生物的羧基与含有二胺基（diamine group）或二酰肼基（dihydrazide group）的分子反应，然后所述衍生物分子与另一个含有丙二醛基（dialdehyde group）的分子反应，来制得在HA或其盐的葡糖醛酸骨架上存有羧基的位置上引入醛基的HA-醛衍生物。在下面反应式2中用示意图展示了用于形成所述HA-醛衍生物的方法的实施例。
[反应式2]
Figure BDA00003654211400061
如反应式2所示，通过在HA或其盐中一些重复单元与在末端具有酰肼基（hydrazidegroup）或胺基的分子进行反应，来合成具有酰肼基或胺基的HA衍生物，而且通过HA衍生物与在两端具有醛基的分子反应，来合成在其中引入醛基的HA衍生物。在两端具有酰肼基或胺基的分子将不受特别限制。例如，所述在两端具有酰肼基或胺基的分子包括己二酸二酰肼（ADH）、己二酰肼（hexane dihydrazide）、庚二酰肼（heptane dihydrazide）、辛二酰肼（octane dihydrazide）、壬烷-1,9-二胺、辛烷-1,8-二胺、己烷二胺（hexamethlyenediamine，HMDA）、二胺基戊烷（diaminopentane）、二胺基丁烷（diaminobutane）、二胺基乙烷（diaminoethane）等。在两端引入醛基的分子将不受特别限制。例如，在两端引入醛基的所述分子可包括己二醛、庚二醛（heptanedial）、辛二醛（octanedial），戊二醛（glutaraldehyde）等。当用ADH合成衍生物时，在反应进行3分钟或2小时时可分别获得有20%或70%的ADH被取代的HA衍生物。当用HA-ADH衍生物和戊二醛合成衍生物时，可分别获得有20%或70%的HA-ADH衍生物和戊二醛被取代的HA-醛衍生物。一方面，当使用本发明的HA-醛衍生物时，根据与HA结合的蛋白质的种类，可通过控制所述HA-醛衍生物组的醛基取代率，以判断所述HA-醛衍生物是否要靶向或绕过肝脏。
本发明一个示例性实施例的HA-醛衍生物的醛基取代率，例如，将通过控制用于诱导葡糖醛酸的开环反应的氧化剂的时间而进行自由控制。此外，通过控制与同时具有HA的羧基以及二酰肼基或二胺基的分子的反应时间，可自由控制所述羧基取代率。
根据本发明的一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物可具有大于5%且小于30%的醛基取代率。与具有大于5%且小于30%的醛基取代率的HA-醛衍生物结合的蛋白质可以靶向肝脏。
根据本发明的一个示例性实施例，所述HA-醛衍生物可具有大于30%且小于100%的醛基取代率。与具有大于30%且小于100%的醛基取代率的HA-醛衍生物结合的蛋白质不会靶向肝脏，具有靶向非特异性特性。
在下面示例性实施例中可得知，当使用10%的低取代率取代所述HA-醛衍生物时，体内保留时间虽短暂，但向肝脏的传递特性良好，然而当用45%的低取代率取代所述HA-醛衍生物时，体内保留时间虽有增加，但向肝脏的传递特性有下降。
通过所制备的HA-醛衍生物与所述蛋白质的N端结合，来制备本发明的HA-蛋白质结合物。
本发明的HA-蛋白质结合物可以为，例如，在HA中包含至少一个用下面化学式4表示的重复单元的结合物。
[化学式4]
Figure BDA00003654211400071
如以下反应式3所示，例如，当包含至少一个化学式2的重复单元的HA-醛衍生物与蛋白质结合时，所述蛋白质N端的胺基与在化学式2中存有的醛基反应而形成结合物。
[反应式3]
Figure BDA00003654211400081
根据另一个示例性实施例，本发明的HA-蛋白质结合物可以为，例如，在HA中包含至少一个用下面化学式5表示的重复单元的结合物。
[化学式5]
Figure BDA00003654211400082
如下面反应式4所示，例如当包含至少一个化学式3的重复单元的HA-醛衍生物与蛋白质结合时，所述蛋白质的N端的胺基与在化学式3中存有的醛基反应而形成结合物。
[反应式4]
Figure BDA00003654211400091
所述HA-醛基衍生物与蛋白质的结合可优选在有用于诱导还原性胺化（reductiveamination）的试剂时进行。例如，当使用如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OCOCH3)3)的直接还原性胺化试剂时，在短时间内可直接诱导出HA-蛋白质结合物。
所述HA-醛衍生物与蛋白质的反应可以在PH5～7的缓冲液中进行。优选地，将所述缓冲液的PH值控制在此PH范围内。因为，能使所述HA-醛衍生物的醛基可特异性地与所述蛋白质的N端反应，而不会与所述蛋白质的如包含另一个胺基的赖氨酸的胺基酸反应。更优选地，所述HA-醛衍生物与蛋白质的N端的反应可以在PH5.5～6.5的缓冲液进行，最优选地在PH6.0中进行。
一方面，通过用保护基将未与所述蛋白质的N端反应的HA-醛衍生物的未反应醛基进行隐蔽。在制备药物传递载体的过程或体内给药过程中，由于未反应的醛基有可能与蛋白质药物的胺基酸残基或体内其他蛋白质物质进行不必要的反应，最好提前将未反应的所述HA-醛衍生物的醛基进行隐蔽。
将如肼基甲酸乙酯或四丁基肼的烷基肼，或者如胺基乙醇的胺基醇用作用来隐蔽所述未反应的醛基的物质，但本发明不限于此。通常，可以用已知的作为醛基的保护基的缩羰(acylal)保护基、缩醛（acetal）保护基及缩酮（ketal）保护基。
如下面反应式5或6所示，实施上述的用于隐蔽未反应醛基的方法，但本发明不限于此方法。
[反应式5]
[反应式6]
Figure BDA00003654211400102
在本发明中，用于制备HA-蛋白质结合物的HA或其盐可具有10,000～3,000,000道尔顿（Da）的分子量，但本发明不会仅限于此。具有此范围内的分子量的HA或其盐可有效地应用于制备可维持药物的药效的药物传递载体。
一方面，根据与HA-醛衍生物反应的蛋白质水溶液的浓度，可控制与每个HA-醛衍生物的分子结合的蛋白质分子的数量。根据一个示例性实施例，每个HA-醛衍生物的分子与1～20个的本发明的HA-蛋白质结合物中的蛋白质结合。有结合此范围内的所述蛋白质分子的数量的HA-蛋白质结合物，可以展示所期望的维持时间的药效，而且由于具有良好的向肝脏组织的传递特性，可用作用来治疗肝脏疾病的治疗剂。
用于制备本发明的HA-蛋白质结合物的蛋白质药物的种类不受特别限制。所述蛋白质药物可溶于水以易于适用在本发明的方法上，但本发明不限于此。为保证所述蛋白质的长期的持续的药效，任何种类的蛋白质可用本发明的HA-蛋白质结合物的剂型形式进行制备并使用。
根据一个示例性实施例，所述蛋白质可以为干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）、干扰素γ（IFN-γ）、胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、生长激素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子（GCSFs）、粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSFs）、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-2、表皮生长因子（EGFS）、降钙素、促肾上腺皮质激素（ACTH）、肿瘤坏死因子（TNF）、atobisban、布舍瑞林（buserelin）、西曲瑞克（cetrorelix）、地洛瑞林（deslorelin）、去氨加压素（desmopressin）、强啡肽A（1-13）、依降钙素、eleidosin、依替巴肽（eptifibatide）、生长激素释放激素-II（GHRHII）、戈那瑞林（gonadorelin）、戈舍瑞林（gosereli）、组氨瑞林（histrelin）、亮丙瑞林（leuprorelin）、赖氨酸（lypressin）、奥曲肽（octreotide）、催产素（oxytocin）、加压素(pitressin)、促胰液素（secretin）、辛卡利特（sincalide），特利加压素（terlipressin），胸腺五肽（thymopentin），胸腺素α1（thymosineα1）、曲普瑞林（triptorelin）、比伐卢定（bivalirudin）、卡贝缩宫素（carbetocin）、环孢素（cyclosporine）、exedine、兰瑞肽（lanreotide）、促黄体激素释放激素（LHRH）、那法瑞林（nafarelin）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone）、普兰林肽（pramlintide）、T-20（恩夫韦地，enfuvirtide）、胸腺法新（thymalfasin）或齐考诺肽（ziconotide）。
此外，本发明涉及提供在HA或其盐中引入醛基的HA-醛衍生物与蛋白质的N端结合而成的HA-蛋白质结合物。
本发明的HA-蛋白质结合物可以通过上述方法制备，但应包括通过除本发明的方法外的其他方法制备的所有的结合物。
如下面实施例描述，可得知与在所述HA或其盐中引入醛基的HA-醛衍生物结合的蛋白质具有95%的生物接合率，同时展示出优秀的稳定性并所述蛋白质的空间结构未受结合聚合物的影响，而且所述蛋白质药物展现出优异的药效。因此，本发明的HA-蛋白质结合物可有效地用于蛋白质的药物传递系统中。特别地，保留与HA的受体结合的羧基并与打开环结构以与蛋白质结合的HA-醛衍生物可通过使Ha的肝靶向传递特性最大化而广泛地应用于治疗肝脏疾病的治疗剂中。此外，通过控制所述HA-醛衍生物的醛取代率来自由控制所述HA的肝靶向特性，从而所述HA-醛衍生物可有效地用于确保需绕过肝脏的蛋白质药物的持续的药效。
有益效果
本发明的HA-蛋白质结合物包括蛋白质药物，该蛋白质药物表现出良好的生物接合率和持久的药效，而且由于HA能特异性地与所述蛋白质的N端结合，所述HA-蛋白质结合物具有良好的蛋白质药物活性。此外，由于通过控制所述HA-醛衍生物可自由控制HA的肝靶向特性，从而能有效地将本发明的HA-蛋白质结合物用作用来治疗肝脏疾病的蛋白质药物，也能有助于保证需绕开肝脏的蛋白质药物的持久的药效。因此，本发明的HA-蛋白质结合物可有效地应用于蛋白质的药物传递系统中。
附图说明
图1A展示了根据取代率的通过本发明制备实施例1中描述的方法所制备的HA-醛-TBC衍生物的1H-NMR结果，图1B展示了根据取代率的通过本发明制备实施例2中描述的方法所制备的HA-醛-TBC衍生物的1H-NMR结果；
图2展示了通过在本发明的制备实施例中描述的方法制备的HA-干扰素α（IFNα）结合物和蛋白质的凝胶渗透色谱(GPC)结果；
图3展示了根据在所述HA-IFNα结合物的一个HA链中含有的干扰素分子数和蛋白质分子数的生物接合率；
图4展示了IFNα和所述HA-IFNα结合物的圆二色谱（circular dichroism，CD）分析结果的比较；
图5展示了通过ELISA分析的本发明一个制备实施例中所制备的IFNα和HA-IFNα结合物的生物活性的分析结果；
图6展示了在本发明一个制备实施例中所制备的IFNα和HA-IFNα结合物通过使用Daudi细胞的抗增殖试验（antiproliferation assay）的生物活性的分析结果；
图7展示了在本发明一个制备实施例中所制备的IFNα和HA-IFNα结合物通过使用肝癌细胞HepG2的抗增殖试验的抗癌治疗效果；
图8展示了本发明一个制备实施例中所制备的IFNα和HA-IFNα结合物在人血清中的稳定性的比较；
图9展示了在尾静脉注射后各标有近红外线荧光（NIRF）染料的本发明一个制备实施例中所制备的IFNα（A）和HA-IFNα结合物（B）的实时生物成像结果；
图10展示了在本发明一个制备实施例中所制备的HA-IFNα结合物的药代动力学分析结果；
图11展示了本发明一个制备实施例中所制备的HA-IFNα结合物在小鼠的肝脏中的抗病毒活性分析结果。
具体实施方式
从下面详细描述的实施例中，可明确本发明的优点和特征，以及用于展现它们的方法。然而，要理解清楚的是，本发明不会限制于这些实施例中，而可用不同形式进行实施并实现。以下本发明所要公开的实施例和展示的本发明的方法对本领域的技术人员来说是显而易见的，而且本发明仅通过权利要求书的范围来定义。
实施例
制备实施例1：HA-醛衍生物的制备
在水中溶解透明质酸（HA）（MW=6.4kDa，35kDa，100kDa，230kDa），其浓度为10mg/ml，而后加入每摩尔HA单元1倍的高碘酸钠。此后，在暗处分别将所得混合液反应2小时、6小时和12小时。通过相对蒸馏水的透析将所述反应液纯化并冻干3天，以获得具有不同取代率的HA-醛衍生物。
制备实施例2：HA-醛衍生物的制备
在水中溶解透明质酸（HA）（MW=6.4kDa，35kDa，100kDa，230kDa），其浓度为5mg/ml，随后加入超过HA单元20摩尔的己二酸二酰肼（ADH）。而后，通过使用HCl将所得混合液的PH调至4.8，然后搅拌30分钟。在所述混合液中加入超过HA单元4摩尔的N-（3-二甲基胺基丙基-N’-乙基碳二亚胺（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide，EDC）盐酸（Mw=191.71）。然后，将PH值维持在4.8的条件下，分别将所得混合液反应3分钟和2小时。随后，通过相对蒸馏水的透析将所述反应液纯化，而后冻干3天，而获得具有不同取代率的HA-醛衍生物。将所制备的HA-ADH衍生物分别溶解于乙酸钠缓冲液（pH5.2）中，其浓度为10mg/ml，而后加入超过所加入的ADH10摩尔的戊二醛。然后，将所得混合液反应24小时。随后，通过相对蒸馏水的透析将所述反应液纯化，而后冻干3天，而获得具有不同取代率的HA-ADH-醛衍生物。
实验实施例1：HA-醛衍生物的取代率的分析
将在制备实施例1中制得的HA-醛衍生物溶解于乙酸钠缓冲液（pH5.2）中，其浓度为5mg/ml，而后加入超过HA单元5摩尔的四丁基肼（tetrabutyl carbazate，TBC）和氰基硼氢化钠（sodium cyanoborohydride，NaBH3CN）。随即，将所得混合液反应24小时。通过相对蒸馏水的透析对所述反应液进行纯化，而后冻干3天，通过使用1H-NMR（DPX300，德国布鲁克）来分析醛的取代率。
如图1所示，结果表明，在制备实施例1中素所制得的HA-TBC衍生物的1H-NMR光谱中，除HA的峰外，在δ=1.2～1.4ppm上还能观察到显示有9个氢原子的TBC的3个甲基的峰。为进行定量分析，将δ=1.85～1.95ppm的HA的乙酰基团的甲基共振设为内部标准。通过比较δ=1.85～1.95ppm与δ=1.2～1.4ppm的峰面积，可算出制备实施例1中所制得的HA-醛衍生物的取代率。从这些1H-NMR分析结果，可计算出所述HA-醛衍生物的取代率。结果表明，通过控制与高碘酸钠的反应时间，能够获得取代率被控制在10～50%的HA-醛衍生物（2小时为10%，12小时为25%、24小时为45%）。
实验实施例2：HA-醛衍生物的取代率的分析
将在制备实施例2中制得的HA-醛衍生物溶解于乙酸钠缓冲液（pH5.2）中，其浓度为5mg/ml，而后加入超过HA单元5摩尔的TBC和NaBH3CN。随即，将所得混合液反应24小时。通过相对蒸馏水的透析对所述反应液进行纯化，而后冻干3天，通过使用1H-NMR（DPX300，德国布鲁克）来分析醛的取代率。如图1B所示，结果表明，在制备实施例2中制得的HA-TBC衍生物的1H-NMR光谱中，除HA的峰外，在δ=1.2～1.4ppm上还能观察到显示有9个氢原子的TBC的三个甲基的峰。为进行定量分析，将δ=1.85～1.95ppm的HA的乙酰基团的甲基共振设为内部标准。通过比较δ=1.85～1.95ppm与δ=1.2～1.4ppm的峰面积，可算出在制备实施例1中所制得的HA-醛衍生物的取代率。从这些1H-NMR分析结果，可计算出所述HA-醛衍生物的取代率。结果表明，根据所引入的ADH的取代率，能够获得取代率被控制在20～70%的HA-醛衍生物。
制备实施例3：HA-醛衍生物与蛋白质的结合物的制备
在醋酸盐缓冲液（pH6）中溶解制备实施例1中所制得的HA-醛衍生物，其浓度为10mg/ml，然后加入水溶液相的IFNα，从而每条HA链上的IFNα分子数在1、4、6和9中进行变化。根据所述HA-醛衍生物的取代率，加入超过所述醛5摩尔的NaBH3CN。将所得混合液反应24小时而获得HA-IFNα结合物。
为隐蔽所述HA-IFNα结合物中未反应而剩余的醛，加入超过所述醛5摩尔的肼基甲酸乙酯（ethyl carbazate），然后再次反应24小时，或者加入超过所述醛5摩尔的胺基乙醇（aminoethanol），然后在pH8下再次反应3小时。通过相对磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）将所得反应液进行透析，而后保存在70℃下。在以下所有实验实施例3、5、6、7、8、9、10和11中，可使用每条HA链上结合有6个IFNα分子的HA-IFNα结合物。
实验实施例3：HA-IFNα结合物的GPC分析
通过对制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物的GPC分析，确认HA-IFNα结合物的形成。
通过使用高效液相色谱法（HPLC）对HA-IFNα结合物进行GPC分析。在下面描述所述分析条件。
GPC分析条件
泵：Waters1525二进制HPLC泵
吸收检测器：Waters2487双λ吸收检测器
采样器：Waters717加自动采样器
色谱柱：Waters Ultrahydrogel500+Waters Ultrahydrogel250
流动相：0.5mL/min流速的PBS（pH7.4）
测定波长：在210nm和280nm处的双检测
如图2所示，所述分析结果表明，当用280nm的波长进行测量时，在高分子量的透明质酸的保留时间的时间段22分钟时可观察到一个峰，这表示着IFNα与HA已结合。
实验实施例4：HA-IFNα结合物的定量分析
通过用GPC测量峰下面积，可算出制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物中的IFNα的含量。首先，制备浓度为1mg/mL的IFNα原液，然后用蒸馏水稀释而制备IFNα标准溶液。在实验实施例3中描述的GPC分析条件下，对所述IFNα标准溶液进行分析，而绘制出根据IFNα浓度的GPC峰下面积的标准曲线。将通过对制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物进行分析来获得的GPC峰下面积代入所述标准曲线中，而获得所述蛋白质的含量。
如图3所示，其结果表明，在制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物中蛋白质的含量会随着进料中与每个HA分子反应的蛋白质分子的数量的增加而增加。可以确定的是，当与每个HA分子反应的蛋白质分子的数量在1、4、6和9之间进行变化时，将与每个HA分子反应的蛋白质分子的平均数量可分别控制在1、4、6和9之间。所述生物接合率（%）被证明为等于或大于95%，而与分子数量无关。
实验实施例5：HA-IFNα结合物的CD分析
根据IFNα的浓度，通过使用(0.25mg/ml)IFNα溶液和制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物进行CD分析。在下面描述所述分析条件。
CD分析条件
紫外分光光度计：JASCO J-715
测量条件：25℃、200～250nm、N2气氛
石英比色皿：2mm的路径长度
原始数据：响应时间为1秒时间隔为0.2mm。
如图4所示，其分析结果表明，IFNα的光谱与所述HA-IFNα结合物的CD峰是相一致的，这表示IFNα与HA结合时IFNα的二级结构保持不变。
实验实施例6：HA-IFNα结合物的活性的分析
通过ELISA/Bradford试验之比，分析所述HA-IFNα结合物的活性。首先，制备1mg/ml的IFNα原液，然后通过稀释而制备IFNα标准溶液。通过使用Bradford检测法，测量根据浓度的增加的吸收率，从而绘制出标准曲线。稀释制备实施例3中制得的HA-IFNα结合物和IFNα，而后在相同条件下通过Bradford检测法测量吸收率，之后将所测量的吸收率代入所述标准曲线中而算出IFNα的含量。此外，将用于Bradford检测法中的样本与所述标准溶液稀释10,000倍，而通过ELISA算出具有活性的IFNα的含量。随后，通过ELISA/Bradford试验之比，分析所述HA-IFNα结合物的活性。
如图5所示，其结果表明，通过ELISA/Bradford检测法的测量，所述HA-IFNα结合物具有70%或更高的活性比。Bradford检测法是测量蛋白质中赖氨酸的含量的解析方法，而ELISA是通过使用IFNα与抗体之间的结合而对IFNα的含量进行定量的解析方法。通过所述活性比，可得知在蛋白质中存在70%或更多的胺基酸具有活性。
实验实施例7：HA-IFNα结合物的活性测试
用人的B-淋巴母细胞（Daudi细胞）测试IFNα的活性，报告称该B-淋巴母细胞在存有IFNα时很少增殖。
首先，制备1mg/ml的IFNα原液，而后通过稀释而制备IFNα标准溶液。通过使用Bradford检测法，测量根据浓度的增加的吸收率，从而绘制出标准曲线。稀释制备实施例3中制得的HA-IFNα结合物和IFNα，而后在相同条件下通过Bradford检测法测量吸收率，之后将所测量的吸收率代入所述标准曲线中而算出IFNα的含量。在含有标准溶液和所稀释的样本的培养基中，将Daudi细胞分别培养5天，然后通过MTS检测法确定所述Daudi细胞的增殖率。
如图6所示，其分析结果表明，所述HA-IFNα结合物的活性低于IFNα标准溶液的活性，但与市场上销售的PEGASYS的活性相近。
实验实施例8：HA-IFNα结合物抗癌效果的分析
用所述HA-IFNα结合物处理肝癌细胞HepG2细胞，然后通过MTT测试法分析所述HepG2细胞的存活率，从而测出所述HA-IFNα结合物的抗癌效果。
首先，制备1mg/ml的IFNα原液，而后通过稀释制备IFNα标准溶液。通过使用Bradford检测法，测量根据浓度的增加的吸收率，从而绘制出标准曲线。稀释制备实施例3中所制得的HA-IFNα结合物和IFNα，而后在相同条件下通过Bradford检测法测量吸收率，之后将所测量的吸收率代入所述标准曲线中而算出IFNα的含量。在含有标准溶液和所稀释的样本的培养基中，将HepG2细胞分别培养3天，然后通过MTT检测法确定所述HepG2细胞的存活率。
如图7所示，其分析结果表明，所述HA-IFNα结合物与IFNα标准溶液具有相近的抗癌效果。
实验实施例9：HA-IFNα结合物的半衰期分析（体外）
将所述IFNα和HA-IFNα结合物（10%/6）（具有10%的醛取代率并在每条HA链上结合有6个IFNα分子的HA-IFNα结合物）用作分析样本，而分析IFNα和HA-IFNα结合物的半衰期。
在人血清中溶解每个样本以使存有的IFNα的浓度都成为1mg/mL，而后在37℃下培养120小时。到预定的时间时，对所得混合液进行取样，然后稀释1,000倍并进行冷藏，以防止人血清对所述样本的影响。通过使用IFNαELISA试剂盒以及利用Daudi细胞的MTS检测法，测量每个样本的生物活性。
如图8所示，其分析结果表明，IFNα在24内被迅速分解。然而，HA-IFNα结合物（10%/6）的半衰期将达到120小时或更长，其半衰期大约比所述IFNα的半衰期长5倍。
实验实施例10：HA-IFNα结合物的体内成像及药代动力学（PK）特性的分析（体内）
为确定所述HA-IFNα结合物的全身分布，对HA-IFNα结合物进行体内成像。用近红外荧光（NIRF）染料将所述IFNα和HA-IFNα结合物进行标记，而后向Balb/c小鼠的静脉注射。注射完30分钟和1个小时后将小鼠麻醉，之后使用发光图像分析仪采集其荧光。如图9所示，用NIRF染料作标记的HA-IFNα结合物以靶向特异性方式传递至肝脏中，而所述NIRF染料-IFNα结合物会均匀地分布，然后在膀胱中能够显示荧光的肾清除（renal clearance）而被去除。其结果与在之前报道的披露了通过使用QDots向肝脏传递的HA衍生物的靶向特异性传递的实时生物成像的结果相符，从而能够支持用于治疗肝脏疾病的HA-IFNα结合物的可行性。
一方面，向SD大鼠尾部静脉中分别给与PBS、IFNα及HA-IFNα结合物（取代率分别为10%、25%和45%），到预定时间后，从SD大鼠尾部静脉中进行抽血。然后，通过使用IFNαELISA试剂盒来测量每个样本中的血液浓度。
如图10所示，其分析结果表明，血液IFNα浓度在24小时内降至基线，而HA-IFNα结合物（45%/6）的血液浓度到第四天为止也未降至基线。
实验实施例11：HA-IFNα结合物的抗病毒特性的分析（体内）
2’-5’-寡腺苷酸合成酶1（2’-5’-oligoadenylate synthetase，OAS1）是由IFNα诱导而表达的抗病毒蛋白质，会参与对抗病毒感染的先天免疫反应。OAS1是一种酶，其会参与合成能够激活用于降解双链RNA及抑制病毒复制的RNase L的2’-5’-寡腺苷酸的反应。IFNα的抗病毒活性与OAS1的表达水平高度相关。
向Balb/c小鼠尾部静脉中分别给与PBS、IFNα、HA-IFNα结合物（10%/6）和HA-IFNα结合物（45%/6）（注射剂量为0.2mg/kg，以IFNα为准）。注射完24小时后，提取小鼠的肝脏，然后通过使用Western印迹检测法对OAS1水平进行定量。
如图11所示，可得知具有更低的取代率的HA-IFNα结合物与IFNα相比能容易地传递到肝脏内并具有长的体内保留时间，因此可观察到在肝脏内起抗病毒作用的OAS1的水平会增加。此外，具有更高取代率的HA-IFNα结合物与具有低的取代率的HA-IFNα结合物相比展现出更低的向肝脏的传递特性，然而由于在体内保留时间的增加而比IFNα具有更高的OAS1水平。

Claims (25)

1.用于制备透明质酸（HA）-蛋白质结合物的方法，包括：
使HA-醛衍生物与蛋白质的N端反应，其中，在所述HA-醛衍生物内，醛基被引入到透明质酸或其盐中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物为在所述HA或其盐的葡糖醛酸骨架中引入至少一个醛基的衍生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物具有至少一个位于末端环处的醛基，所述环在所述HA或其盐的葡糖醛酸骨架处开环。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物是由所述HA或其盐与氧化剂反应而获得的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氧化剂能使所述HA或其盐的葡糖醛酸骨架开环而形成至少一个醛基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸盐。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过控制所述HA或其盐与所述氧化剂的反应时间来控制所述HA或其盐的醛取代率。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物为在所述HA或其盐的葡糖醛酸骨架上存有的羧基的位置上引入醛基的衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，HA-醛衍生物是通过如下方式制得的：让所述透明质酸或其衍生物的羧基与含有二胺基或二酰肼基的分子反应，然后让该衍生物分子与另一个含有丙二醛基的分子反应。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物具有大于5%且小于30%的醛取代率。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物具有大于30%且小于100%的醛取代率。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物与所述蛋白质的N端的反应是在存在用于诱导还原性胺化的试剂时进行的。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述用于诱导还原性胺化的试剂为氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，或三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OCOCH3)3)。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物与蛋白质的反应是在PH5～7的缓冲液中进行的。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA-醛衍生物与蛋白质的反应是在PH5.5～6.5的缓冲液中进行的。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括，用保护基将所述HA-醛衍生物中未与所述蛋白质反应的未反应醛基保护起来。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HA或其盐具有10,000～3,000,000达尔顿（Da）的分子量。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与每个HA-醛衍生物的分子结合的所述蛋白质的分子数量为1～20个。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自干扰素α（IFN-α）、干扰素β、干扰素γ、胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、生长激素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子（GCSFs）、粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSFs）、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-2、表皮生长因子（EGFS）、降钙素、促肾上腺皮质激素（ACTH）、肿瘤坏死因子（TNF）、atobisban、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加压素、强啡肽A（1-13）、依降钙素、eleidosin、依替巴肽、生长激素释放激素-II（GHRHII）、戈那瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、赖氨酸、奥曲肽、催产素、加压素、促胰液素、辛卡利特，特利加压素，胸腺五肽，胸腺素α1、曲普瑞林、比伐卢定、卡贝缩宫素、环孢素、exedine、兰瑞肽、促黄体激素释放激素（LHRH）、那法瑞林、甲状旁腺激素、普兰林肽、T-20（恩夫韦地）、胸腺法新或齐考诺肽。
20.一种HA-蛋白质结合物，在该结合物中，HA-醛衍生物与蛋白质的N端结合，在所述HA-醛衍生物内，醛基被引入到透明质酸或其盐中。
21.根据权利要求20所述的HA-蛋白质结合物，其特征在于，所述HA或其盐具有10,000～3,000,000Da的分子量。
22.根据权利要求20所述的HA-蛋白质结合物，其特征在于，与一个所述HA-醛衍生物的分子结合的所述蛋白质的分子数量为1～20。
23.根据权利要求20所述的HA-蛋白质结合物，其特征在于，所述HA-蛋白质结合物用于治疗肝脏疾病。
24.根据权利要求20所述的HA-蛋白质结合物，其特征在于，所述蛋白质选自干扰素α（IFN-α）、干扰素β、干扰素γ、胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、生长激素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子（GCSFs）、粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSFs）、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-2、表皮生长因子（EGFS）、降钙素、促肾上腺皮质激素（ACTH）、肿瘤坏死因子（TNF）、atobisban、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加压素、强啡肽A（1-13）、依降钙素、eleidosin、依替巴肽、生长激素释放激素-II（GHRHII）、戈那瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、赖氨酸、奥曲肽、催产素、加压素、促胰液素、辛卡利特，特利加压素，胸腺五肽，胸腺素α1、曲普瑞林、比伐卢定、卡贝缩宫素、环孢素、exedine、兰瑞肽、促黄体激素释放激素（LHRH）、那法瑞林、甲状旁腺激素、普兰林肽、T-20（恩夫韦地）、胸腺法新或齐考诺肽。
25.根据权利要求20所述的HA-蛋白质结合物，其特征在于，所述蛋白质为IFNα。
CN201180067381.XA 2010-12-10 2011-12-05 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法 Active CN103492420B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2010-0126432 2010-12-10
KR1020100126432A KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2010-12-10 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
PCT/KR2011/009363 WO2012077950A2 (ko) 2010-12-10 2011-12-05 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103492420A true CN103492420A (zh) 2014-01-01
CN103492420B CN103492420B (zh) 2016-10-12

Family

ID=46207583

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180067381.XA Active CN103492420B (zh) 2010-12-10 2011-12-05 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9221893B2 (zh)
EP (1) EP2650312A4 (zh)
JP (1) JP5784142B2 (zh)
KR (1) KR101309566B1 (zh)
CN (1) CN103492420B (zh)
CA (1) CA2821075A1 (zh)
WO (1) WO2012077950A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106046169A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种磁微粒偶联抗体分子的方法
CN112451542A (zh) * 2020-11-30 2021-03-09 西安交通大学 一种白蛋白/透明质酸纳米复合物-铂类前药及制备方法和应用
CN112569345A (zh) * 2020-12-10 2021-03-30 广东省科学院化工研究所 一种含生长因子的分散体及其制备方法与应用
CN114805631A (zh) * 2022-03-01 2022-07-29 吉林省奇健生物技术有限公司 高活性透明质酸-多肽缀合物及其制备方法和应用
CN116789869A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 吉林省奇健生物技术有限公司 一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101694405B1 (ko) 2008-03-28 2017-01-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 폴리펩티드―중합체 접합체 및 그의 사용 방법
CN104302670A (zh) * 2012-02-07 2015-01-21 Phi生物医药股份有限公司 制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法以及由该方法制造的用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体
US20150291672A1 (en) * 2012-11-01 2015-10-15 The Johns Hopkins University Contact Lens Surface Modification with Hyaluronic Acid (HA) Binding Peptide for HA Accumulation and Retention
KR101664444B1 (ko) 2013-12-13 2016-10-12 재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발 공동연구소 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물
WO2015088275A1 (ko) * 2013-12-13 2015-06-18 재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발 공동연구소 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물
CN108472310B (zh) 2015-12-09 2021-08-03 加利福尼亚大学董事会 治疗眼部疾病或病症的缀合物
JP2019218265A (ja) * 2016-09-14 2019-12-26 生化学工業株式会社 ペプチドの血中滞留性を増強させる方法
KR20180040811A (ko) * 2016-10-13 2018-04-23 (주)웰빙해피팜 아민기가 포함된 생체 적합성 고분자로 가교시킨 히알루론산 조직수복용 생체 재료 및 이의 제조방법
US11235067B2 (en) * 2017-01-27 2022-02-01 Trustees Of Tufts College Nanocomplexes of polyanion-modified proteins
CN109260457B (zh) * 2017-07-18 2023-06-13 苏州高泓利康生物科技有限公司 一种透明质酸-白介素10复合物、其制备方法及其应用
US20210386863A1 (en) * 2018-10-24 2021-12-16 Phi Biomed Inc. Drug conjugate prepared using aldehyde group at end of hyaluronic acid
KR102277785B1 (ko) * 2018-10-24 2021-07-15 (주)화이바이오메드 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체
CN113648427B (zh) * 2021-08-20 2023-07-28 山东大学 透明质酸-es2-af肽偶联物及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126361A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EP1579873A1 (en) * 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677276A (en) * 1994-12-23 1997-10-14 La Jolla Cancer Research Foundation Immobilization of peptides to hyaluronate
US5866165A (en) * 1997-01-15 1999-02-02 Orquest, Inc. Collagen-polysaccharide matrix for bone and cartilage repair
AU6357900A (en) * 1999-07-20 2001-02-05 Amgen, Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates, pharmaceutical compositions and related methods
EP1401875A4 (en) * 2001-05-04 2005-01-26 Univ Utah Res Found HYALURONIC ACID-CONTAINING BIOKON JUGATES: TARGETED DELIVERY OF ANTIBODIES TO CANCER CELLS
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
JP4714423B2 (ja) 2004-01-06 2011-06-29 Ｏｋｉセミコンダクタ株式会社 半導体ウエハとその製造方法
US20050176079A1 (en) * 2004-02-09 2005-08-11 Chu Yong L. Polypeptide bioconjugates, methods of making the bioconjugates and assays employing the bioconjugates
BRPI0519562A2 (pt) * 2004-12-27 2009-01-27 Baxter Int construÇço proteinÁcea, complexo, mÉtodo para prolongar a meia-vida in vivo de fator viii (fviii) ou um derivado biologicamente ativo do mesmo composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodo para formar uma construÇço proteinÁcea
TW200643033A (en) * 2005-03-08 2006-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Conjugate of water-soluble modified hyaluronic acid and glp-1 analogue
US20100210509A1 (en) * 2007-10-09 2010-08-19 Postech Academy-Industry Foundation Long acting hyaluronic acid - peptide conjugate
WO2010138074A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Hilborn Joens Hyaluronic acid based delivery systems

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126361A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EP1579873A1 (en) * 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUN JU OH，ET AL.: "Target specific and long-acting delivery of protein, peptide, and nucleotide therapeutics using hyaluronic acid derivatives", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》, vol. 141, no. 1, 4 January 2010 (2010-01-04), pages 2 - 12 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106046169A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种磁微粒偶联抗体分子的方法
CN112451542A (zh) * 2020-11-30 2021-03-09 西安交通大学 一种白蛋白/透明质酸纳米复合物-铂类前药及制备方法和应用
CN112451542B (zh) * 2020-11-30 2022-02-11 西安交通大学 一种白蛋白/透明质酸纳米复合物-铂类前药及制备方法和应用
CN112569345A (zh) * 2020-12-10 2021-03-30 广东省科学院化工研究所 一种含生长因子的分散体及其制备方法与应用
CN114805631A (zh) * 2022-03-01 2022-07-29 吉林省奇健生物技术有限公司 高活性透明质酸-多肽缀合物及其制备方法和应用
CN116789869A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 吉林省奇健生物技术有限公司 一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012077950A3 (ko) 2012-08-23
EP2650312A2 (en) 2013-10-16
KR20120089506A (ko) 2012-08-13
CA2821075A1 (en) 2012-06-14
CN103492420B (zh) 2016-10-12
JP5784142B2 (ja) 2015-09-24
KR101309566B1 (ko) 2013-09-17
US9221893B2 (en) 2015-12-29
JP2014500272A (ja) 2014-01-09
WO2012077950A2 (ko) 2012-06-14
EP2650312A4 (en) 2016-08-31
US20130253170A1 (en) 2013-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103492420A (zh) 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法
Kong et al. Long acting hyaluronate–exendin 4 conjugate for the treatment of type 2 diabetes
US9095568B2 (en) Therapeutic and vaccine polyelectrolyte nanoparticle compositions
US10092658B2 (en) Method for manufacturing transdermally delivered hyaluronic acid-protein conjugate and transdermally delivered hyaluronic acid-protein conjugate manufactured using same
JP4538666B2 (ja) 薬物内包アクティブターゲット型高分子ミセル、医薬組成物
US9867869B2 (en) Insulin derivatives for diabetes treatment
EP3184553B1 (en) Derivative of hyaluronic acid modified with amino-carboxylic acid
Jackson et al. Dual carrier-cargo hydrophobization and charge ratio optimization improve the systemic circulation and safety of zwitterionic nano-polyplexes
CN112933219A (zh) 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途
Sun et al. Active-targeting long-acting protein-glycopolymer conjugates for selective cancer therapy
CN101809038B (zh) 双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用
CN101636411B (zh) 聚乙二醇修饰的干扰素α2a及其制备方法和应用
JP6560166B2 (ja) 薬物徐放性担体及びその製造方法
US20210386863A1 (en) Drug conjugate prepared using aldehyde group at end of hyaluronic acid
CN112424239B (zh) 高分子化合物及使用了该高分子化合物的细胞内化合物导入促进剂
KR102277785B1 (ko) 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체
RU2466138C1 (ru) Конъюгаты интерферонов и способ их получения
WO2013054298A2 (en) Modified polyethylene glycols and their supramolecular complexes with biologically active macromolecules

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant