CN103333936B - 间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法，该制备方法以间苯三酚为原料，以廉价乳糖底物为半乳糖基供体，采用微生物来源的分子改造的糖苷酶作为工具酶对间苯三酚进行糖基化修饰，合成多种间苯三酚半乳糖苷衍生物。本发明合成的间苯三酚半乳糖苷与原料间苯三酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性，扩大了应用范围，该类化合物自身可作为新的化学合成中间体用以衍生合成新的高附加值化合物。
Description
技术领域
本发明涉及间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶突变酶合成间苯三酚半乳糖苷的方法，属于糖工程技术领域。
技术背景
间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)是一种优良的医药产品，早己被广泛应用于抗菌、抑制脾脏酪氨酸致活酶、苹果防腐等方面。近年来该化合物还成为临床新型亲肌性非阿托品非罂粟碱类纯平滑肌解痉药，其注射液在法国及其他欧洲国家得到了广泛的临床应用，已成为治疗痉挛性疼痛的首选药物。此外，间苯三酚还是重要的精细化工产品，可作为药物合成的中间体用于制备黄酮、异黄酮等抗癌、抗心血管疾病类药物及抗免疫缺损病毒(HIV)新药等。然而，间苯三酚也存在酚类化合物的缺点，如水溶性差、不稳定及光解等性质。
据文献报道，酚类化合物的糖基化修饰能增加水溶性和稳定性，改进药理学性质和疗效。目前尚无酶法糖基化修饰间苯三酚的文献报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法。
间苯三酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，间苯三酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得间苯三酚半乳糖苷。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶选用GenBank登录号为ACE06986.1，将第980位色氨酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase fromLactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备酶蛋白，上述β-半乳糖苷酶对间苯三酚具有显著转糖基活性。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离，型号Silica gel60F254(Merck,Germany).
根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。
上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
有益效果
本发明以间苯三酚为原料，以廉价乳糖底物为半乳糖基供体，采用经过突变的β-半乳糖苷酶合成间苯三酚半乳糖苷，产物与其原料间苯三酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性，扩大了应用范围，该类化合物自身可作为新的化学合成中间体用以衍生合成新的高附加值化合物，在化工及制药业具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为间苯三酚糖苷衍生物1的质谱图；
图2为间苯三酚糖苷衍生物2的质谱图；
图3为间苯三酚糖苷衍生物3的质谱图；
图4为间苯三酚糖苷衍生物2的氢谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
间苯三酚糖苷衍生物，制备步骤如下：
1.β-半乳糖苷酶的制备
人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank登录号为ACE06986.1)，将其连接到pET-21b(+)质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后提取重组质粒，以质粒为模板，采用突变试剂盒（全式金Easy Mutagenesis System,北京）通过PCR在该酶基因序列中引入突变；
上游引物为：5′-CGGGGATGACTCCTTTGGGCAGAAGGTCCA-3′；SEQ ID NO.3
下游引物为：5′-AAAGGAGTCATCCCCGCCGACCCCCATCTG-3′；SEQ ID NO.4
引物中TTT编码苯丙氨酸，通过PCR将980位色氨酸替换为苯丙氨酸；
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；反应20个循环（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸7分钟；20个循环结束后72℃延伸10分钟。
PCR产物经Dpn I酶(TaKaRa)处理后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的β-半乳糖苷酶突变酶基因经测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase from Lactobacillusbulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备β-半乳糖苷酶突变酶。用考马斯亮蓝法测定β-半乳糖苷酶酶液的酶量。
2.β-半乳糖苷酶催化合成间苯三酚半乳糖苷
用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制反应体系50mL，乳糖终浓度为0.2M，间苯三酚终浓度为0.1M，酶的添加量为4μg/mL。在45℃反应45分钟后，100℃煮沸5分钟，终止反应。
3.间苯三酚半乳糖苷的纯化
将煮沸后的反应液12000转/分钟离心20分钟，吸取上清液，在制备薄层层析板(PLCSilica gel60F254,Merck)点样展层。展层结束后，在层析板上每隔10cm取1cm宽的条形小板显色，判定目标糖类在层析板上的位置。然后刮取层析板未显色区域含目标糖苷的硅胶粉末，将其重新溶解于水中，离心取上清，冷冻干燥后所得粉末即为间苯三酚半乳糖苷衍生物。
共分离获得三种不同的糖苷产物，在薄层层析板上显示不同的迁移距离，按迁移率大小分别标记为间苯三酚糖苷衍生物1、间苯三酚糖苷衍生物2、间苯三酚糖苷衍生物3。
上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
4.间苯三酚半乳糖苷衍生物的鉴定
分别取上述三种间苯三酚半乳糖苷用水稀释为质量百分比为1%的溶液，进行质谱分析，图1显示间苯三酚糖苷衍生物1的特征分子离子峰(m/z)为[M-H]-287.076，判断该化合物为间苯三酚单糖苷；图2显示间苯三酚糖苷衍生物2的特征分子离子峰(m/z)为[M-H]-449.128，判断该化合物为间苯三酚双糖苷；图3显示间苯三酚糖苷衍生物2的特征分子离子峰(m/z)为[M-H]-449.127，判断该化合物为间苯三酚双糖苷。取间苯三酚糖苷衍生物2五毫克粉末溶于氘代水中，进行1HNMR分析，结果在化学位移δ>8ppm区域只观察到一个游离的苯环羟基质子信号（如图4所示），说明该化合物的两个半乳糖基分别与苯环两个羟基形成糖苷键。由于间苯三酚双糖苷只有两种可能的连接方式，因而判断间苯三酚糖苷衍生物3为一个二糖分子直接连到苯环上形成糖苷键。
间苯三酚糖苷衍生物1结构如下：
间苯三酚糖苷衍生物2结构如下：
间苯三酚糖苷衍生物3结构如下：
上述质谱分析所用仪器为岛津LCMS-IT-TOF质谱仪（日本）；核磁分析所用仪器为AVANCE600型超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）。
实施例2
间苯三酚半乳糖苷的制备方法，如下步骤如下：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.2M，间苯三酚浓度为0.05M，氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37℃水浴中反应20分钟，煮沸终止反应，12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）间苯三酚半乳糖苷衍生物的纯化与检测同实施例1。
Claims (10)
1.间苯三酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，间苯三酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得间苯三酚半乳糖苷。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测、合并迁移距离相同的产物的步骤。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
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