CN103276029B - 一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，邻苯二酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；（2）将反应体系反应后，煮沸终止反应，离心，取上清液；（3）将上清液，经分离、干燥后，制得邻苯二酚半乳糖苷。采用经过突变的β-半乳糖苷酶合成邻苯二酚半乳糖苷，产物与其原料邻苯二酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性，该化合物自身可作为化学合成中间体用以衍生合成新的高附加值化合物。
Description
技术领域
本发明涉及邻苯二酚糖苷衍生物的制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶突变酶合成邻苯二酚半乳糖苷的方法，属于糖工程技术领域。
技术背景
酚类化合物是一类带有芳香环结构的化合物，具有多种生理学和药理学功能，如儿茶酚具有抗氧化作用、Avarol能抑制HIV的复制等。酚类化合物的糖基化不仅可以增加水溶性，还能改进药理学性质和疗效。例如：对苯二酚具有毒性，而对苯二酚-α-葡萄糖苷(熊果苷)则具有抗菌和皮肤增白效果；子丁香酚由于抑制5α-还原酶而具有修护头发的功能，但其易升华，有特殊气味，化学法糖基化形成的子丁香酚-β-葡萄糖苷能被头皮上存在的微生物缓慢代谢，逐渐降解释放酚类结构，有利于药效的发挥。可以说，新的酚类化合物糖苷具有新的药理学性质，不同糖基化修饰的酚类化合物性质不同，例如对苯二酚半乳糖苷抗氧化活性比熊果苷增高了1.19倍。
邻苯二酚是一种精细化学品的基本原料，广泛用于农药、香料、医药、染料、聚合物等行业，市场潜力巨大。目前邻苯二酚衍生物的开发多采用化学法，酶法衍生化仅有一例相关报道，采用α-葡萄糖苷酶对带有邻苯二酚结构的儿茶酚化合物进行葡萄糖基修饰，尚无邻苯二酚的酶法半乳糖基修饰报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法。
一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，邻苯二酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得邻苯二酚半乳糖苷。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶选用GenBank登录号为ACE06986.1，将第980位色氨基酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase fromLactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备酶蛋白。上述β-半乳糖苷酶对邻苯二酚具有显著转糖基活性。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离，型号Silica gel60F254(Merck,Germany)。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。
上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
有益效果
本发明以邻苯二酚为原料，以廉价乳糖底物为半乳糖基供体，采用经过突变的β-半乳糖苷酶合成邻苯二酚半乳糖苷，产物与其原料邻苯二酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性。该化合物自身可作为一种化学合成中间体，用以衍生合成新的高附加值化合物，在化工、医药等各方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为邻苯二酚半乳糖苷的质谱图；
图2为邻苯二酚半乳糖苷的氢谱；
图3为邻苯二酚半乳糖苷的氢氢相关核磁图谱；
图4为邻苯二酚半乳糖苷的碳氢直接相关核磁图谱；
图5为邻苯二酚半乳糖苷的碳氢远程相关核磁图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
pET-21b(+)质粒购自Invitrogen公司；
大肠杆菌BL21(DE3)购自Invitrogen公司。
实施例1
一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法，步骤如下：
1.β-半乳糖苷酶的制备
人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank登录号为ACE06986.1)，将其连接到pET-21b(+)质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后提取重组质粒，以质粒为模板，采用突变试剂盒（全式金Easy Mutagenesis System,北京）通过PCR在该酶基因序列中引入突变；
上游引物为：5′-CGGGGATGACTCCTTTGGGCAGAAGGTCCA-3′；SEQ ID NO.3
下游引物为：5′-AAAGGAGTCATCCCCGCCGACCCCCATCTG-3′；SEQ ID NO.4
引物中TTT编码苯丙氨酸，通过PCR将980位色氨酸替换为苯丙氨酸；
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；反应20个循环（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸7分钟；20个循环结束后72℃延伸10分钟。
PCR产物经Dpn I酶(TaKaRa)处理后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的β-半乳糖苷酶突变酶基因经测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase from Lactobacillusbulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备β-半乳糖苷酶突变酶。用考马斯亮蓝法测定β-半乳糖苷酶酶液的酶量。
2.β-半乳糖苷酶催化合成邻苯二酚半乳糖苷
用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制反应体系50mL，乳糖终浓度为0.2M，邻苯二酚终浓度为0.1M，酶的添加量为4μg/mL。在45℃反应45分钟后，100℃煮沸5分钟，终止反应。
3.邻苯二酚半乳糖苷的纯化
将煮沸后的反应液12000转/分钟离心20分钟，吸取上清液，在制备薄层层析板(PLCSilica gel60F254,Merck)点样展层。展层结束后，在层析板上每隔10cm取1cm宽的条形小板显色，判定目标糖类在层析板上的位置。然后刮取层析板未显色区域含目标糖苷的硅胶粉末，将其重新溶解于水中，离心取上清，冷冻干燥后所得粉末即为邻苯二酚半乳糖苷。
上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
4.邻苯二酚半乳糖苷的结构鉴定
取上述邻苯二酚半乳糖苷用水稀释为质量百分比为1%的溶液，进行质谱分析，目标产物的特征分子离子峰[M+Na]+为m/z295.07（如图1所示），判断产物分子量为272，与预期产物分子量一致。
将5mg粉末溶于氘代水中，进行核磁解析，综合氢谱（如图2所示）、氢氢相关谱（COSY）（如图3所示）、碳氢直接相关谱（HSQC）（如图4所示）、碳氢远程相关谱（HMBC）（如图5所示），确定各位置碳氢的化学位移和偶合常数，鉴定新合成的产物结构为邻苯二酚-β-D-吡喃半乳糖苷。1H NMR显示半乳糖质子信号位于δ4.95～3.69ppm,苯环上质子信号为δ7.12～6.86ppm。化学位移4.95ppm可观测到半乳糖异头质子的特征双峰信号，偶合常数为7.8Hz，推断半乳糖基通过β键与邻苯二酚分子相连，在HMBC图中可以观测到邻苯二酚苯环的C-1′(δ144.8)与半乳糖异头质子H-1(δ4.95)存在耦合信号，证实了β-半乳糖苷键的存在。
所获得的邻苯二酚-β-D-吡喃半乳糖苷化学结构式如下：
上述质谱分析所用仪器为岛津LCMS-IT-TOF质谱仪（日本）；核磁分析所用仪器为AVANCE600型超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）。
实施例2
一种邻苯二酚-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法，步骤如下：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.2M，邻苯二酚浓度为0.05M，氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37℃水浴中反应20分钟，煮沸终止反应，12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）邻苯二酚半乳糖苷的纯化与检测同实施例1。
Claims (9)
1.一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，邻苯二酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；
（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得邻苯二酚半乳糖苷。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测、合并迁移距离相同的产物的步骤。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，上述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色；
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
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| US5710133A (en) * | 1993-05-07 | 1998-01-20 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | α-glycosyl derivative of catecholamine or its salt, and its preparation and uses |
| CN102241708A (zh) * | 2011-05-10 | 2011-11-16 | 山东大学 | 一种半乳糖苷化合物及其制备方法 |
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