CN103323607A - 一种双组份植物激素的同时测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双组份植物激素的同时测定方法，用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体，以ABEI-BSAAuNPs为纳米粒子标记物，实现对两种植物激素的捕获，并以抗体标记的ABEI-BSAAuNPs纳米粒子为化学发光探针，再用磁性分离和离心方法实现所捕获激素的分离，然后测定磁性分离液和离心分离液的化学发光信号，从而实现了两种植物激素的检测。本发明仅需磁珠、纳米粒子和简单的化学发光技术就实现了植物激素IAA与GA的同时测定，方法简单、成本低、灵敏度高的优势。
Description
技术领域
本发明属于化学发光技术领域，涉及一种双组份植物激素同时测定的方法，具体涉及植物激素吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）双组份的同时测定方法。
背景技术
植物激素是一些对植物生命攸关的化学信号分子，在植物体内合成，并以极微量的浓度引发生理效应，影响和控制着植物的生长发育及其对环境的适应性。植物激素在植物体内的含量很低。近年来植物激素测定方法主要有：液相色谱-质谱法（卢巧梅, 张兰, 陈天文, 卢明华, 陈国南. 液相色谱-串联质谱分析盐胁迫下植物激素的含量变化. 中国科学 B 辑:化学 2009, 39: 785）；气相色谱-质谱法（Barkawi L S, Tam Y Y, Tillman J A, Pederson B, Calio J, Al-Amier H, Emerick M, Normanly J, Cohen J D. A high-throughput method for the quantitative analysis of indole-3-acetic acid and other auxins from plant tissue. Anal Biochem, 2008, 372: 177）；免疫传感器法（Xiao L. T, Wang R Z. Immunosensor assay: a novel method to analyze phytohormones. PGRSA Quarterly. 2006, 33:51）和化学发光法（Hun X, Mei Z H, Wang Z P, He Y H. Indole-3-acetic acid biosensor based on G-rich DNA labeled AuNPs as chemiluminescence probe coupling the DNA signal amplification. Spectrochimica Acta Part A, 2012, 95:114）等。
但是，这些方法的各有其缺点，本发明利用金纳米粒子和磁珠为载体，以 ABEI-BSAAuNPs为纳米粒子标记物，实现了植物激素吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）的双组份测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
发明内容
本发明目的是提供一种同时测定双组份植物激素的方法，利用金纳米粒子和磁珠为载体，以ABEI-BSAAuNPs为纳米粒子标记物，实现植物激素吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）的双组份同时测定。
技术方案
一种双组份植物激素同时测定的方法，植物激素为吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）的双组份，其特征在于用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体，以ABEI-BSAAuNPs为纳米粒子标记物，实现植物激素吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）的双组份同时测定，测定步骤如下：
（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备，制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器（容量瓶，棕色广口瓶，圆底烧瓶等）用王水（盐酸硝酸比例为1:3）泡洗30 min（分钟），然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL质量浓度0.01%的氯金酸（HAuCl4），搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL质量浓度1%的柠檬酸三钠（Na3C6H5O7），继续加热10 min，搅15 min，冷却至室温。转移到棕色瓶中于阴凉处保存；
（2）anti-IAA抗体标记金纳米粒子（AuNPs）的制备，取2 mL的样品管，依次加入2 μL 500 mM（毫摩尔/升）的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH为8.2），6 μL 10 mM的磷酸三氯乙酯（TCEP），6 μL 10-4 M的巯基乙胺，室温放置30 min后加入1 mL 步骤（1）制备的AuNPs，室温下反应12 h（小时），得到巯基乙胺修饰金纳米粒子；取上述所得的巯基乙胺修饰金纳米粒子分散在含5（wt）%戊二醛的磷酸缓冲溶液中，持续搅拌2 h，用磷酸缓冲溶液离心清洗3次，再将其在磷酸缓冲溶液中，加入含10 μg anti-IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到anti-IAA抗体标记金纳米粒子；
（3）anti-GA抗体标记磁珠的制备，在2 mL的样品管中加入含10 μg anti-GA抗体溶液，再加入1000 μL 含0.1 M的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和0.2 M的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化30 min，另取一个10 mL的小烧杯，加入50 μL氨基化磁珠（2～3 μm），2000 μL咪唑缓冲液（0.1 M，pH为6.8），活化30 min；将上述两溶液混合反应12 h，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，用磷酸缓冲溶液定容至500 μL，得到anti-GA抗体标记磁珠；
（4）抗体标记ABEI-BSAAuNPs的制备
a. BSAAuNPs纳米粒子的制备，将5 mL经过恒温的HAuCl4溶液加入到5 mL浓度50 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液中，搅拌反应2 min，然后加入0.5 mL 1M NaOH，并在37 ℃下继续反应1 h，得到BSAAuNPs纳米粒子，粒径为2-3 nm，室温下保存；
b. ABEI-BSAAuNPs的制备，在PBS缓冲溶液加入1 mL BSAAuNPs，再加入10 mg NHS、20 mg EDC，将该混合液在37℃下搅拌1 h，然后加入1 mL N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺（ABEI）溶液，在室温下搅拌12-18 h，得到ABEI-BSAAuNPs复合物；
c. 抗体标记ABEI-BSAAuNPs的制备，取1 mL ABEI-BSAAuNPs溶液，加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg，在37 ℃下活化1 h，再加入100 μL的ABEI-BSAAuNPs，反应时间12-18 h；再将其分成两份，一份加入含10 μg anti-IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，即得IAA抗体标记ABEI-BSAAuNPs；另外一份10 μg anti-GA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到GA抗体标记ABEI-BSAAuNPs；
（5）双组分植物激素的检测，将不同量的目标物IAA和GA标准溶液分别混合，加入anti-GA抗体标记磁珠和anti-IAA抗体标记金纳米粒子，37 ℃孵育1 h，离心分离（离心机转速为14000 rpm）后用PBST溶液清洗3次，再加入GA抗体标记ABEI-BSAAuNPs和IAA抗体标记ABEI-BSAAuNPs混合溶液，37℃孵育1 h；随后，用包含有2% BSA的WB洗涤液洗涤3次，分成2等份，一份在磁性分离器下吸弃上清液，下层溶液用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对GA进行定量；另外一份，在磁性分离器下吸取上清液，将所得上清液在13000 rpm转速下离心，收集沉淀，并用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对IAA进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；
（6）样品分析，将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（5）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（5）所得标准曲线可以获取植物激素IAA和GA含量。
本发明的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
本发明的磷酸缓冲溶液为0.2 M（pH7.4），的配制方法：称取0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O溶解于1 L水中。
本发明的PBS缓冲溶液为0.2 M（pH7.4），的配制方法：称取0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4·12H2O及0.2 g KCl溶解于1 L水中。
本发明的PBST溶液的配制：在0.2 M（pH7.4）的1 L PBS缓冲溶液中加入1 mL的吐温-20，吐温-20的体积浓度为0.1%。
本发明的WB洗涤液：称取2.429 g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），9.959 g氯化钠，0.509 g吐温-20，用 500 mL超纯水溶解后，用0.1 M盐酸调PH至8.0，最后用超纯水稀释至 1000 mL即得。
本发明的化学发光测定选用MPI-E型化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）。
本发明的振荡孵育选用THZ-82A气浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）。
本发明的离心机选用Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机（上海市安亭科学仪器厂）。
本发明的pH测量选用PHS-3D型酸度计（上海雷磁仪器厂）。
本发明的显著效果
本发明研究了不同浓度IAA和GA与发光强度之间的关系，得到了检测IAA和GA的标准曲线，线性范围及线性方程。
当IAA的浓度在0.02 ng/mL-20 ng/mL之间时，随着IAA浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测IAA的非线性方程为ICL = -647.65*exp(-x/0.61) - 5857.63*exp(-x/7.16) + 6466.90（ICL 是体系的化学发光强度；x是IAA的浓度，ng/mL；n = 12，n表示同一浓度测定次数，R2 = 0.9997）。IAA的浓度在0.02 ng/mL-0.3 ng/mL范围内与化学发光强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是ICL = 1273.1x - 2.44，线性相关系数R= 0.9991，检测限是0.01 ng/mL（3σ）。
当GA的浓度在0.02 ng/mL-20 ng/mL之间时，随着GA浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测GA的非线性方程为ICL =-6049.94*exp(-x/20.42) -3765.90*exp(-x/3.18) + 9815.16（ICL 是体系的化学发光强度；x是GA的浓度，ng/mL；n = 12，R2 = 0.9989）。GA的浓度在0.02 ng/mL-0.3 ng/mL范围内与化学发光强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是ICL = 1308.9x + 6.322，线性相关系数R= 0.9995，检测限是0.008 ng/mL（3σ）。
该测定方法的精密度通过对浓度为0.3 ng/mL的IAA和GA进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.7%和3.9%，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
附图说明
图1. ABEI-BSAAuNPs纳米粒子标记物双组份植物激素的同时测定原理图
图2. IAA（A）和GA（B）标准曲线，其中A是IAA的标准曲线，横坐标是IAA浓度，单位是ng/mL，纵坐标ICL是体系的化学发光强度；B是GA的标准曲线，横坐标是GA浓度，单位是ng/mL，纵坐标ICL是体系的化学发光强度。
具体实施方式
按照技术方案的步骤（1）至（5）得到IAA（A）和GA（B）标准曲线见图2，其中巯基乙胺、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺（ABEI）均购自上海阿拉丁试剂；牛血清白蛋白（BSA）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）购自Acros（New Jersey, USA），三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），国药集团化学试剂有限公司；氯金酸（HAuCl4），柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）均购于天津市博迪化工有限公司；氨基化磁珠购自天津倍思乐色谱技术开发中心。
根据发明的方法对IAA和GA含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为96.0–102.2%，测定结果见表1，本发明的方法在IAA和GA检测中具有精密度高的特点。测定时用微纳米级微透析探针插入模式植物玉米颈部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样。
表1. 样品分析测定结果
a7次测量结果
b 单位：ng/mL。
Claims (10)
1.一种双组份植物激素同时测定的方法，植物激素为IAA和GA的双组份，其特征在于用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体，以ABEI-BSAAuNPs为纳米粒子标记物，实现植物激素IAA和GA的双组份同时测定，测定步骤如下：
（1）金纳米粒子AuNPs的制备，制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水泡洗30 min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL质量浓度0.01%的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL质量浓度1%的Na3C6H5O7，继续加热10 min，搅15 min，冷却至室温，转移到棕色瓶中于阴凉处保存；
（2）anti-IAA抗体标记金纳米粒子的制备，取2 mL的样品管，依次加入pH为8.2的2 μL 500 mM的Tris-HCl，6 μL10 mM的TCEP，6 μL 10-4 M的巯基乙胺，室温放置30 min后加入1 mL 步骤（1）制备的AuNPs，室温下反应12 h，得巯基乙胺修饰金纳米粒子；取上述所得的巯基乙胺修饰金纳米粒子分散在含5（wt）%戊二醛的磷酸缓冲溶液中，持续搅拌2 h，用磷酸缓冲溶液离心清洗3次，再将其在磷酸缓冲溶液中，加入含10 μg anti-IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到anti-IAA抗体标记金纳米粒子；
（3）anti-GA抗体标记磁珠的制备，在2 mL的样品管中加入含10 μg anti-GA抗体溶液，再加入1000 μL 含0.1 M的EDC和0.2 M的NHS，活化30 min，另取一个10 mL的小烧杯，加入50 μL粒径为2～3 μm氨基化磁珠，2000 μL 0.1M，pH为6.8咪唑缓冲液，活化30 min；将上述两溶液混合反应12 h，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，用磷酸缓冲溶液定容至500 μL，得到anti-GA抗体标记磁珠；
（4）抗体标记ABEI-BSAAuNPs的制备
a. BSAAuNPs纳米粒子的制备，将5 mL经过恒温的HAuCl4溶液加入到5 mL浓度为 50 mg/mL的BSA溶液中，搅拌反应2 min，然后加入0.5 mL 1 M NaOH，并在37 ℃下继续反应1小时，得BSAAuNPs纳米粒子，粒径为2-3 nm，室温下保存；
b. ABEI-BSAAuNPs的制备，在pH为7.4的PBS缓冲溶液加入1 mL BSAAuNPs，再加入NHS 10 mg、EDC 20mg，将该混合液在37 ℃下搅拌1小时，然后加入1 mL N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺溶液，在室温下搅拌12-18小时，得到ABEI-BSAAuNPs复合物；
c. 抗体标记ABEI-BSAAuNPs的制备，取1 mL ABEI-BSAAuNPs溶液，加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg，在37 ℃下活化1小时，再加入100 μL的ABEI-BSAAuNPs，反应时间12-18小时；再将其分成两份，一份加入含10 μg anti-IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育1 h，得到IAA抗体标记ABEI-BSAAuNPs；另外一份10 μg anti-GA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到GA抗体标记ABEI-BSAAuNPs；
（5）双组分植物激素的检测，将不同量的目标物IAA和GA标准溶液分别混合，加入anti-GA抗体标记磁珠和anti-IAA抗体标记金纳米粒子，37 ℃孵育1 h，离心分离，离心机转速为14000 rpm，分离后用PBST溶液清洗3次，再加入GA抗体标记ABEI-BSAAuNPs和IAA抗体标记ABEI-BSAAuNPs混合溶液，37 ℃孵育1 h；随后，用包含有2% BSA的WB洗涤液洗涤3次，分成2等份，一份在磁性分离器下吸弃上清液，下层溶液用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对GA进行定量；另外一份，在磁性分离器下吸取上清液，将所得上清液在13000 rpm转速下离心，收集沉淀，并用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对IAA进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；
（6）样品分析，将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（5）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（5）所得标准曲线可以获取植物激素IAA和GA含量。
2.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述化学试剂为分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
3.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液为0.2M，pH=7.4，的配制方法：称取0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O溶解于1L水中。
4.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述PBS缓冲溶液是0.2 M，pH=7.4，其的配制方法是称取0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4·12H2O及0.2 g KCl溶解于1L水中。
5.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述PBST溶液的配制方法是在浓度为0.2M，pH=7.4的1 L PBS缓冲溶液中加入1 mL的吐温-20。
6.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述WB洗涤液配制方法是称取2.429g三（羟甲基）氨基甲烷，9.959 g氯化钠，0.509 g吐温-20，用 500 mL超纯水溶解后，用0.1 M盐酸调PH至8.0，最后用超纯水稀释至 1000 mL。
7.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述化学发光测定选用MPI-E型化学发光分析系统。
8.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述振荡孵育选用THZ-82A气浴恒温振荡器。
9.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述离心机选用Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机。
10.根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法，其特征在于所述pH测量选用PHS-3D型酸度计。
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