CN106353500A - 一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，通过丝网印技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；继续滴涂链酶亲和素于阵列微孔中，再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感器。该无标记化学发光免疫传感器可以对48个样品同时检测，改善了单组分无标记化学发光免疫分析模式分析时间长，劳动量大，试剂消耗多等缺陷，实现了多种肿瘤标志物廉价、快速、高通量、高灵敏的联合检测，适用于肿瘤早期的大规模筛查，具有非常重要的应用价值和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域和化学发光分析领域，具体涉及一种多肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法。
背景技术
肿瘤的早期诊断与治疗是提高肿瘤患者存活率的关键。人血清中肿瘤标志物的含量与肿瘤的发展阶段有着密切的联系，其对肿瘤的鉴别诊断、辅助诊断、观察疗效、监测复发和愈后评价都有非常高的应用价值。因此，对肿瘤标志物可靠灵敏的检测是肿瘤筛查和预估的关键。然而，许多资料证实，不同的肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型既可能有共同的肿瘤标志物，也可能有不同的肿瘤标志物，因此寻找仅针对某一种肿瘤，并具有100％特异性和敏感性的“理想”肿瘤标志物是十分困难的，临床上为了提高肿瘤检测的准确性和可靠性，往往都是将检测与目标肿瘤相关的一组标志物，仅能检测一种肿瘤标志物的单组分分析方法已经满足不了临床诊断的需求，因此亟待发展多组分免疫分析新技术。
多组分分析技术可以在单个分析流程中实现多种组分的同时或近同时检测，具有分析通量高、样品消耗少、所需时间短、分析成本低等优点。目前多组分免疫分析方法主要有空间分辨和多标记物两种模式。多标记物模式中，需要将多种标记物标记在蛋白上，存在标记步骤的复杂、费力、耗时，标记后的抗体或抗原分子生物活性降低等缺陷。多种标记物经常需要不同的最优分析条件，如各种标记酶催化反应的最优pH值、温度等都不相同，因此只能妥协某些条件从而导致较差的分析性能。此外，由于化学发光的检测没有选择性，多种标记物之间相互干扰或化学发光信号的重叠也会使分析性能变差。
空间分辨模式是当前多组分免疫分析模式中研究最多、应用最广的分析模式，其通过将各个组分按发光产生的位置不同来进行区分，然后以阵列检测器(如CID，CCD等)进行检测，从而得到相对应的组分含量。从理论上讲，只要基质足够大或者阵列足够小，集成化程度高，就可以在基质上构建大量阵列，以达到同时检测大量样品的目的。因此基于阵列法的空间分辨模式具有高分析通量和多检测对象，分析速度快，样品消耗少等优点，满足临床应用的实际需求，是多组分免疫分析的主流趋势。
发明申请“一种基于纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器及制备和分析方法”(专利申请号：201510919955.1)通过使用纳米模拟酶代替天然酶，改善了传统化学发光免疫分析中天然酶稳定性差，易受环境影响等缺点，使得构建的化学发光体系的稳定性和灵敏度得到显著的提高，但是这个基于纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器一次只能进行单组份免疫分析，存在分析时间长，劳动量大，试剂消耗多等缺陷，这极大地限制了该传感器的临床应用。因此本发明基于纳米模拟酶的无标记化学发光策略，进一步构建了免疫阵列传感器，实现了多种肿瘤标志物的同时、高通量检测，适用于肿瘤早期的大规模筛查，具有非常重要的应用价值和实际意义。
发明内容
本发明提出了一种基于纳米模拟酶的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，用于多种肿瘤标志物的同时检测。
本发明通过丝网印刷技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，其包含48个检测位点，即可以对48个样品同时检测，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感器；与抗原发生特异性免疫反应后形成的免疫复合物能有效阻碍化学发光底物向硫化铜纳米粒子的扩散并抑制模拟酶催化化学发光，引起化学发光信号强度的减弱，化学发光信号由电荷耦合检测器CCD收集。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，包括以下步骤：
(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列，形成48个阵列微孔；
(2)将硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浊液与壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；
(3)取链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(4)取多种生物素化的抗体继续滴涂于传感阵列的阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(5)将封闭液，均匀滴涂与阵列微孔中封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(6)取带有多种分析抗原的样品溶液加入阵列微孔中，在线温育；
(7)取含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；
(8)取化学发光底物滴入阵列微孔中；
(9)化学发光阵列检测器采集化学发光信号。
进一步地，步骤(1)中，4×12免疫传感阵列如图1所示，白色部分为环氧硅烷化的阵列微孔，直径为2mm，边缘间距为4mm；黑色部分为阵列微孔周围的载玻片，并印刷有具有疏水作用的绝缘油漆。进一步地，步骤(2)中所述的硫化铜纳米粒子用量为1.0-3.0mg，壳聚糖溶液的浓度为1.0-2.0wt％。
进一步地，步骤(3)中所述的链酶亲和素溶液的浓度为20-50μg/mL。
进一步地，步骤(4)中所述的生物素化的抗体的浓度为2-10μg/mL。
进一步地，步骤(5)中所述的封闭液为1.0-5.0％牛血清蛋白溶液。
进一步地，步骤(6)所述温育的时间为20-40min。
进一步地，步骤(9)所述的化学发光阵列检测器为电荷耦合检测器CCD，动态积分时间为5-10min。
进一步地，步骤(2)(3)(4)(5)(6)(8)所述的滴入阵列微孔中的试剂量为4-8μL。
本发明达到了如下的有益效果：
本发明基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光分析策略，构建了一种多组分免疫分析的传感器，通过化学发光成像实现了同时检测多种检测肿瘤标志物。本发明通过丝网印刷技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，即可以对48个样品同时检测，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感阵列。此外，本发明还构建了一种多肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫传感阵列的分析方法。本发明具有如下优点：
(1)本发明成功构建了免疫传感阵列，实现了空间分辨多组分免疫分析，改善了单组分免疫分析每次只能检测一个样品，存在分析时间长、劳动量大、试剂消耗多等缺陷。本发明所构建的免疫传感阵列能同时检测48个分析试样，具有高分析通量和多检测对象、分析速度快、样品消耗少等优点，满足临床应用的实际需求，适用于肿瘤早期的大规模筛查。
(2)本发明每个阵列微孔中只需加入4-8μL免疫试剂，极大地减小了试剂用量，节省了分析成本。此外，小体积的阵列微孔减小免疫试剂向界面的扩散时间，加速了免疫试剂向界面的传质过程，从而缩短了免疫分析的时间，提高了分析的速度。
(3)本发明构建的传感器具有高的灵敏性、准确性和稳定性，这是因为硫化铜具有大的比表面积和较强的吸附性能，结合生物素-链酶亲和素系统的放大效应，使传感阵列界面上修饰了大量的抗体。具有良好生物相容性的传感界面，不仅保持了抗体的生物活性，而且均一稳定的抗体层覆盖在硫化铜纳米粒子信号层之上，能高效捕获目标抗原形成免疫复合物，从而阻碍化学发光底物向信号层的扩散，极有利于无标记分析策略的实现。
附图说明
图1为本发明免疫传感器的制作和免疫分析示意图。
图2为本发明免疫传感器同时检测AFP和CEA标准样品的线性曲线。
图中，1.水虎鱼酸(H2SO4:H2O2＝7:3，v/v)；2.GPTMS(γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)；3.硫化铜纳米粒子；4.生物素化的抗体；5.链霉亲和素；6.抗原；7.化学发光底物；8.电荷耦合检测器CCD。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
实施例1
一种无标记化学发光成像免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)，该免疫传感器的制备及分析方法包括以下步骤：
(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列；
(2)将2.0mg硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浮液与1.0wt％壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取5μL上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；
(3)取5μL 50μg/mL链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(4)取5μL 1μg/mL生物素化的AFP抗体和2μg/mL生物素化的CEA抗体分别滴涂于传感阵列的两列阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(5)将5μL 1.0％血清白蛋白溶液，均匀滴涂阵列微孔中封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干，制得该无标记免疫传感阵列；
(6)取5μL带有AFP和CEA抗原的样品加入阵列微孔中，在线温育25min；
(7)PBST冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；
(8)取5μL化学发光底物[luminol(5mM)-PIP(0.6mM)-H2O2(4mM)]滴入阵列微孔中；
(9)电荷耦合检测器CCD采集化学发光信号，动态积分时间为400s。
如图2所示，测定不同浓度的AFP和CEA标准样品，制得AFP和CEA标准样品的线性曲线。制得标准曲线后，为考察该基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器实际应用的可靠性，进行了人血清样品的检测，并与标准方法(表1中样品1-5的参考值由江苏省肿瘤医院提供，由商品化的电化学发光免疫分析仪测量)进行了比较，实验结果如表1所示：
表1
实施例2
一种无标记化学发光成像免疫传感器用于同时检测糖链抗原125(CA125)、糖链抗原199(CA199)、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)，该免疫传感器的制备及分析方法包括以下步骤：
(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列；
(2)将3.0mg硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浮液与2.0wt％壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取6μL上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；
(3)取6μL 100μg/mL链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(4)取6μL 1μg/mL生物素化的AFP抗体、1μg/mL生物素化的CEA抗体、1μg/mL生物素化的CA125抗体和1μg/mL生物素化的CA199抗体，分别滴涂于传感阵列的一列阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(5)将6μL 1.0％血清白蛋白溶液，均匀滴涂于阵列微孔中封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干，制得该无标记免疫传感阵列；
(6)取6μL带有CA125、CA199、AFP和CEA抗原的样品加入阵列微孔中，在线温育35min；
(7)PBST冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；
(8)取6μL化学发光底物[luminol(5mM)-PIP(0.6mM)-H2O2(4mM)]滴入阵列微孔中；
(9)电荷耦合检测器CCD采集化学发光信号，动态积分时间为8min。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列，形成48个阵列微孔；
(2)将硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浊液与壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；
(3)取链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(4)取多种生物素化的抗体继续滴涂于传感器的阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(5)将封闭液均匀滴涂于阵列微孔中，封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；
(6)取带有多种分析抗原的样品溶液加入阵列微孔中，在线温育；
(7)取含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；
(8)取化学发光底物滴入阵列微孔中；
(9)化学发光阵列检测器采集化学发光信号。
2.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(1)中，4×12免疫传感阵列中，阵列微孔周围的载玻片印刷有具有疏水作用的绝缘油漆，环氧硅烷化的阵列微孔直径为2mm，边缘间距为4mm。
3.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硫化铜纳米粒子用量为1.0-3.0mg，壳聚糖溶液的浓度为1.0-2.0wt％。
4.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法备，其特征在于，步骤(3)中所述的链酶亲和素溶液的浓度为20-50μg/mL。
5.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(4)中所述的生物素化的抗体的浓度为2-10μg/mL。
6.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(5)中所述的封闭液为1.0-5.0％牛血清蛋白溶液。
7.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(6)所述温育的时间为20-40min。
8.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(9)所述的化学发光阵列检测器为电荷耦合检测器CCD，动态积分时间为5-10min。
9.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(8)所述的滴入阵列微孔中的试剂量为4-8μL。
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