CN103282054A

CN103282054A - 抗dig抗体和与肽缀合的地高辛配基的复合物的药物组合物

Info

Publication number: CN103282054A
Application number: CN2011800639842A
Authority: CN
Inventors: U·布林克曼; S·德兹阿德克; E·霍夫曼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-01-03
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-09-04
Also published as: CA2822481A1; US20130280279A1; KR20130113493A; MX2013007559A; WO2012093068A1; RU2013135175A; EP2661282A1; BR112013014644A2; JP2014502607A

Abstract

本发明涉及结合地高辛配基的单特异性抗体与地高辛配基缀合的肽的复合物的药物组合物，涉及分离的或回收的复合物以及生产此类复合物或组合物的方法。此外描述了此类药物组合物用作药物的用途。

Description

抗DIG抗体和与肽缀合的地高辛配基的复合物的药物组合物

本发明涉及结合地高辛配基的单特异性抗体与地高辛配基缀合的肽的复合物的药物组合物，回收的复合物以及产生此类复合物或组合物的方法。此外描述了此类药物组合物作为药物的用途。

发明背景

US5,804,371涉及半抗原标记的肽及其在免疫检测方法中的用途。

WO2006/094269和WO2009/136352涉及抗血管生成化合物，VEGF结合肽和掺入这些肽的大分子。

WO2006/095166涉及经修饰的PYY(3-36)肽及其对摄食行为的影响。

WO2007/065808涉及神经肽-2受体激动剂和PYY衍生物及其用于治疗疾病(例如肥胖和体尿病)的用途。

Decarie A.，等人，Peptides，15(1994)511-518涉及地高辛配基标记的肽(缓激肽)及其在发炎组织中的缓激肽的化学发光酶免疫测定中的应用。没有描述分离或回收的地高辛配基标记的肽和抗DIG抗体的复合物。也没有描述此类复合物的药物组合物或用途。

发明概述

本发明的一个方面是包含：

a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和

b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合

的复合物的药物组合物。

本发明的另一个方面是：

a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和

b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合的复合物，其中复合物在生产后被回收。在一个实施方案中，a)的抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，a)的抗体包含SEQ ID NO：37的重链可变结构域和SEQ ID NO：36的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，a)的抗体是人源化或人抗体。

在一个实施方案中，a)的抗体包含SEQ ID NO：39的重链可变结构域和SEQ ID NO：38的轻链可变结构域。

在一个实施方案中肽选自：

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY(SEQ ID NO：26)；

GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：32)；

FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQID NO：33)；

NKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPR(SEQID NO：34)；和

QHRYQQLGAGLKVLFKKTHRILRRLFNLAK(SEQ ID NO：35)。

一个实施方案是根据本发明的药物组合物或复合物，所述药物组合物或复合物用于治疗代谢疾病。

一个实施方案是根据本发明的药物组合物或复合物，所述药物组合物或复合物用于治疗癌症。

一个实施方案是根据本发明的药物组合物或复合物，所述药物组合物或复合物用于治疗炎性疾病。

一个实施方案是产生根据本发明的复合物的方法，所述方法包括以下步骤

-复合结合地高辛配基的单特异性抗体和地高辛配基，其中地

高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合

-回收得到的复合物。

根据本发明的药物组合物和复合物显示了有价值的性质，例如良好的体内血清半寿期(与亲本肽相比)和其具有高生物活性。因此它们作为具有确定的结构的基于肽的药物特别有用。

附图描述

图1：人源化<Dig>IgG的图解模型

图2：肽的地高辛配基化(将地高辛配基缀合至肽)的程序(见例如图2A)和经地高辛配基化的荧光团Dig-Cy5(图2a，使用荧光团作为肽的分析替代物)和经地高辛配基化的PYY衍生物DIG-moPYY(DIG-moPYY)(图2C)的实例

图3：单特异性地高辛配基结合抗DIG抗体和双特异性抗DIG抗体和与肽或荧光团缀合的地高辛配基的复合物的示例图

图4：概念验证：抗DIG抗体(使用双特异性抗体用于概念验证)与地高辛配基化的荧光团(作为肽的分析替代物)Cy5的复合物：地高辛配基化的Cy5<Her2>-<Dig>双特异性抗体复合物的大小排阻层析指示负载地高辛配基化的Cy5和负载分子的同质性。A层析图：1：Her2 Dig Cy5(1：0)2：Her2 Dig Cy5(1：0.5)，3：Her2 Dig Cy5(1：1)，4：Her2 Dig Cy5(1：2)，5：Her2Dig Cy5(1：3)，6：Her2 Dig Cy5(1：5).7：Her2Dig Cy5(0：1)，B分析：二价地高辛配基结合抗体的负载在2∶1的有效载荷∶抗体比率时达到饱和。

图5：抗DIG抗体和与肽缀合的地高辛配基的复合物：与肽缀合的地高辛配基的抗体复合得到确定大小的复合物，通过大小排阻层析证明。

图6：用与肽缀合的地高辛配基负载抗DIG抗体：SEC-MALLS分析证明，地高辛配基化的肽的抗体复合导致确定大小的复合物，所述复合物比未复合的抗体或未复合的肽大且每个抗体衍生物含有2个肽。

图7：相比PEG化的肽，地高辛配基化的和抗体复合的肽的改善的体外生物活性

图8：在抗体复合后地高辛配基化的荧光染料(作为肽的替代物)的改善的体内血清半寿期/稳定性。

图9：在抗体复合后地高辛配基化的肽的改善的体内血清半寿期/稳定性。

图10：相比未复合的肽，抗体复合的地高辛配基化的肽的改善的体内活性。可通过在治疗动物中食物摄取的减少检测IgG复合的DIG-moPYY-肽的体内效力。

图11：相比未复合的肽，抗体复合的地高辛配基化的肽的改善的体内活性。可通过接受未复合的肽的动物相比接受低17倍的剂量的复合的肽的动物中食物摄取的差异检测IgG复合的DIG-moPYY-肽的体内效力。

发明详述

本发明的一个方面是药物组合物，其包含下述复合物：

a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和

b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合。

本发明的另一个方面是下述复合物：

a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和

在一个实施方案中，肽包含10至50个氨基酸。具有12个或更多个氨基酸的肽通常具有二级结构。因此在一个实施方案中，肽包含12至40个氨基酸。在一个实施方案中，肽包含12至30个氨基酸。

术语“地高辛配基”或“DIG”在本文中可互换使用，指3-[(3S，5R，8R，9S，10S，12R，13S，14S，17R)-3，12，14-三羟基-10，13-二甲基-1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，15，16，17-十四氢-环戊二烯并[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS号1672-46-4)。地高辛配基(DIG)是仅在植物毛地黄(Digitalispurpurea)，东方毛地黄(Digitalis orientalis)和狭叶毛地黄(Digitalislanata)(foxgloves)的花和叶中发现的类固醇(Polya，G.，Biochemical targetsof plant bioactive compounds，CRC Press，New York(2003)第847页)。

术语“抗地高辛配基抗体”和“结合地高辛配基的抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合地高辛配基以致a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合的复合物，所述复合物可用作延长肽的半寿期的治疗剂。

术语“与治疗肽缀合的地高辛配基”指与肽共价连接的地高辛配基。通常地高辛配基通过其3-羟基与肽缀合。活化的地高辛配基-3-羧基-甲基衍生物经常被用作此类缀合的地高辛配基肽的起始材料。在一个实施方案中，地高辛配基通过接头与肽缀合(优选地通过其3-羟基)。所述接头可包含：a)亚甲基-羧基-甲基基团(-CH2-C(O)-)，b)从1至10个(优选从1至5个)氨基酸(例如选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸或赖氨酸)和/或c)具有结构式NH2-[(CH2)n O]xCH2-CH2-COOH的一种或多种(优选一种或两种)化合物，其中n是2或3并且x是1至10，优选1至7(这(至少部分地)导致式-NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)；此类化合物的一个实例是，例如12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(导致TEG(三甘醇)接头或TEG间隔子，见实施例5))。在一个实施方案中，接头还包含马来酰亚胺基团。在下文实施例5中描述了通过此类接头与肽缀合的地高辛配基。接头具有稳定和增溶作用，因为其优选地含有电荷或/和可形成氢键。此外其可在空间上协助抗地高辛配基抗体与地高辛配基缀合的肽结合。在一个实施方案中，接头位于肽的氨基酸侧链上(例如通过氨基或巯基基团与赖氨酸或半胱氨酸侧链缀合)。在一个实施方案中，接头位于肽的氨基末端或羧基末端。通常在不影响肽的生物活性的区域选择接头在肽上的位置。因此接头的附着位置取决于肽的本质和负责生物活性的相关结构元件。可在体外测定中检测地高辛配基附着的肽的生物活性。

本文中使用的术语“肽”指氨基酸的聚合物。本文中使用的这些术语适用于下述氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。这些术语也适用于天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可为L或D型。肽可为环状的，在肽内两个非相邻氨基酸之间具有分子内键，例如骨架与骨架、侧链与骨架和侧链与侧链环化。可通过本领域熟知的方法制备环肽。见例如美国专利号6,013,625。例如在Bellmann-Sickert，K.，等人，Trends Pharm.Sci.31(2010)434-441中描述了一般的生物活性肽。

根据公认惯例表示所有肽序列，其中α-N-端氨基酸残基位于左侧，α-C-端氨基酸残基位于右侧。本文中使用的术语″N-端″指肽中氨基酸的游离α-氨基，术语″C-端″指肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。具有N-端基团的肽指具有N-端氨基酸残基的α-氨基氮上的基团的肽。具有N-端基团的氨基酸指具有α-氨基氮上的基团的氨基酸。

除非通过前缀“D”，例如D-Ala或N-Me-D-Ile或以小写形式表示，例如a，i，l，(Ala，Ile，Leu的D型)另外指示，在此说明书和随附的权利要求书中描述的肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然的或“L”构型。使用Cahn-Ingold-Prelog″R″和″S″命名指定肽N端处的某些酰基替换基中的手性中心的立体化学。″R，S″命名表示2种对映异构体形式的外消旋混合物。此命名法根据Cahn，R.S.，等人，Angew.Chem.lnt.Ed.Engl.5(1966)385-415中的描述。

一般地，本文中使用的术语″氨基酸″指天然和非天然氨基酸及其衍生物。这样的氨基酸的实例包括但不限于，Aad(α-氨基己二酸)，Abu(氨基丁酸)，Ach(α-氨基环己烷-羧酸)，Acp(α-氨基环戊烷-羧酸)，Acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)，Aib(α-氨基异丁酸)，Aic(2-氨基茚-2-羧酸；又称2-2-Aic)，1-1-Aic(1-氨基茚-1-羧酸)，(2-氨基茚-2-羧酸)，Ala，烯丙基甘氨酸(AllylGly)，别异亮氨酸(allo-Ile)，Arg，Asn，Asu(α-氨基软木酸，2-氨基辛二酸)，Asp，Bip(4-苯基-苯丙氨酸-羧酸)，BnHP((2S，4R)-4-羟脯氨酸)，Cha(β-环己基丙氨酸)，Cit(瓜氨酸)，环己基甘氨酸(Chg)，环戊基丙氨酸，β-环丙基丙氨酸，Cys，Dab(1，4-二氨基丁酸)，Dap(1，3-二氨基丙酸)，p(3，3-二苯基丙氨酸-羧酸)，3，3-二苯基丙氨酸，二-n-丙基甘氨酸(Dpg)，2-呋喃基丙氨酸，Gln，Glu，Gly，His，高环己基丙氨酸(HoCha)，高瓜氨酸(HoCit)，高环亮氨酸，高亮氨酸(HoLeu)，高精氨酸(HoArg)，高丝氨酸(HoSer)，羟脯氨酸，Ile，Leu，Lys，Lys(Ac)，(1)Nal(1-萘基丙氨酸)，(2)Nal(2-萘基丙氨酸)，Met，4-MeO-Apc(1-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-环己烷-1-羧酸)，正亮氨酸(Nle)，Nva(正缬氨酸)，Omathine，3-Pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧酸)，4-Pal(α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)，Phe，3，4，5，F3-Phe(3，4，5-三氟-苯丙氨酸)，2，3，4，5，6，F5-Phe(2，3，4，5，6-五氟-苯丙氨酸)，Pqa(4-氧-6-(1-哌嗪基)-3(4H)-喹唑啉-醋酸(CAS889958-08-1))，Pro，吡啶基丙氨酸，喹啉基丙氨酸，Ser，肌氨酸(Sar)，噻唑基丙氨酸，噻吩基丙氨酸，Thr，Tic(α-氨基-1，2，3，4，四氢异喹啉-3-羧酸)，Tic(OH)，Tle(叔丁基甘氨酸)，Trp，Tyr，Tyr(Me)，Val。

在本发明的一个实施方案中，氨基酸选自由上述列表组成的组。

为了方便描述本发明，下面列出天然氨基酸的缩写：

Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸；和Val＝V＝缬氨酸。

下面显示了一些常用氨基酸衍生化物的缩写的非限制性列表：

Ac＝乙酰基；Boc＝9-芴甲氧羰基；Dde＝；Fmoc＝9-芴甲氧羰基；Mtr＝4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基；Pbf＝2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Trt＝三苯甲基，tBu＝叔丁基；TEG＝4，7，10-三氧杂十二酸(＝三甘醇(TEG)-接头)。

在一个实施方案中，肽是例如在WO2007/065808中描述的神经肽-2受体激动剂。在一个实施方案中，肽选自

IK-Pqa-RHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO：2)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：3)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(m-)Y (SEQ ID NO：4)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-I)Y (SEQ ID NO：5)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-5二氟)Y (SEQ ID NO：6)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2-6二氟)Y (SEQ ID NO：7)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2-6二甲基)Y (SEQ ID NO：8)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RF(O-CH3) (SEQ ID NO：9)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RF (SEQ ID NO：10)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-NH2)Phe (SEQ ID NO：11)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-F)Phe (SEQ ID NO：12)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-CH2OH)Phe (SEQ ID NO：13)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-CF3)Phe (SEQ ID NO：14)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-F)Phe (SEQ ID NO：15)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2，3.4，5，6-五氟)Phe (SEQ ID NO：16)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3.4-二氯)Phe (SEQ ID NO：17)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RCha (SEQ ID NO：18)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RW (SEQ ID NO：19)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(1)Nal (SEQ ID NO：20)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2)Nal (SEQ ID NO：21)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQR-C-α-Me-Tyr (SEQ ID NO：22)；

IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：23)；

INle-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：24)；

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)R(2-6二氟)Y (SEQ ID NO：25)；

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：26)；

戊基-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：27)；

三甲基乙酰-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：28)；

环己基-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：29)；

苯甲酰-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：30)；

和

Adamtyl-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：31).

在一个实施方案中，肽是Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY。

在一个实施方案中，肽是Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)R(2-6二F)Y。

在一个实施方案中，肽选自：

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY(SEQ ID NO：26)；

GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：32)；

FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQID NO：33)；

NKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPR(SEQID NO：34)；和

QHRYQQLGAGLKVLFKKTHRILRRLFNLAK(SEQ ID NO：35)。

在一个实施方案中，肽与选自下述的肽基本同源：

在一个实施方案中，所述肽选自：

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY(SEQ ID NO：26)；

GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：32)；

FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQID NO：33)；

NKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPR(SEQID NO：34)；和

QHRYQQLGAGLKVLFKKTHRILRRLFNLAK(SEQ ID NO：35)。

″基本同源″表示在肽序列的定义长度上至少约85％(优选至少约90％，和更优选至少约95％或最优选至少约98％的氨基酸残基匹配。可通过使用可从序列数据库中获得的标准软件(例如可从ncbi.nlm.nih.gov的国家癌症生物技术信息中心获得的BLAST程序)比较序列来鉴定基本同源的序列。

在一个实施方案中，肽的特征在于其在体外测定中显示了生物活性。在一个实施方案中，生物活性是抗增生、抗炎症、抗癌、抗病毒，或生物活性是代谢疾病相关的(见例如实施例7)。

在一个实施方案中，复合物的特征在于其包含非天然氨基酸。在一个实施方案中，复合物的特征在于肽不能在活生物中产生。

本文的术语″抗体″以最广义用于单特异性抗体并涵盖多种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们展示期望的抗原结合活性。

″抗体片段″指非完整抗体的分子，所述分子包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab’-SH，F(ab′)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)。

本文中使用的术语“结合地高辛配基的单特异性抗体”指仅与(强心苷)地高辛配基或其衍生物(例如地高辛、洋地黄毒苷)特异性结合，但不与其他(不同)抗原(例如蛋白抗原，例如HER2或IGF-1R)特异性结合的抗体。

本文中使用的术语“结合地高辛配基的双特异性抗体”指与(强心苷)地高辛配基或其衍生物(例如地高辛、洋地黄毒苷)特异性结合，但也与其他(不同)抗原(例如蛋白抗原，例如HER2或IGF-1R)特异性结合的抗体。

用于本文的目的，“受体人框架”是这样的框架，其包含源自如下定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与其相同的氨基酸序列，或其可包含氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

术语″嵌合″抗体指下述抗体，其中重和/或轻链的部分源自特定来源或物种，而重和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。有5种主要的抗体类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应不同免疫球蛋白类的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

本文中使用的术语a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合的“复合物”，指基于抗体-抗原相互作用由抗体和地高辛配基(其与本发明的肽缀合)形成的非共价结合的复合物。

活性剂(例如药物制剂)的″有效量″指在必需的剂量和时间段下有效获得期望的治疗或预防结果的量。

本文的术语“Fc区”是用于定义至少包含部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-端区域。术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外指出，在Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，又称EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中所述。

″框架″或″FR″指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由4个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般以下述序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有包含如本文定义的Fc区的重链的抗体。

术语″宿主细胞″，″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″可互换使用，指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括″转化体″和″经转化的细胞，″其包括原代经转化的细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可与亲本细胞不完全相同，并可包含突变。本文中包括突变体后代，其具有与在原始经转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物活性。

“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般地，所述序列亚组是在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是在Kabat等人，上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是在Kabat等人，上文中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本所有的至少一个，和一般两个可变结构域，其中所有或基本所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指经过人源化的抗体。

本文中使用的术语“高变区”或“HVR，”指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构上确定的环(“高变环”)的每个区域。一般地，天然四链抗体包含6个HVR；3个在VH中(H1，H2，H3)，3个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处(Chothia，C.，和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutesof Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1以外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR也包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR被包含在名为缩略的CDR，或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102处(见Almagro，J.C.，和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外指出，在本文中根据Kabat等人，见上文对可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)进行编号。

本文中使用的术语″单克隆抗体″指从基本均质的抗体群中得到的抗体，即除了可能的变体抗体以外(例如包含天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的产生过程中出现，此类变体一般以少量存在)，组成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于从基本均质的抗体群中得到，而不应被理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用包含所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

将相对参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性″定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)后获得最大百分比序列同一性并且不将任何保守替换视为序列同一性的一部分，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可通过本领域技术内的多种方式实现为了测定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的合适参数，包括为了在比较序列的全长上获得最大比对所需的任意算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.授权，其源代码和用户文档已在美国版权局，Washington D.C.，20559存档，以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码编译得到。ALIGN-2程序应在包括数字UNIXV4.0D的UNIX操作系统上编译使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且没有变动。

在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A相对、与或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(备选地可表述为给定的氨基酸序列A具有或包含相对、与或针对给定的氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性)：

100乘以分数X/Y

其中X是通过ALIGN-2的序列比对程序在该程序的A和B的比对中被评分为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对B的％氨基酸序列同一性不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非特别另外指出，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值是如在先前段落中描述的使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语″药物制剂″指这样的制剂，其处于允许其中含有的活性成分的生物活性有效的形式，且其不含有对将接受所述制剂的对象有不可接受的毒性的额外成分。

“可药用的载体”指除了活性成分以外的药物制剂中的成分，其对对象无毒性。可药用的载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

本文中使用的“治疗(treatment)”(及其语法变化例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指为了改变受治疗的个体的自然过程的临床干预，可为了预防或在临床病理过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和病情，和缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域一般具有类似的结构，每个结构域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以筛选互补VL或VH结构域的文库(见例如，Portolano，S.，等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.，等人，Nature352(1991)624-628)。

本文中使用的术语″载体″指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。术语包括自我复制核酸结构的载体，以及掺入引入其的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称作“表达载体”。

组合物和方法

在一个方面，本发明部分基于复合物a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合；及其药物组合物。在某些实施方案中，提供了结合地高辛配基的抗体。本发明的抗体可用于，例如诊断或治疗癌症、代谢或炎性或病毒疾病。

单特异性抗地高辛配基抗体及与由5-60个氨基酸组成的肽缀合的地高辛配基的示例组合物

在一个方面，本发明部分基于复合物a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合。

抗体亲和力

本文中使用的，术语“结合”或“结合...的”或“特异性结合...的”抗体可互换使用，指在体外测定中，优选在使用纯化的野生型抗原的等离子共振测定中(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)抗体与肿瘤抗原表位的结合。通过术语ka(抗体/抗原复合物中抗体的缔合速率常数)，k_D(解离常数)，和K_D(k_D/ka)定义结合亲和力。结合或特异性结合表示10^-8M或更低，优选10^-8M至10^-13M(在一个实施方案中10^-9M至10^-13M)的结合亲和力(K_D)。因此，根据本发明的结合地高辛配基的抗体以10^-8mol/l或更低，优选10^-8M至10^-13M(在一个实施方案中10^-9M至10^-13M)的结合亲和力(K_D)特异性结合地高辛配基。

抗地高辛配基抗体

可根据例如在Hunter，M.M.，等人，J.Immunol.129(1982)1165-1172中所描述的产生特异性结合强心苷地高辛、洋地黄毒苷和地高辛配基的抗体。此类抗体的一个实例是以高亲和力(KD＝9nM)结合强心苷地高辛、洋地黄毒苷和地高辛配基的单克隆抗体26-10(Schildbach，J.F.，等人，J.Biol.Chem.268(1993)21739-21747；Burks，E.A.，等人，PNAS94(1997)412-417)。

为了制备用于免疫的免疫原，例如地高辛或地高辛配基可与人血清白蛋白缀合(地高辛-HAS；地高辛配基-HSA)。也经常使用与KLH(匙孔血蓝蛋白)缀合的地高辛配基或地高辛-3-CMO(CMO＝(O-羧甲基)肟)。制备地高辛配基免疫原的其他方法在例如US4469797中描述。得到的抗体常常结合强心苷地高辛，洋地黄毒苷和地高辛配基(即它们显示交叉反应性)。

结合地高辛配基的典型抗体包括单克隆抗体26-10，单克隆抗体21H8(Abcam货号ab420)；单克隆抗体1.A2.1(Santa Cruz货号sc-70963)，单克隆抗体(1.71.256Roche Applied Science货号11333062910)。

嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。在例如美国专利号4,816,567；和Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81(1984)6851-6855)中描述了某些嵌合抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类例如猴子的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类从亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基替换为来自非人抗体(例如，得到HVR残基的抗体)的相应残基，例如以恢复或改善抗体的特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro，J.C.，和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并在例如Riechmann，L.，等人，Nature332(1988)332-327；Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337，7,527,791，6,982,321，和7,087,409；Kashmiri，S.V.，等人，Methods36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重修(resurfacing)”)；Dall’Acqua，W.F.，等人，Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn等人，Methods36：61-68(2005)和Klimka，A.，等人，Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述FR改组的“受引导的选择”法)中进一步描述。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最适”法选择的框架区(见例如，Sims，M.J.，等人J.Immunol.151(1993)2296-2308)；源自特定亚组的轻或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(见例如，Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.，等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如，Almagro，J.C.，和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR文库的框架区(见例如，Baca，M.，等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.，等人，J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。

人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可使用本领域已知的多种技术产生人抗体。在van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374和Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中一般地描述了人抗体。

可通过对转基因动物施用免疫原制备人抗体，所述转基因动物已被改造以响应抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整的抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，所述基因座替换了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合进入动物的基因组中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已失活。有关从转基因动物中得到人抗体的方法综述见Lonberg，N.，Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。又见，例如，描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述

技术的美国专利号5,770,429；描述K-M

技术的美国专利号7,041,870，和描述

技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。通过此类动物产生的完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。

也可通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述(见例如，Kozbor，D.，J.Immunol.，133(1984)3001-3005；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)，第51-63页；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。在Li，J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)3557-3562中也描述了通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方法包括在例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，Xiandai Mianyixue26(2006)265-268(描述了人-人杂交瘤)中描述的方法。在Vollmers，H.P.，和Brandlein，S.，Histology and Histopathology20(2005)927-937，以及Vollmers，H.P.，和Brandlein，S.，Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(Trioma技术)。

也可通过分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。然后可将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。下面描述从抗体文库中选择人抗体的技术。

文库来源的抗体

可通过筛选组合文库中具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于产生噬菌体展示文库和筛选此类文库中具有期望的结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。此类方法在例如Hoogenboom，H.R.，等人，Methods in Molecular Biology178(2001)1-37中综述，并在例如McCafferty，J.，等人，Nature348，552-554；Clackson，T.，等人，Nature352(1991)624-628；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597；Marks，J.D.，和Bradbury，A.，Methods in Molecular Biology248(2003)161-176；Sidhu，S.S.，等人，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee，C.V.，等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；和Lee，C.V.，等人，J.Immunol.Methods284(2004)119-132中进一步描述。

在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可如在Winter，G.，等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中描述的对其筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自经免疫的源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可选地，如Griffiths，A.D.，等人，EMBO J.12(1993)725-734描述的，可(例如从人中)克隆天然库以提供针对众多非自身和自身抗原的单一来源抗体，而无需任何免疫。最后，也可如Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.，227(1992)381-388描述的，通过从干细胞中克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CD3区并完成体外重排，来合成地制备天然文库。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936，和2009/0002360。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。

抗体变体

在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可希望提高抗体的结合亲和力和/或其他生物活性。可通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如缺失，和/或插入和/或替换抗体的氨基酸序列中的残基。可进行缺失、插入和替换的任意组合以得到最终构建体，只要最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。

替换、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸替换的抗体变体。替换诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。在标题为“保守替换”的下表中显示了保守替换。在标题为“示例性替换”的表1中提供了更多的替换变化，并参考氨基酸侧链类在下面进一步描述。可在目的抗体中引入氨基酸替换，然后筛选具有期望的活性的产物，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表：

可根据共同侧链性质将氨基酸分组：

(1)疏水：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守替换将需要交换这些类中的一种成员与另一种的成员。

一类替换变体涉及替换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步研究的所得的一种或多种变体相对于亲本抗体将在某些生物性质上(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰和/或将基本保留亲本抗体的某些生物性质。示例性替换变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用如本文描述的基于噬菌体展示的亲和力成熟技术便利地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，在噬菌体上展示变体抗体并筛选具有特定的生物活性(例如结合亲和力)的变体抗体。

可在HVR中进行改变(例如替换)，例如以改善抗体亲和力。可在HVR“热点，”即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(见例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或SDR(a-CDR)中进行此类改变，并检测所得变体VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom，H.R.，等人，Methods in Molecular Biology178(2001)1-37)中描述了通过构建和从二级文库中重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)在被选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向法，其中随机化若干HVR残基(例如，一次4-6个残基)。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，替换、插入和缺失可在一个或多个HVR中出现，只要此类改变基本不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行基本不降低结合亲和力的保守替换(例如本文提供的保守替换)。此类替换可位于HVR“热点”或SDR之外。在上面提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者未改变，或者含有不多于1、2或3个氨基酸替换。

鉴定抗体的可被靶向用于诱变的残基或区域的有用的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.，和Wells，J.A.，Science244(1989)1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电荷的残基如arg，asp，his，lys，和glu)并将其替换为中性或负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以测定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在证明对初始替换功能性敏感的氨基酸位置引入其他替换。可选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为替换候选残基被靶向或消除。可筛选变体以测定它们是否含有期望的性质。

氨基酸序列插入包括长度范围从1个残基至含有100个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶(例如用于ADEPT)或增加抗体的血清半寿期的多肽的融合。

重组方法和组合物

可使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗地高辛配基抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH(例如抗体的轻和/或重链)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了一个或多个包含此类核酸的载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已转化了)：(1)载体，其包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗地高辛配基抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含如上提供的编码抗体的核酸，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。

为了重组产生抗地高辛配基，分离例如上述的编码抗体的核酸并将所述核酸插入一个或多个载体中，用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此类核酸可使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如，美国专利号5,648,237，5,789,199,和5,840,523(又见Charlton，K.A.，Methods inMolecular Biology248(2004)245-254，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，可从细菌细胞糊状物中在可溶级分中分离抗体并可进一步纯化所述抗体。

除了原核细胞外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已被“人源化”，导致产生具有部分或完全的人糖基化模式的抗体(见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.，等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。

用于表达糖基化的抗体的合适的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可与昆虫细胞联合使用、特别用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。

也可利用植物细胞培养物作为宿主。见例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978，和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，可使用适应悬浮培养的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是被SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞，例如在Graham，F.L.，等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(例如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠干细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，例如在Mather，J.P.，等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述；MRC5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系例如Y0，NS0和Sp2/0。有关适合产生抗体的特定哺乳动物宿主细胞系的综述见例如，Yazaki，P.J.，和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology248(2004)255-268。

测定

可通过本领域已知的多种测定鉴定、筛选或表征本文提供的抗地高辛配基抗体的其物理/化学性质和/或生物活性。

药物制剂

通过混合具有期望纯度的下述抗体与一种或多种任选的可药用载剂，制备处于冻干制剂或水溶液的形式的本文描述的复合物a)结合地高辛配基的单特异性抗体，和b)地高辛配基，其中地高辛配基与由5-60个氨基酸组成的肽缀合的药物制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)，(1980))。可药用的载剂在使用的剂量和浓度上一般对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活化剂例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载剂还包括间隙药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(

Baxter International，Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)及其使用方法。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

在美国专利号6,267,958中描述了示例性冻干的抗体制剂。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的抗体制剂，后一种制剂包括组氨酸-醋酸盐缓冲剂。

本文的制剂也可含有对于所治疗的适应症必要的多于一种的活性成分，优选彼此不负面影响的具有互补活性的活性成分。此类活性成分合适地以对于计划的目的有效的量组合存在。

活性成分可包埋在，例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)中，胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳剂中。此类技术在Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.(编)(1980)中公开。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质处于成形的物品的形式，例如薄膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。可由例如通过无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

本发明的一个方面是根据本发明的药物组合物，其用于治疗代谢疾病。

本发明的另一个方面是根据本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。

本发明的另一个方面是根据本发明的药物组合物，其用于治疗炎性疾病。

本发明的另一个方面是根据本发明的复合物，其用于治疗代谢疾病。

另一个方面是根据本发明的复合物，其用于治疗癌症。

另一个方面是根据本发明的复合物，其用于治疗炎性疾病。

本发明的另一个方面是根据本发明的复合物，其用于制造治疗代谢疾病的药物。

另一个方面是根据本发明的复合物，其用于制造治疗癌症的药物。

另一个方面是根据本发明的复合物，其用于制造治疗炎性疾病的药物。

本发明的另一个方面是通过对需要此类治疗的所述患者施用有效量的根据本发明的复合物，治疗患有代谢疾病、癌症或炎性疾病的患者的方法。

制品

在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包含容器和在容器上的或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器盛有单独的组合物或与有效用于治疗、预防和/或诊断病况的另一种组合物组合的组合物，并可具有无菌接入口(例如容器可为静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗选择的病况。此外，制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。本发明的此实施方案中的制品可还包含包装说明书，指示组合物可用于治疗特定病况。可选地或另外地，制品可还包含第二(或第三)容器，所述容器包含可药用的缓冲剂，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可还包括从商业和用户立场期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、针和注射器。

序列表

尽管为了理解清楚的目的已通过阐述和实例相当详细地描述了前述的发明，不应将说明书和实例理解为限制本发明的范围。将本文引用的所有专利和科学文献的公开内容以其整体明确引入作为参考。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上面提供的一般描述，可实践多种其他实施方案。

实验程序

实施例1：分离和表征编码来自小鼠杂交瘤克隆19-11的鼠<Dig>IgG1κ的VH和VL结构域的cDNA

实施例2：mu<Dig>19-11的VH和VL结构域的人源化

实施例3：重组人源化<Dig>抗体和双特异性衍生物的组成、表达和纯化

实施例4：重组人源化<Dig>抗体、-片段和-融合蛋白与地高辛配基化的化合物的结合

实施例5：地高辛配基化的化合物的产生

实施例6：地高辛配基化的化合物与<Dig>IgG的确定复合物的产生

实施例7：地高辛配基化的肽及与<Dig>抗体的复合物保持功能

实施例8：在细胞培养实验中，地高辛配基化的抗体复合的PYY(3-36)来源的肽比PEG化PYY(3-36)来源的肽具有更好的效力

实施例9：地高辛配基化的Cy5或地高辛配基化的PYY来源的肽与<Dig>IgG的复合物的血清稳定性和血清水平

实施例10：地高辛配基化的PYY来源的肽与<Dig>IgG的复合物的体内活性

表

表1：鼠“野生型”DIG-IgG和重组<Dig>衍生物与不同地高辛配基化的抗原的结合亲和力

表2：未修饰的和地高辛配基化人源肽的细胞毒性效力

表3：未修饰的和地高辛配基化的和复合的荧光团Cy5的荧光

表4：在cAMP测定中PYY衍生物的体外生物活性

表5：未复合的和抗体复合的Dig-荧光团和Dig-肽的PK参数

实施例1a：

抗Dig抗体

可如例如在Hunter，M.M.，等人，J.Immunol.129(1982)1165-1172中描述的产生特异性结合强心苷地高辛、洋地黄毒苷和地高辛配基的抗体。此类抗体的一个实例是单克隆抗体26-10。26-10抗体以高亲和力(KD＝9nM)结合强心苷地高辛、洋地黄毒苷和地高辛配基(Schildbach，J.F.，等人，J.Biol.Chem.268(1993)21739-21747；Burks，E.A.，等人，PNAS94(1997)412-417)。

通过应用这些方法和使用缀合人血清白蛋白的地高辛用于免疫，我们生成了单克隆鼠<Dig>抗体杂交瘤克隆19-11。

实施例1b：

分离和表征编码来自小鼠杂交瘤克隆19-11的鼠<Dig>IgG1κ的VH和VL结构域的cDNA

设计、产生、优化和表征重组<Dig>抗体、抗体片段和融合蛋白的先决条件是获得蛋白质和(DNA)序列信息。因此，从杂交瘤克隆19-11中获得鼠<Dig>抗体的VH和VL结构域的此信息。需要随后进行的实验步骤是(i)从产生<Dig>的19-11杂交瘤细胞中分离RNA，(ii)将此RNA转化为cDNA，然后转化为含有VH和VL的PCR片段，和(iii)将这些PCR片段整合进入质粒载体用于在大肠杆菌中增殖并测定其DNA(和推断的蛋白质)序列。在PCT/EP2010/004051中描述了同此描述的实验步骤的更多细节。

从19-11杂交瘤细胞中制备RNA：

应用Rneasy试剂盒(Qiagen)从5x10e6个表达抗体饿杂交瘤细胞(克隆19-11)中制备RNA。简言之，在PBS中洗一次沉淀的细胞，沉淀细胞，随后在500μl RLT-Puffer(+β-ME)中重悬细胞以裂解。使细胞通过Qiashredder(Qiagen)以完全裂解细胞，然后如制造商手册描述的进行基质介导的纯化程序(ETOH，RNeasy柱)。在最后的洗涤步骤后，在50ul无RNA酶的水中从柱上回收RNA。通过定量经1∶20稀释的样品的A260和A280测定回收的RNA的浓度。通过在甲酰胺-琼脂糖凝胶上的变性RNA凝胶电泳(见Maniatis手册)分析分离的RNA样品的完整性(品质、降解程度)。这些RNA凝胶电泳的实例，其显示了代表完整的18S和28S核糖体RNA的离散的带。这些带的完整性(以及约2∶1的强度比)指示RNA制品的质量良好。将从19-11杂交瘤中分离的RNA以等分试样冷冻并贮存在-80℃下。

通过RACE PCR产生编码19-11VH和VL的DNA片段：

通过应用FirstChoice Kit(Ambion)试剂盒，使用描述的用于标准5′-RLM RACE方案的反应，从19-11RNA制剂中制备用于随后的(RACE-)PCR反应的cDNA。使用Pwo DNA聚合酶用于PCR反应。为此，应用10μg19-11RNA或对照RNA(来自小鼠胸腺)，并如描述的处理RNA以整合5′RACE接头。我们不需要应用“外部PCR”反应，而直接进行“内部PCR”：这涉及组合引物对，所述引物对由5′RACE内部引物(来自试剂盒)和C-κ或CH1特异性引物组成。用于扩增VL区的cκ的引物序列是5’-TTTTTTGCGGCCGCCctaacactcattcctgttgaagctc-3’。用于扩增VH区的CH1的引物序列是5’-TTTTTTGCGGCCGCGTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATCC-3’。对于这些引物组合，60℃的退火温度是合适的，并且应用55和65℃之间的温度/(梯度PCR)进行PCR(94℃0.5分钟，55-65℃1分钟-72℃1分钟，35个循环，通过在72℃延伸10分钟完成)。通过从19-11RNA得到的离散的600bp至800bp DNA片段的出现反映含有抗体VH或VL区的DNA片段的成功的特异性扩增。这些DNA片段含有<Dig>杂交瘤19-11的VH和VL的编码序列。

将编码19-11VH和VL的DNA片段克隆进入质粒并测定其DNA和蛋白质序列：

通过琼脂糖凝胶提取分离编码VH和VL的PCR片段，并随后通过标准分子生物学技术(Maniatis手册)进行纯化。通过准确地遵照制造商的说明书应用pCR bluntII topo试剂盒(Invitrogen)将Pwo产生的纯化的PCR片段插入载体pCR bluntII topo中。将Topo-连接反应物转化进大肠杆菌Topo10单次感受态细胞中。之后，将LB-卡那霉素琼脂板上的菌落鉴定为含有载体的大肠杆菌克隆，所述载体具有含有VL-或VH的插入片段。随后从这些菌落制备质粒，并且通过用EcoRI限制性消化证实载体中存在期望插入片段。因为载体骨架含有位于插入片段每侧的EcoRI限制性识别位点，通过具有约800bp(对于VL)或600bp(对于VH)的EcoRi可释放的插入片段定义含有插入片段的质粒。通过对VH和VL的多个克隆进行自动化DNA测序，确定19-11VL和VH的DNA序列和推断的蛋白质序列。<Dig>克隆19-11的VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：36中，<Dig>克隆19-11的VH的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：37中。

实施例2：

mu<Dig>19-11的VH和VL结构域的人源化

抗体序列人源化的目的是为了产生保留鼠源的原始抗体的完全的功能性，但不含(或仅含极少或不相关的)被人免疫系统视为“外源的”序列或结构。可解决此挑战的不同程序是可获得的并已发表(Almagro，J.C.，和Fransson，J.，Frontiers in Bioscience13(2008)1619-1633；Hwang，W.Y.K.，和Foote，J.，Methods36(2005)3-10)。通过二级和三级(和四级)结构确定抗体可变区的功能性，但是这些结构的形成是基于VH和VL(以及相邻和相互作用的实体)的一级序列。因此，人源化的主要挑战是(完全)保留结构决定的功能性，尽管需要在一些位置改变一级蛋白质序列。因此，有关抗体的功能重要区(CDR区)的结构的知识对支持人源化非常重要。为产生人源化的mu<Dig>19-11来源的变体，我们组合了以下实验室湿实验和计算机程序。从(i)计算机预测mu<Dig>19-11的抗原结合位点开始，我们能够(ii)计算机预测具有高度人相似性和高概率保留完整功能性的hu<Dig>变体。最后(iii)我们实验测定了具有和不具有抗原的<Dig>抗体(片段)的(X-射线)结构，以验证和改进我们的计算机模型。在PCT/EP2010/004051中描述了同此描述的设计参数和实验步骤的更多细节。

mu<Dig>19-11的抗原结合位点的计算机建模：

我们的用于mu<Dig>19-11Fv区的计算机结构模型的基础是从实验测定的VH和VL mRNA序列推断的蛋白质序列。通过鼠抗体的Fv结构域的同源性建模与能量最小化组合，计算机产生了由这些序列编码的蛋白质的结构模型。为此，在PDB(蛋白质数据库)中分别检索了用于同源性建模的CDR和框架序列的同源性。对于每个CDR和对于框架，叠加更多的同源物结构。随后从轻和重链二者的不同部分构建模型，随后为复合物的(能量)最小化。从我们的同源性建模程序得到的<Dig>19-11Fv区的结构模型显示，预测的结构的一个非常特别的特征是明显的腔，所述腔似乎深深地延伸进VH-VL界面中。形成此窄腔的主要决定簇是VH的长CDR3环。腔的内部排列有甲硫氨酸(较深的残基)，2个丝氨酸，2个脯氨酸，以及几个酪氨酸(墙侧面)。此抗体识别的抗原地高辛配基以半抗原样的方式结合进入深腔。

在抗原存在下结晶和X-射线结构测定鼠抗Dig Fv区的结合区：

为能够进一步优化抗地高辛配基抗体的人源化VH和VL序列，我们实验测定了亲本(鼠)抗体的结构。为此，应用本领域熟知的方法(木瓜蛋白酶消化)，通过用蛋白酶消化纯化的IgG产生Fab片段。通过蛋白质A层析从剩余的Fc-片段中分离Fab片段(去除Fc)，之后对所述Fab片段进行大小排阻层析(Superdex200HiLoad120ml16/60凝胶过滤柱，GEHealthcare，Sewden)以去除蛋白质片段。为了结晶，将在20mM His-HCl，140mM NaCl，pH6.0中的经纯化的Fab和Cy5标记的地高辛配基(DIG-3-cme-dea-Cy5＝DIG-Cy5/粉末)与地高辛配基化的荧光染料Cy5(Dig-Cy5)复合。在结晶设置前浓缩蛋白质溶液。为了形成复合物，将DIG-Cy5溶解在20mM His-HCl，140mM NaCl，pH6.0中并添加至与浓缩的蛋白质溶液5∶1的最终摩尔比。在混合了1μl蛋白质溶液(24mg/ml)和含有60％(v/v)2-甲基-1，3-丙二醇(MPD)/0.1M醋酸钠pH4.6/5mM CaCl₂的1μl池液后，使用悬滴蒸汽扩散法在25℃得到与DIG-Cy5复合的鼠Fab的结晶。在液氮中速冻晶体，晶体无需任何其他的低温保护。在2009年9月11日在X06SA(SLS，Villingen，Switzerland)上收集与DIG-Cy5复合的鼠Fab的衍射数据。用XDS(Kabsch，J.Appl.Cryst.21(1993)916-924)整合和测量数据。复合物晶体属于P42212空间群，其中

c＝123.696，α＝β＝γ＝90°，并且衍射分辨率为

使用BALBES程序(见Long，F.，等人，Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.64(Pt.1)(2008)125-132)，通过产生基于具有PDB ID3cfd，2a6d，2a6j的结构的检索模型，通过分子置换解析结构(Debler，E.W.，等人，Science319(2008)1232-1235；Sethi，D.K.，等人，Immunity24(2006)429-438)。在不对称单位中可放置共2个Fab分子。完成最初模型并通过使用COOT程序(Emsley，P.，和Cowtan，K.，Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60(Pt.12Pt.1)(2004)2126-2132)手工建模并使用PHENIX程序(Zwart，P.H.，等人，Methods Mol.Biol.426(2008)419-435)精化来精化。在第一轮精化后，DIG-Cy5的DIG部分出现差异电子密度。从PDB ID1lke得到DIG的模型(Korndorfer，I.P.，等人，J.Mol.Biol.330(2003)385-396)，并通过在线工具PRODRG(Schuttelkopf，A.W.，和van Aalten，D.M.，Acta Crystallogr.D Biol.Crystalogr.60(Pt.8)(2004)1355-1363)产生DIG的精化参数。在最终精化步骤中将DIG模型置于电子密度中。使用PYMOL程序制图(DeLano，W.L.，The PyMOLMolecular Graphics System(2008))。

在PCT/EP2010/004051中详细描述了实验结构测定的结果。结构显示，得到的晶体形式在不对称单位中含有2个独立的DIG-Cy5：抗DIG Fab复合物，并可建立2种复合物的原子模型。DIG-Cy5的DIG部分在不对称单位的2个Fab分子中都井然有序，尽管其似乎在不对称单位的一个分子中比在另一个分子中结合地更紧。DIG结合在位于CDR中间的L链和H链的界面的口袋中。DIG的O32原子指向口袋底部，而与Cy5的接头位于外部并指向溶剂中。除了DIG以外，对于Cy5的接头的第一个C原子上可见明显的2F_O-F_C电子密度(图45b中的组B)。由于接头的灵活性，在电子密度图中看不到接头的剩余部分和Cy5。此无序提示接头不附着于蛋白质，并且足够长以允许不同性质和大小的分子(例如染料、siRNA和其他)附着于DIG而不影响抗体识别DIG。有趣地是，结合口袋不是如预期的疏水分子如DIG完全疏水的，而是含有一些正电荷电势。结合口袋上排列了4个酪氨酸残基(57，59，109，110)以及重链的A33，W47，P61，P99和M112。来自轻链的残基Q89，S91，L94，P96和F98参与口袋形成。可能的氢键伙伴，轻链的N35和Y36，形成口袋的底部但不被DIG触及。只有一个直接的氢键参与DIG结合，并在DIG的O32和轻链的Q89之间形成。另外2个氢键不是直接的而是通过水分子介导。O12与Y109的羰基氧和重链的S35的侧链相互作用。第四个氢键在O14和S91(L链)的骨架羰基氧之间形成，但也是通过水分子介导的。比较不对称单位的2个分子中氢键的数目和长度提示，在第二个复合物中，DIG不能完全进入口袋。在一个分子中，DIG部分相对深地陷入口袋并形成4个氢键。第二个DIG结合地更松，其不与在另一个分子中进入口袋一样深，并仅形成比在另一个分子中弱的3个氢键。

保留完全功能性的mu<Dig>19-11人源化变体的确定：

分辨率为的结合区的实验测定结果使得能够表征配体与其抗体的结合模式。其还证明结构与我们通过一级序列的计算机分析预测的结构模型大体相似。可获得的亲本抗体可变区的计算机模建结构和实验测定的“真实”结构(有关更多细节见PCT/EP2010/004051)是详细的建模和通过重组地高辛配基结合模块的蛋白质加工而进一步改善的先决条件。通过应用基于CDR移植和引入调节结合特异性和亲和力的额外突变的程序确定代表期望的人源化VH和VL结构域的氨基酸序列。此程序的基本原理是人种系中与小鼠序列不同的每个氨基酸的“分值”的属性。通过氨基酸变化对抗原识别能力或对复合物稳定性的假定影响确定分数。基于其较低的分数及其相对高的使用选择人种系。在此人源化程序中包括TEPITOPE分析(预测T细胞表位)，目的是在得到的人源化分子中具有很少至没有T细胞表位。当分数太高时(指示高概率的负干扰)，通过此程序最初确定的“人”序列可能需要被(原始的)鼠序列替换。这是CDR中或在CDR序列的周围区中的氨基酸变化最常需要的。在一些情况下，不仅在CDR中而且在框架中也需要“回复突变”为鼠残基以保留稳定性和功能性。我们选择的得到的hu<Dig>变体是基于人框架VH3_11和VL1_39组合，并具有高度类人性。对于VL，不需要在人VK1_39框架和IGKJ4-01/02种系的人j元件中整合任何回复突变。这导致高人特征和相对低的TEPITOPE警报数。VH变体源自人VH3_23种系和人J IGHJ6-01-2。变体J建立在人VH3_11种系上。此外，使用我们的评分方法，我们能够在CDRS中引入一个人氨基酸以增加人特征和减少TEPITOPE警报数。人源化VH的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：38中，而人源化VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：39中。

产生具有增加的亲和力的地高辛配基结合模块：

对抗地高辛配基抗体的人源化VH和VL序列进行了其他优化以产生对地高辛配基具有甚至更高的亲和力的模块。基于实验测定的和计算机计算的预测的结构(见上文，基于结构建模，没有实验结构测定)，我们鉴定了3个位置，其中改变可能影响亲和力。它们位于VH结构域的(Kabat位置)Ser49，Ile57和Ala60。用Ala替换氨基酸VHSer49，用Ala替换VHIle57和用Pro替换VHAla60产生相应的抗体衍生物。可使用标准蛋白质A和大小排阻技术(见实施例3，“重组人源化<Dig>抗体、-片段和双特异性-融合蛋白的组成、表达和纯化”)表达和纯化由此序列组成的结合实体。相比人源化亲本分子，得到的分子是完全功能性的且展示对地高辛配基的改善的亲和力。这通过表面等离子共振(BiaCore)实验证明(详见实施例4，“重组<Dig>抗体、-片段和双特异性-融合蛋白与地高辛配基化的抗原的结合”)证明。这些实验的结果证明，通过引入VH49，VH57和VH60突变，对地高辛配基的亲和力改善了约10倍。之后通过检查实验测定的Dig结合可变区的结构证实了这些位置的相关性。

实施例3：

重组人源化<Dig>抗体的组成、表达和纯化

将鼠和人源化<Dig>模块与人抗体的恒定区组合，以形成嵌合或人源化IgG或产生具有其他抗体序列的双特异性融合蛋白。产生结合Dig的人源化<Dig>IgG需要(i)为此类分子设计和确定氨基酸和核苷酸序列，(ii)在经转染的培养的哺乳动物细胞中表达这些分子，和(iii)从经转染的细胞上清中纯化这些分子。也产生了结合Dig和其他靶(例如受体酪氨酸激酶Her2或IGF1R)的双特异性衍生物，用作概念验证研究的模型系统，其中例如在以下实施例中可证明肽或荧光团的确定的复合。在PCT/EP2010/004051中描述了同此描述的实验步骤的其他细节。.

设计和确定<Dig>IgG以及结合地高辛配基和Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的氨基酸和核苷酸序列：

为了产生具有(原始的)鼠mu<Dig>19-11Fv区的结合特异性的人源化IgG，我们将上面确定的人源化VH序列依读框与IgG1的CH1-CH2-CH3的N-端融合。类似地，我们将上面确定的人源化VL序列依读框与Cκ的N-端融合。得到的hu<Her2><Dig>IgG H-和L-链的氨基酸序列已经在PCT/EP2010/004051中描述。图1中提供了结合人源化地高辛配基的IgG的示意图。

为了产生含有hu<Dig>的结合特异性以及对受体酪氨酸激酶Her2或IGF1R的特异性的双特异性抗体衍生物，我们将通过人源化VH和VL序列确定的<Dig>单链Fv模块依读框分别与以前描述的<Her2>抗体(例如US专利5,772,997)，或IGF1R抗体的H链的C-端融合。通过引入以前描述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter，Y.，等人，Nature Biotechnology14(1996)1239-1245)进一步稳定化应用的<Dig>scFv模块。得到的结合Her2或IGF1R以及地高辛配基的双特异性抗体衍生物的氨基酸和序列在PCT/EP2010/004051中描述。

<Dig>IgG以及结合地高辛配基和Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的表达：

根据制造商的说明书(Invitrogen，USA)使用FreeStyle^TM293表达系统，通过瞬时转染人胚胎肾293-F细胞表达<Dig>IgG和双特异性抗体衍生物。为此，在携带原核和真核选择标记物的表达载体中构建对应的双特异性抗体的轻和重链。这些质粒在大肠杆菌中扩增、纯化，随后用于瞬时转染。使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编)，John Wiley & Sons，Inc中描述的标准细胞培养技术操作细胞。在FreeStyle^TM293表达培养基中于37℃/8％CO2下培养悬浮FreeStyle^TM293-F细胞，并在转染当天以1-2x10⁶活细胞/ml的密度将细胞接种在新鲜的培养基中。在Opti-MEM I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，使用333μl293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和1∶1摩尔比的250μg的重和轻链质粒DNA用于250ml的最终转染体积。在转染后7天，通过以14000g离心30分钟并过滤通过无菌滤器(0.22μm)澄清含有IgG或双特异性抗体的细胞培养物上清。将上清贮存在-20℃直至纯化。为测定细胞培养物上清中抗体和衍生物的浓度，应用亲和力HPLC层析。为此，在UltiMate3000HPLC系统(Dionex)上，将含有结合蛋白质A的抗体和衍生物的细胞培养物上清应用于200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并用200mMNaCl，100mM柠檬酸，pH2,5从基质上洗脱。通过UV吸光度和峰面积的积分定量经洗脱的蛋白质。纯化的标准IgG1抗体用作标准物。

<Dig>IgG以及结合地高辛配基和Her2或IGF1R的双特异性抗体衍生物的纯化：

转染表达质粒7天后，收获HEK293细胞上清。通过使用蛋白质A-SepharoseTM的亲和层析(GE Healthcare，Sweden)和Superdex200大小排阻层析，分两步从上清中纯化其中含有的重组抗体(衍生物)。简言之，将含有单特异性和双特异性抗体的澄清的培养上清应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡的HiTrap蛋白质A HP(5ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8洗脱双特异性抗体，并用0.1ml 1MTris，pH8.5中和含有蛋白质的级分。然后合并洗脱的蛋白质级分，用Amicon超离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml体积并装载于用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)。通过测定在280nm处的光密度(OD)并且以320nm处的OD作为背景校正，使用根据Pace等人，Protein Science，1995，4，2411-1423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，测定经纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。合并单体抗体级分，速冻并贮存于-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和表征。通过存在和缺乏还原剂(5mM1，4-二硫苏糖醇)下的SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色，证实DIGHu2抗体构建体和双特异性DIG构建体的均质性。根据制造商的说明使用

预制凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。在还原条件下，与IgG(以及双特异性Fv融合物)相关的多肽链在SDS-PAGE上显示了与计算的分子量类似的表观分子大小。通过蛋白质A分析了所有构建体的表达水平。在此类未优化的瞬时表达实验中，平均蛋白质产量在每升细胞培养上清6至35mg纯化的蛋白质之间。在PCT/EP2010/004051中描述了同此描述的表达和纯化步骤的更多细节。

实施例4：

重组人源化<Dig>抗体、-片段和-融合蛋白与地高辛配基化的化合物的结合

进行下述分析以评估人源化程序是否导致保留了完全结合活性的<Dig>衍生物。为此，通过表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore T100或Biacore3000仪器(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala)分析了重组<Dig>衍生物的结合性质。此系统公认用于研究分子相互作用。其允许连续实时监控配体/分析物的结合，因此允许在多种测定设置下测定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术是基于测量靠近金包被的生物传感芯片表面的折射率。折射率的变化指示由固定化的配体与溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子与表面上固定化的配体结合则质量增加，在解离的情况下质量减少。为了进行结合研究，使用胺偶联化学将捕获抗人IgG抗体固定在CM5生物传感芯片的表面上。用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳化二亚胺的1∶1混合物以5μl/分钟的流速活化流动池。如果没有另外描述，以10μg/ml在醋酸钠，pH5.0中注入抗人IgG抗体，这导致约12000RU的表面密度。以相同方式处理参考对照流动池，但仅使用载体缓冲液替代捕获抗体。注入1M乙醇胺/HCl pH8.5封闭表面。为了比较人源化蛋白质变体的结合与来自原始杂交瘤19-11的鼠<Dig>IgG的结合，如与上述抗人IgG抗体相同的方式将捕获抗小鼠IgG抗体固定在CM5生物传感芯片的表面上。为了评估重组<Dig>衍生物的功能性，用地高辛配基化的抗原测定了包括(i)人源化IgG，(ii)具有hu<Dig>二硫化物稳定的scFv的融合蛋白的重组hu<Dig>模块的结合。比较得到的结合亲和力与从中得到重组人源化模块的鼠“野生型”DIG-IgG的结合。

杂交瘤来源的鼠<Dig>19-11与人源化<Dig>IgG的比较：

如与上述相同的方式将抗小鼠IgG抗体固定在CM5生物传感芯片的表面上。以2μg/ml注射抗人IgG抗体，这导致约600RU的表面密度。在每一轮结合循环后通过以5μl/分钟注射0,85％H3PO460秒，然后以5μl/分钟注射5mM NaOH60秒以去除任何非共价结合的蛋白质进行再生。在HBS-P(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中稀释待分析的样品并以5μl/分钟的流速注射。对浓度为1至5nM之间的抗体，接触时间(缔合阶段)为3分钟。为了测量结合亲和力，以渐增浓度注射不同的地高辛配基化的抗原，对于DIG-BP4所述渐增浓度为0.3125，0.625，1.25，2.5，5和10nM。对流速为30μl/分钟的每种分子，接触时间(缔合阶段)为3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)为5分钟。所有相互作用在25℃(标准温度)下进行。在鼠<DIG>19_11的情况下，在每轮结合循环后以30μl/分钟流动注射10mM甘氨酸/HCl pH1.5的再生溶液60秒以去除任何非共价结合的蛋白质。在人源化<Dig>IgG的情况下，通过以5μl/分钟注射0,85％H₃PO₄60秒，然后5μl/分钟注入5mM NaOH60秒进行再生。以每秒1个信号的速度检测信号。这些分析的结果在表1中显示，并提示重组人源化<Dig>以与鼠亲本抗体相同的功能性和高亲和力结合地高辛配基化的化合物。发现鼠抗体对地高辛配基化的蛋白质(Dig-BP4，欧洲专利EP1545623B1)的Kd为33pM，而人源化抗体的Kd为＜76pM。类似地，发现鼠抗体对地高辛配基化的核酸(siRNA-Dig)的Kd为269pM，而人源化抗体的Kd为12nM。因此，我们推断<Dig>抗体的功能性在其人源化变体(人源化VH的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：38中，人源化VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：39中)中得到保留。

杂交瘤来源的鼠<Dig>19-11与重组人源化<Dig>-单链Fv融合蛋白的比较：

如与上述相同方式将抗小鼠和抗人IgG抗体固定在CM5生物传感芯片的表面上。在HBS-P中稀释待分析的样品并以5μl/分钟的流速注射。对于浓度为1至5nM之间的抗体，接触时间(缔合阶段)为3分钟。为了测量结合亲和力，以渐增浓度注射不同的地高辛配基化的抗原，对于DIG-BP4，此渐增浓度为0.3125，0.625，1.25，2.5，5和10nM，对于DIG-siRNA为0.018至120nM之间。对流速为30μl/分钟的每种分子，接触时间(缔合阶段)为3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)为5分钟。所有相互作用在25℃(标准温度)下进行。在每轮结合循环后以30μl/分钟流动注射10mM甘氨酸/HCl pH1.5的再生溶液60秒以去除任何非共价结合的蛋白质。当使用RNA酶作为配体时，通过以5μl/分钟注射0,85％H₃PO₄60秒，然后以5μl/分钟注射5mM NaOH60秒进行再生。以每秒1个信号的速度检测信号。这些分析的结果在表1中显示，并提示存在于应用的双特异性融合蛋白(Her2-Dig)中的重组人源化<Dig>scFv模块以与鼠亲本抗体相同的功能性和高亲和力结合地高辛配基化的蛋白质和核酸。发现鼠抗体对地高辛配基化的蛋白质(Dig-BP4)的Kd为33pM，而人源化单链Fv的Kd为68pM。类似地，发现鼠抗体对地高辛配基化的核酸(siRNA-Dig，见实施例11)的Kd为269pM，而人源化单链Fv的Kd为35nM。因此，我们推断野生型抗体的功能性也在存在于双特异性融合蛋白中的重组人源化<Dig>scFv模块中得到保留。

表1：鼠“野生型”DIG-IgG和重组<Dig>衍生物对不同的地高辛配基化的抗原的结合亲和力

抗体衍生物	对DIG-BP4的亲和力
		鼠DIG-IgG 19-11	33pM
人源化DIG-IgG	＜76pM
		人源化<Dig>-单链Fv融合蛋白	68pM

进行了进一步的SPR研究，其中比较了人源化<DIG>-IgG，IGF1R-DIG和鼠<DIG>M-19-11在与单体地高辛配基化的蛋白DIG-肌球蛋白的结合中的结合亲和力。人源化<DIG>-IgG和二硫化物稳定的<DIG>scFv衍生物对DIG-Myo的结合亲和力是可比较的(～15-25nM)，但鼠<DIG>M-19-11的亲和力明显更好。人源化<DIG>-IgG(＜76pM，见表1)和二硫化物稳定的<DIG>scFv对DIG-BP4的较高的亲和力(68pM，见表1)很可能是由于与DIG-BP4结合的亲合性作用，因为蛋白质DIG-BP4在其表面携带多于一个DIG分子。

实施例5：

地高辛配基化的化合物的产生

为了产生用于与结合地高辛配基的抗体复合的化合物，必须(i)通过合适的接头将地高辛配基与化合物偶联和(ii)确保偶联以允许化合物保留其功能性的方式进行。我们制备的作为评估这些功能性的实例的化合物包括地高辛配基化的荧光团(Dig-Cy5)和地高辛配基化的肽衍生物组。偶联程序和试剂在图2A中图示。Dig-Cy5和地高辛配基化的PYY肽衍生物的组成分别在图2B和图2C中显示。我们用作评估此技术的实例的肽为蜂毒肽，FALLLv1，FALLv2和Fam5b。后三种肽已在人来源的生物活性肽的筛选中被鉴定。这些肽可通过添加氨基端半胱氨酸与地高辛配基偶联。

这些肽的氨基酸序列如下：

蜂毒肽：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：32)

FALLv1：FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID NO：33)

FALLv2：NKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPR(SEQ ID NO：34)

Fam5b：QHRYQQLGAGLKVLFKKTHRILRRLFNLAK(SEQ ID NO：35)

我们用作评估此技术的实例的另一种肽衍生物是含有非天然氨基酸的PYY衍生物。在本文中，将PYY的此肽衍生物称为moPYY(用于经修饰的PYY衍生物)。

此肽moPYY的序列如下：

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY(SEQ ID NO：26)

此肽可通过第2位赖氨酸的ε-氨基与地高辛配基偶联。

下面列出可用作评估此技术的实例的其他PYY来源的肽衍生物：

IK-Pqa-RHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO：2)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：3)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(m-)Y (SEQ ID NO：4)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-I)Y (SEQ ID NO：5)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-5二氟)Y (SEQ ID NO：6)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2-6二氟)Y (SEQ ID NO：7)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2-6二甲基)Y (SEQ ID NO：8)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RF(O-CH3) (SEQ ID NO：9)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RF (SEQ ID NO：10)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-NH2)Phe (SEQ ID NO：11)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-F)Phe (SEQ ID NO：12)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-CH2OH)Phe (SEQ ID NO：13)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(4-CF3)Phe (SEQ ID NO：14)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3-F)Phe (SEQ ID NO：15)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2，3.4，5，6-五氟)Phe (SEQ ID NO：16)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(3.4-二氯)Phe (SEQ ID NO：17)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RCha (SEQ ID NO：18)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)RW (SEQ ID NO：19)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(1)Nal (SEQ ID NO：20)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQ(N-甲基)R(2)Nal (SEQ ID NO：21)；

IK-Pqa-RHYLNLVTRQR-C-α-Me-Tyr (SEQ ID NO：22)；

IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：23)；

INle-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：24)；

Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)R(2-6二氟)Y (SEQ ID NO：25)；

戊基-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：27)；

三甲基乙酰-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：28)；

环己基-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：29)；

苯甲酰-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：30)；

和

Adamtyl-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY (SEQ ID NO：31).

我们用作评估此技术的实例的另一种化合物是荧光化合物Cy5。此化合物的组成显示在图2B中。此化合物可通过NHS-酯化学与地高辛配基偶联。

具有用于地高辛配基缀合的氨基端半胱氨酸的肽的产生：

根据已建立的方案(FastMoc0.25mmol)在自动化Applied BiosystemsABI433A肽合成仪上使用Fmoc化学进行肽合成。在迭代循环中，通过顺序偶联相应的Fmoc-氨基酸组装肽序列。在每个偶联步骤中，通过用N-甲基吡咯烷酮中的20％哌啶处理树脂去除N-端Fmoc基团。应用由在DMF中的HBTU/HOBt(每种1mmol)和DIPEA(2mmol)活化(45-60分钟涡旋)的Fmoc-受保护的氨基酸(1mmol)进行偶联。在每个偶联步骤后，通过用在NMP中的Ac2O(0.5M)，DIPEA(0.125M)和HOBt(0.015M)混合物处理(10分钟涡旋)对未反应的氨基加帽。在每个步骤之间，用N-甲基吡咯烷酮和DMF充分洗涤树脂。在自动化双偶联中完成受空间阻碍的氨基酸的掺入。为此目的，用1mmol活化的构件处理2次树脂，在偶联循环之间没有加帽步骤。在完成靶序列后，使用标准氨基酸偶联条件将Fmoc-12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(TEG-间隔子)与FAM5B和INF7肽偶联。随后，将Fmoc-Cys(Trt)-OH附着于所有肽序列的氨基端(FAM5B和INF7具有间隔子，蜂毒肽，FALLv1和FALLv2没有间隔子)。在最终的Fmoc去保护后，将肽树脂置于玻璃滤器中并用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(19mL∶0.5mL∶0.5mL)的混合物处理2.5小时。过滤切割溶液，并通过加入冷的(0℃)二异丙醚(300mL)沉淀肽以产生无色固体，所述固体用二异丙醚反复洗涤。在醋酸/水混合物中重新溶解粗产物，冻干，并随后通过应用含有0.1％TFA的乙腈/水梯度的制备型反相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化。

具有氨基端半胱氨酸的肽与地高辛配基的偶联：

向0.1M KPO₄缓冲液(1mL)中的相应的半胱氨酸修饰的肽(6-20mg)的溶液添加等摩尔量的溶于100μL DMF的地高辛配基-3-羧基-甲基-乙基酰胺马来酰亚胺。在环境温度下小心颠倒反应混合物2-20h，过滤，并通过应用含有0.1％TFA的乙腈/水梯度的制备型反相HPLC(MerckCromolith prep RP-18e柱，100x25mm)分离靶化合物。在冻干后，得到作为无色固体的地高辛配基-肽缀合物。蜂毒肽的分子量是2949.64，得到的肽-Dig缀合物的分子量是3520.33。FALLv1肽的分子量是4710.59，得到的肽-Dig缀合物的分子量是5384.43。FALLv2肽的分子量是4791.76，得到的肽-Dig缀合物的分子量是5465.59。Fam5b肽的分子量是3634.37，得到的肽-Dig缀合物的分子量是5410.47。INF7肽的分子量是2896.25，得到的肽-Dig缀合物的分子量是3466.94。我们将以等分试样溶解在H2O中的缀合物贮存于-20℃直到与抗体复合。图7A图示了肽-地高辛配基缀合物的组成。

PYY(3-36)-肽衍生物的地高辛配基化形式的产生：

通过自动化固相合成结合树脂的肽序列Ac-IK(Dde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM树脂得到PYY(3-36)-肽衍生物(被称为moPYY)。根据已建立的方案(FastMoc0.25mmol)在自动化AppliedBiosystems ABI 433A肽合成仪上使用Fmoc化学进行肽合成。应用TentaGel RAM树脂(装载：0.18mmol/g；Rapp Polymers，Germany)，在迭代循环中通过顺序偶联相应的Fmoc-氨基酸(规模：0.25mmol)组装肽序列。在每个偶联步骤中，通过用在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的20％哌啶处理树脂(3x2.5分钟)去除N-端Fmoc基团。应用由在DMF中的HBTU/HOBt(每种1mmol)和DIPEA(2mmol)活化(45-60分钟涡旋)的Fmoc-受保护的氨基酸(1mmol)进行偶联。分别在第2、3和14位将氨基酸衍生物Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Pqa-OH，和Fmoc-N-Me-Arg(Mtr)-OH掺入合成序列。在每个偶联步骤后，通过用在NMP中的Ac₂O(0.5M)，DIPEA(0.125M)和HOBt(0.015M)的混合物处理(10分钟涡旋)对未反应的氨基加帽。在每个步骤之间，用N-甲基吡咯烷酮和DMF充分洗涤树脂。在自动化双偶联中完成受空间阻碍的氨基酸的掺入。为此，用1mmol活化构件处理2次树脂，在偶联循环之间没有加帽步骤。在完成靶序列后，将树脂转移进玻璃烧结的固相反应器用于进一步操作。

为了去除ivDde基团，将肽树脂(Ac-IK(Dde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM树脂)用DMF膨胀30分钟，随后用DMF(60mL)中的2％水合肼溶液处理2小时。在用异丙醇和DMF充分洗涤树脂后，添加Fmoc-12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(用于引入TEG-接头)(887mg，2m mmol)，HATU(760.4mg，2mmol)，HOAt(272.2mg，2mmol)和在DMF(3mL)中的2M二异丙基乙基胺(2mL，4mmol)的溶液，摇晃混合物16小时。用DMF洗涤树脂并用在DMF中的40％哌啶混合物切割Fmoc-基团。随后，将树脂置于玻璃滤器中并用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(19mL∶0.5mL∶0.5mL)的混合物处理2.5小时。过滤切割溶液，并通过加入冷的(0℃)二异丙醚(300mL)沉淀肽以产生无色固体，所述无色固体用二异丙醚反复洗涤。在醋酸/水混合物中重新溶解粗产物，冻干以得到无色固体状的标题化合物(337mg，0.137mmol，55％)，将其用于随后的操作，不进行进一步纯化。为了分析表征肽衍生物，我们应用以下条件并得到以下数据：分析性HPLC：t_R＝9.8分钟(Merck Chromolith PerformanceRP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA80∶20，25分钟)；ESI-MS(阳离子模式)：m/z：计算的C₁₁₅H₁₇₃N₃₅O₂₆：2461.9；所见的：1231.7[M+2H]²⁺，计算的：1231.9；821.5[M+3H]³⁺，计算的：821.6；616.4[M+4H]⁴⁺，计算的：2461.9。

地高辛配基化的肽衍生物DIG-moPYY的制备：

向在水(5mL)中的肽Ac-IK(H₂N-TEG)-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-甲基)RY(100mg，40.6μmol)溶液添加溶于NMP(1mL)的地高辛配基-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(26.6mg，48.8μmol)。添加三乙胺(13.6L，97.6μmol)并将混合物在室温颠倒2小时。随后，添加额外的溶于NMP(0.5mL)的地高辛配基-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(13.3mg，24.4μmol)和三乙胺(6.8μL，48.8μmol)，并颠倒溶液15小时。通过应用含有0.1％TFA的乙腈/水梯度的制备型反相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化粗产物以产生无色固体状Dig-PYY肽(29mg，10.0μmol，25％)。为了分析表征肽衍生物，我们应用以下条件并得到以下数据：分析性HPLC：t_R＝11.3分钟(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA80∶20，25分钟)；ESI-MS(阳离子模式)：m/z：计算的C₁₄₀H₂₀₇N₃₅O₃₂：2892，4；所见的：964.9[M+2H]²⁺，计算的：965.1。我们将地高辛配基化的肽冻干贮存于4℃直到与抗体复合。图2C显示了DIG-moPYY的结构。

地高辛配基化Cy5的产生：

为了产生地高辛配基化的Cy5，用单bac乙二胺转化DIG-羧甲基-NHS酯(DE3836656)。随后去除Boc，并允许释放的胺与Cy5-NHS酯(GEHealthcare，PA15106)反应。为了纯化DIG-Cy5，进行使用RP18柱的HPLC。洗脱液A是含有0.1％TFA的H₂O，洗脱液B是含有0.1％TFA的乙腈。在运行60分钟的洗脱期间，洗脱液B的浓度从0％增加到100％。Cy5的分子量是791.99Da。得到的Cy5-Dig缀合物的分子量是1167.55Da。我们将在PBS中的等分试样的缀合物贮存于-20℃直到与抗体复合。图2B显示了Cy5-地高辛配基缀合物的结构。

实施例6：

地高辛配基化的肽或荧光团与<Dig>IgG的确定复合物的产生

地高辛配基化的肽与结合地高辛配基的抗体和抗体衍生物的复合物可赋予有利的生物物理行为和对肽的改善的PK参数。此外，在应用双特异性抗体作为示例性概念验证复合物时，此类复合物能够将肽靶向至这样的细胞，所述细胞展示由双特异性抗体变体识别的抗原。这些复合物由1个人源化<靶>-<Dig>IgG组成，所述人源化<靶>-<Dig>IgG在其两个高亲和力Dig结合位点上结合2个(每个位点1个)地高辛配基化的肽。此类复合物的组成显示在图3中。理想地，尽管被地高辛配基化以及同时与抗体复合，肽保留良好的生物学活性。也是理想地(在双特异性靶向模块的情况下)，在复合的地高辛配基化的肽的存在下，双特异性抗体衍生物的细胞表面靶结合位点保留其结合特异性和亲和力。我们用作评估此技术的实例的一组肽为蜂毒肽，FALLLv1，FALLv2和Fam5b。后三种肽已在人来源的生物活性肽的筛选中被鉴定。可通过测定其对人肿瘤细胞系的细胞毒性作用体外评估蜂毒肽和三种人来源的肽的生物活性。此外，我们用作评估此技术的实例的另一种肽为酪酪肽或胰腺肽YY短PYY(3-36)类似物(WO2007/065808)。如果通过第2位的赖氨酸被地高辛配基化，其在下文中称为DIG-moPYY。此化合物在图2C中显示。肽moPYY及其衍生物结合并因而调节NPY受体家族的的Y2受体(Y2R)。PYY由回肠和结肠中的神经内分泌细胞响应进餐分泌。其抑制胃运动，增加消化和养分吸收效率，并已显示可能通过Y2受体介导降低食欲。因为PYY通过平衡食物摄取在能量内稳态中发挥关键作用，此肽可用于治疗II型糖尿病或肥胖(WO2007/065808)。尽管moPYY在体外有高度和特异性活性，和许多其他治疗肽一样，其在活生物中具有有限的稳定性和短血清半寿期的缺点。解决此问题的一种方法是定位PEG化(WO2007/065808)，然而已知PEG在许多情况下干扰肽的可接近性(针对受体)和活性。抗体：Dig-肽复合物的产生因此可作为PEG化的备选方案。为了产生此类复合物，必须(i)通过合适的接头将地高辛配基与肽偶联，允许肽暴露在抗体表面上方并因此保留其活性；和(ii)产生地高辛配基化的肽与<Dig>IgG的复合物，其中保留治疗肽的生物活性。我们用作评估此技术的实例的另一种化合物是Dig-Cy5(图2B)。此分子具有荧光性质，因此其活性可通过体外和体内荧光成像测定。

地高辛配基化的肽蜂毒肽，FALLv1和FALLv2与重组<靶>-<Dig>双特异性抗体的复合：

为了产生具有地高辛配基化的化合物的抗体复合物，必须(i)产生和表征地高辛配基化的肽与结合地高辛配基的抗体衍生物的复合物。这些复合物应以确定的方式形成(2个Dig-肽结合1个<Dig>IgG)。(ii)确保这些复合物保留化合物或肽的活性。使用重组<IGF1R>-<Dig>双特异性抗体和<Her2>-<Dig>双特异性抗体作为偶联反应的蛋白质组分。这些分子的组成和纯化已在上面描述。为了产生地高辛配基化的肽与<IGF1R>-<Dig>和<Her2>-<Dig>双特异性抗体的复合物，我们在H₂O中溶解(蜂毒肽，FALLv1，FALLv2)肽-Dig缀合物至1mg/ml的终浓度。使双特异性抗体在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH＝6.0缓冲液中达到1mg/ml(4,85μM)的浓度。通过上下吹吸和在室温孵育15分钟，将肽和双特异性抗体混合至2∶1的摩尔比(肽比抗体)。然后，在体外测定中使用复合物，无需进一步修饰。在Opti-MEM1(Invitrogen Madison，WI)中进行用于这些测定的复合物的稀释。将得到的复合物定义为每分子抗体衍生物携带2个Dig-肽的单体IgG样分子。通过大小排阻层析和负荷/竞争实验证实这些双特异性肽复合物的确定的组成(和2∶1的肽与蛋白质的比例)。图3提供了此类确定的抗体复合物的示意图。已经在PCT/EP2010/004051中描述了将蜂毒肽，FALL或Fam5B偶联至结合地高辛配基的实体的更多细节。

地高辛配基化Cy5与<Dig>IgG和<Dig>抗体衍生物的复合：

使用人源化和鼠<Dig>IgG或双特异性抗体衍生物作为偶联反应的蛋白质组分。这些分子的组成和纯化已在上面描述。为了产生地高辛配基化的Cy5与结合地高辛配基的抗体的复合物，我们在PBS中溶解Cy5-Dig缀合物至0.5mg/ml的终浓度。使用在由20mM组氨酸和140mM NaCl，pH6组成的缓冲液中的浓度为1mg/ml(5μM)的抗体或抗体衍生物(使用至少10mg/ml的抗体或抗体衍生物的浓度可得到最佳结果)。将地高辛配基化的Cy5和抗体(-衍生物)混合至2∶1的摩尔比(地高辛配基化的Cy5比抗体)。此程序得到具有确定组成的复合物的均质制剂。图4示例显示了负载实验的结果，其中将含有2个地高辛配基结合位点的双特异性抗体衍生物与不同化学计量比的Dig-Cy5孵育。通过在大小排阻柱上测量与抗体缔合的荧光团的荧光(650/667nm)可测定抗体的装载。这些实验的结果证明，只有在抗体含有地高辛配基结合位点时才出现负载；没有Dig结合特异性的抗体(例如Her2或IGF1R结合IgG)不结合Dig-Cy5。此外，观察到二价的结合Dig的抗体衍生物的增加的负载信号，直到Dig-Cy5比IgG的比例达到2∶1。之后，负载相关的荧光信号达到稳定。这证明1个二价抗DIG IgG结合2分子的Dig-Cy5。结合复合物非常稳定，因为其在与分析大小排阻程序相关的时间段内和实验条件下没有解离。

地高辛配基化的PYY(3-36)来源的肽(moPYY)与杂交瘤来源的鼠<Dig>IgG和人源化的重组<Dig>IgG的复合：

为了产生地高辛配基化的肽与鼠杂交瘤来源的<Dig>IgG的复合物，在12ml水中溶解mu<IgG>(来自10mM KPO4，70mM NaCl；pH7.5的冻干物)并针对20mM His，140mM NaCl；pH6.0透析以在11ml缓冲液中得到300mg(2x10^-6mol)(c＝27.3mg/ml)。在1小时内添加4份2.85mgDIG-moPYY(11.57mg，4x10-6mol，2当量)并在室温再孵育1小时。在复合反应完成后，使用大小排阻层析纯化肽-IgG复合物，所述大小排阻层析通过在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0中以2.5ml/分钟流动的Superdex20026/60GL柱(320ml)进行。以4ml级分收集洗脱的复合物，合并，并通过0.2μm滤器灭菌以得到浓度为14.3mg/ml的234mg IgG/肽复合物。以类似的方式，为了产生人源化<Dig>IgG的肽复合物，在20mMHis，140mM NaCl，pH6,0中使hu<Dig>IgG达到10.6mg/ml的浓度(9.81mg，6,5x10^-8mol在0.93ml中)。将0,57mg＝1,97x10^-7mol＝3,03当量的地高辛配基化的肽DIG-moPYY作为冻干物添加至IgG溶液。在室温孵育肽和抗体1.5小时。使用大小排阻层析去除过量的肽，所述大小排阻层析在通过在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0中以0.5ml/分钟流动的Superose6 10/300GL柱进行。以0.5ml级分收集洗脱的复合物，合并，并通过0.2μm滤器灭菌以得到浓度为1.86mg/ml的4.7mg IgG/肽复合物。将得到的肽-IgG复合物定义为单体IgG样分子。图5显示了DIG-moPYY肽与人源化和鼠<Dig>IgG的复合物的大小排阻谱。将得到的复合物定义为每一个抗体衍生物携带2个Dig-PYY衍生物的单体IgG样分子。通过大小排阻层析证实这些肽复合物的确定组成，大小排阻层析也提示没有蛋白质聚集物(图5)。通过SEC-MALS(大小排阻层析-多角度光散射)分析图6进一步证实了这些双特异性肽复合物的确定的组成(和2∶1的肽比蛋白质的比例)。对于SEC-MALS分析，将100-500μg的各个样品应用于Superdex200 10/300GL大小排阻柱，流速为0.25-0.5ml/分钟，使用1x PBS pH7.4作为流动相。使用Wyatt miniDawn TREOS/QELS检测器检测光散射，使用Wyatt Optilab rEX-检测器测量折射率。使用ASTRA软件(版本5.3.4.14)分析得到的数据。SEC MALLS分析的结果提供了有关复合物的质量、半径和大小的信息。然后将这些数据与对应的未负载的抗体的数据比较。这些实验结果证明，将DIG-moPYY暴露于结合Dig的抗体导致每一个二价IgG含有2个DIG-moPYY衍生物的复合物。因此，DIG-moPYY可与结合Dig的抗体在确定的位点(结合区)并以确定的化学计量复合。结合复合物非常稳定，因为其在与分析SEC-MALLS程序相关的时间段内和实验条件下没有解离。通过应用表面等离子共振研究表征复合物提供了复合反应产生确定的和完全负载的分子的另外证据。结合地高辛配基的抗体可与SPR芯片结合，这导致信号增加。随后添加DIG-moPYY导致进一步的信号增加，直到所有的结合位点被完全占据。在这些条件下，加入更多的DIG-moPYY不能进一步增加信号。这提示负载反应是特异性的，且信号不是由Dig-肽的非特异性粘性导致。此外，抗体的装载非常稳定，因为没有证据显示Dig-肽与抗体分离。这些实验的结果证明，将DIG-moPYY暴露于结合Dig的抗体导致具有确定大小的分子的良好确定的组成。因此，DIG-moPYY可与Dig结合抗体在确定的位点(结合区)并以确定的化学计量复合。得到的组合物在SEC上似乎是良好确定的和均质的。结合复合物非常稳定，因为其在与SEC或SPR程序相关的时间段内和实验条件下没有解离。

实施例7：

地高辛配基化的肽和具有<Dig>抗体的复合物保留了功能性

任何目标为生物活性化合物的抗体复合的技术需要解决的一个非常重要的问题是化合物的功能性应得到保留。我们描述的抗体技术对生物活性肽具有2个调节步骤。在第一步中，我们将地高辛配基与生物活性肽共价偶联。在第二步中，此地高辛配基化的肽与是大蛋白质的抗体衍生物复合。为了保留肽的活性，确保两步中经修饰的肽的活性是重要的：活性测定需要显示(i)肽的功能性在地高辛配基化后得以保留，和(ii)在地高辛配基化的肽与鼠或人源化<Dig>复合后功能性得以保留。

未修饰的和地高辛配基化的细胞毒性肽的生物活性和抗体复合的细胞毒性肽的生物活性的比较：

为了评估添加或通过地高辛配基改变蜂毒肽，FALLv1和FALLv2肽是否改变其生物活性，我们进行了体外测定。因为这些肽是细胞毒性的，其生物活性可通过监控死细胞数容易地分析。为了测量此数字，使用CytoTox-Glo测定(Promega Madison，WI)。表2列出了为了评估蜂毒肽，Fallv1和Fallv2肽及其DIG修饰的变体的生物活性而进行的这些CytoTox-Glo测定的结果。对于这些测定，在96孔板中以每孔15000细胞的密度接种H322M细胞。于37℃，5％CO2和85％湿度下在具有10％FCS，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺和NEAA混合物的RPMI中孵育细胞24小时。然后以指示的浓度将肽及其DIG修饰的变体添加至细胞。再孵育细胞48小时。在此时间后，根据制造商的说明用CytoTox-Glo测定试剂处理细胞。简言之，此测定通过培养基中存在的蛋白酶检测死细胞，所述蛋白酶切割试剂中的荧光肽。因此此测定的荧光代表死细胞。然后在InfiniteF200荧光阅读器(Tecan Austria，

)中分析96孔板。这些测定的结果(表2)显示，当与未修饰的肽相比时，地高辛配基化的肽保留了其生物活性。未修饰的肽的CytoTox-Glo测定的IC50值为3,28μM，而地高辛配基化的肽蜂毒肽为3,98μM。在与地高辛配基缀合后Fallv1和Fallv2的活性也类似地得到保留(表2)。因此，地高辛配基化不干扰生物活性。我们推断，蜂毒肽，FALLv1和FALLv2肽的地高辛配基化不干扰其生物活性。不仅与半抗原共价偶联可能影响生物活性，肽与大抗体分子的复合也可能影响其生物活性。因为IgG来源的分子是大蛋白质(肽大小的10-40倍)，不能先验地排除此类分子可能在空间上阻碍肽的可接近性并因此干扰生物活性。为了解决此问题，我们分析了细胞毒性肽FALLv1和Fam5b的肽-抗体复合物的体外活性。我们再次利用了以下事实，即这些肽对肿瘤细胞系具有细胞毒性，并因此在如上所述的细胞毒性和活力测定中检测了其功能性。这些测定的结果显示，当与结合地高辛配基的抗体衍生物复合时，地高辛配基化的肽保留了其生物活性。此外，利用双特异性抗体用于将此类肽靶向肿瘤细胞，我们可显示相比非靶向的细胞，针对靶向的细胞的增加的肽介导的细胞毒性(如在PCT/EP2010/004051中所示)。

表2：未修饰的和地高辛配基化的人来源的肽的细胞毒性效力

肽	IC50未修饰的肽	IC50地高辛配基化的肽
			蜂毒肽	3.3μM	4.0μM
FALLv2	9.3μM	7.6μM
			FALLv1	7.4μM	6.4μM

未修饰的和地高辛配基化的Cy5的荧光活性：

为了评估Cy5的地高辛配基化是否改变其荧光特征，我们比较了Cy5的激发和发射谱并将其与新生成的Dig-Cy5的光谱以及与具有双特异性抗体的复合物中的Dig-Cy5的光谱比较。表3总结了这些分析的结果：Cy5与地高辛配基的缀合，以及Dig-Cy5与抗体的复合不干扰Cy5的荧光特征。

表3：未修饰的和地高辛配基化的和复合的荧光团Cy5的荧光

分子	激发最大值(nm)	发射最大值(nm)
			Cy5	652	680
DIG-Cy5	647	674
			<DIG>DIG-Cy5复合物	657	678

未修饰的和地高辛配基化的PYY(3-36)来源的肽(DIG-moPYY)和具有<Dig>IgG的复合物的生物活性的比较：

PYY来源的肽的期望功能是结合并干扰其同宗受体NPY2的信号传递。经NPY2受体的信号传递参与和/或调控代谢过程。为了评估用地高辛配基修饰moPYY肽产生DIG-moPYY是否影响此活性，我们评估了其抑制表达NPY2受体的HEK293细胞中的毛喉素(Forskolin)刺激的cAMP积累的能力(cAMP测定)。平行地我们评估了在用于地高辛配基化的相同位置处用PEG衍生化的moPYY肽(PEG-moPYY)的活性。图7显示了为评估PYY(3-36)、其Y2受体特异性修饰的类似物moPYY，其Dig修饰的变体DIG-moPYY的生物活性，以及PEG化变体PEG-moPYY的生物活性和抗体复合的Dig-变体的生物活性而进行的cAMP测定的结果。对于cAMP激动剂测定，使用以下材料：384孔板；Tropix cAMP-Screen试剂盒；cAMP ELISA系统(Applied Biosystems，货号T1505；CS20000)；毛喉素(Calbiochem货号344270)；细胞：HEK293/hNPY2R；生长培养基：Dulbecco改良伊格尔培养基(D-MEM，Gibco)；10％胎牛血清(FBS，Gibco)，经热失活；1％青霉素/链霉素(Pen10000单位/mL：Strep10000单位/mL，Gibco)；500μg/mL G418(遗传霉素，Gibco货号11811-031)；和平板培养基：DMEM/F12w/o酚红(Gibco)；10％FBS(Gibco，货号10082-147)，经热失活；1％青霉素/链霉素(Gibco，货号15140-122)；500μg/mL G418(遗传霉素，Gibco，货号11811-031)。

为了进行测定，于第一天丢弃培养基，并用每瓶(T225)10mL PBS洗涤单层细胞。在倾倒出PBS后，使用5mL VERSENE(Gibco，货号1504006)移动细胞(37℃下5分钟)。轻轻拍打烧瓶，并合并细胞悬浮液。用10mL平板培养基冲洗每个烧瓶，并以1000rpm离心5分钟。合并悬浮物并计数。对于HEK293/hNPY2R，以2.0/105细胞/mL的密度在平板培养基中重悬悬浮液。使用多点分配器将50ml细胞(HEK293/hNPY2R-10,000细胞/孔)转移进384孔板。在37℃孵育板过夜。第二天，检查细胞75-85％汇合。允许培养基和试剂达到室温。在准备稀释液前，允许于二甲亚砜(DMSO，Sigma，货号D2650)中的刺激化合物的储液加热至32℃5-10分钟。在具有0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Calbiochem，货号410957)和0.5mg/mL BSA的DMEM/F12中制备稀释液。在刺激培养基中的最终DMSO浓度为1.1％，毛喉素浓度为5μM。将细胞板轻轻倒置在纸巾上拍掉细胞培养基。每孔放置50μL刺激培养基(每个浓度进行4个重复)。在室温孵育板30分钟，并在显微镜下检查细胞毒性。处理30分钟后丢弃刺激培养基，并添加50μL/孔的测定裂解缓冲液(Tropix试剂盒中提供的)。在37℃孵育板45分钟。将20μL裂解液从刺激板转移进来自Tropix试剂盒的经预包被的抗体板(384孔)。添加10μLAP缀合物和20μL抗cAMP抗体。在室温孵育板1小时，同时摇晃。然后用洗涤缓冲液洗板5次，每次洗涤70μL/孔。将板拍干。加入30μL/孔的CSPD/Saphire-II RTU底物/增强物溶液并在室温孵育45分钟(摇晃)。在光度计(VICTOR-V)中测量1秒/孔的信号。这些测定的结果(图7)显示，地高辛配基化的肽衍生物DIG-moPYY保留了moPYY的大部分活性。未修饰的肽的cAMP测定的IC50值为0.012nM，修饰的类似物moPYY为0.12nM，而地高辛配基化的肽DIG-moPYY为0.42nM。因此，地高辛配基化仅对生物活性具有微小影响。与大<Dig>IgG的复合对Dig-肽的活性具有一些影响，但其仍然保留了显著活性：肽-抗体复合物的cAMP测定的IC50值为2.4nM。

如在cAMP测定中证明的，其他PYY衍生物(WO2007/065808的神经肽-2受体激动剂)也显示了体外生物活性(见WO2007/065808)并且是可用于抗<DIG>/Dig-肽复合物的肽。下表中显示了体外结果，EC₅₀的总结：

表4：在cAMP测定中PYY衍生物的体外生物活性

实施例8：

在细胞培养实验中地高辛配基化的抗体复合的moPYY肽比PEG化的moPYY肽具有更好的效力

PEG与肽的共价偶联经常干扰肽的功能性并因此降低其活性。例如，通常比与其附着的肽长的PEG链可能“包裹”肽从而掩蔽关键区的可接近性。不仅与半抗原的共价偶联可能影响生物活性，肽与大抗体分子的复合也可能影响生物活性。IgG似乎不太可能像PEG链一样“包裹”肽并因此掩蔽关键区的可接近性。然而，由于IgG是大蛋白质(肽大小的10-40倍)，不能先验地排除此类分子可能在空间上阻碍肽的可接近性并因此干扰其生物活性。为了解决此问题，我们在针对肽与其同宗受体的相互作用的cAMP测定(有关cAMP测定的细节见上文)中比较了肽-IgG复合物与PYY来源的肽的PEG-肽的体外活性。

这些测定的结果(图7)显示，地高辛配基化的肽比其PEG化的对应物更好地保留了活性。地高辛配基化的肽DIG-moPYY的cAMP测定的IC50值为0.42nM。相反地，在与PEG-moPYY中相同位置处的PEG化导致效力大大(＞20倍)降低的分子(IC50＝10nM)。这显示，PYY(3-36)类似物肽的地高辛配基化相比在相同位置处的PEG化对其生物活性具有较少的影响。此外，Dig-肽相比PEG-肽的改善的效力在与<Dig>抗体复合后仍然可见：相比PEG化的肽的10nM的IC50值，肽-抗体复合物的cAMP测定的IC50值为2.4nM。因此，Dig-肽-抗体复合物的体外生物活性比PEG-肽的体外生物活性好4倍。

实施例9：

地高辛配基化的Cy5或地高辛配基化的moPYY肽与<Dig>IgG的复合物的血清稳定性和血清水平

我们的肽修饰技术的目的是改善肽的治疗应用性。目前肽的治疗应用的主要瓶颈是受限的体内稳定性和/或短的血清半寿期和快速清除。为了评估半抗原标记的肽与抗体的复合能否克服这些问题，我们测定了荧光团或肽的抗体复合物的体内PK参数并将其与未修饰的化合物的PK比较。为此我们需要(i)用地高辛配基化的荧光团Dig-Cy5或地高辛配基化的Dig-PYY肽衍生物负载结合地高辛配基的IgG；(ii)将未复合的和复合的化合物应用于动物，和(iii)分析这些动物中化合物随时间的血清浓度。

制备具有Dig-Cy5和DIG-moPYY的<Dig-IgG>复合物：

为了生成Dig-Cy5复合物，于室温在1小时内，添加四份886,1nmol冻干的DIG-Cy5至20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0中的446,4nmol抗DIG-抗体，同时缓慢摇晃。在添加最后一份后，孵育样品共计2小时。在DIG-PYY复合物的情况下，将691,7nmol冻干的DIG-PYY添加至在20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0中的364nmol抗DIG-抗体，和DIG-Cy5复合物同样地处理。将样品应用于Superdex200HiLoad16/60制备级大小排阻柱，使用20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0作为流动相。合并含有复合物的级分并使用离心过滤装置(Vivaspin20，30kDa MWCO，GE Healthcare)浓缩至19,4mg/ml(DIG-Cy5复合物)和19,9mg/ml(DIG-PYY复合物)。通过公式((A₂₈₀-(A₆₄₉x CF))x稀释因子)/ε测定含有DIG-Cy5的样品的蛋白质浓度。CF是校正因子A_280nm/A_649nm，其被测定为0,008。使用公式：(A_649nm/(ε_Cy5x蛋白质浓度M))x稀释因子计算抗体的DIG-Cy5装载，结果为1,2摩尔DIG-Cy5每摩尔抗体。通过SEC-MALLS测定DIG-PYY复合物的装载，得到1∶1的DIG-PYY∶抗体比。使用PVDF注射器式滤器(0,22μm孔径)在无菌条件下过滤所有样品。

在静脉应用后的不同时间点测定复合的和未复合的Dig-Cy5的体内血清浓度：

为了分析小荧光底物的抗体复合对PK参数的影响，将在20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0中的32,1nmol的DIG-Cy5或相应的抗体复合的化合物的每种物质应用于2只雌性小鼠(品种NRMI)。应用抗体复合物的小鼠体重为24g，25g，应用未复合的DIG-Cy5的小鼠体重为24g和25g。在以下时间点后收集约0,1ml血样：0,08h，2h和24h对于小鼠1，和0,08h，4h24h对于小鼠2。通过在室温离心(9300x g，3分钟，4℃)1小时后得到至少40μl的血清样品。将血清样品贮存于-80℃。为了测定在给定时间点血清中的化合物的量，我们利用Dig-Cy5的荧光性质：使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Varian)于室温在120μl石英比色皿中测量血清样品中的Cy5相关的荧光。激发波长为649nm，在670nm处测量发射。在1x PBS中稀释血清样品以达到合适的发射强度范围。使用在1xPBS中与各个样品相同稀释的未处理的小鼠血清作为空白探针。图8和表4显示了这些分析的结果，以对注射后5分钟的(峰)血清水平标准化的Cy5介导的荧光的相对(％)水平表示。如对于具有相当小的分子量的化合物所预期的，未复合的Dig-Cy5快速从血清中消失。注射后2小时，低于5％的应用的且在5分钟后可在血清中检测到的荧光仍然可检测到。在较晚的时间点，注射后4小时和24小时，检测不到Cy5介导的荧光信号。这指示化合物从循环中被快速清除。相比未复合的化合物，抗体复合的化合物可在较高水平上和较晚的时间点被检测到。注射后2小时，在血清中仍可检测到约70％的应用的荧光(将5分钟的水平设定为100％)。在较晚的时间点也可检测到显著的Cy5介导的荧光水平，在注射后4小时(hr)可检测到5分钟值的约60％，在注射后24小时仍可检测到约40％。这指示抗体复合显著增加了小化合物的血清半寿期。

表5：未复合的和抗体复合的Dig-荧光团和Dig-肽的PK参数

在静脉应用后的不同时间点测定复合的和未复合的Dig-肽的体内血清浓度：

为了分析地高辛配基化的肽的抗体复合对PK参数的影响，将在20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0中的32,1nmol DIG-moPYY肽，或相应的抗体复合的肽的每种物质应用于2只雌性小鼠(品种NRMI)。应用<DIG>-DIG-moPYY的小鼠体重为23g和25g，应用DIG-moPYY的小鼠体重为28g和26g。在以下时间点后收集约0,1ml血样：0,08h，2h和24h对于小鼠1，和0,08h，4h24h对于小鼠2。通过在室温离心(9300xg，3分钟，4℃)1小时后得到至少40μl血清样品。将血清样品贮存于-80℃。发现测定在给定时间点血清中的地高辛配基化的肽的量比测定Dig-Cy5更困难。原因是我们没有检测血清样品中的肽的直接手段。因此，我们设计了蛋白质印迹相关的测定来检测血清中的地高辛配基化的肽。在第一步中，在还原性SDS-PAGE上分离血清样品。因为其样品制备包括将血清暴露于高浓度的SDS和还原剂，Dig-肽可从(完全变性/解折叠的)<Dig>IgG中释放。为了介导肽从抗体复合物中释放并通过SDS-PAGE将其分离，在18μl20mM组氨酸/140mM NaCl pH6,0中稀释2μl的每个血清样品，与6,7μl的4x LDS样品缓冲液和3μl的10x样品还原剂(NuPAGE，Invitrogen)在95℃混合5分钟。使用2μl相同品种的未处理小鼠的血清作为对照。将样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，以200V/120mA运行20分钟，使用1xMES(Invitrogen)作为电泳缓冲液。随后，以25V/130mA使用XCell Sure

Mini-Cell系统(Invitrogen)40分钟，将分离的蛋白质和肽印迹在PVDF膜上(0,22μm孔大小，Invitrogen)。在1xPBS+1％Tween20(PBST)中的1％脱脂奶粉中封闭膜，室温1小时。随后用抗地高辛配基抗体检测膜上的地高辛配基化的肽。为此，在室温对膜应用在10ml的1％脱脂奶粉/PBST中的浓度为13μg/ml的抗地高辛配基抗体MAK<DIG>M-19-11-IgG(SP/Q)2小时。在1xPBST中洗膜3x5分钟。在室温应用在10ml 1％脱脂奶粉/PBST中1∶25稀释的与POD偶联的抗小鼠IgG Fab片段(来自LumiLight^PLUS蛋白质印迹试剂盒(Roche))1小时。用1xPBST洗膜3x5分钟。通过在4ml LumiLight蛋白质印迹底物中室温孵育膜5分钟进行检测。使用LumiImager F1(Roche)检测化学发光，曝光时间为20分钟。我们的分析结果显示在图9和表4中。由于血清中的高蛋白质浓度以及由于Dig-肽的大小相当小，不能保证蛋白质印迹来源的信号的精确定量。此外，蛋白质印迹衍生技术传递定性数据(条带的存在与否)而不是定量数据。然而，尽管有这些技术限制，我们能够证明在不同时间点在鼠血清中存在Dig-肽。接受抗体复合的肽的小鼠(图9A)在最早的时间点(施用后5分钟)显示了强信号。由对照肽的印迹大小和位置所显示的，这些信号可清楚地认定至肽。在这些血清样品中，也可见较高质量的额外信号。这些可能代表在血清中存在的、并在我们的测定中显示异常电泳行为的肽。在用抗体复合的肽处理的小鼠血清中，肽相关信号在早期时间点最强，并随时间降低。然而，在所有时点，甚至在施用后24小时仍可检测到信号良好的肽。相反地，在接受未复合的肽的小鼠中，甚至在最早的时间点，几乎检测不到任何可与小的释放的肽相关的信号。图9B显示了在正常曝光条件下，在印迹上几乎看不到游离肽。对印迹增强对比度和延长曝光时间能够证明在施用后5分钟存在一些肽，然而仅有痕量。在较晚的时间点，甚至使用增强对比度也检测不到清晰的肽条带。此外，在接受未复合肽的小鼠中较高质量的额外信号也弱得多。我们从这些实验中得出结论，未复合的肽在小鼠血清中具有非常短的半寿期。相反地，接受相同的但处于抗体复合的形式的肽的小鼠显示在大大增长的时期中这些肽存在于血清中。甚至在注射后24小时，可在这些小鼠的血清中清楚地鉴定到肽。因此，抗体复合不仅改善了小荧光化合物的药物代谢动力学(见图8)，也改善了地高辛配基化的肽的药物代谢动力学。

实施例10：

地高辛配基化的PYY来源的肽与<Dig>IgG的复合物的体内活性

描述的肽修饰技术的目的是为了改善肽的治疗应用性。目前肽的治疗应用的主要瓶颈是有限的体内稳定性和/或短血清半寿期和快速清除。短血清半寿期和快速清除进而常常限制治疗肽的治疗效力。因为半抗原标记的肽与抗体的复合增加了包括肽的小化合物的血清半寿期(见上文)，我们推断这可导致抗体复合的肽相比未复合的肽的改善的治疗效力。为了解决此问题，我们测定了肽-抗体复合物的体内生物活性，并将其与未复合的肽的体内生物活性比较。

为了测定在这些实验中NPY2受体激动剂对食物摄取的影响，我们在DIO(饮食诱导的肥胖)模型中对动物(成年雄性C57Bl/6小鼠)应用未复合的PYY来源的肽和抗体复合的肽。在从Jackson laboratories获得的成年雄性C57Bl/6小鼠上进行实验。使小鼠接受高脂饮食(HFD；60％的饮食热量kcal为脂肪，BioServe F3282)20周以诱导肥胖。根据体重和24小时食物摄取将饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠分类，并关入标准笼中于22℃以颠倒的12-h光/12-h暗循环单独饲养，并在开始实验前适应这些条件至少6天。在研究全程随意提供食物(HFD)和水。在暗循环开始时注射Ab-PYY_3-37融合蛋白和载体对照，并在不同时间间隔测量食物摄取直至给药后96小时(N＝6-8小鼠/组)。以11.05μMol/kg的浓度应用未复合的肽moPYY。以0.62μMol/kg的浓度应用抗体复合的DIG-moPYY。因此，注射的抗体复合的肽的摩尔浓度比未复合的肽的浓度低大于17倍。酪酪肽或胰腺肽YY短PYY(3-36)类似物结合并因而调控NPY受体家族的Y2受体(Y2R)。PYY由回肠和结肠中的神经内分泌细胞响应进餐分泌。其抑制胃运动，增加消化和营养吸收效率，并已显示推定地由Y2受体介导降低食欲。因为PYY通过平衡食物摄取在能量内稳态中发挥关键作用，此肽及其衍生物例如moPYY或PEG-moPYY或DIG-moPYY可用于治疗II型糖尿病或肥胖。因为此肽已显示推定地由Y2受体介导降低食欲，可通过在DIO模型中测量食物摄取评估其体内活性。因此通过降低的食物摄取反映肽介导的活性。食物摄取降低指示治疗效力，食物摄取无变化或摄取增加将对应低效力或无效。这些研究的结果显示在图10和图11中，其中比较了未处理的动物和用未复合的肽处理的和接受抗体复合的肽的动物的食物摄取的差异。显示的数据证明，应用未复合的肽在此动物模型中对食物摄取几乎没有任何影响。相反地，应用抗体复合的肽(甚至以几乎减少20倍的剂量)在持续数小时至数天期间显著降低了受处理的动物的食物摄取。这证明治疗肽与抗体的稳定复合可显著改善其治疗效力。