KR970005329B1

KR970005329B1 - 포유 동물의 레트로바이러스 감염 치료용 조성물

Info

Publication number: KR970005329B1
Application number: KR1019920701358A
Authority: KR
Inventors: 폴커 에르플레; 새르마크 토르벤
Original assignee: 게에스에프-프로슝첸트룸 퓌르 움벨트 운트 게순드하이트, 게엠베하; 페르츨, 메나헤; 새르마크 토르벤
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1997-04-15
Also published as: GR930300031T1; DE504191T1; EP0504191B1; DE69011870T2; WO1991008753A1; JPH075475B2; ES2048137T1; EP0504191A1; AU6880891A; ATE110278T1; JPH05504761A; AU646652B2; DK0504191T3; DE69011870D1; BR9007904A; ES2048137T3

Abstract

내용 없음.

Description

포유 동물의 레트로바이러스 감염 치료용 조성물

제1도는 감염되지 않은 세포와 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포의 세포 성장 비교를 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 농도에 대하여 상호 의존적이다.

제2도는 표준화된 세포주에 비교된 역전사 효소의 활성(PT%), 및 HIV에 감염된 T-림프종 세포(KE37-1/111β)의 배양 상층액의 감염도(INF%)에 비교된 역전사 효소의 활성(RT%)을 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 유사체의 농도에 대하여 상호 의존적이다.

제3도는 감염되지 않은 세포에 대한 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포의 세포 성장 비교를 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 농도에 대하여 상호 의존적이다.

제4도는 표준화된 세포의 수와 비교한 역전사 효소의 활성(RT%), 및 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 T-림프종 세포(KE37-1/111β)의 배양 상층액의 감염도(INF%)를 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 유사체의 농도에 대하여 상호 의존적이다.

제5도는 HIV 바이러스 GP41 분자의 카르복시 말단의 도시적 모형을 나타낸다.

제6도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 간염 세포와 감염되지 않은 세포의 성장 비교를 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 농도와 상호 관계가 있다.

제7도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제8도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 비교를 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 6의 농도와 상관 관계가 있다.

제9도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 6의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제10도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 4의 농도와 상관 관계가 있다.

제11도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 4의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제12도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 E의 농도와 상관 관계가 있다.

제13도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 E의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제14도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 백분율 그래프로서, 멜리틴 F의 농도와 상관 관계가 있다.

제15도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 F의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제16도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 백분율 그래프로서, 멜리틴 3의 농도와 상관 관계가 있다.

제17도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 3의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제18도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 멜리틴 1-20의 농도와 상관 관계가 있다.

제19도는 감염성 세포의 백분율을 멜리틴 1-20의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제20도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 마스토파란(masto-paran)의 농도와 상관 관계가 있다.

제21도는 감염성 세포의 백분율을 마스토파란의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제22도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, AMFI 2와 비교하였다.

레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타내고, AMFI 1의 농도와 비교한 결과는 제22도에 도시된 바와 같다.

제23도는 감염성 세포의 백분율을 AMFI 2의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다. AMFI 1의 농도에 대한 함수로 나타낸 감염성 세포의 백분율은 제 23도에 도시된 결과와 동일하였다.

제24도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 이를 MHC 펩티드의 농도와 비교하였다.

제25도는 감염성 세포의 백분율을 MHC 펩티드의 함수로 나타낸 그래프이다.

제26도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리된 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프로서, 이를 DMSO(용매 대조군)의 농도와 비교하였다.

제27도는 감염성 세포의 백분율을 DMSO(용매 대조군)의 농도에 대한 함수로 나타내었다.

제28도는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포와 감염되지 않은 세포의 세포 성장 백분율을 미처리된 대조군에 대한 백분율을 HOLST 펩티드(음성 대조군)의 농도와 비교하였다.

제29도는 감염성 세포의 백분율을 HOLST 펩티드의 농도에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제30도는 시간 간격을 다양하게 하여 멜리틴 농도에 비교한 P24 제조물의 백분율을 나타낸 그래프이다.

제31도는 3시간 주기로 멜리틴의 농도와 비교한 세포 및 상층액내 P24 제조물의 백분율을 나타내는 그래프이다.

제32도와 제33도는 멜리틴의 존재하에 배양 후 3시간 및 14시간에 각각 세포와 상층액내의 P24 농도를 나타내는 그래프이다.

제34도는 다양한 농도의 멜리틴과 함께 인큐베이션한 후 각각 3시간 과 14시간에 세포가 없는 HIV 상층액에서의 P24에 대한 멜리틴의 영향을 나타내는 그래프이다.

제35도는 마우스에 대한 독성 지속 실험을 나타내는 그래프로서, 더욱 상세하게는 특정 독의 복용 개시후 다양한 시점에서 측정된 독성 실험에 사용된 여러 가지 독에 대하여 마우스의 유효 체중을 나타낸다.

제36도는 독성 지속 실험에서의 마우스의 체중을 독성 실험에 사용된 물질을 투여하기 시작한 후의 날짜수에 대한 함수로서 나타낸 그래프이다.

제37도는 각각의 마우스의 체중을 꿀벌 독의 투여 개시 후 다양한 일자마다 꿀벌 독의 사용에 대한 함수로서 나타낸 그래프이다.

제38도는 마우스의 체중을 말벌 독의 투여 개시 후 다양한 날짜에 말벌 독의 사용에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제39도는 마우스의 체중을 말벌 혼합물의 투여 개시 후 다양한 날짜에 말벌 혼합물의 사용에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제40도는 마우스의 체중을 말벌 혼합물의 투여 개시 후 다양한 날짜에 말벌 혼합물의 사용에 대한 함수로 나타낸 그래프이다.

제41도는 마우스에 대한 독성 지속 실험을 나타낸 그래프로서, 독성 실험에 사용된 꿀벌 및 말벌의 혼합물을 투여한 각각의 생쥐의 다양한 해부학적 부분에 대한 현미경 검사 결과를 요약한 것이다.

제41a도는 제40도에 나타낸 다양한 데이터에 대한 설명이다.

제42도는 멜리틴 및 이것의 구조적 유사체의 구조를 나타낸 그래프이다.

발명의 분야

본 발명은 포유 동물의 레트로바이러스, 특히 HIV 감염의 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히메노프테라 독(hymenoptera venom), 또는 예컨대 이것을 단백질 성분이나 폴리펩티드 성분과 같은 구조적 유사체를 포유동물 숙주에 투입하여 포유동물의 레트로바이러스-감염 세포, 특히 HIV-감염 세포의 성장을 감소 또는 실질적으로 억제시키거나, 상기 세포내에서 바이러스 복제를 개별적으로 제한하거나 실질적으로 억제할 수 있도록 하는, 포유 동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염-치료용 조성물에 관한 것이다.

종래 기술에 대한 설명

의학계에서는 레트로바이러스 및 특히 HIV 감염 환자들에 대한 효과적인 치료방법과 그 치료제를 오랫동안 추구하여 왔다. 본원에 있어서, 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염은 HIV1 감염과 HIV2 감염 모두를 망라하는 것을 의미한다.

이 점에 있어서, 지금까지 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포의 바이러스 복제를 억제하면서도 부작용으로서 상기 세포에 심각한 손상을 주지 않고 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염에 효과적으로 대항하는 치료제를 개발하려는 연구가 이루어져 왔다. 더욱 구체적으로, 상기 연구의 목적은 현재 AZT를 사용하는 것 이외에 또 다른 치료제를 제공하는 것이다. 그러나, 이러한 치료제는 바이러스 보균체인 세포를 억제하거나 실질적으로 제한하기 위해, 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염이 되었거나 또는 HIV가 증식중인 세포를 선택적으로 파괴할 수 있어야만 하는 것이다.

주지된 바와 같이, HIV 바이러스는 레트로바이러스이므로 RNA 바이러스로 분류하는 것이 가장 적합하다. 그러나, 이러한 특별한 레트로바이러스의 RNA는 복제에 의해 직접 증식될 수 없고 역전사 효소의 보조하에 DNA 합성이 중개되어야 한다.

주지된 바와 같이, DNA는 RAN 바이러스의 복제를 위한 주형으로서 작용한다. 이 DNA는 그 후에 숙주세포의 게놈에 통합된다. 이러한 통합후에 새로운 바이러스 세포가 생성되는 것이다.

본 발명은 독성 이하 농도의 히메노프테라 독, 또는 예컨대 이것의 단백질 성분이나 폴리펩티드 성분과 같은 구조적 유사체를 사용하여 독성이하의 농도에서 역전사 효소를 억제하고, 또는 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염세포의 성장을 선택적으로 억제하여 바이러스 복제를 간섭함으로써 부수적인 장점과 함께 실질적으로 또는 치료적인 면에서 바이러스 보균체를 제거할 수 있는 것이다. 1989년 4월 18일자 Benton등의 미합중국 특허 제4,822,608호 히메노프테라 독, 또는 이것의 단백질 성분이나 폴리펩티드 성분으로 이루어지는 약제를 사용한 포유 동물의 감염 치료 방법 및 치료용 조성물에는, 예컨대 히메노프테라 독, 또는 이것의 단백질 성분이나 폴리펩티드 성분과 같은 천연물로부터 유래된 2차 약제가 항-바이러스 효과, 항암 효과, 및 바이러스성 질병에 대한 발암 억제 효과를 증진시켜 줄 수 있다는 것을 제시하고 있다.

더욱 상세하게는 Benton등의 교시에는, 꿀벌 독의 주성분인 멜리틴(melittin)을 예정 감염에 대하여 항박테리아 활성을 가지는 항생제와 조합하여 사용하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 이 교시에는 멜리틴과 항생제를 치료에 유효한 다양한 양으로 조합함으로써 상승적인 장점을 이룰 수도 있다는 것이 제안되어 있다.

Benton 등의 교시를 참고로, 종래의 기술에서 상세하게 논의된 바와 같이, 꿀벌 독의 주성분인 멜리틴은 실질적으로 26개 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 이 아미노산 잔기들은 Gly-lle-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-lle-Ser-Trp-lle-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-아미드이다.

또한, 본 발명자들은 멜리틴 유사체의 직접적인 효과를 발견하였는데, 이는 마지막(C-말단)6개 이상의 아미노산을 변경시키거나 6개의 연속된 글리신 잔기로 교체시키면 멜리틴과 비슷한 치료 효과를 가지는 것으로 나타났으며, 이 아미노산 유사체의 구조는 Gly-lle-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-lle-Ser-Trp-lle-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly이다.

그러므로, 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 포유동물을 안전하고 효과적인 방법으로 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 더 나아가 예컨대 AZT의 사용을 수반하는 치료법과 같은 종래의 HIV 치료법에 각각 관련된 손상을 방지하면서도 포유동물을 감염시키는 바이러스-세포의 보균체를 제거하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 치료방법 및 치료용 조성물을 얻는 것이 오랫동안 요구되어 왔다.

발명의 목적 및 발명의 요약

본 발명의 목적은 히메토프테라 독, 또는 예컨대 이것의 단백질 성분이나 폴리펩티드 성분과 같은 구조적 유사체를 사용하여 포유동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염을 치료하기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 필수적으로 꿀벌의 독 뒝벌(bumble bee)의 독, 말벌의 독 및 흰점 말벌(bald face hornet)의 독, 상기 독의 활성 단백질 성분 및 이것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 히메노프테라 독을 포유동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염의 치료에 사용하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유 동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 치료 방법 및 치료 조성물을 제공하는 것으로서, 이 방법은 포유동물에 멜리틴의 구조적 유사체 또는 멜리틴 그 자체를 독성 이하의 효과적인 복용량만큼 투여하여 포유 동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포내에서 바이러스의 복제를 실질적으로 억제시키는 것이다.

나아가 본 발명의 또 다른 목적은, 포유 동물에 있어서 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염의 치료용 조성물을 제공하는 것으로서, 이 방법은 포유 동물에 멜리틴 혼합물의 폴리펩티드 및 구조적 유사체 또는 멜리틴 그 자체를 독성 이하의 효과적인 복용량만큼 투여하여 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포내의 바이러스 세포의 복제를 억제시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안전하고 효과적인 포유 동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염에 대한 개선된 치료 방법 및 치료용 조성물을 제공하는 것이며, 더 나아가 이에 따른 장점은 종래의 치료법에 결부되던 각각의 손상들을 피할 수 있게 된 점이다.

바람직한 실시에 관한 설명

재료 및 방법

재료

이하 기술되는 KE37-1(미감염)과 KE37-11/111β(감염) 세포주는 미합중국 NIH Robert Gallows 박사의 실험실로부터 구입할 수 있고, 밀리리터(㎖)당 대략 100단위의 페니실린, 100㎍의 스트렙토마이신, 그리고 약0.25㎍의Fungizone(Amphotericine B)이 함유된 우태아 혈청을 공급하여 RPMI 1640 배지(GIBCO)에서 성장시켰다.

이하 기술되는 사람의 간층 조직(mesenchyma) 세포주 LC5 및 LC5-HIV는 1989년 3월 9일자로 프랑스 파리의 콜렉션 드 린스티튜트 파스퇴르(the Collection De L'lnstitut Pasteur)에 기탁되어 각각 1-842와 1-843이라는 기탁 번호가 부여되었다.

LC5 및 LC5-HIV 세포주는 RPMI 1640 배지에서 우태아 혈청을 공급하여 성장시켰다.

합성 펩티드

시판되는 펩티드 합성기(모델 Biolynx, Pharmacia Biochrome, Cambridge, 영국)를 사용하여 GP41로부터 멜리틴 펩티드와 그 유사체를 합성하고, 이 기계(Pharmacia Biochrome, Cambridge, 미국)에 미리 측량된 아미노산 OPFP 에스테르를 공급하였다.

합성 방법은 장치의 매뉴얼에 설명된 Fmoc 방법을 기초로 하였다. 아실화 속도(acylation rate)는 제작사의 프로토콜에 따라 음이온계 염료(Acid vilet 17, 디메틸포름아미드 100㎖당 30㎍, 디이소프로필에틸아민 14㎖당 0)를 사용하고 Bioplus 소프트웨어에 의해 600㎜에서 모니터링하였다. 이 원리는 양쪽성 이온 분배 모니터링이 방법(CDM)으로서 Salisbury, S.A., Treemeer, E.J., Davies, J.W. 및 Owen, D., E., I., A., (1990) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, p.538-540에 설명되어 있다.

사용된 링커는 펩티드 아미드(Ultrosyn C. Pharmacia Biochrome, Cambridge, 영국)의 방출을 초래한다.

우선, 대칭선 무수물을 사용하고 디메틸아미노피리딘(0.05meq)을 첨가하여 산 불안정 링커 Ultrosyn C(0.1meq)에 대한 커플링을 수행하였다.

이 결과, Fmoc 그룹의 방출에 의해 측정한 바 1시간 후에는 적어도 80%의 커플링이 이루어졌으며, 미처리된 부위는 아세트산 무수물로 봉쇄하였다. 그 다음으로는, 시판중인 활성 에스테로(Pharmacia Biochrome, 영국)를 사용하여 커플링을 수행하고, 앞에서 사용한 소프트웨어에 의해 자동적으로 수행되는 CDM에 의해 커플링 시간을 측정하였다. 전형적인 커플링 시간은 에스테르를 4배 초과하여 사용했을 때 1시간이었다. 디히드록시벤조 트리아졸 에스테르를 사용하여 무색이 될 때까지(1.5∼2시간) Ser를 커플링 시켰다.

5층전 부피(bed volume)의 피페리딘(디메틸포름아미드내에 20%)을 사용하여 Fmoc그룹을 제거하였다. 디메틸포름아미드는 사용 전에 증류시켜서 Biolynx의 프로토콜에 설명된 디니트로플루오로벤젠 테스트로 측정하였을 때 필수적으로 아민이 없는 상태가 되도록 한다. 이러한 커플링 중의 어느 것도 특별한 문제점을 야기하지 않았고, 미정제 펩티드들은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC, 하기 참조)로 측정한 결과 80%이상의 순도인 것으로 나타났다.

트리플루오로아세트산을 사용하고 2% 아니솔과 2%의 에탄디티올을 첨가하여 수지로부터 펩티드를 절단한 후 에테르로 침전시켰다. 이 펩티드를 TSK 120T 역상 칼럼(7.5×300㎜)(Pharmacia, 스웨덴)에서 HPLC에 의해 순도 95% 이상으로 정제하였다. 펩티드들은 0.1% 트리플루오로아세트산내에서 아세토니트릴 0 내지 80%로하여 90분 동안에 걸쳐 선형 구배를 사용함으로써, 전형적으로 65% 아세토니트릴(55%와 75%사이)에서 용출되었다. 서열은 Applied Biosystem 서열기를 사용하여 제조사의 지침에 따라 단백질을 서열화함으로써 확인되었다.

GP41 유사체와 마스토파란의 합성은 멜리틴에 대하여 설명된 바와 같이 수행하였다. 사용된 멜리틴 유사체 및 다른 펩티드들을 제 42도에 도시하였다.

방법

제1도 내지 제4도를 더욱 구체적으로 참고해보자면, 멜라틴과 이것의 특정 유사체를 HIV에 감염된 T-림프증 세로에 대한 효과에 관하여 테스트하였다. 이때, 테스트에는 다음과 같은 세포주를 사용하였다 : KE37-1/111β(HTLV-111β 감염). 이감염된 세포들을 37℃의 온도와 5%의 CO₂가 존재하는 테스트 조건에서 7일 동안 인큐베이션하였다.

RPMI 1640 배양 배지(GIBCO)를 사용하였고, ㎖당 약 100단위의 페니실린, 100㎍의 스트렙토마이신, 그리고 0.25㎍이 Fungizone(Amphotericin B)가 함유된 10% 갓태어난 송아지 혈청을 첨가하였다. 이것은 항생-항균 용액 1㎖과 동등한 것이다.(GIBCO 카달로그 No. 043-05240 배지 100㎖ 당).

전술한 물질을 다양한 농도를 존재시키고 1주일간 인큐베이션한 후, 매일 배지를 새로이 첨가하면서 배양물에 대하여 다음과 같은 시험을 수행하였다.

첫 번째 시험은 MTT 시험법을 사용하여 상대적인 세포 농도를 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염세포의 존재하는 수에 대한 함수로서 측정하기 위한 목적으로 수행되었다. MTT 시험은 T. Mosmann, Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival : Application to Proliferation and Cytotoxity Assays,V.65(1983), pp. 55-63에 따라 마이크로타이터 플레이트에서 수행되었다.

이 MTT 시험을 다음과 같이 약간 변형하였다 : 10㎕의 MTT 용액(5㎎/㎖ MTT를 PBS에 용해시키고 여과법에 의해 별균하였다; MTT는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸임브로마이드이다)을 각각의 웰에 가하였다. 5% CO₂분위기하 37° 에서 4시간 동안 MTT와 함께 세포를 인큐베이션하였다. 황색 MTT는 대사가 활발한 세포에 의해 청색 포르마잔(formazane)으로 환원된다. 각각의 웰에 이소프로판올내의 0.04N HCI 200㎕와 가하여 반응을 중지시키고 염료를 추출하였다.

모든 포르마젠 결정을 용해시키기 위해 결과 용액을 격렬하게 혼합하였다. 용액의 광학 밀도(OD)를 600㎚에서 측정하였다. 광학 밀도는 이러한 조건하에서 세포 밀도에 비례한다.

2차 시험은 Poiesz 등이 기술한 시험법을 사용하여, 치료된 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포배양물의 상층액내 역전사 효소의 활성을 측정하기 위해 수행되었는데, 상기 시험법은 PNAS 77(1980)에 기술되었고, 그 후 변형되었다.

3차 시험은 치료된 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포배양물의 상층액에 대하여 상대적 감염성을 측정할 목적으로 수행되었다. 여기에서, 미감염 HIV 감응성 사람 태아의 폐세포(LC5)를 배양물 상층액내에서 인큐베이션시켜 시험하였고, 그 다음으로는 새로운 배지에서 동일 세포를 3일 동안 배양시켰다. 그 다음에는 이 세포들을 HIV 특이적 단백질 제조에 대하여 시험하였다.

혈청 반응 검사를 거쳐 HIV 단백질의 존재를 입증하는 방법을 수행하였는데, 여기에서는 이 단백질에 대한 항체, 즉 1차 항체와, 대응 면역 글로불린에 대한 항체, 즉 2차 항체, 그리고 여기에 커플링(coupling)되는 양고추냉이 과산화 효소(Horse radish peroxidase)를 사용하였다. 항원-항체의 복합체를 기사화하기 위해서는 3-아미노에틸카르바졸을 사용하였다. 이 물질은 물에 용해되지 않는다.

이 방법은 간접 면역 과산화 효소 착색법으로서 더 잘 알려져 있다. 이 방법은 Mellert 등의 HTLV-lll/LAV 항체 테스트 : indirect lmmunoperoxidase staining. ALDS-FORSCHUNG(ALFO) Feb 1986 Heft 2, pp. 105-107에 기술되어 있다.

제1도 내지 4도에 도시된 바와 같이, 멜리틴은 ㎖당 5㎍ 이상의 농도일 경우 HIV 비감염 세포는 물론 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포에 대해서도 독성을 가진다는 점에 주의해야 한다. 여기에서, 본 시험 결과를 더욱 구체적으로 분석하기 위해 이하에서는 마우스에 대한 독성 검사를 제시한다.

또한, 전술한 바 이외에도 제3도에 나타낸 바와 같은 특정된 멜리틴 유사체는 멜리틴보다도 독성이 훨씬 적은 것으로 나타났다. 그러나, 바로 이 유사체는 복용량을 높여서, 즉 ㎖당 10㎍으로 하였을 경우라면 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포에 대한 선택적 성장 억제 효과가 나타나게 되는 것이다.

또한, ㎖당 5㎍의 농도에서 멜리틴은 감염 세포와 비감염 세포 모두에게 독성이 있다는 점에 주의해야 하지만, 본 발명자는 멜리틴 유사체를 사용하였을 경우에 약 7일 후에는 감염 세포의 성장이 거의 80%까지 감소되는 반면, 비감염 세포의 성장은 별로 영향을 입지 않는 것으로 나타나는 것을 알게 되었다.

또한, 제1도 내지 제4도에 타나탄 시험결과에서는, 멜리틴 농도가 ㎖당 2.5㎍일 때 세포의 성장 수준은 아직 영향을 받지 아니하고, 역전사 효소의 활성과 세포가 감염될 가능성이 실질적으로 제로(0)가 된다는 것이 나타나 있다. 이는 제2도를 참조하면 가장 확실하다.

또한, 제4도에 나타나 있는 시험결과는, 멜리틴 유사체가 역전사 효소의 활성과, 상층액-치료된 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포내의 감염성 바이러스 세포의 양을 저하시킬 수도 있다는 것을 가장 잘 나타내고 있다. 이러한 효과는 미감염 세포에 대해서는 아직 독성을 나타내지 않고 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포에 대해서는 확실하게 독성을 나타내는 농도 범위에서 나타나게 된다.

요약하자면, 제1도 내지 4도에 나타난 시험 결과, 멜리틴은 독성 이하의 농도에서는 역전사 효소를 억제함으로써 바이러스 복제를 억제하여 치료에 유용한 것으로 나타났다. 또한, 멜리틴은 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포의 성장을 선택적으로 억제하여 포유동물에 있어서 바이러스 보균체를 제거할 수 있도록 하는 것으로 나타났다.

추가로 시험을 수행하여 제1도 내지 제4도의 시험결과를 보충하였다. 이 실험들은 제6도 내지 제34도를 각각 참조함으로써 분명하게 설명될 수 있는데, 이에 따라 멜리틴이 HIV-감염 세포의 성장을 억제하는 기전을 조사할 수 있다.

더 구체적으로 제5도를 도입 및 참조함으로써, HIV 단백질 GP41의 2차 구조를 예견하는 데에 신경망 전산화 원리에 근거한 CHARMM 알고리즘을 사용하여 HIV 단백질 gp41의 표면에 대한 에너지 최소화 연구를 수행하였다. 주지된 바와 같이, 여기에서 사용된 신경망 프로그램은 아미노산 서열로부터 단백질의 2차 구조를 예상하기 위해 적용되었다.

이 네트워크는 아미노산 잔기를 다음과 같은 3가지 유형의 2차 구조로 분류하도록 되어 있다 : 알파난선, 베타-시트 및 랜덤 코일.

공지의 2차 구조를 거대 단백질 세트를 트레이닝함으로써 신경망은 단지 신규한 단백질의 기본 구조만을 바탕으로 하여 그 단백질의 2차 구조를 예상할 수 있게 된다.

신경망 방법에 근거한 컴퓨터 모델링에 의해 사람 면역 결핍 바이러스(HIV 단백질 GP41)의 2차 구조를 분석하는 것에 관해서는 H. Andreassen Analysis of the Secondary Structure of human lmmunode Virus(HIV) Proteins p17, gp120, and gp41 by Computer Modeling Based on Neutral Network, Journal of Acquired lmmune Defiiency Syndromes, v.3(1990), pp. 615-622에 기술되어 있다.

더욱 구체적으로는, 이와 같은 연구들로부터 도출된 결론은 GP41 단백질의 2개 전이막 부분에 멜리틴의 구조와 동일성이 있다는 것이다. 여기에서, 멜리틴과 아주 다른 멜리틴 유사체는 동일한 HIV 억제 효과를 가지는 것으로 나타나므로 이러한 동일성은 매우 주의할 필요가 있다.

그러므로, 멜리틴 내에 있는 수개의 아미노산은 만일 양친성(amphiph-il;icity)이 유지될 수만 있다면 분자의 활성을 변화시키지 않고서도 멜리틴내 아미노산 중의 몇 개를 교체시킬 수 있고, 전하의 상호 작용에 의해 4개의 멜리틴 분자를 중합시킬 수도 있다.

이하 더욱 상세하게 설명되겠으나, 이러한 시험에서 도출된 결론은 멜리틴이 주요 HIV 단백질 붕의 하나인 당단백질 GP41과 상호 작용을 한다는 것이다. 제5도에 도시된 GP41과 메리틴의 전이막 영역 사이의 유사성 때문에 이와 같은 작용이 가능한 것으로 보인다. 주지된 바와 같이, 멜리틴은 길이가 26개 아미노산인 양친성 펩티드이다.

이온 강도가 높은 수성 용액 내에서 멜리틴은 4합체의 형태로 되어 있다. 그러나, 낮은 이온 강도에서는 멜리틴은 단량체의 랜덤 코일 형태로 되어 있다. 생리적 이온 강도에서, 이러한 2가지 형태의 분배는 동일한 것으로 나타났다.

종래의 연구에서, 멜리틴은 나선의 한쪽에 대전된 전하를 분배하고 대전되지 않은 쪽이 세포막과 결합하도록 된 단량체 알파나선을 형성함으로써 세포막의 소수성 분위기에 적응될 수 있도록 되어 있는 것으로 밝혀졌다.

이 연구에서는 또한, 둘러싼 지질과 접하고 있는 멜리틴 중합체의 표면이 이와 같이 대전되지 않았음을 지시하고 있는 것이다.

나아가, 멜리틴 분자의 형태에 있어서 다른 독특한 점은 프롤린(아미노산 번호 14)에 의해 멜리틴의 나선에 약 120°의 비틀림이 도입되어 있다는 것이다. HIV GP41 멜리틴 유사 서열에서는 상기와 유사한 비틀림이 발견되었다. 선행 연구에서는 멜리틴이 몇 가지 효과를 가지는 것으로 알려져 있다고 밝혔다. 이러한 효과는 알파나선이 일련의 통로를 형성하는 세포 표면 결합 방법과 중합화 방법으로서 가장 잘 설명될 수 있다.

또한, 후미 C-말단의 후미 6개 아미노산에 의한 결합은 세포 용해에 필수적인 것으로 보인다. 이러한 사실은 이하 설명되는 실험 측정 데이터를 이해하는데 매우 중요한 것이다.

주지된 바와 같이, 멜리틴이 통로를 형성하게 되는 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 그러나, 멜리틴 분자는 그 염기의 C-말단을 인산염 음이온과 결합시킴으로써 10개의 포스파티딜콜린 분자와 상호 작용을 하는 것으로 보인다.

멜라틴 분자는 일단 고정되면 막의 외부 지질층으로 들어가 막의 구조를 교란시키는 것으로 보인다. 이렇게 한 다음, 막의 외층을 통하는 구멍을 형성하여 이온 침투능을 증가시키고 차후에는 막을 파괴시키게 된다. 막에 형성된 통로는 멜리틴 분자에 의해 안정화되는 것으로 보인다. 또한, 통로가 형성되면 세포가 용해되고, 이하에서는 이를 멜리틴의 독성이라고 하기로 한다. 이는 알파톡신과 보충물이 세포독성을 가지게 되는 기전과 비교될 수 있다. 이 분자들은 막을 연결시킬 수도 있지만 부수적인 결과로서 구멍을 형성할 수도 있다.

양친성 펩티드의 효과는 통로 형성 가능성 이외에도 다음과 같은 것이 있다; 포스포리파아제 A2에 대한 효과로서는 2개의 단백질간에 양친성 상호 작용을 할 수 있는 것으로 설명 된다. 이 경우에는, 멜리틴이 효소 단백질 포스포리파아제 A2의 소수성 부분과 상호 작용을 할 수도 있고, 멜리틴-인지질의 상호 작용에 기인할 수도 있다.

이외에, 세포내에 대해서도 멜리틴의 효과가 존재할 수 있다. 예를들면, 멜리틴은 뇌하수체 전엽에 있는 내인성 포스포리파아제 A2를 자극하여 성장 호르몬의 분지를 촉진할 수도 있다. 제6도 내지 제34도에 그래프로 나타내어진 일련의 실험은 2개의 극단을 검출하기 위해 고안되었다. 특히, 이 실험들은 다른 세포들을 감염시킬 수 있는 능력이 감소된 바이러스의 방출 및/또는 이러한 바이러스 방출 억제를 검출하기 위해 고안되어진 것이다.

다른 세포를 감염시킬 능력의 감소는, 예를 들어 글리코실화 억제제에 의해 나타나고, 바이러스 방출에 대한 직접적인 효과는 아실화 억제제, RT 억제제 및 멜리틴에 의해 나타난다. 그러나, 이러한 실험적 고안의 가장 중요한 특징은 멜리틴의 독성을 검출하는 것이다.

본 실험은 세포종(astrocytoma) 세포주 LC5-HIV(클로닝된 감염 세포)와 T-림프종 세포주 KE37-1/lllβ(클로닝 및 HILV-Ⅲβ로 감염된 세포) 모두에 대하여 수행되었다. 양자의 경우에 있어서, 결과는 모두 동일하였다. 일련의 실험에 있어서는, 베크만 인스투르먼트(Backman Instrument)사이에서 제작한 완전 자동화 실험실용 로봇 시프템 Biomek 1000을 사용하여 HIV 방출을 시험하였다. 이 시스템에서는 다음과 같은 단계가 수행되었다. 우선, (클로닝된) 만성 감염 세포를 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고 7일간 성장시켰다. 그 다음에는, 여기에 도면에 나타난 바와 같이 마지막 날 또는 기간 전체에 걸쳐서 멜리틴을 투여하였다.

생존 세포의 수를 MTT에 의해 정량하고 이것을 대사(탈수소 효소) 테스트시켰다. MTT 시험은 자동적으로 수행하였다. 실험 기간 동안에 독성 효과가 검출되었으나 별도의 대조 실험에서는 검출되지 않았다.

또한, 최종 세척시로부터 24시간 내지 7일까지 다양한 시간 경과 중에 방출된 바이러스 세포를 함유하는 상층액을 배양물로부터 수집하고, 이것의 부분 표본(aliguot)을 모아 항원 또는 바이러스 효소 역전사 효소(RT)를 사용하여 바이러스를 정량하였다. 또한, 마이크로 타이터 플레이트내의 미감염 세포 배양물에 부분표본을 첨가하여 바이러스 세포가 이 미감염 세포를 재감염시킬 수 있는 능력을 측정하였다. 여기에서, 면역 과산화 효소 염색 방법에 의해 감염 세포의 수를 자동 정량하였다.

시험 결과를 멜리틴의 독성(MTT 시험); 1차 배양물로부터의 HIV 방출(RT 테이스); 및 방출된 바이러스가 미감염 세포를 가염시킬 수 있는 능력에 관하여 나타내었다.

제6도와 제7도에 나타난 바와 같이, 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포에 대한 멜리틴의 모든 효과는 감염된 세포로부터의 바이러스 세포 방출을 억제하는 것(제6도)으로 보이지만, 그 특성상 감염 세포에 선택적으로 영향을 미치지는 않는 것으로 보인다.(제7도).

이러한 관계는 각각 멜리틴 6(제8도 및 제9도); 멜리틴 4(제10도 및 제11도); 멜리틴 E(제12도 및 제13도); 멜리틴 F(제14도 및 제15도); 멜리틴 3(제16도 및 제17도); 및 멜리틴 1-20(제18도 및 제19)에 대해서도 마찬가지로 나타났다.

멜리틴의 막용해 효과가 멜리틴의 C-말단이 세포에 표면 결합되는 것에 의존하기 때문에, 이러한 시험결과에서 얻어진 정보는 주목할만하다.

전술한 바와 같이, 이러한 결합 방법은 또한 아미노산 서열 Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-아미드를 포함하는 C-말단 서열에 기인하는 양성 전하에 의존되는 것으로 보인다.

멜리틴의 효과가 기지의 통로 형성 기전에 근거한 것인지 아니면 미지의 방법에 의한 것인지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 (1-20)-6(Gly)-아미드를 시험하였다. 이는 이러한 형태의 멜리틴이 전하를 상실하면 양친성에 일치하는 방식으로 작용할 것이고 세포 표면과의 특이적 상호 작용에 의존하지는 않을 것이라는 이유 때문이었다.

그러나, 제18도와 제19도에 잘 나타난 바와 같이, 본 발명자의 가설과는 반대로 멜리틴 유사체는 세포의 표면에 특이적으로 결합하지 않으므로 훨씬 적은 독성이 나타나서 바이러스 세포의 방출을 억제하였고, 또한 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 것으로 명백히 나타났다.

이 실험 결과는 멜리틴의 독성과 세포 용해 효과가 감염 세포의 선태적 사멸을 방해한다고 생각할 수도 있는 것이다. 이는 멜리틴의 용해 특성이 항-HIV 효과에 포함되지 않는다고 추측할 수 있다. 그러므로, 이는 멜리틴의 작용에 있어서 지금까지 알려지지 않은 새로운 작용인 것이다.

또한, 시험 결과 천연의 멜리틴이 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 LC5 세포를 용해시킬 수 있다는 것이 분명해졌다. 예를 들어 실험 결과에서는, 이러한 작용의 특성이 동일 물질의 임계 농도 현상과 관련이 있는 것으로 나타났다. 더욱 구체적으로는, 임계 농도에 도달했을 때(㎖당 10㎍), 감염되었거나 감염되지 않은 모든 세포가 사멸되는 것이다.

이러한 효과는 HIV 방출 효과보다 10배 높은 농도에서 발생하게 된다. 멜리틴 COOH를 시험해보면 멜리틴 아미드보다 덜 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 21 위치 내지 26 위치 사이의 양성 하전된 아미노산의 결합꼬리부(tail)과 결여된 2개의 멜리틴 유사체를 추가로 시험하였다.

이 멜리틴 유사체는 모두 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염 세포에 대하여 분명한 동일 효과가 있었다. 즉, 이감염 세포들은 선택적으로 사멸되었다. 예를 들어, ㎖당 10㎍의 농도일 때 감염 세포의 절반이 사멸되었으나 미감염 세포는 본질적으로 영향을 받지 않았다.

또한, 사용된 농도에서는 임계 농도에서 세포가 용해되는 멜리틴 특성과 같은 세포의 용해 현상이 관찰되지 않았다. 멜리틴 유사체의 효과는 유사체의 농도가 상승됨에 따라 감염 세포의 생존도를 지속적으로 하강시키는 것으로 나타났다. 이러한 멜리틴 유사체의 효과는 간단히 설명되지는 않는다.

즉, 감염 세포들은 미감염 세포와 같은 정도로 생존할 수 있다는 것이 명백하므로, 만일 HIV 방출이 억제된다면 감염 세포가 미감염 세포보다 사망률이 더 높을 것으로 기대되지는 않는다. 또한, 자체의 양친성구조를 통해 작용하는 항바이러스 물질인 멜리틴의 효과는 각각 제18도 및 제19도에 멜리틴(1-20)의 효과로서 더욱 구체적으로 나타나 있다.

이 점에 있어서, 멜리틴 1-20은 분자의 세포 결합 부분이 결여되어 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 그럼에도 불구하고 이 유사체는 천연 멜리틴과 멜리틴(1-20)-6-(Gly)-아미드와 마찬가지로 HIV 방출을 억제한다. 또한, 이와 같은 멜리틴은 C-말단이 양성 하전되지 않은 멜리틴, 즉 멜리틴(1-20)-6-(Gly)-아미드와 마찬가지로 감염 세포의 성장을 억제한다.

그러므로, 멜리틴의 항바이러스 효과는 공지된 멜리틴의 세포 용해 가전과는 무관하며, 멜리틴의 양친성효과 및 막 카오트로픽(Chaotropic) 효과에 의존되는 것으로 나타났다. 그러므로, 감염 세포에 대한 선택적 사멸은 비록 현재에는 단지 이론적이고 아직까지 밝혀지지 않은 멜리틴 효과에 기인할 수도 있겠지만, HIV 방출의 억제에 따른 기능이라고 볼 수도 있는 것이다.

또한, 제20도와 제21도에는 독성 물질인 마스토파란의 효과가 밝혀져 있다. 이것도 또한 양친성 펩티드이지만, 아미노산 잔기를 14개만 함유하고 있는 아주 짧은 것이다. 유사한 구조를 가진 펩티드들, 즉 마스토파란뿐만 아니라 MHC(MAJOR histocompatiility complex sequence)와 GP41 유사체는 특별히 눈에 띄는 효과가 전혀 없다. 또한 멜리틴에 대하여 외적 구조상의 유사성이 전혀 없는 대조 펩티드도 마찬가지로 특별한 효과가 없다.

제30도와 제31도를 상세히 살펴보면, 본 발명자는 세포내에서 바이러스 단백질 P24의 형성을 특정함으로써, 멜리틴으로 처리된 총 감염체(클론 배양물)에 있어서 바이러스 단백질 합성이 감소되는 것을 나타내었다.

이는 기본적으로, 설사 세포 배양물에 멜리틴을 첨가하는 동안과 직후 또는 다른 방법으로 바이러스 수를 감소시킬 수 있다고 하더라도, 바이러스에 대한 멜리틴의 효과는 감염 세포로부터 바이러스가 방출되기전에 바이러스를 공격하는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 자료들로부터는 바이러스 생성은 배양이 시작된 후 최고에 이를 때까지 약 3일 내지 5일이 경과해야 함을 알 수 있다. 이 시점에서는 배양물에 멜리틴이 존재하지 않는다.

또한, 얻어진 시험 결과는 멜리틴의 반감기가 19시간이고, 배양물에 첨가된 2시간 이후부터는 배지 내에서 측정되지 않는데, 즉 세포에 흡수되어진 것이다.

본 관찰에서는 본 실험의 모든 효과를 무세포 바이러스, 즉 상층액에 분출된 바이러스에 대한 멜리틴의 직접적인 효과에 의해 설명하는 것을 배제하였다.

히메노프테라 독의 반복 투여 효과를 마우스에 대하여 조사하였다. 10마리씩으로 이루어진 NMRI 마우스군(성별로 5마리씩)들에 다음과 같이 독을 피하 투여하였다 : 꿀벌, 말벌(yellow jacket), 말벌류(Hormet)혼합물, 또는 말벌과 (Vespid)혼합물, 제 0, 4, 7, 12, 14 및 16일.

각각의 시험 대상 동물에 독을 각각 1, 2.5, 5, 10, 25 및 50㎍씩 투여하였다.

5번째 군에는 대조 용액을 투여하고 대조군으로 취급하였다. 결과는 각각 제35도 내지 41a도에 요약한 바와 같았다.

임상 관찰과 체중 기록을 반복 수행하였다. 실험 종료시에 모든 실험 동물을 해부하고 조직 병리학적 검사를 수행하였다.

조사 결과, 마우스는 4가지 독에 대하여 내성이 있는 것으로 판단되었다. 또한, 심각한 성장 변화 또는 현미경적 변화는 전혀 관찰되지 않았다.

다양한 히메노프테라 독에 관한 독성 지속검사에 사용된 재료와 방법

서론

포유 동물에 대한 히메노프테라 독의 반복 투여 효과를 평가하기 위해 마우스에 대하여 독성 지속 검사를 수행하였다.

시험물질

다음과 같은 히메노프테라 종의 독을 시험하였다 :

꿀벌(Apix mellifera)(Nr.BB02 참조), 말벌(Vespula maculifrons)(Nr. YJ02 참조), 말벌류 혼합물(흰얼굴 말벌(Vespula maculata)과 황색 말벌(Vespula arenaria))(Nr.MH01참조), 말벌목 혼합물(말벌, 흰얼굴 말벌 및 황색 말벌)(Nr. MV02 참조).

대조 표준인 실험 동물에는 다음과 같은 대조 용액을 투여하였다 : NaCL : 012M, 사람의 혈청 알부민(HSA) : 0.03%, 만니톨 : 3%, 인산 나트륨 : 0.005M, pH 7.4.

시험물질 제조

다음과 같이 조성된 에반스(Evans) 완충 식염수에 독을 희석시켰다 :

Na₂HPO₄·2HO₂O-0.71g/ℓ

KH₂PO₄-0.363g/ℓ

NaCI-5g/ℓ

페놀-4g/ℓ

디-Na-EDTA·2H₂O-0.1g/ℓ.

매회 마다 동일 복용 부피, 즉 0.5㎖동물 개체를 유지하기 위해 다른 농도로 pH 7이 되도록 하였다. 매번 투여시마다 물질을 새로이 제조하였다.

동물 및 조건

동물 : 생후 7주이고 체중이 약 25g(암) 및 30g(수)인 마우스 NMRI 주 SPF(Anticimex, Norrviken)를 우리(cage)당 5마리씩 수용하였다.

급식 : 펠릿(Anticimex, R3)과 물을 무제한 공급하였다.

온도(실온) : 22±1℃.

(상대)습도 : 50℃10%.

(인공)채광 : 12시간/일.

군(group) 규모

임의로 10마리씩의 동물(각 성별로 5마리씩)을 선택하여 1개군으로 하고, 총 5개군으로 하였다(1개의 대조군 포함).

복용량

각각의 군에 있어서 2-5번에게 다음과 같은 복용 계호기을 실행하였다.

그 후에, 각각의 마우스에 1개월에 1번씩 50μg의 독을 총 5회 투여하였다. 그러므로, 실험 기간 동안 마우스당 주사된 독의 총량은 343.5㎍이 되었다.

대조 동물에는, 만니톨 및 HSA 상대 농도가 제2군 및 제3군과 같은 정도를 되도록 에반스 완충 식염수 대조 용액을 희석시켜서 각 마리당 0.5㎖/동물 만큼씩 상기와 동일한 횟수로 투여하였다.

투여 경로

척추 중간과 허리 부분에 피하 투여하였다.

관찰

임상적 증상

매일 건강의 악화와 독성에 대한 임상적 증상을 대조하고 기록하였다.

체중

체중 복용 개시 전에 개별적 체중을 기록하고, 그 후 매 투여시마다 체중을 기록하였다.

최종 검사

50㎍씩 주사를 시작한 지 6개월 후에 모든 마우스를 사망시키고 해부하였다. 조직 검사용 및 조직 병리학적 실험용으로 다음의 기관으로부터 조직을 채취하였다 : 피부, 타액선, 기도, 폐 및 기관지, 심장 및 동맥, 갑상선, 부갑상선, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 결장, 직장, 장간막 림프절, 간, 담낭, 대퇴근, 좌골신경, 흉골분절, 흉선, 췌장, 비장, 신장, 부신, 요낭, 정낭, 전립선, 고환, 난소, 자궁, 뇌 뇌하수체선, 눈, 척수 및 주사 부위.

결과

조사 결과를 각각 제35 내지 제41a도에 나타내었다.

관찰

임상적 증상

마우스 제309번(말벌류 혼합물)은 실험 기관의 최종 2개월 동안 계속해서 회전운동을 하였다.

마우스 제203번(말벌)은 실험 종료 1개월 전에 짧은 기간동안 수종이 형성되고 앞다리에 탈모 현상이 발생하였다.

체중

제36도 내지 제40도에 나타난 바와 같다.

체중은 투약에 의해 영향을 받지 않았다.

최종 검사

거시적 병리 현상

마우스 제304번(말벌류 홉합물)에 있어서는 비장이 복벽에 굳게 부착되고 있었고, 마우스 제406번(말벌목 혼합물)에서는 췌장에 굳게 부착되어 있었다. 마우스 제101번과 제105(꿀벌)은 각각 폐에 1㎜의 단단한 결절이 있었다. 그 외의 다른 현저한 점은 전혀 발견되지 않았다. 주사 부위는 사망시에도 부풀어오르거나 다른 변화가 일어나지 않았다.

미시적 병리 현상

현미경 검사 결과를 제41도 및 제41a도에 나타내었다. 다음의 마우스에 장간막 림프절에서 반응성 괴사(nercrosis)가 발견되었다 : 제110번(꿀벌), 제307 및 308번(말벌류 환합물), 제406 및 410번(말벌목 혼합물). 마우스 210번(말벌)은 장간막 림프절에서 보통의 림프종 증식 현상이 있었다.

마우스 제310(말벌류 혼합물)은 비장에서 아급성 또는 만성 세포반응과 함께 병소 괴사가 있었다. 마우스 제304번(말벌류 혼합물)은 비장이 복벽에 부착되었는데 이는 섬유성이고, 마우스 제406번(말벌목 혼합물)은 비장이 췌장에 부착되었는데 이는 만성 섬유증과 혈관화(vascularization)가 잘된 것이다.

장간막 림프절과 비장에 있어서 설명된 변화는 독에 의해 야기된 것일 수도 있으나, 이는 동물의 상태와 관련하였을 때 무해한 것으로 판단된다.

마우스 제101번과 105번(꿀벌), 그리고 마우스 402번(말벌목 혼합물)은 폐에서 선동이 발견되었다. 마우스 470번(말벌목 혼합물)은 기관지 상피에 작은 결절의 증식이 있었다. 이러한 변화는 자연 발생된 것이다. 독을 투여한 마우스뿐만 아니라 대조 마우스에 있어서도 약간의 세포침윤과 함께 간의 실질 세포의 괴사가 아주 미약하게 발견되었다. 또한, 3개의 대조 마우스에서는 신장에서 약한 만성 침윤성 변화가 나타났다.

라우셔(Rausher) 백혈병에 걸린 마우스에 대한 체내 검사

라우셔 백혈병 마우스는 레트로바이러스 감염에 대한 모델로서 널리 인식되어졌다. 바이러스가 마우스내에서 적혈 구조 혈성 백혈병을 발생시키면 비장의 크기가 증가되어 적혈구 생성 증가의 정도를 지시하게 된다. 본 검사에서는 6개 gly 꼬리부(tail)에 대한 멜리틴 유사체의 효과를 시험하였다.

멜리틴의 항바이러스 효과에 대한 시험은 Balb C 마우스(생후 12주; 모두 수컷)에 대하여 시행되었다. 실험 동물을 우리(cage)당 4마리씩 수용하였다. 라우셔 백혈병 바이러스를 복강내 주사하여 동물을 감염시키고(각 동물마다 감염성 입자(바이러스)를 0.2㎖ 부피만큼), 10분 후에 시험 물질을 피하 주사하였다.

동물들을 대조군(식염수를 주사 투여) 또는 시험군(멜리틴 유사체를 투여)의 2개군으로 나누었다.

상기와 같이 감염시킨 각각 16마리씩의 balb C 마우스 2개군에 완충 식염수(25mM KHPO, 150mM NaCI, pH 7.8, PBS로 호칭됨) 또는 PBS내의 멜리틴-6-gly(5㎍/체중 ㎎으로 0.1㎖ 부피만큼) 중 어느 한가지를 주사하였다.

펩티드를 100㎍/㎖으로 용해시키고 시험 동물과 대조 동물에 각각 PBS 또는 PBS+ 시험 물질을 동일한 부피(0.1㎖)만큼 피하 주사하였다. 주사는 감염성 바이러스를 주사한 후 10분 경과 후에 실시하였다. 2일후, 동물에 멜리틴 유사체(10㎍/체중 ㎎) 또는 PBS를 0.100㎖만큼씩 다시 피하 주사하였다. 최초 주사 후 4일 후에, 멜리틴 유사체 20㎍/체중 ㎎을 사용하여 제 3회의 주사를 수행하였다.

모든 동물들은 멜리틴 유사체 또는 PBS의 주사에 영향을 받지 않았으며, 주사의 급성기에도 생존하였다. 정상적으로 감염된 마우스는 2주 이내에 비장의 무게가 150㎎ 이상으로 증가되었다. 이 규모는 2.5g까지 증가될 수도 있다. 정상적인 비장은 이보다 0.1㎎ 내지 0.15㎎ 정도 높거나 낮은 수준이며, 이는 마우스의 95%가 이 범위 이내의 비장을 가지고 있음을 의미한다.

170㎎ 이상의 비장은 2주 후에 뚜렷한 감염을 나타내고, 정상 수준인 150㎎ 이상 170㎎까지의 비장은 경계 수준인 경우이다.

대조군으로 시험된 모든 동물의 비장은 2주 후 모두 150㎎ 이상을 나타내었다. 시험군에 있어서도 시험된 동물중 25% 비장이 150㎎ 이상을 나타내었으나 170㎎ 미만이었고 경계 수준인 경우로 판단되었다.

그러나, 나머지는 비장이 증대되는 증상을 전혀 나타내지 않았으며, 즉 정상인 동물과 같은 100-150㎎ 이내였다. 단지 1마리의 동물의 비장만이 대조군과 비교하여 100%의 병리학적 증상을 나타내었다.

이 실험으로부터 다음과 같은 결론이 도출되었다.

1. 본 특허출원에 기재된 체외 실험과 비슷한 농도의 멜리틴 유사체로 치료하면 동물들은 생존한 수 있다.

2. 비교 처리된 대조군에서는 질병이 100% 발현된데 반하여 감염 동물의 75%가 발병되지 않았기 때문에, 멜리틴 유사체는 포유 동물에 있어서 레트로바이러스의 발현을 확실하게 억제할 수 있다.

3. 멜리틴 그 유사체는 HIV 뿐만 아니라 다른 레트로바이러스도 억제시킬 수 있다.

결론

전반적으로 평가하자면, 마우스는 4가지 독성 물질, 즉 꿀벌의 독, 말벌의 독, 말벌류 혼합물의 독 및 말벌목 혼합물의 독을 소량 투여하였을 경우에 매우 양호한 내성을 나타내었다. 거시적 또는 미시적으로 심한 변화는 전혀 발견되지 않았다. 전술한 바와 같이, 멜리틴은 HIV의 주단백질 중의 하나인 당단백질 GP41과 상호 작용을 하여, 포유 동물의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV 감염을 치료할 수 있는 방법을 제공한다. 제5도에 잘 나타난 바와 같은 GP41의 전이막 영역과 멜리틴 사이의 유사성 때문에 가능한 것이다.

제5도에 따르면, GP41에는 분자가 막에 결합되는 부분에 현저한 특징을 가지는 양친성 구역이 있다. GP41의 양친성 부분은 대전된 아미노산이 반대 방향으로 평행한 루프(loop)를 형성하도록 되어 있는데, 여기에서 루프의 2개 다리(leg)는 멜리틴 중합과 관련된 구조와 유사한 대전된 중화 구조를 형성한다.

또한, 멜리틴은 GP41의 분자내 전하를 정상적으로 중성화시킴으로써 GP41의 구조를 극적으로 변화시킬 수 있다.

바이러스의 형성은 GP41과 바이러스 단백질 P17의 핵과의 상효 작용에 의존되므로, 위와 같은 변화는 바이러스 형성에 영향을 줄 수 있고, 또한 기본적인 바이러스 분리 과정을 수행할 수도 있는 것이다. 알려진 바와 같이, 예컨대 HIV와 같은 바이러스는 세포 표면에 바이러스 게놈이 들어 있는 작은 막을 발아시키는 것을 포함하는 방법으로 어느 세포로부터 다른 세포로 퍼지게 된다.

이 과정은 세포 표면의 변화에 민감한 것으로 보인다. 예를 들어, 지질 제제를 가하면 감염 세포로부터 바이러스가 방출되는 것이 널리 공지되어 있다. 이러한 효과는 세포막에 대한 카오트로픽(chaotropic)작용에 기인할 수 있다. 그러나, 이 작용의 기전은 아직 불명확하다.

멜리틴이 GP41 단백질과 상호 작용을 할 수 있도록 하는 GP41 단백질의 구조적 특징은 아미노산 770과 856 사이에 있는 것으로 보이며, 여기에는 770 내지 794 및 824 내지 856 양친성 서열이 포함되어 있다. 제5도 참조. 이러한 서열의 양친성은 서열의 전반적으로 낮은 소수성과 결합된 높은 소수성 모멘트에 의해 검출될 수 있다. 분자 운동에 의해 2개의 양친성 다리(leg)가 형성되었고, 이들은 양친성에 의해 상호 작용을 하여, 잠재적으로는 전이막 루프의 형성에 의해 막 내부로 삽입될 수 있다.

다른 방법으로서는 세포막의 내표면에 부유(float)될 수도 있다. 양자의 경우에 있어서, 멜리틴과의 상호 작용은 GP41의 세포질막 부분의 부위에 대한 위치를 변화시키게 되어, 바이러스 형성의 필수적 선구체로 보이는 P4과 상호 작용을 하게 되는 것이다. 여기에서, 멜리틴과 GB41 양친성 서열 824 내지 856 사이의 중요한 유사성은, 이들의 양친성 나선에 프롤린을 가지고 있다는 점이다.

전술한 바와 같이, 이러한 구조적 특징은 나선에 120° 비틀림을 도입하게 되어 약간 휘어진 형태를 가지도록 한다. 또는, 멜리틴이 막과 상호작용을 하여 카오트로픽(chaotropic)제로서 작용할 수도 있다. 이것도 또한 양친성에 기인하는 것이다.

주지된 바와 같이, 카오트로픽제의 효과는 막에 있어서 정돈된 인지질 배열을 교란시키는 것이다. 이러한 효과는 막의 상 전이점을 변화시켜서 막의 두께를 변화시키게 된다.

예상되는 바와 같이, 부유 멜리틴이 세포막에 카오트로픽 영향을 일으킨다는 사실은 전혀 새로운 것이 아니다. 그러나, 이 동일한 결과가 바이러스의 발아 과정에 어떻게 작용하는지는 불명확하고 현재까지 밝혀지지 않고 있다.

그럼에도 불구하고, 막의 지질 배열에는 항-HIV 효과나 변화가 일어난다는 것이 확실하게 나타났다. 더욱이, 여러 가지 인지질 제제를 가해도 감염 세포로부터는 HIV가 방출된다. 그러나, 이러한 효과를 나타나게 하는 지질의 종류는 아직 확인되지 않았다.

그러나, 멜리틴은 인지질과 상호 작용을 하는 것으로 알려져 있고, 미확인 지질 종류의 이러한 효과나 결합은 HIV 방출에 작용하는 것으로 나타났으며, 이는 멜리틴의 하-효과에 대한 설명을 제공할 수도 있을 것이다.

인지질을 가하면 멜리틴과 매우 비슷한 효과가 나타나기 때문에, 이러한 지질은 인지질이 아닐 것으로 추정된다.

결론적으로, 이러한 시험은 멜리틴이 2가지 효과를 가지는 것을 나타냈는데, 즉 처음의 단기간 동안에는 바이러스를 비활성화시키고, 2차적으로는 장기간 동안 적어도 P24 제조를 감소시켰다. 이러한 특성은 멜리틴 양친성 나선의 특이적 구조에 기인하여 나타난다.

또한, 시험 결과에서는 꼬리의 구조가 유사체의 효과 정도를 결정지으며 효과의 질을 결정하지는 않는다는 것이 밝혀졌다. 즉 꼬리에 Lys-Arg-Lys-Arg-Gly-Gly를 함유하는 유사체의 효과적인 농도는 꼬리가 없는 멜리틴의 효과적인 농도보다도 약 100배 낮다.

덧붙이자면, 시험 결과에서는 독성 이하 농도의 멜리틴으로 단일 처리함으로써 상층액의 감염도가 낮아졌다는 것이 밝혀졌다. 여기에서, 치료는 배양의 시작과 동시에 하고, 감염도의 측정은 치료 7일 후에 시행하였다.

전술한 바와 같이, 이러한 유형의 배양물 내에서 바이러스의 최고 농도는 배양 후 5일이 되어도 나타나지 않았다. 본 발명자가 여기에서 도출해낸 결론은, 만일 치료 7일 후의 감소된 바이러스 감염도가 단지 바이러스에 대한 멜리틴의 직접적인 효과 때문이라면, 치료 후 5일 정도의 나중에는 멜리틴 또는 이것을 활성 단편이 존재해야 한다는 것이다.

본 발명자는 멜리틴이 배양물에 도입된지 수시간 이내에 세포에 흡수되는 것을 발견했기 때문에 위와 같은 현상은 불가능한 것이다. 또한, 만일 상층액 감염도의 감소가 부분적으로 바이러스의 제조 결함, 또는 새로 합성된 비리온의 파괴에 따른 바이러스 제조의 감소에 기인한다면, 세포내에서 및/또는 멜리틴 처리된 배양물의 상층액에서 바이러스 단백질의 양은 감소되는 것으로 나타나야 한다. 이러한 가설이 옳은지를 결정하기 위해, 본 발명자는 바이러스 단백질 제조용 마커(marker)로서 P24 마커를 선택하였다. 시험 결과, 멜리틴과 함께 2시간 인큐베이션함으로써 세포 및 상층액에서의 P24가 최소한 약간 감소되었다.

그러나, 멜리틴과 함께 그 다음의 14시간 동안 인큐베이션한 결과, 상충액 뿐만 아니라 세포내의 P24가 현저하게 감소되었다.(60% 저하). 그러므로, 세포내의 P24는 상층액의 P24가 보다 더 신속하고 강력하게 감소될 수 있는 것으로 보인다. 또한, 무세포 HIV를 멜리틴과 함께 인큐베이션하면 P24 항원에 대한 검출을 저해시키지 않으며, 단지 바이러스 감염도의 감소를 야기하는 것으로 나타났다.

마우스에 대한 체외 실험을 수행하였다. 이로부터 다음과 같은 결론이 도출되었다 :

1. 본출원에 기술된 체외 실험과 비슷한 농도의 멜리틴 유사체로 치료하면 동물들이 생존할 수 있다.

2. 비교 처리된 대조군에서는 100% 발병이 이루어진데 비해 감염된 동물의 75%는 발병되지 않았기 때문에, 멜리틴 유사체는 포유 동물 내에서 레토로바이러스의 발현을 확실하게 억제한다.

3. 멜리틴 및 멜리틴 유사체는 HIV 뿐만 아니라 다른 레트로바이러스도 억제한다.

지금까지 본 발명은 가장 실질적이고 바람직한 실시예를 기재하였으나, 지금까지 기재된 설명에 제한되는 바 없이 본 발명의 영역 이내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 당연하다.

Claims

독성 이하 유효량의 멜리틴 또는 이것의 구조적 유사체를 활성 성분으로서 함유하는, 포유동물에 있어서 레트로바이러스에 감염된 세포내의 바이러스 복제를 감소 또는 억제시키거나 상기 감염세포의 성장을 감소 또는 억제시켜서 상기 포유동물의 레트로바이러스의 감염을 치료하기 위한 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 레트로바이러스 감염이 라우셔(Rauscher) 백혈병 바이러스 감염 또는 HIV 감염인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 독성 이하 유효량의 멜리틴 또는 이것의 구조적 유사체의 폴리펩티드 한합물을 활성 성분으로서 함유하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 히메노프테라 독, 상기 히메노프테라 독의 1종 이상의 활성 단백질 성분, 상기 히메노프테라 독의 1종 이상의 폴리펩티드 성분 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 독성 이하 유효량의 작용제를 활성 성분으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 꿀벌, 독 뒝벌 독, 말벌 독, 흰점 말벌 독, 상기 독의 활성 단백질 성분, 및 이것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 독성 이하 유효량의 작용제를 활성 성분으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포-결합 서열이 부착되었거나 부착되지 않은 양친매성 α헬리스를 활성 성분으로서 독성 이하 유효량 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 성분으로서 독성 이하 유효량의 Gly-lle-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-lle-Ser-Trp-lle-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly을 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 멜리틴 및 구조 유사체 Gly-lle-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-lle-Ser-Trp-lle-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly를 활성 성분으로서 독성 이하 유효량 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, Amfi 1 및 멜리틴-유사GP41 펩티드를 활성 성분으로서 독성이하 유효량 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, Amfi 2 및 멜리틴-유사 GP41 펩티드를 활성 성분으로서 독성이하 유효량 사용하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 감염 치료용 약제 조성물.