CN103122379A - 基因转染实时监测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因转染实时监测的方法，其基于四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺，可在室温下对聚乙烯亚胺进行四甲基异硫氰酸罗丹明标记，合成简单、条件温和、成本低、便于操作。通过标记了四甲基异硫氰酸罗丹明的聚乙烯亚胺静电吸附表达荧光蛋白的质粒DNA，并将质粒DNA转染到细胞内，采用荧光成像的方法实时监测作为载体的聚乙烯亚胺和质粒在细胞内的分布及质粒在细胞内的表达，该方法简单易于实现，适用于绝大多数实验室，便于操作推广。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基因转染实时监测的方法。
背景技术
随着人类基因组计划的完成和细胞生物学技术的进步，基因治疗将在人类攻克肿瘤这一顽症过程中占据重要地位，并将成为一种常见的治疗手段。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的的生物医学新技术。基因转染技术已广泛应用于基因治疗研究中。基因转染是指将具有生物功能的核酸分子（基因）转移或运送到细胞内并使核酸分子（基因）在细胞内维持其生物功能。将转染基因导入细胞进行表达是实现基因治疗的必须步骤。而监测转染基因在进入细胞后在细胞内的亚细胞分布及最终的细胞内定位则有利于研究外源基因进入细胞引起的生物学现象，进而揭示转染基因的特定生物学机制。
近年来，可视化追踪转染基因在细胞内的定位及分布，引起了越来越多的科学工作者的关注。如Mingyuan Gao等基于量子点构建了一种新型的基因载体，利用量子点优良的光学性质，实现了基因转染的同时，对转染过程进行实时，可视化示踪。
然而传统的用于可视化示踪外源的转染基因在细胞内的分布及定位，主要侧重于应用具有光学特点的纳米材料进行标记，过程复杂、成本相对较高。
发明内容
基于此，有必要提供一种快速简易的基因转染实时监测的方法。
一种基因转染实时监测的方法，包括如下步骤：
将四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与含有荧光蛋白表达基因的待转染质粒DNA按照质量比为1:1~4:1的比例在水中混合均匀，室温下反应，得到负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液；
向激光共聚焦成像培养皿中接种1.2~2*104个待转染细胞，在二氧化碳培养箱中于37℃孵育18~24小时，所述培养液的培养基含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗；
更换使用不含胎牛血清且不含双抗的培养基并加入所述负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液，控制所述聚乙烯亚胺的终浓度为1~10μg/mL，继续孵育4~6小时后换用含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基继续孵育18~48小时；及
用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗上述培养的待转染细胞，加入新鲜的含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基进行实时激光共聚焦扫描监测。
在其中一个实施例中，所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺通过如下步骤制备：
配置浓度为10~20mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液及浓度为5~20mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:1~1:40的比例将所述聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与所述四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌5~8小时，之后将得到的混合液置于截留分子量为2000~3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析3~5次，共透析1~2天，再用超纯水透析2~3天，得到所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺。
在其中一个实施例中，所述荧光蛋白表达基因为绿色荧光蛋白表达基因。
在其中一个实施例中，所述待转染细胞为人胚肾细胞。
上述基因转染实时监测的方法基于四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺，可在室温下对聚乙烯亚胺进行四甲基异硫氰酸罗丹明标记，合成简单、条件温和、成本低、便于操作，是一种普适通用的方法。通过标记了四甲基异硫氰酸罗丹明的聚乙烯亚胺静电吸附表达荧光蛋白的质粒DNA，并将质粒DNA转染到细胞内，采用荧光成像的方法实时监测作为载体的聚乙烯亚胺和质粒在细胞内的分布及质粒在细胞内的表达，该方法简单易于实现，适用于绝大多数实验室，便于操作推广。
附图说明
图1为一实施方式的基因转染实时监测的方法流程图；
图2为实施例4的激光共聚焦扫描成像结果图；
图3为实施例5的激光共聚焦扫描成像结果图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对基因转染实时监测方法作进一步详细的说明。
如图1所示，一实施方式的基因转染实时监测的方法，包括如下步骤：
步骤S110，将四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与含有荧光蛋白表达基因的待转染质粒DNA按照质量比为1:1~4:1的比例在水中混合均匀，室温下反应，得到负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液。其中该聚乙烯亚胺标记有四甲基异硫氰酸罗丹明。。
其中，四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺可以通过如下步骤制备：
配置浓度为10~20mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液及浓度为5~20mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:1~1:40的比例将聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌5~8小时，之后将得到的混合液置于截留分子量为2000~3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析3~5次，共透析1~2天，再用超纯水透析2~3天，得到四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺。
荧光蛋白表达基因可以为绿色荧光蛋白表达基因、黄色荧光蛋白表达基因等，优选绿色荧光蛋白表达基因。
步骤S120，向激光共聚焦成像培养皿中接种1.2~2*104个待转染细胞，在二氧化碳培养箱中于37℃孵育18~24小时，培养液的培养基含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗（青霉素和链霉素）。
待转染细胞可以为人胚肾细胞（293T）、非洲绿猴SV40转化肾细胞（cos-7）或人乳腺癌细胞（MCF-7）等，优选人胚肾细胞。
步骤S130，更换使用不含胎牛血清且不含双抗的培养基并加入负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液，控制聚乙烯亚胺的终浓度为1~10μg/mL，继续孵育4~6小时后换用含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基继续孵育18~48小时。
基础陪养基可以为DMEM培养基，不含双抗是由于双抗的存在可能会影响质粒的表达效果，在标准化的转染方法中，一般均会采用不含双抗的培养液。
步骤S140，用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗上述培养的待转染细胞，加入新鲜的含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基进行实时激光共聚焦扫描监测。
上述标记质粒DNA在543nm的激发光激发时，在波长为567~575nm有最大的发射。质粒DNA在人胚肾细胞内表达绿色荧光蛋白，488nm的激发光激发时，在510nm左右有最大的发射。
上述基因转染实时监测的方法基于四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记的聚乙烯亚胺（PEI25kDa），可在室温下对聚乙烯亚胺进行四甲基异硫氰酸罗丹明标记，合成简单、条件温和、成本低、便于操作，是一种普适通用的方法。通过标记了四甲基异硫氰酸罗丹明的聚乙烯亚胺静电吸附表达荧光蛋白的质粒DNA，并将质粒DNA转染到细胞内，采用荧光成像的方法实时监测作为载体的聚乙烯亚胺和质粒在细胞内的分布及质粒在细胞内的表达，该方法简单易于实现，适用于绝大多数实验室，便于操作推广。
以下为具体实施例部分：
实施例1：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺的合成：
①配置浓度为17.86mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液；
②配置浓度为10mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
③按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:10的比例将聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌6小时，6小时后将得到混合液转入截留分子量在3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析3次，透析1天，再用超纯水继续透析2天。
实施例2：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺的合成：
①配置浓度为17.86mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液；
②配置浓度为10mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
③按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:20的比例将聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌6小时，6小时后将得到混合液转入截留分子量在3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析5次，透析2天，再用超纯水继续透析3天。
实施例3：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺的合成：
实施例2：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺的合成：
①配置浓度为17.86mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液；
②配置浓度为10mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
③按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:40的比例将聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌6小时，6小时后将得到混合液转入截留分子量在3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析4次，透析1.5天，再用超纯水继续透析2.5天。
实施例4：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺在实时监测细胞转染中的应用
①取人胚肾细胞（293T）（购于中科院上海细胞库，其组织来源：293T细胞由293细胞（转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系）派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。），在CO2体积百分含量为5%的37℃孵箱中，用含质量百分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液连续培养（Hyclone公司产品，成分：高糖且含4.0mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）。
②取实施例3制得的四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与质粒DNA按照质量比为1.3:1的比例混合均匀，常温下反应30分钟，得标记质粒DNA的水溶液。
③取8腔室共聚焦成像专用皿，向每孔加入400μL培养液（不含双抗，胎牛血清的质量百分数为10%），每孔1.2~2×104个细胞，在CO2体积百分含量为5%的37℃孵箱中孵育24小时。24小时后，换用新鲜的不含胎牛血清且不含双抗的培养液，加入上述的四甲基异硫氰酸罗丹明-PEI/质粒DNA的水溶液，聚乙烯亚胺的最终作用浓度为4μg/mL，继续孵育4小时，换用不含双抗的含质量百分数10%的胎牛血清的培养液继续孵育20小时。
④用pH7.4的磷酸缓冲液轻轻冲洗3次，加新鲜的培养液（不含双抗，胎牛血清的质量百分数为10%），进行激光共聚焦扫描。如图2所示。图2为PEI25kDa与TRITC的摩尔比为1:10时，绿色荧光蛋白在293T细胞中的转染效果：a.明场成像图，b.TRITC的荧光成像图，c.绿色荧光蛋白的成像图，d.为a、b、c的叠加图。
实施例5：四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺在实时监测细胞转染中的应用
采用实施例2制得的四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺，用该四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺用于人胚肾细胞（293T）实时监测表达绿色荧光蛋白的质粒在细胞中的转染，其具体的方法和步骤，同实施例4所述，用于人胚肾细胞（293T）实时监测表达绿色荧光蛋白的质粒在细胞中的转染的方法和步骤。如图3所示。图3为PEI25kDa与TRITC的摩尔比为1:20时，绿色荧光蛋白在293T细胞中的转染效果：a.明场成像图，b.TRITC的荧光成像图，c.绿色荧光蛋白的成像图，d.为a、b、c的叠加图。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种基因转染实时监测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与含有荧光蛋白表达基因的待转染质粒DNA按照质量比为1:1~4:1的比例在水中混合均匀，室温下反应，得到负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液；
向激光共聚焦成像培养皿中加入含待转染细胞的培养液，控制所述待转染细胞密度在1.2~2*104个/孔之间，在二氧化碳培养箱中于37℃孵育18~24小时，所述培养液的培养基含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗；
更换使用不含胎牛血清且不含双抗的培养基并加入所述负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液，控制所述聚乙烯亚胺的终浓度为1~10μg/mL，继续孵育4~6小时后换用含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基继续孵育18~48小时；及
用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗上述培养的待转染细胞，加入新鲜的含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基进行实时激光共聚焦扫描监测。
2.如权利要求1所述的基因转染实时监测的方法，其特征在于，所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺通过如下步骤制备：
配置浓度为10~20mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液及浓度为5~20mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；
按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:1~1:40的比例将所述聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与所述四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌5~8小时，之后将得到的混合液置于截留分子量为2000~3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析3~5次，共透析1~2天，再用超纯水透析2~3天，得到所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺。
3.如权利要求1所述的基因转染实时监测的方法，其特征在于，所述荧光蛋白表达基因为绿色荧光蛋白表达基因。
4.如权利要求1所述的基因转染实时监测的方法，其特征在于，所述待转染细胞为人胚肾细胞。
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