CN103096932B

CN103096932B - 细胞穿透肽及其用途

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Publication number: CN103096932B
Application number: CN201180029464.XA
Authority: CN
Inventors: U·布林克曼; A·哈斯; D·迈塞尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: IL223285A0; US9303075B2; NZ704191A; RU2556800C2; CA2800650A1; JP2013531988A; WO2011157715A1; US20130164219A1; EP2579899B1; EP2579899A2; US20150239947A1; NZ603732A; WO2011157713A3; AU2011267078A1; KR101590674B1; KR20130037206A; SG186347A1; CN103096932A; US9303076B2; JP5726299B2

Abstract

本发明涉及能够内化入细胞的肽分子，其中该肽分子：(a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度；(b)在它的一级氨基酸序列中包含至少25％，优选至少30％带正电荷的氨基酸残基；和(c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ的TAT肽的内化效力的至少80％，优选至少90％的效力内化入细胞。本发明还涉及对应的编码这种肽的核酸分子，以及包含至少一个这种肽的组合物，该肽附着于一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个，其中通过选自共价键和非共价键的连接来达到该附着。此外，本发明还涉及检测这种肽或这种组合物的内化行为的方法，其包括：(a)对一个或多个细胞施用该肽或组合物；和(b)检测该肽或组合物的内化。最后，本发明涉及这种肽或这种组合物在转化或转染一个或多个细胞中的用途，以及在预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症中的用途。

Description

细胞穿透肽及其用途

技术领域

本发明涉及人细胞穿透肽(CPP)的鉴定和功能表征及其用途，尤其是作为转染载体。

背景技术

细胞质膜是阻止细胞摄取非主动输入的大多数分子的有效屏障，因此也妨碍治疗性物质的定向递送。仅小范围具有特定分子量、极性和/或净电荷的分子能够(被动)扩散通过细胞膜。所有其他分子都必须例如通过受体介导的胞吞作用或通过结合ATP的转运分子主动转运。此外，还可以例如利用电穿孔、阳离子脂质/脂质体、显微注射、病毒递送或包封在聚合物中来人为迫使分子穿过细胞膜。但是，这些方法主要用来递送疏水分子。此外，与这些方法相关的显著副作用及它们的适用性主要限于体外用途的事实妨碍了它们成为用于将药物或其他治疗活性剂递送至细胞来预防或治疗医学病症的有效工具。

具体而言，定向递送的需要也已成为基于RNAi(RNA干扰)的药物研发中的主要挑战。这类药剂包含干扰引起疾病或促进疾病的基因表达的小RNA分子(例如siRNA、miRNA或shRNA)。2001年在哺乳动物细胞中证实RNAi(Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411，494-498)之后，很快认识到，可以利用此序列特异性转录后基因沉默机制来研发一类新的药剂，该药剂还可以是用于治疗迄今的治疗干预不易接近的疾病的有希望的手段(De Fougerolles，A.等(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6，443-453)。

但是，由于RNAi发生在细胞溶胶中，任何基于RNA的药物都必须穿过细胞膜来发挥其疗效。迄今已描述了几种方法来达到此目标，如使用脂质(Schroeder；A.等(2010)J.Intern.Med.267，9-21)、病毒载体(Liu，Y.P.和Berkhout，B.(2009)Curr.Top.Med.Chem.9，1130-1143)和聚阳离子纳米颗粒(Howard，K.A.(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61，710-720)。

用于使分子易位通过细胞膜的另一种方法是使用细胞穿透肽(CPP)(也称为蛋白质转导结构域(PTD)或膜易位序列(MTS)；综述于例如Fonseca，S.B等(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61，953-964；Heitz，F.等(2009)Br.J.Pharmacol.157，195-206中)。

就它们的一级氨基酸序列和它们的结构二者而言，CPP是一组异源肽分子。CPP的突出实例包括HIV-1TAT易位结构域(Green；M.和Loewenstein，P.M.(1988)Cell 55，1179-1188)和来自果蝇属(Drosophila)的触角足(Antennapedia)蛋白质的同源域(Joliot；A.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美国88，1864-1868)。确切的易位机制仍有争议。触角足蛋白质的突变研究显示，称为穿透肽(penetratin)或pAntp的16个氨基酸的序列(Derossi，D.等(1994)J.Biol.Chem.269，10444-10450)对膜易位而言是必要且充分。随后，开发了其他蛋白质衍生的CPP，如HIV-1Tat蛋白质的碱性序列(Vives，E.等(1997)J.Biol.Chem.272，16010-16017)。开发的合成肽是两亲性模型肽MAP(Oehlke，J.等(1998)Biochim.Biophys.Acta 1414，127-139)。

已显示反义DNA或肽核酸(PNA)与CPP的偶联在体内发挥希望的作用。但是，对于哪些特征是CPP发挥其易位功能必需的仍有疑问。一般而言，已在不同CPP之间发现了小的序列和/或结构相似性。到目前为止，唯一始终存在的特征是非常高的碱性(带正电荷)氨基酸含量产生净正电荷。因此，假定CPP最初与细胞膜中的脂质或蛋白质(蛋白聚糖)的带负电荷的首基(head group)结合。但是，一旦结合，该肽仍在膜结合区室内侧。进一步的摄取机制仍是广泛争论的问题。已提出，CPP或者“逆行”转运至ER，它们在ER中进入细胞易位装置(Fischer，R.等(2004)J.Biol.Chem.279，12625-12635)，或者它们直接跨膜易位(Rothbard，J.B.等(2005)Adv.Drug Deliv.Rev.57，495-504)。取决于内化机制，已知的CPP主要定位在细胞核中，或者在它们内化在小泡中的情况下，主要保留在这些小泡内侧，只有小部分释放进入细胞质。

许多CPP对所应用的细胞具有严重副作用，考虑到衍生CPP的大多数蛋白质作为例如抗微生物物质或毒素发挥作用的事实，这是可以理解的。例如，CPP可以导致由膜破裂引起的细胞质泄露，且还可以干扰膜蛋白质正常发挥功能。CPP还可以显示细胞毒性作用，如transportan，其影响GTP酶活性(Soomets，U.等(2000)Biochim.Biophys.Acta 1467，165-176)。此外，越来越多的证据显示，许多CPP仅在体内环境中不能满足的某些非常特异的条件下发挥它们的功能。另一缺点是，取决于靶细胞，CPP可以在细胞中快速降解。最后，由于许多已知的CPP衍生自非人蛋白质，常观察到毒性和/或免疫原性作用，其可以干扰这些肽的利用，例如在人类中用于治疗应用。

因此，仍然存在对克服上述限制的改进的细胞穿透肽的需要。具体而言，存在对这样的细胞穿透肽的需要，该细胞穿透肽代表适宜的转染小泡或负荷(cargo)，使得能够高效地将诸如治疗剂的化合物递送入靶细胞而不产生显著的细胞毒性和/或免疫原性作用。

此外，还存在对包含这类CPP的组合物以及对将这类CPP用作用于诊断和治疗应用的分子工具的方法的需要。

因此，本发明的目的是提供这类CPP及对应的组合物和方法。

发明概述

在一方面，本发明涉及能够内化入细胞的肽分子，其中该肽分子：(a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度；(b)在其一级氨基酸序列中包含至少25％，优选至少30％带正电荷的氨基酸残基；和(c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：1)的TAT肽的内化效力的至少80％，优选至少90％的效力内化入细胞。

在具体实施方案中，该肽的至少部分形成α-螺旋二级结构。

优选地，该肽具有哺乳动物来源，尤其优选具有人来源。

在其他优选实施方案中，该肽具有选自以下的氨基酸序列：GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(SEQ ID NO：2)；IREIME

KFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR(SEQ ID NO：3)；YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD(SEQ ID NO：4)；SKVRFCSGRKRPVRRRPEPQLKGIVTRLFS(SEQ ID NO：5)；SMSVLEPGTAKKHKGGILRKGAKLFFRRRH(SEQ ID NO：6)；QRKIGGRGRIISPYRTPVLRRHRYSIFRST(SEQ ID NO：7)；QHVRIRVIKKKKVIMKKRKKLTLTRPTPLV(SEQ ID NO：8)；FHFFPRRPRIHFRFPNRPFVPSRCNHRFPF(SEQ ID NO：9)；FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID NO：10)；及在其总长度内与SEQID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

在尤其优选的实施方案中，该肽具有选自以下的氨基酸序列：GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(SEQ ID NO：2)；IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR(SEQ ID NO：3)；YLKVVRKHHRVIAGQFFGH HHTDSFRMLYD(SEQ ID NO：4)；及在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明涉及编码上文定义的肽的核酸分子。

还在另一方面，本发明涉及包含上文定义的核酸分子的载体。

还在另一方面，本发明涉及包含上文定义的载体的宿主细胞。

在另一方面，本发明涉及产生上文定义的肽的方法，其包括：(a)在适宜条件下培养上文定义的宿主细胞；和(b)分离所产生的肽。

还在另一方面，本发明涉及包含至少一种上文定义的肽的组合物，该肽附着于一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个，其中通过选自共价键和非共价键的连接来达到该附着。

在具体实施方案中，该组合物的该至少一种肽附着于一个或多个其他肽。优选地，该一个或多个其他肽至少部分形成α-螺旋二级结构。在具体实施方案中，该一个或多个其他肽是促凋亡肽。

在另一方面，本发明涉及产生上文定义的组合物的方法，其包括：(a)提供至少一种上文定义的肽；和(b)使该至少一种肽与一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个接触，从而允许形成附着。

还在另一方面，本发明涉及检测上文定义的肽或上文定义的组合物的内化行为的方法，其包括：(a)对一个或多个细胞施用该肽或该组合物；和(b)检测该肽或该组合物的内化。

在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种上文定义的肽或上文定义的组合物，且可选地进一步包含一种或多种可药用赋形剂和/或添加剂。

在另一方面，本发明涉及上文定义的肽或上文定义的组合物在转化或转染一个或多个细胞中的用途。

还在另一方面，本发明涉及上文定义的肽或上文定义的组合物用于预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症。

还在另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症的方法，其包括对受试者施用至少一种上文定义的肽或上文定义的组合物。

在另一方面，本发明涉及成套试剂盒(kit-of-part)，其包含以下中的至少任一个：(a)上文定义的肽；(b)上文定义的核酸分子；(c)上文定义的载体；(d)上文定义的宿主细胞；和(e)上文定义的组合物。

本发明的其他实施方案将从后文的详细描述显而易见。

附图简述

图1：用于鉴定人细胞穿透肽的生物信息学方法。

所显示的是所应用的筛选方法的示意图。包括SwissProt数据库中的所有人条目以及描述和Gene Ontology(GO)注释(A)，用30个氨基酸残基的滑动窗(sliding window)进行分析(B)。为了鉴定假定的细胞穿透肽(CPP)，应用生物信息学过滤(C)：第一，仅选择具有10个或更多个正电荷的肽；第二，仅选择免疫原性可能性低的胞外蛋白质(“步骤2和3”)。为了减少肽的数目，选择了几种方法：最高等电点(IEP)和最高疏水性的交集；与HIV衍生的TAT肽序列的序列相似性；以及文献和BLAST结果的仔细分析。

图2：500种随机肽的疏水性对IEP作图。

从10.5×10⁶种人三十聚体的整体随机选择500种肽，用它们的疏水性对它们的IEP作图。加入对照肽TAT、poly-Arg、REV、鱼精蛋白和INF7(非填充方块)。非毒性和非转染肽显示为黑点，转染毒性肽显示为蓝点，毒性肽显示为红点，非毒性转染肽显示为绿点。

图3：所分析的所有肽的毒性对转染能力作图。

针对各20μM的Aha1siRNA和萤光素酶siRNA下的平均GAPDHmRNA水平(y轴，“毒性”)，以及各20μM下的萤光素酶的Aha1/GAPDH和Aha1 siRNA的Aha1/GAPDH各自的差异(x轴，“转染”)，对针对它们转染siRNA的能力和它们的细胞毒性分析的所有肽作图。用红色虚线显示毒性(70％平均GAPDH mRNA含量)和转染(＞TAT，18％)的阈值。虚线产生4个象限：左上：非转染非毒性肽；右上：转染非毒性肽；左下：毒性肽；右下：转染毒性肽。嵌入框显示处于作图区域范围之外的毒性肽。

图4：肽WNT16的分析。

WNT16是非毒性、无转染能力(即，非转染)的肽的实例。实验方法与图3中相同。将在1μM下获得的mRNA值设为100％来显示剂量依赖性效应。生存力表示为培养基对照的百分比。Aha1siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图5：肽BPIL3和FALL的分析。

BPIL3是毒性、无转染能力的肽的实例。实验方法与图3中相同。(A)指出Aha1和GAPDH的水平显示相似的行为，GAPDH显示更高的敏感性。这解释了Aha1/GAPDH值的增加。为了显示转染效率为它的毒性所掩蔽的毒性肽的可能的治疗窗口，用FALL进行了相同的分析(B)。将在 1μM下获得的两种肽(A，B)的mRNA值设为100％来说明剂量依赖性效应。将两种肽(A，B)的生存力表示为培养基对照的百分比。Aha1 siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图6：肽CU025的分析。

CU025是毒性、具有转染能力的肽的实例。实验方法与图3中相同。将在1μM下获得的mRNA值设为100％来显示剂量依赖性效应。生存力表示为培养基对照的百分比。Aha1 siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图7：非毒性、具有转染能力的肽的分析。

CPXM2、ASM3B和NRTN是非毒性、具有转染能力的肽的实例。实验方法与图3中相同。作为对照，测定了TAT和Poly-Arg的Aha1/GAPDH比值(A)。CPXM2(B)和ASM3B(C)都显示Aha1 mRNA对GAPDHmRNA的浓度依赖性降低，而不显示显著干扰细胞生存力。NRTN的详细分析(D)产生Aha1 mRNA对GAPDH mRNA的强烈降低，而对细胞生存力无显著的剂量依赖性效应。(A、B、C、D)在所有情况下，将在1μM下获得的mRNA值设为100％来显示剂量依赖性效应。生存力表示为培养基对照的百分比。Aha1 siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图8：所选择的肽的凝胶移位分析。

为了显示肽TAT(A)、NRTN(B)和WNT16(D)各自的复合体形成，将500μg siRNA双链体与所示摩尔比的肽孵育1小时，并利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来分析。此分析分别显示siRNA与TAT、NRTN和WNT16之间的复合体形成。为了显示NRTN对siRNA对溴化乙锭的可及性的影响，在存在和缺乏蛋白酶K的情况下孵育复合体(C)。

图9：NRTN介导的转染足以引起细胞表型。

通过分析肽转染靶向人Eg5 mRNA的siRNA双链体的能力来研究NRTN的siRNA序列特异性。通过进行CytoTox-Glo细胞毒性测定(Promega Inc.)来测定依赖于Eg5敲减的凋亡诱导。将在1μM下获得的mRNA值设为100％来显示剂量依赖性效应。凋亡的诱导表示为培养基对照的百分比。Aha1 siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图10：GDNF和NRTN的序列比对。

大鼠GDNF和人NRTN的氨基酸序列比对显示它们的关系。相同的氨基酸用白色背景上的浅灰色表示，相似的氨基酸用浅灰色背景上的黑色表示，不同的氨基酸用白色背景上的黑色表示。指出了大鼠GDNF的α-螺旋序列。所使用的NRTN肽在框内。

图11：NTRN具有α-螺旋结构元件。

FALL(A)、NRTN(B)和TAT(C)肽的UV CD光谱学分析。分别在缺乏(“H2O”)或存在10％、25％和50％三氟乙醇(TFE)的情况下，使用0.1mg/ml的肽，以0.1nm的数据间距(data pitch)和1nm的带宽从195nm至260nm测定光谱。

图12：NRTN、TAT和FALL作为细胞穿透肽发挥作用。

包含N端FITC标记的TAT(A)、WNT16(B)、FALL(C)和NRTN(D)肽的FACS分析。在肽的存在下孵育细胞3小时，用蛋白酶K处理30分钟，并通过FACS在FITC通道中分析内化的肽。黑色线表示1μM下的信号，浅灰色表示5μM下的信号，深灰色线表示10μM下的信号。

图13：NRTN在血清条件下显示活性。

针对它在转染培养基中缺乏(A)和存在(B)血清的情况下转染siRNA双链体的能力分析了NRTN。实验方法与图3中相同。在包含10％FCS的正常RPMI 1640生长培养基中进行测定(B)，或在OptiMEM降血清培养基中3小时后将培养基换回正常生长培养基来进行测定(A)。将在1μM下获得的mRNA值设为100％来显示剂量依赖性效应。Aha1siRNA显示为黑色填充方块；萤光素酶siRNA显示为非填充圆。

图14：NRTN摄入人脑内皮细胞。

将5μM的异硫氰酸荧光素(FITC)缀合NRTN肽(分别为N端和C端缀合)与hCMEC/D3脑内皮细胞在37℃孵育1h。随后，洗涤并固定细胞。用荧光显微镜采集图像。在两种情况下，肽都定位至胞内内体结构。

图15：NRTN介导的促凋亡的Nur77肽的细胞摄取。

在多种浓度的NRTN(方块)、Nur(圆)和NurNRTN(三角)肽的存在下孵育MCF-7人乳腺癌细胞24小时。各自的氨基酸序列在下图中给出。用于评估细胞生存力(从而评估凋亡的诱导)的实验方法与图3中相同。

图16：NRTN介导的促凋亡的4E-BP1肽的细胞摄取。

在多种浓度的4E-BP1(圆)、TAT4E-BP1(方块)和NRTN4E-BP1(三角)肽的存在下孵育MCF-7人乳腺癌细胞24小时(上图)。分别将两种融合肽(实线)各自的作用进一步与其非活性变体(TATinact4E-BP1和NRTNinact4E-BP1；虚线)相比较(中图)。各自的氨基酸序列在下图中给出。用于评估细胞生存力(从而评估凋亡的诱导)的实验方法与图3中相同。

发明详述

本发明基于以下意外发现，通过组合候选多肽的生物信息学筛选和随后的实验评价，可以鉴定出几种CPP，与之前的“黄金标准”参考肽TAT相比，其具有较好的功能谱，尤其是在血清的存在下更高的总体转染效力、更高的转染活性，以及更低的细胞毒性程度。令人惊奇地，就它们的一级氨基酸序列而言，这些CPP不显示任何显著的相似性。因此，这些肽可以在用于治疗干预的新的有效递送剂的开发中作为模型。

可以在缺乏本文未明确公开的任意一个或多个组成部分、一个或多个限制的情况下适宜地实施下文说明性描述的本发明。

在本说明书和权利要求中使用术语“包含”时，它不排除其他组成部分或步骤。为了本发明的目的，认为术语“由......组成”是术语“包含”的优选实施方案。如果后文定义某个组包含至少某数目的实施方案，则这还将理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

在提到单数名词时使用不定冠词或定冠词(例如，“一”、“一个”或“该”) 时，除非明确地另有说明，这包括了该名词的复数形式。

在本发明的背景中显示数值的情况下，技术人员将理解，在准确度区间内保证所讨论的特征的技术作用，该区间通常包含所给出的数值的±10％、且优选±5％的偏差。

此外，说明书和权利要求中用术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等来在相似的组成部分之间进行区分，并非必然用于描述相继顺序或时间顺序。应理解，这样使用的术语在适当环境下可互换，且本文描述的本发明的实施方案可以以不同于本文所描述或说明的顺序操作。

下文将在使用该术语的背景中给出其他术语的定义。提供以下术语或定义仅仅是为了辅助理解本发明。不应将这些定义解释为具有小于本领域普通技术人员的理解的范围。

在第一方面，本发明涉及能够内化入细胞的肽分子，其中该肽分子：

(a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度；

(b)在其一级氨基酸序列中包含至少25％，优选至少30％带正电荷的氨基酸残基；和

(c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：1)的TAT肽的内化效力的至少80％，优选至少90％的效力内化入细胞。

本文所用的术语“肽分子”(本文中也称为“肽”)指任意天然存在或合成(例如，通过化学合成或重组DNA技术产生)的线性大分子，其包含通过肽键连接的多个天然氨基酸残基或修饰氨基酸残基。这类肽可以形成由至少两个相同或不同的肽分子组成的寡聚体。

本发明的肽具有至少10个氨基酸残基(例如，10、11、12、13或14个氨基酸残基)的长度，且优选具有至少15个氨基端残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少35个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基或至少45个氨基酸残基的长度。在具体实施方案中，本发明的肽具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸残基的长度。

本文所用的术语“天然氨基酸残基”指任意天然掺入肽中的22种“标准”氨基酸。在这22种中，20种由一般遗传密码直接编码。其余两种(硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸)通过独特的合成机制掺入蛋白质中。通常，本发明的肽的氨基酸残基作为L-异构体存在。在一些实施方案中，本发明的肽的一个或多个氨基酸残基作为D-异构体存在。本文所用的术语“修饰氨基酸残基”指非标准氨基酸，如翻译后修饰的氨基酸。翻译后修饰的实例尤其包括磷酸化、糖基化、酰化(例如，乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化)、烷化、羧化、羟化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质变化(例如，β-消除脱亚氨化(deimidation)、脱酰胺作用)和结构变化(例如，二硫键的形成)。

按照一般惯例从氨基(N)端至羧基(C)端书写本文定义的肽的氨基酸序列。但是，对应的“反转”肽也在本发明之内。本文所用的术语“反转肽”指具有与它们的“规则”对应物相同的序列但取向相反(即，从C端至N端)的肽。例如，“规则”TAT肽具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ。对应的“反转”TAT肽具有氨基酸序列QPPRRRQRRKKRG。

本发明的肽在它们各自的一级氨基酸序列中(即，在它们的全长内)具有至少25％，优选至少30％带正电荷的氨基酸残基。本文所用的术语“带正电荷的氨基酸”(本文中还称为“碱性氨基酸”)指存在于特定肽中的赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)残基的整体。在具体实施方案中，本发明的肽在它的一级氨基酸序列中包含25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％带正电荷的氨基酸残基。在其他实施方案中，本发明的肽在它们各自的一级氨基酸序列中包含至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％带正电荷的氨基酸残基。

本文所用的术语“能够内化入细胞”指肽穿过细胞膜(尤其包括外侧“限制性”细胞膜(通常还称为“质膜”)、内体膜和内质网膜)和/或指导给定的药剂或负荷穿过这些细胞膜的能力。这种穿过细胞膜在本文中还称为“细胞穿透”。因此，具有该穿过细胞膜的能力的肽在本文中称为“细胞穿透肽”。在本发明的背景中，想象任意可能的内化机制，包括依赖能量(即，主动)的转运机制(例如胞吞)和不依赖能量(即，被动)的转运机制(例如扩散)二者。本文所用的术语“内化”将理解为涉及至少部分穿过细胞质膜进入细胞质的肽的定位(不同于在诸如小泡、内体的不同细胞区室中或在细胞核中的定位)。在具体实施方案中，所利用的给定的转运机制保证内化的肽或组合物的至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少2％、至少5％或至少10％定位入细胞质。

本发明的肽以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：1；还见Vives；E.等(1997)，上文)的TAT肽的内化效力的至少80％，优选至少90％的效力内化入细胞。换言之，与参考肽(就细胞穿透肽而言，TAT代表“黄金标准”)相比，表征该肽的功能活性。在具体实施方案中，本发明的肽以TAT肽的内化效力的80％、85％、90％或95％的效力内化。在具体的优选实施方案中，本发明的肽以至少与TAT肽相同的效力(即，100％)内化。尤其优选地，本发明的肽以比TAT肽高的效力(即，超过100％或至少101％)内化，例如以TAT肽的内化效力的105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。

本文所用的术语“内化效力”将以广义理解。该术语不仅指本发明的肽穿过细胞质膜的程度(即，内化行为本身)，还指该肽指导给定的药剂或负荷穿过细胞质膜的效率(即它的转染能力；本文中还称为“转染性(transfectivity)”)。本领域中建立了测定给定多肽的内化行为和/或转染能力的许多方法，例如，通过将可检测标记(例如荧光染料)附着于该肽(和/或带转染的负荷)或通过将该肽与报道分子融合，从而使得能够在发生该肽的细胞摄取时例如利用FACS分析或通过特异性抗体来检测(见例如Ausubel，F.M.等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley &Sons，Hoboken，NJ，美国)。技术人员还充分了解如何选择将在这类方法中利用的肽和(如果适用)负荷的各自的浓度范围，其可以取决于肽的性质、负荷的大小、所使用的细胞类型等。

在其他实施方案中，本发明的肽内化后不对它们各自的靶细胞产生显著的细胞毒性和/或免疫原性作用，即，它们不干扰细胞生存力(至少在足以介导细胞转染和/或穿透的浓度下)。本文所用的术语“不显著的”将理解为本发明的肽内化后杀死少于50％，优选少于40％或30％、尤其是少于20％或10％的靶细胞。在其他实施方案中，肽内化入细胞时产生的细胞毒性(和/或免疫原性)作用与具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQID NO：1)的TAT肽产生的对应的作用相同或比它小。在具体实施方案中，肽内化入细胞时产生的细胞毒性(和/或免疫原性)作用比TAT肽产生的作用的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％。技术人员充分了解测定给定化合物的细胞毒性和/或对其应用这种化合物的给定靶细胞的生存力的方法(还见例如Ausubel，F.M.等(2001)，上文)。对应的测定试剂盒可从多种供应商购得。

在具体实施方案中，可以通过例如利用化学合成或重组DNA技术在肽中引入一个或多个修饰来“掩蔽”本发明的肽可能的内在细胞毒性和/或免疫原性作用。这类修饰可以涉及例如官能团的添加、去除或取代，或这类官能团的位置的变动。技术人员充分了解如何针对给定的肽达到这种“掩蔽”。

在其他实施方案中，本发明的肽分子包含至少一个构造结构域(structured domain)，即，形成(即折叠为)稳定二级结构(即，在线性序列中相互靠近定位的氨基酸残基的特定空间排列)的元件。通常，氨基酸残基之间的空间关系属于规则类型，产生本领域公知的周期性结构，如α-螺旋(棒状紧密螺旋结构)和β-折叠股(延长的序列，多个这类序列可选地形成平行或反向平行的β-折叠)。在本发明内，肽分子可以包含一个包含在非构造环境中的这种构造结构域，或者可以包含相互分开的两个或多个这种构造结构域(属于相同的类型或属于不同的类型，例如两个α-螺旋或一个α-螺旋和一个β-折叠)。在一些实施方案中，肽分子在它的全长内形成二级结构(即，不包含非构造区)。

在优选实施方案中，本文定义的肽分子的至少部分形成α-螺旋二级结构。该α-螺旋元件可以包含至少4个或6个氨基酸残基，且优选至少8个或10个氨基酸残基。在具体实施方案中，本发明的肽分子包含单个α-螺旋元件作为唯一的二级结构。

在优选实施方案中，本发明的肽分子具有哺乳动物来源，即，它们衍生自诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猪、母牛、马或猴的生物。尤其优选地，该肽分子具有人来源，即，它们衍生自人序列或代表人序列。本文所用的术语“衍生自人序列”指与天然存在的人序列相比具有少量修饰(例如，一个或多个氨基酸取代)的人来源的序列。本文所用的术语“代表人序列”指与天然存在的人序列相同(即，不具有序列变异或修饰)的序列。

在其他优选实施方案中，本发明的肽分子具有选自以下的氨基酸序列：GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(NRTN肽；SEQ ID NO：2)；IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR(CPXM2肽；SEQ ID NO：3)；YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD(ASM3B肽；SEQ ID NO：4)；SKVRFCSGRKRPVRRRPEPQLKGIVTRLFS(FGF 12肽；SEQ ID NO：5)；SMSVLEPGTAKKHKGGILRKGAKLFFRRRH(CU025肽；SEQ ID NO：6)；QRKIGGRGRIISPYRTPVLRRHRYSIFRST(IGS10肽；SEQ ID NO：7)；QHVRIRVIKKKKVIMKKRKKLTLTRPTPLV(CPXM肽；SEQ ID NO：8)；FHFFPRRPRIHFRFPNRPFVPSRCNHRFPF(CD026肽；SEQ ID NO：9)；FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(FALL39Var.1肽(也称为FALL肽；SEQ ID NO：10)；和在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

在尤其优选的实施方案中，该肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

本文所用的术语“百分比(％)序列同一性”描述了与构成模板氨基酸序列全长的氨基酸残基数相比，两个或多个比对的氨基酸序列的相同氨基酸的匹配数。换言之，在将比对用于两个或多个序列或子序列(即，从其衍生的片段或截短)时，在为了用本领域已知的序列比较算法测量的比较窗内或指定区域内的最大对应而比较和比对(子)序列时，或在手动比对和目检时，可以测定相同的氨基酸残基的百分比。因此，以上定义不仅适用于SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：10的全长序列，还适用于包含在SEQID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个中的至少10个，优选至少15个氨基酸的序列的任意截短。

为了评价两个蛋白质序列之间的同一性水平，可以用本领域已知的适宜计算机程序对它们进行电子比对。这类程序包括BLAST(Altschul，S.F.等(1990)J.MoI.Biol.215，403-410)、FASTA(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)Science 227，1435-1441)或执行Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)J.MoI.Biol.147，195-197)等。除提供配对序列比对外，这些程序还报告序列同一性水平(通常以百分比同一性)和发生偶然比对的概率(P值)。对于氨基酸序列，BLASTP程序用3的字长(W)和10的期望值(E)作为默认值。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff，S.和Henikoff，J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.美国89，10915-10919)使用50的比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝4和两条链的比较。可以利用诸如CLUSTALW(Higgins，D.等(1994)Nucl.Acids Res.2，4673-4680)的计算机程序来比对两个以上序列。此外，CLUSTALW在其同一性计算中考虑序列缺口。

只要氨基酸序列在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性，它就在本发明的实施方案之内。存在的氨基酸改变的类型(例如，末端添加、插入、缺失和取代一个或多个氨基酸残基或其组合)不相关。在具体实施方案中，“氨基酸序列衍生物”与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个具有至少70％、至少72％、至少74％、至少76％或至少78％总体序列同一性。优选地，“氨基酸序列衍生物”与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：10中的任一个具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％总体序列同一性。

在第二方面，本发明涉及编码上文定义的肽分子的核酸分子。

本文所用的术语“核酸分子”指编码本发明的肽的任意核酸。这类核酸分子的实例包括天然存在的核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及化学合成或利用重组基因技术产生的人工设计的核酸，包括例如核酸类似物，例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)等(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，Molecular cloning：A laboratorymanual(第3版)Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。天然存在的核酸的具体实例包括DNA序列(如基因组DNA或cDNA分子)、以及RNA序列(如hnRNA、mRNA或rRNA分子)或其反向互补核酸序列。这类核酸可以具有任意长度，且可以是单链或双链分子。通常，本发明的靶核酸长度为30至5000个核苷酸，例如30至3000个核苷酸、45至2000个核苷酸、60至1000个核苷酸或75至500个核苷酸。本文所用的术语“核苷酸”将理解为指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸二者(即，RNA和DNA分子)。

优选地，本发明的核酸分子作为使得能够表达它的遗传构建体(通常还称为“表达盒”)的组成部分存在。如果遗传构建体包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，且如果这类序列与编码肽的核苷酸序列“有效连接”，则将它称为“能够表达核酸分子”或“能够允许核酸(即，核苷酸)序列的表达”。有效连接是这样的连接，其中调节序列元件和待表达的序列(和/或待表达的序列等)以使得能够进行基因表达的方式连接。

进行基因表达所必需的调节区的精确性质可以在物种间不同，但一般而言，这些区域包含启动子，在原核生物中，该启动子包含启动子本身(即，指导转录起始的DNA元件)以及在转录为RNA时将发出起始翻译的信号的DNA元件二者。这类启动子区通常包含涉及转录和翻译的起始的5’非编码序列，如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件，或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’帽化元件。这些区域还可以包含增强子或抑制子元件，以及翻译信号和用于将天然多肽靶向至宿主细胞的特定区室的前导序列。适宜的原核启动子尤其包括大肠杆菌(E.coli)的lacUV5、trp、tet和tac启动子及T7噬菌体启动子。适宜的真核启动子尤其包括SV40早期和晚期启动子、RSV和CMV启动子及酵母A0X1和GAL1启动子。

此外，3’非编码序列可以包含涉及转录终止、多聚腺苷化作用等的调节元件。但是，如果这些终止序列在特定宿主细胞中不具有令人满意的功能，则可以用在该细胞中具有功能的信号取代它们。技术人员充分了解，适合用于在给定环境中表达核酸分子的所有这些调节元件及这类元件的选择在他的常识之内。

可选地作为表达盒的部分的本发明的核酸分子还可以包含在载体或其他克隆载体中。因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明的核酸分子的载体。

本发明的载体可以是例如质粒、黏粒、噬粒、病毒、噬菌体、人工染色体或遗传工程中常用的其他载体。优选地，该载体是能够指导本发明的核酸分子表达的表达载体。除上述调节序列和待表达的核酸序列外，这种表达载体可以包含至少一个复制起点，以及衍生自与用来进行表达的宿主相容的物种的控制序列，以及赋予转染细胞可选择的表型的一个或多个选择标记。包含一个以上复制起点的特殊设计的载体(即，穿梭载体)允许在不同宿主间穿梭，如在细菌和真菌细胞之间或在细菌和动物细胞之间。适合用于原核细胞的复制起点包括例如ColE1和M13。哺乳动物载体中的示例性复制起点是SV40。适宜的原核选择标记尤其包括卡那霉素、氨苄青霉素和四环素抗性基因。在真核生物中，二氢叶酸还原酶基因和谷氨酰胺合酶基因代表了可以利用的示例性选择标记。本领域中良好地建立了可以用来设计和/或修饰重组载体的方法(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)。

大量适宜的载体市售可得，且为技术人员公知，技术人员还能够确定哪些载体适合用于在给定环境中表达目的核酸分子。这类载体的实例尤其包括原核载体，如pUC系列、pBluescript、pET系列、pCRTOPO、λgt11、pBBR1-MCS系列和pBC2，以及与哺乳动物细胞中的表达相容的载体，如pCEP4、pXT1、pSG5、pRSVneo、pSV2-dhfr、pcDNA3 pSIR和plRES-EGFP。适合用于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的基因表达的质粒载体的实例尤其包括pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K。

备选地，本文定义的本发明的核酸分子还可以插入载体，使得发生与另一核酸分子的翻译融合。该其他核酸分子可以例如编码肽或蛋白质，该肽或蛋白质提高本发明的肽的溶解度和/或便于纯化本发明的肽。这类载体的实例包括pET32、pET41和pET43。

在另一方面，本发明涉及包含上文定义的载体的宿主细胞。

可以利用多种转化、转导或转染方法来达到将核酸载体引入宿主细胞，所有这些方法在本领域中都已完善(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)。

在本发明内，引入的载体可以作为独立的遗传单位在宿主细胞中增殖和维持，或者它可以通过遗传重组稳定整合入宿主细胞的基因组。这种重组可以通过非同源重组发生在基因组的随机位置，或者通过同源重组或经位点特异性整合酶发生在基因组的特定位置。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选真核细胞。适宜的原核细胞尤其包括大肠杆菌的菌株(例如BL21、DH5α、XL-1-Blue、JM105、JM110和)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌属物种(Salmonella spec.)和根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。适宜的真核宿主细胞尤其包括酵母(例如巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫细胞(例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)S2细胞和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞)和植物细胞。优选地，本文利用的真核宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。

适宜的哺乳动物细胞尤其包括永生化细胞系，如人Hela、HEK293、H9、MCF7和Jurkat细胞；小鼠NIH3T3、C127和L细胞；猿猴COS1和COS7细胞；鹌鹑QC1-3细胞；及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。所有这些宿主细胞都可以获自诸如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(Manassas，VA，美国))或德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Braunschweig，德国))的保藏中心，以及获自多种商业供应商。原代哺乳动物细胞(即，直接获自生物(处于任意发育阶段，尤其包括胚细胞、胚胎、幼体期和成年)的细胞)也在本发明之内。适宜的原代细胞的实例包括心肌细胞、原代肝细胞、成纤维细胞、神经元细胞以及干细胞。衍生自原代细胞的永生化稳定细胞系也在本发明之内。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞构成多细胞生物的部分。换言之，本发明还涉及包含至少一个本文定义的宿主细胞的转基因生物。优选地，该转基因生物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猪、母牛、马、猴或人。

在另一方面，本发明涉及产生本文定义的肽的方法，其包括：

(a)在适宜条件下培养本发明的宿主细胞；和

(b)分离所产生的肽。

可获得大量适宜的方法来在适当的宿主细胞中产生肽。如果利用单细胞宿主，如原核生物或哺乳动物细胞系，则本领域技术人员可以回复到多种培养条件。方便地，通过已建立的技术(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)来从所培养的细胞的培养基、裂解物或提取物或从分离的(生物)膜收获所产生的肽。在宿主细胞是多细胞生物的部分的情况下，这些细胞的级分可以作为用于分离本发明的肽的来源。

用于上述宿主细胞的适当的培养基和条件为本领域公知。例如，适合用于培养细菌的条件涉及在通气条件下在Luria Bertani(LB)培养基中培养它们。为了提高表达产物的产率和溶解度，可以用本领域已知的适宜添加剂(如蛋白伴侣、稀有密码子tRNA、辅基(prostethic group)、辅因子、金属离子等)缓冲或补充培养基。通常，可以在4℃至37℃培养大肠杆菌，精确的温度或温度顺序取决于待表达的分子。一般而言，技术人员还了解到，可以必须使这些条件适应宿主的需要和所表达的肽或蛋白质的要求。如果用诱导型表达系统(例如，四环素诱导的Tet-On/Tet-Off系统或蜕皮激素(ecdysone)诱导系统)来调节目的核酸分子在宿主细胞中的表达，则可以通过加入适当的诱导剂来诱导表达。

取决于所利用的具体细胞类型及其具体的生长需要，可以例如在补充了10％(v/v)FCS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基或DMEM(Dulbecco′s Modified EagleMedium)中进行哺乳动物细胞培养。备选地，可以使用具有降低的血清浓度的生长培养基，如OptiMEM。可以在5％CO₂的水饱和空气中37℃孵育细胞。

适合用于昆虫细胞培养的培养基尤其包括补充了10％FCS的TNM或SF900培养基。昆虫细胞通常作为贴壁或悬浮培养物培养在27℃。

适合用于原核细胞和真核细胞二者的表达流程为本领域公知(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)。各自的测定系统、试剂盒和试剂可从多种供应商购得。

用于产生本发明的肽分子的备选方法涉及mRNA的体外翻译。适宜的无细胞体外翻译系统尤其包括兔网织红细胞裂解物、小麦胚提取物、犬胰腺微粒体膜、大肠杆菌S30提取物以及偶联的转录/翻译系统。对应的测定系统可从多种供应商购得。

分离所产生的肽的方法为本领域公知，且尤其包括离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析(大小排阻层析)、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、圆盘凝胶电泳和免疫沉淀(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)。

在另一方面，本发明涉及组合物(本文中还称为“复合体”)，其包含至少一种上文定义的肽，该肽附着于至少一个其他部分(本文中还称为“负荷”)，该至少一个其他部分优选是一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个，其中通过选自共价键和非共价键的连接来达到该附着。

本文所用的术语“附着”将以其最广泛的含义理解，即，它指两个或多个化合物间任意类型的分子相互作用。术语“共价键”指分子内形式的化学键合，其特征在于，在两个成分间共享一对或多对电子，产生使得到的分子保持在一起的相互吸引。术语“非共价键”指分子间或分子的部分间在性质上不是共价键的多种相互作用，其提供力来使分子或分子的部分通常以特定取向或构象保持在一起。这类非共价相互作用尤其包括离子键、疏水相互作用、氢键、范德瓦尔斯力和偶极-偶极键。在共价键的情况下，本发明的肽可以直接或通过接头分子与该至少一个其他部分偶联，该接头分子在物理上分开本发明的肽和该至少一个其他部分，从而确保两个实体都未因与另一实体靠近而在其功能上受限制。取决于该至少一个其他部分，该接头可以是例如肽键、氨基酸、适当长度的肽或提供希望的特征的不同分子。在具体实施方案中，该接头是赖氨酸或精氨酸残基，其ε-氨基适于将本文定义的肽与多种其他部分偶联。技术人员知道如何根据他的常识来设计适当的接头分子，尤其是接头肽。例如，肽接头可以选自LIP(蛋白质中的环)数据库(Michalsky，E.等(2003)Prot.Eng.56，979-985)。这种接头可以附着于N端或C端，或者，如果认为适宜，还可以附着于本发明的肽的非末端氨基酸残基。

在优选实施方案中，该至少一种上文定义的肽通过非共价相互作用(例如通过(可逆的)复合体形成)附着于该至少一个其他部分。

在其他具体实施方案中，该至少一种上文定义的肽通过共价相互作用(例如，以融合分子的形式)附着于该至少一个其他部分。本文所用的术语“融合分子”指至少两个部分组成的分子(bipartite molecule)，其包含本发明的肽，该肽与至少一个其他部分偶联，从而形成单个实体。该肽和该至少一个其他部分可以由上述接头分开，或者可以直接偶联。该至少一个其他部分可以在N端、C端或末端氨基酸外的任意氨基酸处与本发明的肽融合，优选与N端融合。其他部分可以与已经包含在该融合分子中的部分融合。技术人员充分了解用于确定本发明的融合分子中的部分的测定最佳顺序和/或组合。通常，当融合分子包含本发明的肽和至少一种其他肽时，该术语不包括这样的融合分子，在该融合分子中，融合产生天然存在的肽。可以按照上文针对本发明的肽的产生描述的方法来产生和分离这种融合分子。

本发明的组合物可以包含本文定义的一种或多种肽。在多个至少两种肽的情况下，这些可以属于相同的类型或属于不同的类型。反之，如果该至少一种本发明的肽附着于两个或多个其他部分，则这些部分可以属于相同的类型或属于不同的类型(例如，两个核酸分子或一个核酸分子和一个肽分子)。在具体实施方案中，本发明的单种肽附着于多个两种或多种其他部分。在其他实施方案中，本发明的多个两种或多种肽附着于单个其他部分。

在优选实施方案中，该至少一个其他部分选自一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒。

本发明的组合物还可以包含其他成分，例如，用于稳定该一种或多种本文定义的肽和该至少一个其他部分之间的附着的物质(例如，螯合剂)；用于保护该组合物(例如免受细胞核酸酶)的物质；或用于补偿该组合物的净电荷来便于细胞摄取的物质。

本文所用的术语“小分子”将以它最广泛的含义理解，且不仅包括低分子量有机化合物，还包括标记和报道分子(参见下文)；半抗原(即，只有在附着于更大的载体时才可以引出免疫应答的小分子)，如肼屈嗪、漆酚、荧光素、生物素和洋地黄毒苷；及适体。

本文所用的术语“纳米颗粒”指至少一个尺寸小于100nm的微观颗粒。通常，纳米颗粒具有50nm至500nm(即0.05μm至0.5μm)范围内的直径；在生理环境中结构稳定；且能够容纳更小的分子(如药物或其他生物活性剂)，然后可以将该分子递送至希望的部位。许多纳米颗粒(或纳米载体)对温度敏感和/或对pH敏感，即，它们在加热和/或pH变化时释放其负荷。这类纳米载体保护所包封化合物免受降解和消化液，直至它们释放。

在具体实施方案中，包含在该组合物中的该至少一种本发明的肽附着于一个或多个核酸分子。优选地，该一个或多个核酸分子所附着的该至少一种本发明的肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

该至少一种本文定义的肽所附着的该一个或多个核酸分子可以是任意长度的天然存在或人工的DNA分子或RNA分子(包括适体)，其可以是单链或双链。在超过一个核酸分子附着于该至少一种肽的实施方案中，这些核酸分子可以属于相同的类型(即，具有相同的核苷酸序列)或属于不同的类型。通常，本发明的一种肽附着于单个核酸分子。

在具体实施方案中，该一个或多个核酸分子是RNA分子，通常是小的非编码RNA分子(即，不翻译为肽或蛋白质的RNA，如snRNA、snoRNA、stRNA、siRNA、miRNA和shRNA)，优选地，该RNA分子选自siRNA分子、miRNA分子和shRNA分子。

本文所用的术语“miRNA分子”(或“miRNA”)以它在本领域中的通常含义给出(综述于例如Bartel，D.P.(2004)Cell 23，281-292；He，L.和Hannon，G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5，522-531中)。因此，术语“microRNA”指衍生自基因座的内源RNA分子，其加工自可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物。虽然成熟miRNA的长度通常是20、21、22、23、24或25个核苷酸，但也可以存在其他数目的核苷酸，例如18、19、26或27个核苷酸。

miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜能，将成熟miRNA置于不完美的RNA双链体(本文中也称为茎环结构或发夹结构，或称为pre-miRNA)内，该双链体作为从更长的前体转录物加工miRNA的中间物。此加工通常通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异性内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(称为“pri-miRNA”)产生miRNA前体(本文中也称为“pre-miRNA”)，该前体通常折叠为发夹结构或茎环结构。利用Dicer从此miRNA前体切出miRNA双链体，其在发夹结构或茎环结构的一条臂上包含成熟miRNA，在另一条臂上包含大小相似的区段(通常称为miRNA＊)。然后miRNA被引导至它的靶mRNA来发挥其功能，而miRNA＊在大多数情况下降解。取决于miRNA和它的靶标之间的互补程度，miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制特异性切割，且miRNA作为短干扰RNA(siRNA)发挥作用。与miRNA具有较低互补性的靶mRNA定向至细胞降解途径和/或在翻译上受抑制。但是，miRNA如何抑制其靶mRNA翻译的机制仍是有争议的问题。

在一些实施方案中，附着于该至少一个本文定义的肽分子的该一个或多个核酸分子是成熟miRNA分子。在其他实施方案中，利用miRNA前体分子。本文所用的术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。通常，pre-miRNA折叠为稳定的发夹(即双链体)或茎环结构。该发夹结构的长度在50至120个核苷酸的范围内，通常为55至100个核苷酸，优选60至90个核苷酸(计数与miRNA配对的核苷酸残基(即“茎”)和任意一个或多个间插区段(即“环”)，但排除更远侧的序列)。

本文所用的术语“siRNA分子”(或“siRNA”)也以它在本领域中的通常含义给出(综述于例如Dorsett，Y.和Tuschl，T.(2004)Nat.Rev.DrugDisc.3，318-329；Rana，T.M.(2007)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.8，23-36中)。因此，“siNA”指双链RNA分子，其通常在其3’端具有2个核苷酸突出，在其5’端具有磷酸基团。虽然成熟siRNA的长度通常是20、21、22、23、24或25个核苷酸，但也可以存在其他数目的核苷酸，例如18、19、26或27个核苷酸。在本发明内，也可以利用具有至多49个核苷酸的长度的siRNA前体分子。通过Dicer来从这种前体加工成熟siRNA。

通常，用术语“siRNA”来指外源引入细胞中的干扰RNA。同时，已在多种生物中发现了内源性siRNA，并归入至少四类：反式作用siRNA(tasiRNA)、结合重复序列的siRNA(rasiRNA)、小扫描(scn)RNA和 Piwi相互作用(pi)RNA(综述于例如Rana，T.M.(2007)上文中)。

siRNA的一条链掺入称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体中。RISC用此siRNA链来识别与所掺入的siRNA链至少部分互补的mRNA靶分子，然后切割这些靶mRNA。掺入RISC中的siRNA链称为引导链或反义链。另一条siRNA链(称为过客链或有义链)从siRNA消除，且与靶mRNA至少部分同源。本领域技术人员将理解，一般而言，siRNA的任一条链都可以掺入RISC，并作为引导链发挥作用。但是，siRNA设计(例如，在希望的引导链的5’端降低siRNA双链体稳定性)可以偏向将希望的引导链掺入RISC中。siRNA的反义链是siRNA的活性引导剂，因为反义链掺入RISC中，从而允许RISC识别与反义siRNA具有至少部分互补性的靶mRNA，以进行切割或翻译抑制。RISC介导的具有与引导链至少部分互补的序列的mRNA的切割导致该mRNA和对应的蛋白质的稳态水平的降低。

本文所用的术语“shRNA分子”(即，短发夹RNA分子)指人工单链干扰RNA分子，其在茎环或发夹结构中包含“siRNA双链体”的有义链和反义链二者。此发夹结构的茎的长度通常在19至29个核苷酸的范围内，环的长度通常在4至15个核苷酸的范围内(见例如Siolas，D.等(2004)Nat.Biotechnol.23，227-231)。通常，在RNA聚合酶III启动子(例如U6启动子)的控制下在DNA表达载体内编码shRNA分子。

在一些实施方案中，上述RNA分子包含仅含有核糖核苷酸单位的主链结构。在其他实施方案中，这种RNA分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位和至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，该RNA分子可以包含使核糖2′-OH基团变为2′-O-甲基或2′-O-甲氧乙基(也称为“2′-O-甲基化”)的一个或多个修饰，该修饰防止培养基中的核酸酶降解，且重要地，还防止RNA诱导的沉默复合体核酸酶的内核分离，导致小RNA分子的不可逆抑制。在功能上等同于2′-O-甲基化的另一可能的修饰涉及锁核酸(LNA)，其代表包含一个或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，该单体具有锁定在模拟RNA的糖构象中的二环呋喃糖单位(参见例如Orom，U.A. 等(2006)Gene 372，137-141)。

在一些其他实施方案中，待附着于该至少一个本发明的肽分子的核酸分子代表内源miRNA表达的沉默基因。这类沉默基因的一个实例是化学改造的寡核苷酸(称为“antagomirs”)，其代表与胆固醇缀合的23个核苷酸的单链RNA分子(Krutzfeldt，J.等(2005)Nature 438，685-689)。作为这类化学修饰的寡核苷酸的备选，产生了可以作为产生自转基因的RNA在细胞中表达的microRNA抑制剂。称为“microRNA海绵”，这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，且包含目的microRNA的多个串联结合位点(Ebert，M.S.等(2007)Nat.Methods 4，721-726)。

在特别优选的实施方案中，包含于该组合物中的该至少一种肽附着于一种或多种其他肽。本文所用的术语“其他肽”指这些肽不同于本文定义的能够内化入细胞的肽(即，权利要求中指定的肽)。

尤其优选地，该一个或多个其他肽分子所附着的该至少一种本发明的肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及在其总长度内与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中的任一个具有至少70％，优选至少80％总体序列同一性的氨基酸序列。

该至少一种本文定义的肽所附着的该一种或多种其他肽可以是任意长度的天然存在的分子或人工分子。例如，这类其他肽的长度可以在2至500个氨基酸或5至200个氨基酸的范围内。通常，这类肽具有8至100个氨基酸或10至50个氨基酸之间的长度。优选地，这类肽的长度可以在10至40个氨基酸、12至35个氨基酸或15至30个氨基酸的范围内。可以通过化学合成、利用重组DNA技术或其组合来获得人工肽分子。在本领域中所有这些合成方法都已是完善的(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文)。

在一个以上其他肽分子附着于该至少一种本发明的肽的实施方案中，这些其他肽分子可以属于相同的类型(即，具有相同的氨基酸序列)或属于不同的类型。通常，本发明的一种肽附着于单个其他肽分子。

在其他实施方案中，该一个或多个其他肽分子包含至少一个构造结构域(structured domain)，即，形成(即折叠为)稳定二级结构(即，在线性序列中相互靠近定位的氨基酸残基的特定空间排列)的元件。通常，氨基酸残基之间的空间关系属于规则类型，产生本领域公知的周期性结构，如α-螺旋(棒状紧密螺旋结构)和β-折叠股(延长的序列，多个这类序列可选地形成平行或反向平行的β-折叠)。肽分子可以包含一个包含在非构造环境中的这种构造结构域，或者可以包含相互分开的两个或多个这类构造结构域(属于相同类型或属于不同类型，例如两个α-螺旋或一个α-螺旋和一个β-折叠股)。肽分子可以在它的全长内形成这种二级结构(即，不包含非构造区)。在一个以上其他肽分子包含于本文定义的组合物中的情况下，还可能该其他肽分子的部分包含至少一个构造结构域，而其余部分是非构造的。

在优选实施方案中，本文定义的该一个或多个其他肽分子的至少部分形成α-螺旋二级结构。该α-螺旋元件可以包含至少4个或6个氨基酸残基，且优选至少8个或10个氨基酸残基。在具体实施方案中，本发明的肽分子包含单个α-螺旋元件作为仅有的二级结构。

在其他具体实施方案中，该一种或多种肽是促凋亡肽，即，能够诱导和/或调节凋亡(即，程序性细胞死亡)的肽。技术人员充分了解负责起始和/或介导凋亡的蛋白质因子以及选择保持促凋亡功能性的肽序列的适宜手段。例如，可以从科学文献以及诸如“APOPTOSIS Database”的多种数据库检索这类促凋亡因子(Doctor，K.S.等(2003)Cell Death Diff.10，621-623)。

在其他实施方案中，该一种或多种其他肽具有选自以下的功能性：激活/去抑制细胞肿瘤阻抑基因、抑制细胞癌基因和抑制组成性活化的蛋白质变体。还在其他实施方案中，该一种或多种肽代表细胞受体(如细胞因子受体、血管紧张素受体、内皮素受体、血管升压素受体和缓激肽受体)的天然存在的配体或合成配体(例如激动剂和拮抗剂)。同样，许多这类肽为本领域公知或可以容易地从多种资源检索。

在另一方面，本发明涉及产生上文定义的组合物的方法，其包括：

(a)提供至少一种本发明的肽；和

(b)使该至少一种肽与一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个接触，从而允许形成附着。

技术人员充分了解用于进行这种方法的适宜的反应条件(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文；Ausubel，F.M.等(2001)上文)。

在另一方面，本发明涉及检测本发明的肽或本发明的组合物(即，附着于负荷的至少一种肽)的内化行为的方法，其包括：

(a)对一个或多个细胞施用该肽或该组合物；和

(b)检测该肽或该组合物的内化。

该方法可以尤其适于估计该肽或该组合物对医疗(例如诊断)或研究目的的适用性。如果检测到该肽或该组合物的有效内化且可选地它在细胞质中的定位，则这表明该化合物可以用于特定应用。

为此，可以将本发明的肽或组合物与一个或多个可检测标记融合。可以按照本发明使用的标记包括任意化合物，其在化学、物理或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。可以通过本领域公知的方法来达到标记和随后的检测(见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，上文；及Lottspeich，F.和Zorbas H.(1998)Bioanalytik，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg/Berlin，德国)。该标记尤其可以选自荧光标记、酶标记、产色标记、发光标记、放射性标记、半抗原、生物素、金属络合物、金属和胶体金。所有这些类型的标记在本领域中都已完善，且可以从多种供应商购得。由这类标记介导的物理反应的实例是在照射时发射荧光或磷光。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶是酶标记的实例，其催化形成产色反应产物，且可以用于本发明。

在另一方面，本发明涉及本文定义的肽或本文定义的组合物在转化或转染一个或多个细胞中的用途，即，该组合物作为用于将负荷转运入特定靶细胞中的递送载体的应用。

在具体实施方案中，本发明涉及上文定义的组合物在将药剂转染和/ 或定向递送至特定细胞中的用途，该组合物包含至少一种本发明的肽，该肽附着于一个或多个核酸分子和一个或多个肽或蛋白质中的至少任一个。

还在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一个本文定义的肽分子或本文定义的组合物(即，附着于负荷的至少一种肽)，且可选地进一步包含一种或多种可药用赋形剂和/或添加剂。

本文所用的术语“药物组合物”指用于对受试者，优选对人患者施用的组合物。本发明的药物组合物包括本领域中建立的任意药物剂型，尤其是胶囊剂、微囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、粉剂、弹丸剂、多颗粒制剂(例如小球剂、颗粒剂或晶体剂)、气雾剂、喷雾剂、泡沫剂、溶液剂、分散剂、酊剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、油包水型乳剂(如软膏剂)和水包油型乳剂(如霜剂、洗剂和镇痛剂)。该制剂可以包装在分开的剂量单位中或多剂量容器中。

本发明的药物组合物包括适合用于口腔、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、腹膜和肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)施用，或用于通过吸入或吹入施用的制剂。施用可以是局部施用或全身施用。

可以按照已建立的方法来制备药物组合物(见例如Gennaro，A.L.和Gennaro，A.R.(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA；Crowder，T.M.等(2003)A Guide to Pharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC，Boca Raton，FL；Niazi，S.K.(2004)Handbook of PharmaceuticalManufacturing Formulations，CRC Press，Boca Raton，FL)。

对于该组合物的制备，可以使用一种或多种可药用(即)惰性无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油和硬化油。适合用于产生溶液剂、混悬剂、乳剂、使用前重构在溶液或气溶胶混合物中的气雾剂混合物或粉剂的赋形剂尤其包括水、醇、甘油、多元醇及其适宜的混合物，以及植物油。药物组合物还可以包含添加剂，例如，填充剂、黏合剂、湿润剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及其他溶剂或加溶剂或用于达到贮存作用的物质。后者将理解为，可以将本发明的活性肽或组合物掺入缓释或持续释放或定向的递送系统，如脂质体、纳米颗粒和微囊。

将以适宜的剂量对受试者施用本发明的药物组合物。所应用的具体剂量方案将由主治医师以及临床因素决定。如医学领域公知，给定患者的适当剂量取决于许多因素，包括患者的体型、性别和年龄；待施用的具体化合物；施用的时间和途径；一般健康；既存病症；及同时施用的其他药物。给定情境的治疗有效量将通过例行实验容易地测定，且在普通临床医生或医师的技能和判断之内。通常，作为定期施用的剂量应在每天1μg至1g的范围内。但是，优选的剂量可以在每天0.01mg至100mg的范围内，更优选的剂量在每天0.01mg至50mg的范围内，最优选的剂量在每天0.01mg至10mg的范围内。

还在另一方面，本发明涉及本文定义的肽或本文定义的组合物用于预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症。为了此目的，可以将本发明的肽或组合物配制为上文定义的药物组合物，并对受试者，优选对人患者施用。

本文所用的术语“癌症”指任意类型或形式的恶性增生，其特征在于靶细胞基于遗传重编程的不受控制的分裂，以及靶细胞通过侵入直接生长进入邻近组织或通过转移(其中癌细胞通过血流或淋巴系统转运)植入远端部位而扩散的能力。实例尤其包括乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肝癌和肺癌。

本文所用的术语“免疫疾病”指免疫系统的任意障碍。这类免疫疾病的实例尤其包括免疫缺陷(即，其中免疫系统对抗感染性疾病的能力受损或完全缺乏的先天性或获得性病症，如AIDS或SCID)、超敏反应(如变态反应或哮喘)和自身免疫病。本文所用的术语“自身免疫病”将理解为指产生自身体对内源物质和组织的过度免疫应答的任意障碍，其中身体攻击其自身的细胞。自身免疫病的实例尤其包括多发性硬化、克罗恩病、红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎和多关节炎。

本文所用的术语“心血管疾病”指心脏和冠状血管的任意障碍。心血管疾病的实例尤其包括冠心病、心绞痛、动脉硬化、心肌病、心肌梗塞、局部缺血和心肌炎。

本文所用的术语“神经疾病”(或“神经障碍”)指神经系统的任意障碍，包括中枢神经系统(CNS)(即脑和脊髓)的疾病和周围神经系统的疾病。CNS疾病的实例尤其包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、闭锁综合症和抽动秽语综合症。周围神经系统的疾病的实例包括例如多发性单神经炎和多神经病。

本文所用的术语“感染”指基于外来病原体(如细菌、病毒或真菌)定居宿主生物的任意障碍。细菌感染的实例尤其包括细菌性脑膜炎、霍乱、白喉、李斯特菌病、百日咳、沙门氏菌病、破伤风和斑疹伤寒。病毒感染的实例尤其包括普通感冒、流行性感冒、登革热、依波拉出血热、肝炎、流行性腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病和天花。真菌感染的实例尤其包括脚癣、酵母菌病和白假丝酵母病。

本文所用的术语“炎性疾病”指与炎症相关的任意障碍，包括例如痤疮、哮喘、花粉症、关节炎、炎性肠病、盆腔炎和移植排斥。

在另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症的方法，其包括对受试者施用至少一种本发明的肽或本发明的组合物。优选地，该受试者是人患者。

在最后一方面，本发明涉及包含以下中的至少任一个的成套试剂盒：

(a)上文定义的肽分子；

(b)上文定义的核酸分子；

(c)上文定义的载体；

(d)上文定义的宿主细胞；和

(e)上文定义的组合物。

该试剂盒的多种成分(a)至(e)可以包装在一个或多个容器中，如一个或多个小管中。例如，包含在该试剂盒中的各成分可以包装在分开的容器中。

该试剂盒的以上成分可以以冻干或干燥的形式或溶解在适宜的缓冲液(如磷酸缓冲盐溶液或Tris/EDTA(TE)缓冲液)中提供。本发明的宿主细胞可以例如作为划线培养在琼脂平板上的“继代培养物(step culture)”或以适合用于长期保存的任意其他形式提供。这类保存方法在本领域中已完善。

该试剂盒还可以包含附加试剂，尤其包括防腐剂、生长培养基和/或用于保存和/或重建上述成分的缓冲液、洗涤溶液等。这些试剂可以与成分(a)至(e)中的一种或多种组合提供，即，在同一容器中(例如，溶解在适当缓冲液中的肽或核酸分子)。备选地，这些附加试剂中的至少一些可以提供在分开的容器中。

通过附图和以下实施例来进一步描述本发明，这些附图和实施例只是为了说明本发明的具体实施方案的目的，不解释为以任意方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：材料和方法

1.1哺乳动物细胞培养

按每孔15000个细胞的密度将MCF7细胞接种在96孔板中。在37℃、5％CO₂和85％湿度下在补充了10％FCS(胎牛血清)和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中孵育细胞24小时。对于功能测定，在OptiMEM培养基中洗涤细胞，并用OptiMEM替换RPMI 1640(所有试剂均购自Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，美国)。通过用所示肽浓度将100nM siRNA在OptiMEM中在室温下孵育30分钟来形成siRNA和肽的复合体。将该复合体加至细胞并孵育3小时。随后，用正常RPMI 1640生长培养基替换OptiMEM。对于产生bDNA裂解物，再孵育细胞21小时，对于进行CellTiter-Glo或CytoTox-Glo测定(参见下文)，再孵育细胞45小时。

1.2mRNA水平的定量

为了定量细胞mRNA水平，进行了bDNA(分支DNA)测定，该测定使得能够检测单种mRNA水平。为此，将确定数目的待分析细胞接种在96孔板中，并使其过夜附着。次日，用siRNA转染细胞。

再24小时后，按厂家的说明用QuantiGene Plex 2.0测定试剂盒(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，美国)定量mRNA种类。简言之，在基因特异性探针集的存在下将细胞裂解物转移至捕获平板，并在53℃过夜孵育。洗涤后，顺次用放大剂和连接碱性磷酸酶(AP)的标记探针在53℃孵育孔，两次孵育之间具有洗涤步骤。随后，加入发光AP底物dioxitane，并在53℃孵育30分钟。用InfiniteF200冷光仪(Iuminescence reader，TecanAustria GmbH，奥地利)测定发光。

1.3细胞生存力测定

为了测量活细胞的数目，按厂家的流程使用CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(Promega Corporation，Madison，WI，美国)。在肽和siRNA的存在下孵育细胞48小时。随后，裂解细胞，产生与所存在的ATP的量成比例的发光信号，该发光信号转而与所存在的活细胞的数目成比例。在InfiniteF200冷光仪中分析发光。

1.4细胞毒性测定

为了测定肽的细胞毒性，按厂家的流程使用CytoTox-Glo CytotocityAssay(Promega Corporation，Madison，WI，美国)。在肽和siRNA的存在下孵育细胞48小时。然后，用发光的肽底物处理细胞来测量从丧失膜完整性的细胞释放的死细胞蛋白酶活性。该底物不能跨过活细胞的完整膜，未从活细胞群体产生任何可察觉的信号。因此，此测定的发光代表死细胞。然后在InfiniteF200冷光仪中分析96孔板。

1.5肽合成

用Fmoc化学品在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中按已建立的流程(FastMoc 0.25mmol)进行肽合成。在迭代循环中，通过顺次偶联对应的Fmoc氨基酸来组装各肽序列。

在每个偶联步骤中，通过用含20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮处理树脂来去除N端Fmoc基团。用通过含HBTU/HOBt(各1mmol)和DIPEA(2mmol)的DMF活化的受Fmoc保护的氨基酸(1mmol)进行偶联。偶联步骤后，通过用NMP中的Ac2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)和HOBt(0.015M)的混合物处理来帽化的未反应的氨基。在两个步骤之间，用N-甲基吡咯烷酮和DMF充分洗涤树脂。在自动化双偶联中达到空间位阻氨基酸的掺入。为了此目的，用1mmol的活化构件处理树脂两次而无中间的帽化步骤。靶序列完成后，用标准反应条件将Fmoc-12-氨基-4，7，10-三噁十二酸(TEG间隔区)偶联至该肽。随后，将Fmoc-Cys(Trt)-OH附着于所有肽序列的氨基端。最后的Fmoc去保护后，将肽树脂放入过滤玻璃料中，并用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(比例为19ml∶0.5ml∶0.5ml)的混合物处理2.5小时。过滤切割溶液，通过加入冷的(0℃)二异丙醚(300ml)来沉淀肽，产生无色固体，用二异丙醚反复洗涤该无色固体。将粗产物重新溶解在乙酸和水的混合物中，冻干，并通过利用含0.1％TFA的乙腈/水梯度的制备型反相HPLC来纯化(Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm；Merck KGaA，Darmstadt，德国)。

1.6FACS分子

对于FACS分析，通过在accutase(具有蛋白水解活性和胶原水解活性的酶溶液；可从多种供应商购得)中孵育15分钟来脱附MCF7细胞(ATCC编号HTB-22)。在FACS缓冲液(含5％FCS的PBS)中洗涤后，按3×105细胞/ml的最终密度将细胞接种在96孔圆底多孔板(目录号3799，Corning Inc.，Corning，NY美国)中，并立即使用。在分别存在1μM、5μM和10μM FITC标记肽的情况下，在OptiMEM培养基中37℃孵育细胞3小时。然后，在FACS缓冲液中洗涤细胞，并在含蛋白酶K(0.02mg/ml)的缓冲液中37℃孵育30分钟。洗涤细胞两次，使用FITC通道，用FACSCanto II(BD Biosciences；San Jose，CA，美国)进行分析。

1.7凝胶移位测定

通过按给定的摩尔比将500μg siRNA双链体与各肽混合在水中来进行凝胶移位测定。在37℃形成复合体1小时，并在含溴化乙锭的2.5％琼脂糖凝胶上分析(电泳：125V，40分钟)。对于蛋白酶K处理，向上述标准反应加入1μl蛋白酶K。

实施例2：潜在的人CPP的鉴定

2.1生物信息学方法

通过HIV衍生的TAT(Frankel，A.D.和Pabo，C.O.(1988)Cell 55，1189-1193；Vives；E.等(1997)，上文)和模型肽聚精氨酸(Wender，P.A.等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.美国97，13003-13008；Futaki，S.等(2001)J.Biol.Chem.276，5836-5840)来示例的一组细胞穿透肽(CPP)的特征在于高含量的带正电荷的氨基酸。其他CPP(所谓的倾斜肽(tilted peptide))由带电荷的亲水氨基酸序列和不带电荷的亲脂氨基酸序列二者组成(Lins，L.等(2008)Biochim.Biophys.Acta 1778，1537-1544)。从而容易让人推测CPP应具有这两种特征。为了在人蛋白质组中鉴定这类序列，利用了生物信息学方法。图1显示用来产生肽的候选列表的流程的示意图。

为了产生肽文库，使用了滑动窗法。选择了30个氨基酸的窗口大小，并应用于SwissProt蛋白质数据库(Swiss Institute of Bioinformatics；http://www.expasy.org/sprot/)的所有条目。这产生了10,459,557条个体肽的文库，其中1,024,818条是独特的。163,887条肽出现了超过一次，平均为2.7次，这反映了几种蛋白质的重复性质。在所产生的文库内，每一个体肽序列与它的对应的源信息(该肽的序列、源蛋白质和在该蛋白质内的位置)以及该源蛋白质的Gene Ontology(GO)注释(Ashburner，M.等(2000)Nat.Genet.25，25-39)相关联。与每条肽相关的其他信息包括它的氨基酸组成，如电荷数、等电点(IEP)和预测的疏水性。使用30个氨基酸的滑动窗的原理是，产生比通常用于CPP的肽更大的肽，因为更大的肽具有更高的可能性构造二级结构(例如α-螺旋或β-折叠)。与非构造肽相比，包含这类二级结构的肽显示对细胞穿透有利(Deshayes，S.等(2004)Biochemistry 43，7698-7706)。此外，据报道，长度小于12个氨基酸的α-螺旋肽具有降低的与核酸分子相互作用、从而转染核酸分子的能力(Niidome，T.等(1999)Bioconjug.Chem.10，773-780)。

在另一步骤中，过滤在其一级氨基酸序列中包含超过30％带正电荷的氨基酸残基(即，精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K))的肽，以产生与带正电荷的模型肽TAT和Poly-Arg具有更高相似性的肽。此过滤产生227,307条个体肽。为了富集针对具有更高的可能性为免疫系统所耐受(即，具有免疫原性的可能性较低)的肽获得的选择，将结果与对应的蛋白质条目的GO比对，并限于胞外蛋白质。最后，此过滤(即，衍生自因此对人免疫系统而言“可见”的人胞外蛋白质的候选者的选择)将肽的数目从8630种个体蛋白质显著减少到583种各个蛋白质。

2.2用于实验表征的肽候选者的选择

将减少肽候选者数目的主要因素从计算机分析方法(可以分析的样品数实际上无限制)转移至实验分析(experimental wet-lab analyse，仅可以广泛研究有限数目的候选者)。此外，缩短候选者列表的另一实际考虑是便于处理、在生物学测定中的适用性和最终研发药学活性化合物的可行性。另一方面，将可溶性明显弱或难以合成的肽序列从进一步的评价排除。

为了避免此最终步骤的候选者选择由单个或可能两个严格参数决定，利用三种不同方法来编制用于实验评价的最终候选者列表。

候选肽的一个子集的特征在于，不仅包含至少30％带正电荷的残基(“KHR30”)，还包含许多疏水残基。因此，就它们的IEP以及它们的疏水性对肽进行排序。两个列表的具有最高得分的1000条肽相交产生衍生自29种蛋白质的91条肽。最后，选择了衍生自具有最高交集值的20种蛋白质的20条肽。

候选者的第二子集基于与TAT肽序列的相似性产生。用FASTA算法(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)，上文)对所有肽进行同源性比较。根据它们各自的E值对肽进行排序(E值越高，排位越高)。此方法产生了衍生自10种蛋白质的135条肽。最后，选择了衍生自5种蛋白质的5条肽用于进一步分析。

作为第三子集，基于与它们的源蛋白质的一种或多种功能相关的文献分析，选择了衍生自25种个体蛋白质的36条候选肽用于实验评价。肽数目与蛋白质数目的不一致解释为来自一种蛋白质的多个序列(例如CO9_mot1a、CO9_mot1b)或一个序列的不同变体(例如，包含或缺乏二硫键，如Granulysin WT、Granulysin G8、Granulysin G9)的使用。一般而言，保持30个氨基酸残基的长度，但是，如果将已知基序鉴定为包含这种三十聚体，则将肽的长度延长至如FALL中的39个氨基酸残基(Yang，Y.X.等(2004)Acta Pharmacol.Sin.25，239-245)或如LIP_Cons_C_WT(多种脂酶的共有序列)中的48个氨基酸残基(Demant，T.等(1988)J.LipidRes.29，1603-1611)。该限制基于针对这些序列获得的文献和BLAST结果的仔细分析。优选的是：衍生自已知干扰膜的蛋白质(如补体系统的因子)的肽；衍生自降解脂质的蛋白质(如脂酶)的肽；衍生自产生杀菌因子的蛋白质(如FALL(Nijink，A.和Hancock，R.E.(2009)Curr.Opin.Hematol.16，41-47)或BPIL3(Mulero，J.J.等(2002)Immunogenetics 54，293-300))的肽；及与报道为充当CPP的那些相似的肽(Takeshima，K.等(2003)J.Biol.Chem.278，1310-1315；Arrighi，R.B.等(2008)Antimicrob.AgentsChemother.52，3414-3417)。

表1中列出了进行进一步实验评价的所有肽(包括对照)。

为了图示该初始过滤，将肽的IEP对它们的疏水性作图。与500种随机选择的肽(约10×10⁶种肽中)相比，该初始过滤明显导致所选择的肽的累积(参见图2)。为了进一步比较，还包括了5种阳性对照肽(即，TAT、REV、鱼精蛋白、Poly-Arg和INF7)。此分析显示，带正电荷的对照肽TAT、REV、鱼精蛋白和10xArg符合过滤标准，而INF7作为带负电荷且疏水的肽出现在标尺的另一端。

除所选择的人衍生的CPP候选者外，将具有报道的CPP活性的八种肽包括在筛选中作为对照(参见表1)。这些肽可以与核苷酸形成非共价复合体，且具有转染能力：TAT，衍生自HIV的反式激活蛋白的CPP(Ignatovich，I.A.等(2003)J.Biol.Chem.278，42625-42636)；REV，HIV的TAT相关肽(Futaki，S.等，上文)；poly-Arg(Kim，W.J.等(2006)Mol.Ther.14，343-350)作为带正电荷的肽的真实实例；响尾蛇胺(Nascimento， F.D.等(2007)J.Biol.Chem.282，21349-21360)。此外，包括截短的鱼精蛋白(Song，E.等(2005)Nat.Biotechnol.23，709-717)和穿孔蛋白的N端作为人肽的实例。未归入TAT样CPP类的另外两种对照是衍生自流感病毒HA的肽Inf7(带负电荷且疏水的肽；Plank，C.等(1994)J.Biol.Chem.269，12918-12924)和MTS(主要疏水的肽；Lin，Y.Z.等(1995)J.Biol.Chem.270，14255-14258)。

实施例3：筛选介导siRNA转染的肽

为了针对它们将siRNA转染入哺乳动物细胞的能力分析潜在的CPP，利用了递增的肽浓度(从1μM至20μM)连同恒定的siRNA浓度(100nM)。使用此肽浓度范围是因为已显示诸如TAT的带正电荷的肽在至多10μM的范围内内化入细胞，并保留在胞内膜区室中，而不显著进入细胞溶胶(Duchardt，F.等(2007)Traffic 8，848-866)。只有高于约5-10μM的阈值，这些肽才显示进入细胞溶胶。如用DharmaFECT转染试剂(Dharmacon，Inc.，Lafayette，CO，美国；结果未显示)在对照实验中所测定，10nM siRNA的浓度在饱和范围内。

所利用的siRNA寡核苷酸针对人Aha1 mRNA(Panaretou，B.等(2002)Mol.Cell 10，1307-1318，或针对萤光素酶mRNA作为对照。

在OptiMEM培养基中形成siRNA和各肽的复合体，并在室温孵育15分钟。在该复合体的存在下在OptiMEM中孵育细胞3小时。洗涤后，在正常生长培养基中再孵育细胞21小时或45小时。然后，利用bDNA测定来测量Aha1mRNA和参考mRNA(即GAPDH mRNA)的水平。用分别用siAHA1和对照siRNA(siGL3，萤光素酶)转染的细胞进行这些测定。

作为特异性RNAi的测量，在siAHA1转染的细胞和siGL3转染的细胞中比较了Aha1 mRNA水平相对于GAPDH mRNA水平的降低。与siGL3转染的细胞相比，特异性siRNA介导的转染导致siAhA1转染的细胞中Aha1/GAPDH mRNA值的降低。图3显示这些测定的筛选读数：将未转染的对照细胞的Aha1/GAPDH mRNA值设为100％(对于各测定)，相对于该值表示siAha1或siGL3转染的细胞的Aha1/GAPDH mRNA值。对于此归一化数据集，确定了siAha1和siGL3转染的细胞各自的Aha1/GAPDH mRNA水平之间的差异。特异性肽导致siAha1转染的显著降低而不降低siGL3转染，其导致正差异值。这些值越显著，观察到越多的特异性RNAi(参见图3)。

在选定的样品中，在所有转染方法中都观察到了Aha1mRNA和/或GAPDH mRNA降低。这指向所应用的肽的独立于siRNA特异性的生长抑制作用或毒性作用。如这些肽中的一些也充当杀菌剂的事实所凸显，干扰膜完整性的肽(即CPP)常具有损伤细胞的内在能力(Arrighi，R.B.等(2008)，上文)。因此，利用CytoTox-Glo和CellTiter-Glo测定(PromegaCorporation，Madison，WI，美国)分析了假定的人CPP的细胞毒性活性。通过CellTiterGlow测定检测的介导生长抑制或细胞毒性的肽与对应的GAPDH mRNA水平的降低良好地相关。基于此观察结果，将GAPDHmRNA水平用作细胞毒性的一般读数：将相对于培养基对照的100％GAPDH mRNA的平均测量结果视为非毒性，99％和70％之间的值视为中等毒性，低于70％的值视为毒性(参见图3)。

根据肽介导转染和/或生长抑制/细胞毒性的效力，定义了不同表型种类：显示比TAT低的Aha1特异性siRNA转染效力的肽归入“非转染”肽类；显示等于或高于TAT的转染效力的肽称为“转染”肽。类似地，导致GAPDH mRNA值＞70％的肽分类为“非毒性”，而导致GAPDH mRNA降低至更低的值的肽称为“毒性”。

根据这些分类，将所有肽归入以下四类之一：

(a)非功能肽(非转染和非毒性)

(b)非转染毒性肽

(c)转染毒性肽

(d)转染非毒性肽

3.1非功能肽

所筛选的61条人衍生肽中的41条归入此类(表1和图3)。这些肽显示在所应用的浓度下对细胞无显著毒性，它们也不介导siRNA转染。因此，在计算机分析方法中作为假定的CPP选择的肽的67％在转染和生存力实验中未显示任何表型。在之前已报道为具有CPP活性的8种对照肽的组中，三种肽(响尾蛇胺、MTS和穿孔蛋白)归入此类。

作为实例，图4显示衍生自蛋白质WNT16的肽的表型，WNT16涉及WNT信号发放(Mazieres，J.等(2005)Oncogene 24，5396-5400)。由于WNT16肽序列符合“KHR10+胞外”的搜索条件，将其作为用于实验评价的候选者包括在内。

3.2非转染毒性肽

所筛选的61条人衍生肽中的11条在所应用的浓度下显示毒性迹象(降低的生存力和/或＞70％的GAPDH mRNA降低)，但不介导siRNA转染(参见表1和图3)。因此，与TAT肽相比，它们的转染能力更差。所分析的(阳性)对照肽中没有一种归入此类，从而确认了对照事实上具有转染能力。图5显示隶属于此类的肽的两个实例的表型。

一条肽衍生自人蛋白质BPLI3(图5A；Bingle，C.D.和Craven，C.J.(2004)Trends Immunol.25，53-55)。在CellTiter-Glo测定中，针对暴露于此肽的细胞观察到了生存力的剂量依赖性丧失。这与GAPDH mRNA水平的剂量依赖性降低平行，确认了用平均GAPDH mRNA值作为生长抑制和/或毒性的读数的方法。有趣地，CytoTox-Glo测定未在暴露于BPIL3肽的细胞中显示显著的凋亡(结果未显示)。因此，此肽通过非凋亡机制导致生长抑制和/或细胞死亡。未针对此肽观察到转染活性(相对于GAPDHmRNA的特异性Aha1 mRNA降低)。

另一条具有细胞毒性特性的肽(图5B)衍生自人蛋白质cathelicidine(Nijink，A.和Hancock，R.E.(2009)，上文)。还已将该肽(称为FALL)描述为具有抗微生物功能性。在暴露于细胞时，FALL肽显示显著的毒性，其反映为细胞生存力的丧失和GAPDH mRNA水平的降低。潜在的转染活性的分析仅在毒性显著的10μM或更高的浓度下显示特异性Aha1 mRNA降低(相对于GAPDH mRNA)的非结论性证据。在这些(毒性)条件下仅观察到一些较小的mRNA降低。但是，在较低浓度(5μM)下，可以观察到Aha1 mRNA的清晰和特异的降低。这表明，虽然转染效力比TAT差，即，低于转染肽种类的阈值设定，但FALL能够转染siRNA。

3.3转染毒性肽

此类肽不包含对照中的任一种，但包含人候选肽中的5种。后者显示转染活性(即，特异性Aha1敲减)的清晰证据，但还导致细胞生长抑制和/或毒性。

作为实例，图6显示暴露于衍生自CU025蛋白质的肽的细胞的表型。CU025是具有未知功能性的包含钙结合结构域的蛋白质(SwissPro检索号Q9Y426)。与GAPDH mRNA水平相比，siRNA转染实验显示Aha1 mRNA水平的显著和特异的降低。但是，如通过生存力测定和GAPDH mRNA的显著降低所测定，此肽还导致生长抑制和/或毒性。此降低的生存力在达到转染和RNAi所需的肽浓度下已经变得明显。因此，此肽及此肽种类的其他成员在siRNA转染中的适用性严重受限于它们的毒性表型。

3.4转染非毒性肽

此类肽对涉及转染siRNA的应用最有利，因为这些肽在不干扰细胞生存力的浓度下具有转染功能性。大多数对照肽归入此类。在选择用于实验评价的61种人肽候选者中，3种肽在不介导干扰细胞生存力或仅最低限度地介导干扰细胞生存力的浓度下显示转染活性的清晰证据。这些肽衍生自之前未表征的羧肽酶CPXM2(SwissProt检索号Q8N436)、酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶ASM3B(SwissProt检索号Q92485)以及人GDNF相关神经营养因子neurturin(NRTN；Kotzbauer，P.T.等(1996)Nature 384，467-470)。

图7将CPXM2(图7B)、ASM3B(图7C)和NRTN(图7D)肽的转染介导的特异性Aha1敲减及对细胞生存力的作用与TAT和Poly-Arg(图7A)相比较。在与Aha1特异性siRNA一起应用时，CPXM2和ASM3B都导致内源Aha1 mRNA水平的显著降低，而无显著毒性。此表型类似于针对对照肽TAT和Poly-Arg观察到的表型(结果未显示)。

NRTN肽介导Aha1 mRNA水平相对于GAPDH mRNA水平的甚至更有效的降低，对细胞生存力仅具有较小的影响。细胞生长/生存力仅在高浓度(高于10μM))下受影响。有趣地，NRTN肽在更低的非毒性浓度下仍显示显著的转染功能性。在这些浓度下，NTRN衍生肽的转染效力高于所分析的所有(阳性)对照肽的转染效力。考虑到此表型，对NRTN肽进行了更详细的表征。

实施例4：肽/siRNA复合体的形成对介导转染而言必要但不充分

可以解释诸如TAT或鱼精蛋白的带电荷肽的转染功能性的机制包括带正电荷的肽和带负电荷的核酸之间的复合体的形成。这类复合体使得肽介导的膜相互作用和/或内体逃逸功能性能够将复合的核酸转入细胞的细胞溶胶中(Law，M.等(2008)Biotechnol.Prog.24，957-963)。为了确定以上机制是否也可以适用于NTRN衍生肽，进行了凝胶移位分析(参见图8)。为此，将siRNA与递增浓度的肽共孵育，然后通过凝胶电泳来分析它们的迁移模式。TAT肽显示预期的(阳性对照)siRNA迁移的浓度依赖性延迟(图8A)。因此，TAT与siRNA分子形成复合体。对于TAT，从10∶1的肽/siRNA比值开始，观察到了凝胶移位，在25∶1或更高的比值下观察到最显著的作用。

图8B中显示将siRNA暴露于NTRN衍生肽的平行分析。在1∶1或更高的肽/siRNA比值下已经观察到了siRNA的延迟。此外，与TAT肽(其总是迁移入凝胶)不同，25∶1的NTRN肽/siRNA比值导致所形成的复合体滞留在加样口中。在更高的比值下，阻止了通过溴化乙锭染色进行检测。此发现与嵌入剂较不易于接近核酸与多阳离子肽的复合体的观察结果(Wolfert，M.A.和Seymour，L.W.(1996)Gene Ther.3，269-273)一致。但是，在用蛋白酶K处理时，可以在凝胶中观察到对应的siRNA信号(参见图8C)。因此，NRTN衍生肽能够与siRNA形成似乎高度凝聚的稳定复合体。

这些结果表明，肽/siRNA复合体的形成与TAT和NTRN衍生肽二者的转染功能性相关。因此，可以合理地假设，为了利用肽的膜相互作用和/ 或“内体逃逸”功能性进行siRNA转染，需要该络合(即，复合体形成)。但是，有待回答的问题是，所观察到的络合对转染功能性而言是否也是充分的？因此，还针对既不显示细胞毒性，也不显示转染功能性(见上文)的WNT16衍生肽分析了siRNA络合能力。暴露于WNT16衍生肽的siTNA的凝胶移位测定显示siRNA电泳迁移率的清晰的剂量依赖性延迟，甚至比针对TAT肽观察到的延迟更强(参见图8D)。1∶1和更高的肽/siRNA比值介导了有效的凝胶移位。非转染肽有效形成复合体的观察结果表明，肽和siRNA的络合本身不足以赋予转染功能性。因此，siRNA络合似乎是功能性的必要条件，但肽的其他序列和/或结构特征对介导转染也很重要。

以上数据显示，NTRN衍生肽与siRNA分子形成复合体，并以有效方式介导它们的转染。所应用的siRNA是siAha1，其靶向细胞持家基因(热休克蛋白90ATP酶同源物1的激活剂(Panaretou，B.等(2002)，上文))的mRNA。用针对萤光素酶mRNA的siRNA作为对照。

为了证明NTRN肽可以广泛应用于siRNA转染(而不限于特定siRNA序列)，研究了它转染siAha1以外的siRNA的能力。图9显示NTRN肽介导的靶向有丝分裂驱动蛋白Eg5(Blangy，A.等(1995)Cell 83，1159-1169)的mRNA的siRNA的转染的结果。在＜10μM的浓度下发现了细胞Eg5mRNA的有效降低。在这些剂量下，NTRN肽不干扰细胞生存力。已知Eg5mRNA的有效排除引起有丝分裂停滞，导致凋亡的起始(Blangy，A.等(1995)，上文)。因此，通过NTRN肽介导的siEg5转染观察到了凋亡表型(图9)。在相同条件下用对照siRNA转染也没有细胞毒性，从而确认了该凋亡表型由Eg5mRNA排除引起。

以上数据表明，人NRTN衍生肽不仅可以广泛应用于介导siRNA的转染，而且它的转染效力足以引出RNAi介导的细胞表型。

实施例5：具有转染能力的肽内化入细胞

为了测定筛选方法中鉴定的CPP的内化行为，利用FACS分析了该肽的FITC标记的衍生物(分别在1μM、5μM和10μM下)。使用了以下肽：NRTN作为转染肽、WNT16作为非转染肽、FALL作为毒性肽及TAT 作为参考(阳性对照)(参见图12)。在荧光肽衍生物的存在下在OptiMEM中37℃孵育MCF7细胞3小时。随后，用蛋白酶K在37℃处理细胞30分钟来去除表面结合的肽，从而确保仅监测内化的肽。然后在PBS中洗涤细胞，并通过FACS进行分析。

结果显示对照肽TAT内化入MCF7细胞(参见图12A)。TAT摄入细胞显示对肽浓度的线性依赖性，其也符合TAT作为siRNA转染试剂发挥作用的发现(参见上文)。非转染非毒性肽WNT16未显示显著摄入MCF7细胞(图12B)，其符合所观察到的该肽不能转染siRNA。这还表明，肽的摄取并非简单地与带正电荷的氨基酸的存在相关。毒性FALL肽以线性浓度依赖性方式内化入MCF细胞(图12C)。

转染阳性肽NRTN也内化入MCF7细胞(图12D)。但是，与其他肽不同，NRTN未显示线性浓度依赖性摄取。事实上，在浓度从5μM提高到10μM时观察到了内化的强烈增加。此发现表明存在一个阈值，在该阈值以下，摄取显著但微弱。在该阈值以上，观察到细胞摄取的显著增加。

总之，这些结果显示转染阳性肽与细胞相互作用并内化入细胞的能力。此外，这些数据显示，所分析的肽不仅作为转染试剂发挥作用，还充当了细胞穿透肽。

实施例6：肽候选者的分选、过滤和分类

通过组合计算机分析和实验筛选方法，在人蛋白质组中发现了具有潜在的CPP功能性或转染功能性的肽序列。在这些候选者中，发现3种肽具有转染能力但无毒性，即，它们在不干扰细胞生存力的剂量下具有转染功能性。这些肽尤其可以在开发siRNA递送剂作为将来基于siRNA的药物的部分中作为模型。

6.1生物信息学方法

所利用的计算机分析方法基于包含人蛋白质中存在的所有重叠肽的三十聚体肽文库。从这超过10×10⁶种肽鉴定了符合初始搜索字符串(三十聚体肽中＞30％带正电荷的氨基酸残基(即，H+K+R))的衍生自583种人胞外蛋白质的8630种肽。

为了产生进行实验分析的肽的候选名单，通过反向和正向选择步骤来进一步限制候选者的数目：在由于长碱性序列而在单种蛋白质中存在多个肽命中的情况下，避免冗余。在大多数这些情况下，选择衍生自给定蛋白质的一种代表性的肽。从进一步的考虑排除了例如由于多个二硫键的存在或预测的溶解性弱而认为其难以合成或处理的肽。应用了用于选择(从剩余列表)用于实验评价的候选者的几个正向选择参数，包括：(i)高IEP和高疏水度；(ii)与TAT的序列相似性；和(iii)已提出衍生该肽的蛋白质(如补体系统的蛋白质、杀菌因子和脂酶)的膜相互作用功能性。

6.2实验方法

通过实验评价，将候选肽(通过计算机分析方法来定义)分为四类：(a)非功能肽(即，非转染和非毒性)；(b)非转染毒性肽；(c)转染毒性肽；和(d)转染非毒性肽。

在第一方法中，根据它们最高级别的IEP值和疏水性特征来选择肽候选者，如具有转染能力的毒性肽CU025和CPXM，非转染毒性肽CD026和MMP25。因此，此过滤能够从富含正电荷氨基酸的肽源鉴定假定的细胞穿透肽(CPP)。

所应用的另一过滤基于候选肽与TAT参考肽的序列相似性。通过实验评价了与TAT具有最显著的相似性的5种肽。但是，这些肽中的4种(包括与TAT显示最高相似性的PROK2)在不干扰细胞生存力的剂量下未显示可检测到的转染活性。NRTN衍生肽是唯一的功能性(即，具有转染能力)成员。此肽在所进行的测定中显示最好的转染功能性，具有甚至高于TAT的效力。这表明，这些肽的转染活性不仅由一级氨基酸序列决定，还由确定的序列模体、尤其是由二级结构决定。

在第三方法中，用文献数据和BLAST结果二者来限制候选肽的列表。选择用于实验评价的是衍生自其活性需要与膜的相互作用的蛋白质的肽。所选择的大多数肽未显示任何功能表型(即，转染能力)。甚至衍生自公知其扰乱膜完整性的蛋白质(如补体因子或穿孔蛋白)的肽也未显示转染功能性。此发现表明，正确构造的结构域可以是赋予这些蛋白质的膜扰乱活性所必需的(例如，MACPF结构域(Rosado，C.J.等(2008)Cell.Microbiol.10，1765-1774))。显然，不能通过肽来模拟此功能性，即使它们匹配所利用的搜索策略。

另一方面，分别衍生自CPXM2和ASM3B的转染毒性肽及衍生自BPIL3和FALL39的毒性肽包含在此第三组内。有趣地，分类为毒性的肽中的一些衍生自杀菌肽。这类肽干扰病原体的膜完整性。在高浓度下，这些肽对人癌细胞具有毒性。至少FALL肽在特定浓度范围内显示介导siRNA转染。此发现可以解释为：在质膜中形成了孔，可以通过其发生siRNA的非特异性摄取。另一解释是，肽介导的siRNA摄取为该肽的毒性所掩蔽。此外，最近提出的涉及CPP摄取的膜修复机制(Palm-Apergi，C.等(2009)FASEB J.23，214-223)也可以有助于解释这些肽的部分功能性。

但是，这些肽在转染所必需的浓度下已经降低细胞生存力的事实妨碍了这类肽在siRNA递送中的适用性。

实施例7：NRTN衍生肽的表征

7.1NRTN衍生肽的结构特征

neurturin(NRTN)衍生肽是在本筛选中鉴定的候选者，其始终在不干扰细胞生存力的浓度下显示最高的转染siRNA的能力。此肽能够与siRNA形成涉及核酸的强烈凝聚的非共价复合体。此特征符合溴化乙锭嵌入剂不易于接近NRTN络合的siRNA的发现。如利用凝胶移位测定所测定，NRTN和siRNA之间的复合体形成在1∶50的比值下最大。在本文所用的体外功能性(即，转染能力)测试系统中，这对应于100nM siRNA对5μM肽的比值。但是，如果该体外系统中的NRTN浓度提高至高于复合体饱和的比值，则观察到附加的转染活性。可以通过游离的带正电荷的NRTN肽保护siRNA-NRTN复合体免遭细胞表面上的阴离子蛋白聚糖破裂的能力来解释此发现。

NRTN肽介导siRNA转染的机制是什么？与核酸形成复合体当然是肽功能性的一个必需要求，因为所有具有转染能力的肽都显示此特征。但是，复合本身并不足以介导转染，因为也鉴定了与TAT同样好或甚至比TAT 更好地形成siRNA复合体但不具有转染功能性的肽。此外，一级序列的组成(即，存在的带电荷残基和/或疏水残基的数目)也不可能单独介导功能性。许多与TAT具有序列相似性的肽(包括具有非常高的序列相似度的肽)没有功能。

NRTN衍生肽的转染功能性的一种可能的解释可以见于它的二级结构中。选择三十聚体肽来进行筛选(不同于应用更短的肽的大多数其他方法(Futaki，S.等(2001)，上文；Crombez，L.等(2007)Biochem.Soc.Trans.35，44-46；Jafari，M和Chen，P.(2009)Curr.Top.Med.Chem.9，1088-1097))具有这样的优势，这些肽具有更高的可能性折叠并保持特定二级结构。NRTN是TGF生长因子蛋白质家族的成员，且类似于各自的结构已被解析的GDNF和Artemin(Eigenbrot，C.和Gerber，N.(1997)Nat.Struct.Biol.4，435-438；Wang，X.等(2006)Structure 14，1083-1092)。

大鼠GDNF序列和人NRTN序列的序列比对及提出的二级结构的比较显示，具有转染活性的NRTN肽序列可以形成二级结构(参见图10)。对应于功能性NRTN肽的序列部分定位于蛋白质的可及表面上，且包含带正电荷的α-螺旋氨基酸序列。NRTN内的α-螺旋结构的鉴定完全符合α-螺旋结构有利于膜穿透的现有假设(Deshayes，S.等(2004)，上文)。所分析的NRTN衍生肽包含完整的α-螺旋结构以及周围区域的观察结果支持本方法筛选更大的肽的可靠性。仍有待澄清α-螺旋结构本身(其覆盖该三十聚体肽的12个氨基酸)是否足以介导有效的转染。但是，似乎可能是，至少一些附加残基也为肽功能性所需。

为了获得这些二级结构预测的实验证据，利用UV圆二色性(UV-CD)光谱学(综述于例如Whitmore，L.和Wallace，B.A.(2008)Biopolymers 89，392-400中)针对二级结构元件的存在进一步分析了NRTN肽。此技术使得能够与非构造的无规卷曲序列相比较，根据它们的特定UV光谱来鉴定折叠为二级结构的序列元件。用Jasco J 715旋光光度计(Jasco，Inc.，Easton，MD，美国)以0.1nm的数据间距和1nm的带宽从195nm至260nm进行分析。该仪器的测定池具有0.1cm的长度。按0.1mg/ml的浓度利用肽(参见图11)。

用之前已显示折叠为α-螺旋结构的FALL肽作为阳性对照(Agerberth，B.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.美国92，195-199)。在水溶液中，FALL肽采用无规卷曲构象。在存在10％三氟乙醇(TFE)作为共溶剂的情况下，光谱分别在208nm和222nm显示特征性最小峰，其随TFE浓度的增加(即，25％TFE和50％TFE；参见图11A)变得更显著。已知TFE稳定，诱导肽和蛋白质中二级结构的形成(Buck，M.(1998)Q.Rev.BIophys.31，297-355)。

在与FALL肽相同的测定条件下分析NRTN肽时，观察到了类似的光谱，即，分别在208nm和222nm显示最小峰的光谱。因此，NRTN肽实际上包含根据序列同源性数据预测的α-螺旋部分(参见图11B)。

相反，用TAT肽获得的光谱未显示此肽折叠为二级结构的迹象。甚至在存在50％TFE的情况下，该肽也采用无规卷曲构象(参见图11C)。

此外，通过FACS分析监测的内化行为表明，NRTN肽不仅作为例如siRNA分子的转染试剂发挥作用，还甚至在缺乏核酸分子的情况下作为细胞穿透肽发挥作用。此发现表明，NRTN还可以代表缀合负荷(如其他肽或蛋白质)的适宜载体。值得注意的是，NRTN的内化似乎并非线性依赖于所利用的浓度。相反，似乎存在特定的阈值，在该阈值以上，发生细胞摄取。还针对诸如TAT和Poly-Arg的其他肽的内化行为观察到了这种阈值现象(Duchardt，F.等(2007)，上文)。

此外，FACS分析显示了FALL肽在细胞中的强烈累积。此发现符合FALL肽作为细胞毒性肽的观察结果。毒性需要肽和靶细胞的直接物理相互作用。但是，与NRTN肽不同，FALL的内化行为线性依赖于它的浓度。因此，对FALL的毒性而言，不存在阈值，这符合所获得的显示浓度依赖性细胞毒性的细胞生存力数据。

另一方面，非转染肽WNT16不以显著的程度内化入细胞。因此，仅在肽的一级序列中存在带正电荷的氨基酸不能指示该肽作为CPP的可用性。这些结果提供进一步的暗示，折叠为二级结构的序列模体(如NRTN 中)可以构成CPP的细胞摄取的主要决定子。

7.2NRTN衍生肽在血清的存在下具有转染活性

治疗性siRNA递送是所鉴定的人CPP样肽的一种吸引人的应用。用显示相似或甚至更好的功能性的人序列取代非人病原体衍生的实体对治疗方法有利，因为它降低了转染组件可以具有免疫原性的风险。给定肽的治疗性应用还需要该肽具有足够的(转染)活性。此外，所观察到的肽的体外活性在体内环境中必须也是真实的。

本领域中完善的用于检测肽介导的转染的“标准体外条件”下进行本文所述的大多数测定(见例如Simeoni，F.等(2003)Nucleic Acids Res.31，2717-2724；Richard，J.P.等(2005)J.Biol.Chem.280，15300-15306；Abes，R.等(2007)Biochem.Soc.Trans.35，775-779；Kumar，P.等(2007)Nature448，39-43；Mueller，J.等(2008)Bioconjug.Chem.19，2363-2374；Sugita，T.等(2008)Br.J.Pharmacol.153，1143-1152)。因此，在基本不含血清的条件下进行初始“转染步骤”的孵育。在此步骤加入血清干扰CPP的转染能力(参见图13；还见Ignatovich，I.A.等(2003)，上文)。但是，(CPP样)肽的治疗适用性显然需要血清接触。值得注意的是，在培养基(虽然具有降低的血清浓度)的存在下，NRTN肽仍然可以介导转染(参见图13)。

7.3NRTN衍生肽在血脑屏障细胞培养物模型中结合并内化入上皮细胞

之前已报道，细胞穿透肽不仅可作为用于将siRNA递送入细胞的转染载体应用，在穿透诸如血脑屏障的屏障来例如介导脑中的RNAi中似乎也具有功能(Mathupala，S.P.(2009)Expert Opin.Ther.Pat.19，137-140)。容易让人推测，NRTN在这方面也可以具有功能，因为NRTN是神经胶质细胞衍生的神经营养因子(Sariola，H.和Saarma，M.(2003)J.Cell Sci.116，3855-3862)，可能更好地接近中枢神经系统。

为了评价NRTN衍生肽与形成血脑屏障的内皮细胞的可能的相互作用，在血脑屏障(BBB)模型(Weksler，B.B.等(2005)FASEB J.19，1872-1874；Poller，B.等(2008)J.Neurochem.107，1358-1363)中将 hCMEC/D3细胞或原代人脑内皮细胞暴露于NRTN衍生肽。这些分析的结果(参见图14)显示，NRTN衍生肽在这些测定条件下累积(即，内化)在内体结构中。在BBB内皮细胞中，紧密连接有效阻止了亲水分子的细胞通道，内体是使得大分子能够受控地转运跨过血脑屏障的胞吞转运机制的主要成分。因此，NRTN衍生肽定位至对BBB功能性(即，对介导和控制跨BBB转运)重要的区室。

CPP的治疗适用性的另一可能的延伸是它们与诸如抗体和抗体片段的靶向部分的组合。

实施例8：NRTN衍生肽在胞内递送促凋亡肽中的应用

NRTN衍生肽的内化行为(参见上文)显示，这些肽不仅作为例如siRNA分子的转染试剂发挥作用，还作为“经典的”细胞穿透肽发挥作用。此发现表明，NRTN还可以代表缀合负荷(如其他肽或蛋白质)的适宜载体。

为了确定NRTN衍生序列是否能够介导肽的细胞摄取，将多种具有生物学活性的肽与NRTN融合。所利用的肽融合配偶体显示与涉及介导凋亡的胞质靶蛋白相互作用。换言之，如果表达或主动递送至癌细胞的细胞质，则这些肽诱导凋亡(即，它们是“促凋亡的”)。但是，这些促凋亡肽本身不能穿透生物膜。只有它们与已知CPP(如TAT、穿透肽和poly-Arg)的缀合或融合使得能够进行细胞摄取，从而诱导凋亡。

为了评价NRTN衍生序列的细胞穿透功能性，使用了以下融合配偶体：(i)核受体Nur77衍生的肽，其与BCL2相互作用，并将它转变为促凋亡分子；和(ii)与翻译因子eIF4E相互作用的4E-BP1衍生肽，eIF4E结合mRNA的5′CAP结构，且已知其在癌细胞中调节凋亡。

8.1NRTN介导的促凋亡的NUR77衍生肽的胞内摄取

Nur77是能够与关键凋亡介质(如BCLB和BCL2)相互作用的核孤儿受体。Nur77与BCL2的相互作用引起BCL2的构象变化，导致其BH3结构域的暴露。这将BCL-2转变为具有促凋亡功能的蛋白质(Lin，B.等(2004)Cell 116，527-540；Luciano，F.等(2007)Blood 109，3849-3855)。还可以用衍生自诸如Nor1的相关蛋白质的肽来达到相同的转变(Kolluri，S.K.等(2008)Cancer Cell 14，285-298)。

Nor1和Nur77各自的BCL2相互作用序列可以比对如下：

Nor1 GDWIDSILAFSRSLHSLLVDL (SEQ ID NO：70)

Nur77 GEWLDSIKDFSLNLQSLNLDI (SEQ ID NO：71)

能够与BCL-2相互作用的甚至更小的肽由Nor1的C端12个氨基酸组成：FSRSLHSLLVDL(SEQ ID NO：72)。

虽然已证明了它将BCL-2转变为促凋亡分子的能力，但甚至以高浓度将后一种肽(即，“Nor/Nur”；SEQ ID NO：72)加至癌细胞并不足以诱导凋亡，因为细胞靶蛋白定位在细胞质中，但该肽本身不能有效穿过细胞膜到达靶标。简言之，在此肽的存在下孵育MCF-7乳腺癌细胞24小时。未观察到细胞生存力的降低或凋亡的诱导(细胞毒性和生存力测定见实施例1)。类似地，将这些细胞暴露于人衍生的CPP NRTN也未影响细胞生存力或导致凋亡的诱导(参见图15)。

为了分析NRTN实际上是否具有CPP功能性，产生了杂合序列，该杂合序列在N端包含Nur77衍生的肽序列，该肽序列在C端与NRTN肽的部分融合。为了确定适宜的融合位置，发现Nur77肽的C端部分类似于NRTN肽内的序列，并选择此区域作为融合点。产生的NurNRTN融合肽以及两种亲本肽的氨基酸序列图示在图15的下图中。融合肽保留Nur77的全长序列(以几乎未改变的形式)和NRTN肽的缩短的N端序列。产生的肽具有与亲本NRTN肽相同的长度(30氨基酸)。

NurNRTN的氨基酸序列是：

FSRSLHSLLYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO：73).

为了确定Nur77衍生肽的BCL2结合特性是否保留在NurNRTN融合肽中，分别将NurNRTN和NRTN肽偶联至碘乙酰基小球(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL，美国)。用重组BCL2(Calbiochem/Merck，Darmstadt，德国)孵育小球，并用PBS和0.5MNaCl、0.025NaN₃、0.05％Tween20洗涤来去除未结合的蛋白质。通过以下来测定BCL2与固定化NurNTRN融合肽的特异性结合：用洗脱缓冲液(pH 2.8)从小球洗脱结合的肽，将洗脱的级分转移至硝酸纤维素(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，美国)，并利用MemCode蛋白质可逆染色试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，美国)检测蛋白质。这些分析的结果显示，可以在来自NurNRTN融合肽包被的小球的洗脱物中检测到BCL2。相反，从NRTN肽包被的小球洗脱了量非常小的BCL2。因此，NurNRTN融合肽保留了结合BCL2的能力。

随后，评价了NurNRTN融合肽是否能够穿透细胞膜，从而在细胞内诱导促凋亡活性。用MCF-7人乳腺癌细胞作为模型。实验方法如上文所述(参见实施例1)。在分别测试Nur77和NRTN肽时未产生细胞毒性的肽浓度下，融合肽显示显著的细胞毒性，其还反映为凋亡的诱导(参见图15)。此效应是剂量依赖性的：细胞毒性随肽浓度提高而增加。

作为对照，将NUR肽的非活性突变体与NRTN肽融合。此肽不干扰细胞生存力。此外，NUR肽与非活性WNT16肽的融合也不干扰细胞生存力。

这些结果表明，NRTN衍生序列与本身不能穿透细胞的肽的融合可以进入细胞，并引出胞内活性。换言之，融合肽的NRTN部分作为载体发挥作用来在细胞中发挥Nur77(即负荷)的促凋亡活性。此外，这些结果提供证据证明，在其氨基端改变的NRTN衍生序列保留CPP功能性。

8.2NRTN介导的促凋亡的4E-BP1衍生肽的胞内摄取

eIF4E是结合mRNA的5′CAP结构且对细胞生存力重要的翻译因子。干扰eIF4E的功能性可以在癌细胞中导致凋亡。蛋白质4E-BP1结合eIF4E，从而调节/干扰eIF4E的功能性。结果，由于其对eIF4E功能性的调节，提高的4E-BP1水平导致翻译的抑制，从而在癌细胞中导致凋亡的诱导(Flynn，A.和Proud，C.G.(1996)Cancer Surv.27，293-310；Robert，F.和Pelletier，J.(2009)Expert Opin.Ther.Targets 13，1279-1293)。

还可以用长度为20个氨基酸的小肽来达到全长4E-BP1的促凋亡功能性(Tomoo，K.等(2006)Biochem.J.140，237-246)。此肽包含eI4FE结合基序(YXRXXLB，其中X是任意氨基酸，B是疏水残基；Moerke，N.J.等(2007)Cell 128，257-267)。进一步的分析已显示，该结合基序的其余三个氨基酸残基(即，Y、R、L)对促凋亡功能性很重要(Marcotrigiano，J.等(1999)Mol.Cell 3，707-716)。这些残基的突变(例如，用甘氨酸残基取代)导致活性4EBP1衍生肽转变为非活性衍生物。

本文所用的活性和非活性4E-BP1肽的氨基酸序列是(对于所有序列，还见图16的下图)：

4E-BP1 GTRIIYDRKFLMECRNSPVT(SEQ ID NO：74)

inact4E-BP1 GTRIIGDGKFGMECRNSPVT(SEQ ID NO：75)

虽然已证明了它阻断eIF4E的能力，但甚至以高浓度将4E-BP1衍生肽加至癌细胞并不足以诱导凋亡，因为细胞靶蛋白定位在细胞质中，但该肽本身不能有效穿过细胞膜到达靶标。简言之，在此肽的存在下孵育MCF-7乳腺癌细胞24小时。未观察到细胞生存力的降低或凋亡的诱导(细胞毒性和生存力测定见实施例1)。类似地，将这些细胞暴露于人衍生的CPP NRTN也未影响细胞生存力或导致凋亡的诱导(参见图16的上图)。

之前，已显示诸如TAT的已知CPP与4EBP1衍生肽的融合导致该融合肽的细胞摄取(Ko，S.Y.等(2009)Clin.Cancer Res.15，4336-4347)。本文利用了以下TAT/eIFE4融合肽：

TAT4E-BP1 YGRKKRRQRRRGTRIIYDRKFLMECRNSPVT

(SEQ ID NO：76)

TATinact4E-BP1 YGRKKRRQRRRGTRIIGDGKFGMECRNSPVT

(SEQ ID NO：77)

在这些TAT/4E-BP1融合肽的存在下孵育24小时的MCF-7乳腺癌细胞在20μM的浓度下显示细胞生存力的降低和由凋亡的诱导引起的细胞毒性(细胞毒性和生存力测定见实施例1)的清晰证据。此效应由具有功能活性(即，促凋亡)的4E-BP1肽序列特异性介导，因为对应的突变变体完全无活性(参见图16的中图)。

为了分析NRTN实际上是否具有CPP功能性，产生了杂合序列，该杂合序列在N端包含NRTN肽的部分，该部分在C端与活性或非活性4EBP1衍生肽序列融合。产生的两种融合肽的氨基酸序列图示在图16的下图中。该融合肽保留4E-BP1的全长序列以及全长NRTN肽，导致总长度为50个氨基酸。因此，这些分子显著大于已知的CPP。

该活性或非活性NRTN/4E-BP1融合肽的氨基酸序列是：

NRTN4E-BP1 (SEQ ID NO：78)

GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRAGTRIIYDRKFLMECRNSPVT

NRTNinact4E-BP1 (SEQ ID NO：79)

GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRAGTRIIGDGKFGMECRNSPVT

随后，评价了NRTN4E-BP1融合肽是否能够穿透细胞膜，从而在细胞内诱导促凋亡活性。用MCF-7乳腺癌细胞作为模型。实验方法如上文所述(参见实施例1)。在分别测试4E-BP1和NRTN时未产生细胞毒性的肽浓度下，融合肽显示显著的细胞毒性，其还反映为凋亡的诱导(参见图16的中图)。此效应是剂量依赖性的：细胞毒性随肽浓度提高而增加。

此外，与它的TAT融合对应物相比，NRTN融合肽显示显著更高的效力。此外，所观察到的细胞毒性作用由具有功能活性(即，促凋亡)的4E-BP1肽序列部分特异性介导，因为该融合肽的对应的突变变体无活性(参见图16的中图)。4E-BP1肽与WNT16肽的融合不干扰细胞生存力。

这些结果表明，NRTN衍生序列与本身不能穿透细胞的肽的融合可以进入细胞，并引出胞内活性。与TAT融合肽的直接比较显示，NRTN融合具有更高的效力。这些结果还提供证据证明，在其羧基端改变的NRTN衍生序列保留CPP功能性。最后，通过利用NRTN衍生序列，可以产生具有至少50个氨基酸的长度的功能性CPP。

可以在缺乏本文未明确公开的任意一个或多个组成部分、一个或多个限制的情况下适宜地实施本文说明性描述的本发明。因此，例如，应扩大而无限制地理解术语“包含”、“包括”、“含有”等。此外，本文所用的术语和表述作为描述性术语而不是限制性术语使用，在这类术语和表述的使用中不存在排除所显示和描述的特征或其部分的任意等同物的意图，而应认为，在本发明所要求的范围内，多种修改是可能的。因此，应理解，虽然已通过实施方案和可选特征明确公开了本发明，但本领域技术人员可以求助于其中所包含的发明的修改和变动，认为这类修改和变动也在本发明的范围之内。

本文已概括地和按属类地描述了本发明。落在此类公开内容内的每一较窄种类和亚类分组也形成本发明的部分。这包含具有从该属类去除任意主题的条件或阴性限制的本发明的种类描述，无论所删除的材料是否在本文中明确引用。

其他实施方案在以下权利要求之内。此外，在按照Markush组描述本发明的特征和方面时，本领域技术人员应理解，因此还按照Markush组的任意个体成员或成员亚组描述本发明。

表1：进行实验评价的人候选CPP以及对照肽。

对照肽显示为灰色。“分类”列指肽的关于它们的转染能力以及细胞毒性的功能性分类：“-”，非转染非毒性肽；“tox”，非转染毒性肽；“+/tox”，转染毒性肽；“+”，转染非毒性肽。

其中，Trunc-protamine是：Trunc_鱼精蛋白；

Crotamine是：响尾蛇胺；

Perforin是：穿孔蛋白；

Defensin是：防卫素；

Factor_H_derived是：因子H衍生的。

Claims

1.组合物，其包含至少一种附着于一个或多个核酸分子的肽，所述肽能够内化入细胞，其中所述肽：

(a)具有氨基酸序列GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(SEQ ID NO:2)；和

(b)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:1)的TAT肽的内化效力的至少200％的效力内化入细胞；和

其中通过选自共价键和非共价键的连接来达到所述附着。

2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种肽的至少部分形成α-螺旋二级结构。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述至少一种肽具有哺乳动物来源。

4.权利要求3的组合物，其中所述至少一种肽具有人来源。

5.产生权利要求1至4中任一项的组合物的方法，其包括：

(a)提供能够内化入细胞的至少一种肽；和

(b)使所述至少一种肽与一个或多个核酸分子接触，从而允许形成附着。

6.检测权利要求1至4中任一项的组合物的内化行为的体外方法，其包括：

(a)对一个或多个细胞施用所述组合物；和

(b)检测所述组合物的内化。

7.药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的组合物。

8.权利要求7的药物组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂和/或添加剂。

9.权利要求1至4中任一项的组合物的用途，用于体外转化或转染一个或多个细胞。

10.权利要求1至4中任一项的组合物在制备用于预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病和炎性疾病的病症的药物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述炎性疾病是感染。