CN102994464B - 一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有葡萄糖1-4wt%，(NH₄)₂SO₄1-4wt%，Zn²⁺0.5×10^-4-4×10^-4mol/L，VB₄1×10^-4-1×10^-3wt%，培养基初始pH=3.8-4.4。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量1mL，玻璃珠0个，于25℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。

Description

一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。 

背景技术

漆酶(Laccase)是一种含铜多酚氧化酶，它能催化一系列有机和无机化合物发生一个电子氧化，同时伴随有氧还原成水。目前已发现多种生物能产生漆酶，包括植物、真菌、昆虫、细菌等。其中，以真菌中的白腐菌分布最多（钞亚鹏等，2001）。 

漆酶具有广泛的底物作用范围，可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃。因此，在生物降解、制浆造纸中、废水处理、生物漂白、污染物脱毒、土壤修复等方面，漆酶具有重要的应用价值。目前，漆酶的研究己在多领域、多水平上展开。许多由真菌引起的植物病害中，漆酶被显示是一个重要的毒力因子^[8]。揭示虫生真菌是否能产漆酶，可为虫生真菌生防作用的深入研究提供依据。对虫生真菌漆酶的研究结果若能应用在对害虫的生物防治，无疑能更大限度地开发利用生物资源。 

扁座壳孢(Aschersonia placenta)是一种重要的昆虫病原真菌，在农林害虫生物防治中具有广泛的应用前景。该菌属子囊菌门 (Ascomycota)粪菌纲(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科(Clavicipitaceae)座壳孢属(Aschersonia)，而对扁座壳孢发酵生产漆酶国内鲜有报道，具有较大的发展前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。 

本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，所述培养基的原料含有葡萄糖0.5-2wt%，(NH₄)₂SO₄ 1-4wt%，Zn²⁺0.5×10^-4-4×10^-4mol/L，VB₄ 1×10^-4-1×10^-3wt%，培养基初始pH=3.8-4.4。 

更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有葡萄糖0.5wt%，(NH4)₂SO₄4wt%，Zn²⁺0.5×10^-4 mol/L，VB₄ 5×10^-4 wt%，培养基初始pH=4.4。 

其次，本发明还提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，所述方法包含以下步骤： 

（a）将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量1mL，于25℃，转速160 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，20%土豆汁1L、葡萄糖 2%、酵母膏 1%，自然pH。 

本发明采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。 

采用本发明优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期3d，玻璃珠0个，发酵产生结果扁座壳孢产漆酶为45U/mL以上。 

本发明的有益效果：本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。 

附图说明

图1 不同碳源对产酶活性的影响。注：图中Dex、D-Sor、Mal、Fru、Suc、Myc、SS、Car、L-Ara、CK分别表示葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、L-阿拉伯糖和对照组。 

图2 不同氮源对产酶活性的影响。注：图中YE、YEP、Try、PN、Cas、AS、SN、Pep、Ure、CK分别表示酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO₃、干酪素、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、蛋白胨、尿素和对照组。 

图3 不同维生素对产酶活性的影响。 

图4 不同无机盐离子对产酶活性的影响。 

图5不同初始pH对产酶活性的影响。 

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 

实施例1 

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基和基础培养基配制

（a）种子培养基：20%土豆汁1L、葡萄糖 2%、酵母膏 1%，自然pH。1.01MPa，灭菌20min。

（b）基础培养基：20%土豆汁1L、葡萄糖 2%、酵母膏 1%，自然pH。1.01MPa，灭菌20min。 

（2）发酵种子的制作：将扁座壳孢接种于马铃薯琼脂培养基上，于25℃下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25℃，转速160 r/min下培养24h，即为发酵液。 

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下， 5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长465nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。 

（4）漆酶酶活测定：取0.2mL发酵上清液加入3.3mL醋酸缓冲液(pH4.4)和0.5mL 4.0mmol/L愈创木酚中(以热灭活上清液作为对照)，25℃水浴5min，冰浴加入2mL 16.5%三氯乙酸试剂终止反应，离心后取上清液在波长465nm下测吸光度。 

式中，A为样品的吸光度；V _总、V _酶分别代表反应体系总体积及反应酶液的体积；ε为吸光系数(ε₄₆₅＝1.21×10^-4mol/L·cm)；以每分钟氧化底物1.0μmol来定义酶活。

 （5）不同碳源、氮源、维生素、无机盐离子、初始pH对产漆酶的影响。 

（a）碳源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加2%葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠和L-阿拉伯糖，接入相同的扁座壳孢菌液，在25℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。 

（b）氮源对产酶的影响，在基础培养基中分别添加1%的酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO₃、干酪素、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、蛋白胨和尿素，接入相同的扁座壳孢菌液，在25℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。 

（c）维生素对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加0.01% V_B1、V_B2、V_B4、V_B6、V_C、V_E、V_复合，接入等量的扁座壳孢菌液，在25℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。 

（d）无机盐离子对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加相同摩尔数的无机盐离子(0.4mmol NaH₂PO₄·2H₂O、KH₂PO₄、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、FeCl₃·6H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、CoCl₂·6H₂O、MnSO₄)，接入相同的扁座壳孢菌液，在25℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。 

（e）初始pH对酶产量的影响，用基础培养基分别提供不同酸碱度的培养环境(pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)，接入等量的扁座壳孢菌液，在25℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。 

实验结果 

碳源对酶产量的影响：如图1所示，添加葡萄糖大幅提高了漆酶活性。在接种后第3d就出现漆酶活性高峰，酶活性达到43.27U/mL。添加D-山梨醇、果糖、可溶性淀粉的处理，在接种后第3d酶活分别达到14.40U/mL、14.43U/mL、16.60U/mL，与对照组酶活15.43U/mL相近；添加海藻糖、麦芽糖、羧甲基纤维素钠、蔗糖和L-阿拉伯糖的处理都对供试菌产酶有不同程度的抑制作用。添加蔗糖和L-阿拉伯糖的处理检测不到酶活。

氮源对产酶的影响：如图2所示，在所添加的不同氮源中，添加酵母膏、酵母浸粉和硫酸铵的处理有助于提高产酶水平，酶活性分别达到40.55U/mL、39.19U/mL、41.62U/mL，而添加干酪素、蛋白胨的处理较对照处理的酶活低，二者对供试菌产酶具有抑制作用。此外，胰蛋白胨、硝酸钾、硝酸钠和尿素的处理对其有强烈的抑制作用。据此，硫酸铵是扁座壳孢菌产漆酶的最佳氮源。 

维生素对酶产量的影响：如图3所示，在所添加的不同维生素里，与CK相比，维生素B₄最有助于扁座壳孢菌提高产酶水平(图5)，维生素C次之，然后是复合维生素，所测得酶活力分别为：45.22U/mL、37.58U/mL、29.06U/mL。实验结果表明：添加维生素B₁、维生素B₆均能增加扁座壳孢菌产漆酶。而维生素B₂与维生素E对产酶则有显著的抑制作用，测得酶活仅为：6.54U/mL、6.06U/mL。 

初始pH对酶产量的影响：如图4所示，在所添加的相同摩尔数不同种无机盐离子中，添加Na⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺的处理均有助于提高该菌产漆酶能力，酶活性分别达到19.87U/mL、36.18U/mL 、35.23U/mL、23.66U/mL，而添加K⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺的处理较对照处理的酶活低，对供试菌产酶具有抑制作用。此外，Cu²⁺ 对扁座壳孢菌产漆酶无明显的促进作用。据此，Zn²⁺ 最能提高扁座壳孢菌产漆酶。 

无机盐离子对酶产量的影响：如图5所示，在不同初始pH的培养基中培养后，pH=4.0的处理有助于提高产漆酶能力，酶活性达到30.93U/mL，初始pH=4.5的处理，其酶活值也达23.80 U/mL。据此，初始pH=4.0-4.5最能提高扁座壳孢菌产漆酶。 

实施例2 

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表1，将相同量的接种量（10%）菌种接种于250mL，装有50mL培养液，在25℃，转速160 r/min下培养培养3d。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表1 扁座壳孢漆酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计 

表2 扁座壳孢漆酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

注:K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和，K4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表3 培养基优化验证试验 

正交结果分析表明：由表2，3可得适合测定供试菌漆酶活力的反应体系为：A₁B₄C₁D₃E₄。正交实验结果表明：相应水平的碳源、氮源、金属离子、维生素、pH分别是：0.5%葡萄糖，4% (NH₄)₂SO₄，0.5×10^-4 mol/L Zn²⁺，维生素B₄ 5 mg，pH 4.4，即A₁B₄C₄D₄E₄。从表2极差分析可知，变化因子的极差值R分别为碳源(56.46)、氮源(34.57)、金属离子(20.09)、维生素(40.19)和pH(25.02)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与扁座壳孢菌漆酶培养基密切相关，尤其是碳源葡萄糖的变化对该菌产漆酶的影响更大。

(2)正交实验确定最优培养条件 

在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，玻璃珠个数，培养时间，在25℃，转速160 r/min下培养，各组号的培养时间以表9为准。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表4扁座壳孢漆酶四因子三水平（3⁴）正交实验 

表5扁座壳孢漆酶四因子三水平（3⁴）正交实验设计实验结果

注: K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和， R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

5可知，分别选取最适合该菌产漆酶的各培养条件(接菌量、装液量、内置玻璃珠个数和培养时间)进行4因素3水平的正交试验，以筛选出最优培养条件。4个因子均对扁座壳孢菌产漆酶有影响。由表8可知，最高酶活力可达到46.07U/mL，其相应的实验条件为A₁B₁C₁D₁(接种量1mL，装液量50mL，不放置玻璃珠，培养时间3d)；据正交试验分析结果，可以得到：A₁B₁C₁D₁是最有利于产酶的条件。 

实施例3 

真菌产漆酶发酵方法

（1）    发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：扁座壳孢

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。

（B）种子液制备 

将斜面上的纯种扁座壳孢转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL培养基，然后在25℃，在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养3d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

（2）    发酵培养 

发酵培养基：按照培养基优化正交实验结果，即含有葡萄糖0.5w%，(NH₄)₂SO₄ 4 w %，Zn²⁺0.5×10^-4 mol/L，V_B4 5×10^-4 w %，培养基初始pH=4.4，配制。

将上一步骤中制备的扁座壳孢发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量1mL接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液， 

摇床温度：27℃±1℃，转速160rpm，

发酵周期：3d，

发酵产生结果扁座壳孢产漆酶为45U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (4)

1.一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料中含有葡萄糖0.5-2wt%，(NH₄)₂SO₄ 1-4wt%，Zn²⁺0.5×10^-4-4×10^-4mol/L，VB₄ 1×10^-4-1×10^-3wt%，培养基初始pH=3.8-4.4。

2.根据权利要求1所述的扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料，含有葡萄糖0.5wt%，(NH4)₂SO₄4wt%，Zn²⁺0.5×10^-4 mol/L，VB₄ 5×10^-4 wt%，培养基初始pH=4.4。

3.一种扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

（a）将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量1mL，玻璃珠0个，于25℃，转速160 r/min下培养。

4.根据权利要求3所述的扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有：按培养基的重量计算，含有20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。

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