CN105671024A

CN105671024A - 一种利用淡紫拟青霉yt08生产壳聚糖酶的方法

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Publication number: CN105671024A
Application number: CN201610250994.1A
Authority: CN
Inventors: 程仕伟; 解孝满; 潘笑笑; 张萍; 李文清; 解卫海
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2016-06-15

Abstract

本发明公开了一种利用淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶的方法，属于微生物技术领域，该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC？No.10026。本发明的发酵培养基：10～20g/L甘油，20～35g/L大豆蛋白胨，0.5～2.5g/L？MnSO₄，12～20g/L粉末壳聚糖，2.5～4g/L？NaCl，0.5～1.5g/L？CaCl₂，1.5～3.5g/L？MgSO₄，0.5～2g/L？FeSO₄；培养条件为：培养温度30～34℃，接种量0.2～0.8％(v/v)，pH？5～6.5。本发明的培养方法具有酶来源新颖，产酶量大，活力值高，操作简单，不易染菌，易于控制等优点。

Description

一种利用淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地涉及一种利用淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶的方法。

背景技术

壳聚糖是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的一类阳离子型氨基多糖，是几丁质部分或完全脱乙酰基的衍生物，由于在生理条件下的低溶解性和高粘度导致其有效应用受到阻碍。壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖类化合物，具有独特的生理活性和优越的功能性质，在食品、工业、医药和化工领域具有重要应用。

壳聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.1.132)是一类催化氨基葡萄糖间的β-1,4-糖苷键断裂，专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，是在催化壳聚糖底物水解转化制备壳寡糖的产业化领域具有重要应用前景的酶类，尤其是在低分子量且高生理活性的壳寡糖制备方面的应用引人注目。根据其作用位点不同，壳聚糖酶可分为3类：1)水解GlcN-GlcN键及GlcNAc-G1cN键；2)只能水解G1cN-GlcN键；3)既可水解G1cN-GlcN键又可水解G1cN-GlcNAc键。所有壳聚糖酶有一个共同催化性质就是要求糖苷键的一侧至少有1个G1cN残基，而不能催化GlcNAc-G1cNAc键的断裂，不同生物来源壳聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成产物壳寡糖聚合度存在差异。

壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌、蓝藻和植物等生物体中，其中细菌来源的壳聚糖酶的研究报道较多，而真菌来源的相对较少。从已有发表文献的结果，虽然壳聚糖酶的生物来源较多，但是多数生物体的壳聚糖酶产量偏少，难以进行产业化生产应用。本发明是在筛选获得一株用于番茄和葡萄根结线虫害防治的淡紫拟青霉(发明专利CN104818216A)的基础上，发现该菌株也高产壳聚糖酶，以此确定其培养方法，并适应于产业化生产制备壳聚糖酶，进一步应用于壳寡糖转化制造领域。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用淡紫拟青霉YT08菌株发酵生产高活性壳聚糖酶的方法，所述的酶可通过高效水解壳聚糖来生产高生理活性的壳寡糖。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

淡紫拟青霉(paecilomyceslelacinus)YT08菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCCNo.10026。

本发明提供一种利用该菌株发酵生产壳聚糖酶的方法，具体步骤如下：

(1)菌种活化：取保存的淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液；

进一步，所述的活化培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH7.0，121℃灭菌20min备用。

(2)发酵生产壳聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接种量在灭菌后的发酵培养基中接入步骤(1)活化种子液，在180rpm的旋转摇床中培养，控制温度为30～34℃，发酵3-5d后培养完毕，发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用；或者在发酵罐中以70％的体积比例装入发酵培养基，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵过程中的pH始终维持在pH5～6.5，调节培养温度在30～34℃，溶解氧维持在10％(mg/ml)以上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用。

进一步，所述得发酵培养基(g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO₄0.5～2.5，粉末壳聚糖(85％以上的脱乙酰度)12～20，NaCl2.5～4，CaCl₂0.5～1.5，MgSO₄1.5～3.5，FeSO₄0.5～2，pH5～6.5。

本发明的培养方法与现有技术相比的有益效果在于：

(1)产壳聚糖酶的活力高

本发明的培养方法，酶活力高于以往多数报道的酶活力值，表明其单位时空产率增加幅度大，具备产业化生产潜力。

(2)培养方法简单

淡紫拟青霉YT08的培养方法简单，对于碳源等营养因子需求低，培养容易且过程不易染菌；发酵罐培养过程中不需要复杂的补料工艺，适合工厂化放大生产。

(3)培养方法切合实际，酶活提高幅度大

采用本发明的培养方法，在实际发酵生产过程中的壳聚糖酶活力值，与初期的培养方法比较，其酶产量提高了100多倍，培养方法的产量突出。

(4)壳聚糖酶的生物来源新型

本发明涉及的是淡紫拟青霉来源壳聚糖酶的培养方法，目前还未见该生物来源壳聚糖酶的产业化报道，市场前景应用广阔。

附图说明

图1为实施例3中淡紫拟青霉YT08摇瓶发酵生产壳聚糖酶的培养曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。

实施例1：淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶发酵组分优化

碳源对菌株产壳聚糖酶的影响见表1，可以看出甘油、蔗糖和甘露醇作为碳源发酵生产壳聚糖酶的效果较好，最好的是甘油。所用的初始培养基成分(g/L)：酵母粉3，蛋白胨5，硝酸铵2，硫酸镁1，硫酸铵0.5，磷酸氢二钾3，磷酸二氢钠1，粉末壳聚糖5，碳源30，其中碳源为葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、甘油、糊精、淀粉、甘露醇，接入活化种子后在180rpm和30℃的摇床中发酵48h后测定酶活力。

表1碳源对菌株产酶的影响

碳源	相对酶活力(％)
		碳源	1.63
葡萄糖	3.28
		果糖	95.9
蔗糖	4.91
		麦芽糖	100
甘油	5.73
		糊精	2.45
淀粉	77.05

氮源对菌株产壳聚糖酶的影响见表2，大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、酵母粉是发酵生产壳聚糖酶的较好氮源，其中最佳氮源为大豆蛋白胨。所用的初始培养基组分(g/L)：甘油30，氮源10，硫酸镁1，磷酸氢二钾3，磷酸二氢钠1，粉末壳聚糖5，接入活化种子后在180rpm和30℃的摇床中发酵48h后测定酶活力。

表2氮源对菌株产酶的影响

金属盐对菌株产壳聚糖酶的影响见表3，对壳聚糖酶的发酵生产具有正效应的因素是硫酸锰、氯化钠、硫酸镁、氯化钙和硫酸亚铁，其中最佳产酶的金属盐为硫酸锰。所用的初始培养基组分(g/L)：甘油30，大豆蛋白胨10，金属盐2，粉末壳聚糖5，接入活化种子后在180rpm和30℃的摇床中发酵48h后测定酶活力。

表3金属盐对菌株产酶的影响

诱导物对菌株产壳聚糖酶的影响见表4，可以看出添加粉末壳聚糖对壳聚糖酶的诱导效果最好，所用的初始发酵培养基(g/L)：甘油30，大豆蛋白胨10，硫酸锰1，硫酸镁1，氯化钠1，诱导物5。

表4诱导物对菌株产酶的影响

诱导物	相对酶活力(％)
		粉末壳聚糖	100
胶体壳聚糖	62.94
		氨基葡萄糖	42.13
空白	9.14

选取对淡紫拟青霉YT08发酵生产壳聚糖酶有正影响的因素：甘油(X₁)、大豆蛋白胨(X₂)、NaCl(X₃)、FeSO₄(X₄)、CaCl₂(X₅)、MgSO₄(X₆)、MnSO₄(X₇)、粉末壳聚糖(X₈)，进行Plackett–Burman试验设计以筛选对菌株产酶有显著影响的培养因子，其试验设计和测定结果见表5。利用DesignExpert7.1.6(Stat-Ease,Inc.,Minneapolis,USA)软件分析，表明甘油(X₁)、大豆蛋白胨(X₂)、MnSO₄(X₇)、粉末壳聚糖(X₈)是对菌株产壳聚糖酶影响极其显著的培养因子。

表5Plackett–Burman试验设计与显著因素筛选

采用初始发酵培养基(g/L)：NaCl3，FeSO₄1，CaCl₂1，MgSO₄2，对甘油(X₁)、大豆蛋白胨(X₂)、MnSO₄(X₇)、粉末壳聚糖(X₈)这四个因素进行爬坡试验设计与优化，其结果见表6，可以看出序号4组获得最大壳聚糖酶活力。

表6爬坡试验设计与优化

序号	X₁	X₂	X₇	X₈	酶活(U/mL)
						初始	20	20	2	8	3.15
1	18	23	1.8	10	3.75
						2	16	26	1.6	12	4.07
3	14	29	1.4	14	6.44
						4	12	32	1.2	16	10.25
5	10	35	0.8	18	7.49
						6	8	38	0.6	20	6.58
7	6	41	0.4	22	4.86

以爬坡试验设计与优化的结果为中心点，进行甘油(X₁)、大豆蛋白胨(X₂)、MnSO₄(X₇)、粉末壳聚糖(X₈)这四个培养组分的中心组合设计与优化，其组合设计和结果见表7。利用DesignExpert7.1.6(Stat-Ease,Inc.,Minneapolis,USA)软件分析，表明将甘油的浓度调至12g/L，大豆蛋白胨的浓度调至29g/L，硫酸锰的浓度调至1g/L，粉末壳聚糖的浓度调至18g/L，可以得到最大的壳聚糖酶活性，为14.50U/mL。采用中心组合设计优化获得的培养组分，发酵48h后壳聚糖酶活性值为14.53U/mL，故本优化设计方案准确。

表7中心组合设计培养组分与优化

实施例2：淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶发酵条件优化

采用实施例1中的优化培养组分(g/L)：甘油12，大豆蛋白胨29，NaCl3，FeSO₄1，CaCl₂1，MgSO₄2，MnSO₄1，粉末壳聚糖18，通过对不同培养pH、培养温度和接种量条件下的发酵96h后的培养物进行壳聚糖酶活力测定，其结果见表8、表9和表10，可以看出淡紫拟青霉YT08产壳聚糖酶的最优培养pH为6，温度为32℃，接种量为0.6％(v/v)。

表8培养pH对菌株产酶的影响

培养pH	相对酶活力(％)
		4	56.24
5	89.92
		6	100
6.5	92.04
		7	79.45
7.5	72.75
		8	55.02
9	25.1
		10	4.67

表9培养温度对菌株产酶的影响

表10接种量对菌株产酶的影响

以单因素优化的培养温度、pH和接种量为中心点，进行Box-Behnken设计，深入优化优化培养条件，其组合设计和优化结果见表11。利用DesignExpert7.1.6(Stat-Ease,Inc.,Minneapolis,USA)软件分析，表明在温度30℃、pH5.0、接种量0.3％(v/v)时获得最大酶活性112.16U/mL。采用该组合设计优化后获得的培养条件，发酵96h后测定壳聚糖酶活性值为111.75U/mL，接近预测值，故本优化设计方案准确。

表11Box-Behnken设计培养条件与优化

实施例3：淡紫拟青霉YT08利用摇瓶培养发酵生产壳聚糖酶

采用实施例1优化后的发酵培养基(g/L)：甘油12，大豆蛋白胨29，MnSO₄1，粉末壳聚糖18，NaCl3，CaCl₂1，MgSO₄2，FeSO₄1；采用实施例2优化后的发酵条件：初始pH5，接种量0.3％(v/v)，培养温度30℃，摇瓶培养发酵生产壳聚糖酶，每500ml三角烧瓶中装液量100ml，每隔12小时取一瓶测定壳聚糖酶活性，绘制发酵曲线，其结果见附图1。随着淡紫拟青霉YT08的生长进入指数生长期，壳聚糖酶大量表达(24-72h)，并在发酵72h时获得最大壳聚糖酶活性，为126.47U/mL。

实施例4：淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶利用发酵罐(10L)发酵生产壳聚糖酶

1)对比例1

采用如下培养组分(g/L)：甘油20，大豆蛋白胨35，MnSO₄2.5，粉末壳聚糖20，NaCl4，CaCl₂1.5，MgSO₄3.5，FeSO₄2。10L发酵罐中培养基的装液量为7L，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH6.5，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在34℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10％以上。每隔6小时取样一次，测定壳聚糖酶活力，在发酵78h时获得最大壳聚糖酶活力，为109.35U/mL。

2)对比例2

采用如下培养组分(g/L)：甘油12，大豆蛋白胨29，MnSO₄1，粉末壳聚糖18，NaCl3，CaCl₂1，MgSO₄2，FeSO₄1。10L发酵罐中培养基的装液量为7L，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.3％(v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH6，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10％以上。每隔6小时取样一次，测定壳聚糖酶活力，在发酵72h时获得最大壳聚糖酶活力，为142.83U/mL。

实施例5：发酵罐(50L)发酵生产壳聚糖酶

1)对比例1

采用如下培养组分(g/L)：甘油12，大豆蛋白胨29，MnSO₄1，粉末壳聚糖18，NaCl3，CaCl₂1，MgSO₄2，FeSO₄1。50L发酵罐中培养基的装液量为35L，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.3％(v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH6，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10％以上。每隔6小时取样一次，测定壳聚糖酶活力，在发酵72h时获得最大壳聚糖酶活力，为145.76U/mL。

2)对比例2

采用如下培养组分(g/L)：甘油10，大豆蛋白胨20，MnSO₄0.5，粉末壳聚糖12，NaCl2.5，CaCl₂0.5，MgSO₄1.5，FeSO₄0.5。50L发酵罐中培养基的装液量为35L，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.3％(v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH5.5，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10％以上。每隔6小时取样一次，测定壳聚糖酶活力，在发酵66h时获得最大壳聚糖酶活力，为121.35U/mL。实施例5淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶最佳方案利用淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶的方法，具体步骤如下：

(1)菌种活化

活化培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5,pH7.0。500ml三角烧瓶中分装50ml活化培养基，121℃灭菌20min备用。从试管斜面保存淡紫拟青霉YT08菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养36h至菌体浑浊，制得活化种子液。

(2)发酵罐培养发酵生产壳聚糖酶

采用优化后培养基(g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO₄0.5～2.5，粉末壳聚糖(85％以上的脱乙酰度)12～20，NaCl2.5～4，CaCl₂0.5～1.5，MgSO₄1.5～3.5，FeSO₄0.5～2。以70％比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH5～6.5，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30～34℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在10％以上。经发酵2-4d后发酵完毕，测定壳聚糖酶活力，获得的最大壳聚糖酶活力可达145.76U/mL。发酵液经10000r/min离心5min，去除菌体后收集保留上清液，然后再经0.22um的微孔过滤膜过滤除菌，即作为液体酶使用。

所用壳聚糖酶的测定方法：发酵液经5000rpm离心10min得发酵上清液。取0.2mL发酵上清液加水至1ml，在加入1ml的底物溶液水浴(40℃)保温20min，加DNS试剂3mL，沸水浴5min，定容至25ml后取4ml反应样液在5000rpm下离心10min。取离心后上清液以对照组作为空白在520nm处测定OD值，根据DNS标准曲线，计算其酶活力。空白对照组：0.2mL发酵上清液加水至1ml，沸水浴5min灭活，再加入相同体积的壳聚糖溶液和DNS，处理方法同样品组。

酶活计算：以单位体积(ml)单位时间(min)水解产生的氨基葡萄糖的umol数为酶活力的定义单位，公式如下：

E = \frac{(A 520 + 0.079) \times 5}{0.1221 \times 20}

式中：E—壳聚糖酶活性(U/mL)，A₅₂₀—吸光值，5—稀释倍数，20—反应时间(min)

所用标准曲线的制作：精确称取100℃干燥至恒重的氨基葡萄糖盐酸盐0.13g，加蒸馏水溶解并定容至100ml，配成6umol/mL浓度的溶液。按不同浓度梯度在各25mL比色管中加入底物溶液和3mL的DNS显色液，沸水浴反应5min，定容至25ml后于520mn下测OD值，并绘制标准曲线。

所用壳聚糖底物溶液的配置：称取1克90％脱乙酰度的壳聚糖，加水50ml，逐渐滴加乙酸使其完全溶解，在滴加4mol/L的乙酸钠溶液调pH至6.0，定容至100ml后备用。

所用DNS试剂的配置：91g酒石酸钾钠加入500mL热水中，在45℃水浴中搅拌溶解后依次加入20gNaOH和3.15g3，5-二硝基水杨酸(DNS)，然后再加入2.5g结晶酚和2.5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，用蒸馏水定容至1000mL，贮存在棕色瓶中放置暗处一周后使用。

Claims

1.一种利用该菌株发酵生产壳聚糖酶的方法，其特征在于它的具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种利用该菌株发酵生产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的活化培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH7.0，121℃灭菌20min备用。

3.根据权利要求1所述的一种利用该菌株发酵生产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的发酵培养基(g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO₄0.5～2.5，85％以上的脱乙酰度的粉末壳聚糖12～20，NaCl2.5～4，CaCl₂0.5～1.5，MgSO₄1.5～3.5，FeSO₄0.5～2，pH5～6.5。