CN102899396B - 影响奶牛乳腺炎易感/抗性hmgb3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用，属于生物化学遗传育种技术领域，具体是通过反转录RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR的方法提供一个奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候选基因，利用牛HMGB3基因P3启动子区的1个功能性SNP位点的信息，并且采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在这个位点的基因型，选择具有乳腺炎抗性的基因型个体。选择有利的基因型个体留种，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群体中的频率，从而提高群体抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶牛乳腺炎的发病率，减少经济损失。本发明为奶牛的乳腺炎抗性遗传改良提供了一种新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学遗传育种技术领域，具体地说是一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因启动子区功能性分子标记位点及其在奶牛遗传改良中的应用。
背景技术
乳腺炎是奶牛饲养中最为常见、复杂的疾病之一，也是造成奶牛业损失最大的一种疾病。是乳腺组织受到物理、化学、微生物等的刺激所发生的炎性变化，其特点是乳中的体细胞增多，乳腺组织发生病理变化，乳的性状品质发生异常。据估计，大约95％的病例是由金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、链球菌(Strep.uberis)和大肠杆菌(E.coli)感染引起，每年因乳腺炎造成的损失高达350亿美元(Wellenberg等，2002)。该病所造成的经济损失包括降低牛奶的产量和乳品的质量和风味、增加奶牛的淘汰率、炎症的治疗费以及额外的劳动支出。同时乳腺炎的病原菌还可通过牛奶而危害人体健康。有关奶牛乳腺炎发病机理和防治的研究已有100多年的历史，并取得了显著的进展。然而，奶牛乳腺炎是一种非常复杂的疾病，尽管许多国家都已经对各种乳腺炎实施综合防治措施，但它是一种受多因素影响的疾病，很难控制。目前，对乳腺炎的控制与预防措施并没有从整体上降低乳腺炎的发病率，而且乳腺炎也是奶牛生产中抗生素使用的最主要原因(Villli，2001)。因此，我们迫切需要探讨其它途径来降低乳腺炎的发病率，通过遗传选择来提高奶牛乳腺炎抗性被认为是解决乳腺炎问题的一种最好的长期策略(Burton等，2001)。若通过遗传育种手段，可使奶牛增强乳腺炎的抗性，减少药物的使用量，改善牛奶质量安全，减少经济损失，有望从根本上解决乳腺炎这一长期困扰着世界奶业发展的难题。奶牛抗性的遗传力很低，基于表型选择的遗传改良效果不佳。而奶牛分子育种可以实现奶牛的早期选择，大大缩短奶牛遗传改良的世代间隔，节约选育成本，提高选择效率。启动子(promoter)是基因中一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(DNA)序列。它可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸(RNA)合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和 调控区域，就像“开关”，决定基因的表达与否，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。启动子本身并无编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像一面旗帜，其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点，指挥聚合酶的合成。因此，该区域的启动子发生突变(变异)，将对基因的表达有着毁灭性作用。例如，启动子区中的单核苷酸突变(SNP)可影响基因的表达调控、基因功能等，对个体的表型具有重要的影响，根据基因型可以选择出具有潜在不同的表型的个体。因此，基于功能性的分子标记辅助选择的分子育种技术具有很好应用潜力。
高迁移率族蛋白(High mobility group box，HMGB)是一种非组蛋白染色体蛋白质。通常位于细胞内，可参与多种生物学的过程，包括维持核小体结构、调节基因转录、核糖核酸形成、DNA修复等。染色体HMGB蛋白包括HMGB1、HMGB2、HMGB3是所有由核酸受体调控的先天性免疫反应的激发所必不可少的(Yanai H，Ban T，Wang Z，et al.HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses.Nature.2009Nov 5；462(7269)：99-103)。HMGB可能充当细胞内核酸的普适性“哨兵”。HMGB1、HMGB2、HMGB3是根据结合DNA的HMG盒的功能域区分的。其中，HMGB3据报道有两个转录本(NM_001076285.2和NM_001113257.2)。到目前为止，牛HMGB3基因的两个转录本的表达调控模式以及它在奶牛乳腺炎方面的功能性研究尚未见报道。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用。
本发明的技术方案改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法是：通过反转录RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR的方法提供一个奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候选基因，同时为了深入研究HMGB3两个转录本的表达调控模式，利用在线软件分析发现牛HMGB3基因共有3个启动子区：P1、P2和P3，进一步通过构建载体、细胞转染、启动子活性测定和荧光强度测定实验发现了牛HMGB3基因3个启动子的核心区域，并且在第3个启动子P3的核心区域内发现了一个SNP，构建EGFP-HMGB3-P3载体，经293T细胞转染后，发现该SNP位点可影响启动子P3活性，属于功能性位点，利用该SNP与奶牛乳中体细胞评分SCS的关联分析表明该SNP与奶牛乳腺炎有关，选择有利的等位基因型个体留种，从而改善种群奶牛的抗乳腺炎能力。
影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心启动子区的鉴定方法是通过 实时反转录RT-PCR和荧光定量RT-qPCR的方法发现目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺组织中mRNA存在差异表达；构建不同长度片段的pGL3-basic-HMGB3双荧光素酶报告基因载体，以及具有野生型和突变型碱基的pEGFP-N1-HMGB3载体，分别转染293T细胞，确定牛HMGB3基因的核心启动子区；通过对牛HMGB3基因核心启动子区进行直接测序分析，在HMGB3基因的第3启动子P3内发现一个单核苷酸突变g.+2690C＞T，它位于潜在的转录因子结合位点上，可影响启动子P3的转录活性；通过奶牛群体基因型和乳中体细胞评分的关联分析，证明这个位点为功能性位点，且与奶牛乳腺炎有关。
实现影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心启动子区的鉴定以及利用该鉴定改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法步骤是：
a、筛选HMGB3基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因
a.a RT-PCR检测HMGB3基因两个转录本在不同组织中的表达
提取患乳腺炎奶牛的乳腺组织样品和正常牛的不同组织样品的mRNA，反转录后用来分析HMGB3mRNA的相应组织的表达量，
利用RT-PCR定量的结果，反映转录本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各组织中的表达情况，来确定HMGB3基因与奶牛乳腺炎的关系；
a.b荧光定量RT-qPCR检测HMGB3基因在乳腺组织中的表达
为了进一步分析HMGB3的表达量和奶牛乳腺炎的关系，分别选择正常的和患乳腺炎的乳腺组织进行RT-qPCR，相对表达水平用管家基因β-actin做内参，每个样品重复实验，
分析荧光定量RT-qPCR的结果，比较患乳腺炎的组织HMGB3mRNA的表达量和其在正常奶牛乳腺组织的表达量；结果表明，患乳腺炎的组织HMGB3mRNA的表达显著高于其在正常奶牛乳腺组织的表达；
b、牛HMGB3基因启动子P1、P2、P3的克隆和活性分析
生物信息学genomatix软件预测发现牛HMGB3基因有3个启动子，为了进一步验证这3个启动子是否具有启动子活性，而且确定其核心启动子区，利用序列递减的方法对P1和P2启动子区不同片段构建入pGL3-basic载体并且转染293T细胞，进行双荧光素酶报告基因分析其不同片段的启动子活性，根据NCBI的牛HMGB3基因参考序列，构建pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4和pGL3-5载体验证分析HMGB3-P1启动子，构建pGL3-C-1和pGL3-C-2载体分析P2启动子，最终实验验证发现HMGB3基因的P1启动子核心区位于g.-655-g.-114，牛HMGB3基因的P2启动子核心区位于g.-116-g.+301区域；
c、HMGB3基因P3启动子区功能性SNP位点的鉴别
设计引物HMGB3F：SEQ ID NO.3和HMGB3R：SEQ ID NO.4扩增HMGB3启动子P3区，通过对DNA直接测序的方法，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果，在P1和P2启动子区未发现SNP位点，但是在P3启动子区内发现了1个SNP位点，即在扩增片段的第454位发生碱基C＞T突变，根据国际通用的SNP命名和编码规则，该SNP突变命名为g.+2690C＞T，由于这个突变的引入消除了限制性内切核酸酶Sac II的结合位点，因此，Sac II限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段，经2％的凝胶电泳后，TT基因型可分离出两个条带538bp和388bp，CT基因型可分离出四个条带538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分离出三个条带388bp、347bp和191bp；
基因组结构分析发现，启动子P3位于牛HMGB3基因的第三内含子中，与HMGB3转录本2相差7个碱基，结合牛HMGB3基因转录本2的基因表达结果，表明，启动子P3负责启动转录本2的转录，为了进一步研究该SNP(g.+2690C＞T)对P3启动子的活性是否有影响，将序列包含C和T等位基因的g.+2253～g.+3035两个启动子片段分别构建入pEGFP-N1载体，命名为pEGFP-N1-P3-WT和pEGFP-N1-P3-MT，转染293T细胞24和48小时后，在荧光显微镜下观察其荧光强度，分析发现含有T等位基因的启动子片段活性高于含有C等位基因的片段活性，表明T等位基因片段具有更高的启动子活性，可促进HMGB3基因的转录，为进一步分析启动子P3的g.+2690C＞T突变是否影响转录因子结合位点，用软，分析P3序列突变前后，转录因子结合位点，结果发现，C突变为T后，删除了1个转录因子E2F结合位点，导致了HMGB3基因启动子P3具有更强的启动子活性；
选择HMGB3基因序列上P3启动子鉴别到的SNP位点在302头中国荷斯坦奶牛个体中，对SNP进行酶切基因分型，采用SAS8.1软件进行关联性分析，发现TT基因型个体的SCS显著低于具有CC和CT基因型个体的SCS，表明HMGB3基因g.2690位点的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体，通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。
牛HMBG3基因启动子，其特征在于牛HMBG3基因启动子1的核心序列为SEQID NO.1；牛HMBG3基因启动子2的核心序列为SEQ ID NO.2。
一对扩增牛HMGB3启动子3的引物序列，其上游引物HMGB3F序列为：SEQID NO.3，下游引物HMGB3R序列为：SEQ ID NO.4，其PCR扩增的产物大小为798bp，序列如SEQ ID NO.5。
一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核苷酸序列及其可影响启动子活性的功能性单核苷酸位点SNP(g.+2690C＞T)，其序列如SEQ ID NO.5，并且扩增片段的第454bp处的单核苷酸位点为C或T。
上述方法在牲畜疾病抗性育种中的应用。
利用牛HMGB3基因P3启动子区的1个功能性SNP位点的信息，并且采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在这个位点的基因型，选择具有乳腺炎抗性的基因型个体在牛抗乳腺炎遗传改良中的应用。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
本发明利用牛HMGB3基因P3启动子区的1个功能性SNP位点的信息，并且采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在这个位点的基因型，实现对具有乳腺炎抗性的基因型个体的早期选择。
本发明鉴别了1个功能性的SNP位点，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛HMGB3基因此位点的基因型，并且通过和奶牛乳中体细胞评分的关联分析，选择有利的基因型个体留种，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群体中的频率，从而提高群体抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶牛患乳腺炎的发病率，减少经济损失。本发明为奶牛的乳腺炎抗性遗传改良提供了一种新的方法。
附图说明
图1：牛HMGB3基因在不同组织中的差异表达。A.HMGB3-TV1和HMGB3-TV2在不同组织中的表达；B.牛HMGB3基因在正常和患乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达。
图2：牛HMGB3基因不同转录本和启动子结构。图2中：5’-UTR表示5端非翻译区，3’-UTR表示3’-端非翻译区。灰色的框表示外显子，虚线表示内含子。P1(1535-2092)表示启动子P1在牛HMGB3基因序列的第1535-2092位碱基，P2(2074-2491)表示启动子2位于牛HMGB3基因序列的第2074-2491位碱基，P3(4428-5225)表示启动子3位于牛HMGB3基因序列的第4428-5225位碱基。ATG翻译起始位点的A为+1。E1～E7：外显子1～外显子7；E4＝e2，E5＝e2，E6＝e3，E7＝e5。
图3：牛HMGB3基因P1和P2启动子区不同片段荧光活性测定结果。
图4：牛HMGB3基因g.+2690C＞T位点携带牛的基因测序图。
图5：牛HMGB3基因g.+2690C＞T位点Sac II限制性酶切分型。图5中：
M：Marker 2000bp；TT基因型(538bp+388bp)，CT基因型(538bp+388bp+347bp+191bp)，CC基因型(388bp+347bp+191bp)。
图6：牛HMGB3基因g.+2690C＞T位点突变前后，P3启动子构建载体转染 293T细胞后的荧光强度图。图6中：图片在倒置荧光显微镜(型号：Olympus IX70)上放大100倍拍摄。WT：表示构建的pEGFP-N1-启动子P3片段的g.+2690位是C碱基；MT：表示构建的pEGFP-N1-启动子P3片段的g.+2690位是突变后的T碱基。
图7：牛HMGB3基因启动子P3的g.+2690位点突变前后其转录因子结合位点的变化。
具体实施方式
下面对本发明的影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用作以下详细说明。
本发明的影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用，其具体方案是：
1、筛选HMGB3基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因
1.1RT-PCR检测HMGB3基因两个转录本在不同组织中的表达
提取患乳腺炎奶牛的乳腺组织样品和正常牛的不同组织样品的mRNA，反转录后用来分析HMGB3mRNA的相应组织的表达量。
PCR扩增反应25μl PCR扩增反应体系为：模板cDNA(100ng/μl)1μl，引物(TV1-F，TV1-R；TV2-F，TV2-R，见表1)各(10μmol/L)0.5μl，2×TaqPCR MasterMix 12.5μl(北京诺维森生物公司)，双蒸水(ddH2O)补至25μl。扩增反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，59℃(转录本HMGB3-TV1)或56℃(转录本HMGB3-TV2)退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃保持10min。
RT-PCR定量的结果表明，转录本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各组织中的表达情况如图1所示。转录本HMGB3-TV1在正常和患乳腺炎的奶牛乳腺组织中的表达显著高于其它组织。转录本HMGB3-TV2在患乳腺炎的奶牛乳腺组织显著高于其在正常奶牛乳腺组织中的表达。上述结果提示，HMGB3基因与奶牛乳腺炎密切相关。
表1RT-PCR和RT-qPCR所需引物
1.2荧光定量(RT-qPCR)检测HMGB3因在乳腺组织中的表达
为了进一步分析HMGB3的表达量和奶牛乳腺炎的关系。分别选择了正常的和患乳腺炎的乳腺组织进行RT-qPCR。相对表达水平用管家基因β-actin(序列号：NM_173979.3)做内参。每个样品重复做三次。
20μl RT-qPCR扩增体系：10.0μl Premix Ex TaqTM II(2×，大连宝生物工程公司)，0.4μM上下游引物(TV-F，TV-R；β-actinF，β-actin-R，见表1)，2.0μl HMGB3cDNA(＜100ng)或者β-actin质粒DNA，6.4μl蒸馏水。扩增条件为：94℃15s，60℃15s，共40个循环；最后70℃5s.
荧光定量的结果表明，患乳腺炎的组织HMGB3mRNA的表达显著高于其在正常奶牛乳腺组织的表达(图1)。
2、牛HMGB3基因启动子P1、P2、P3的克隆和活性分析
生物信息学genomatix软件
(http://www.genomatix.de/applications/index.html)预测发现牛HMGB3基因有3个启动子。为了进一步验证这3个启动子是否具有启动子活性，而且确定其核心启动子区，申请者利用序列递减的方法对P1和P2启动子区不同片段构建入pGL3-basic载体并且转染293T细胞，进行双荧光素酶报告基因分析其不同片段的启动子活性。根据NCBI的牛HMGB3基因参考序列(NC_007331.4)，构建pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4和pGL3-5载体验证分析HMGB3-P1启动子。构建pGL3-C-1和pGL3-C-2载体分析P2启动子，见表2。最终实验验证发现HMGB3基因的P1启动子核心区位于g.-655-g.-114，牛HMGB3基因的P2启动子核心区位于g.-116-g.+301区域(图2和图3)。
3、牛HMGB3基因P3启动子区功能性SNP位点的鉴别
设计引物HMGB3F：SEQ ID NO.3和HMGB3R：SEQ ID NO.4扩增HMGB3启动子 P3区。通过对DNA直接测序的方法，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果。如图4所示，申请人在P1和P2启动子区未发现SNP位点，但是在P3启动子区内发现了1个SNP位点，即在扩增片段的第454位发生碱基C＞T突变，根据国际通用的SNP命名和编码规则(http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/)，该SNP突变命名为g.+2690C＞T。由于这个突变的引入消除了限制性内切核酸酶Sac II的结合位点。因此，Sac II限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段，经2％的凝胶电泳后，TT基因型可分离出两个条带538bp和388bp，CT基因型可分离出四个条带538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分离出三个条带388bp、347bp和191bp(图5)。
基因组结构分析发现，启动子P3位于牛HMGB3基因的第三内含子中，与HMGB3转录本2相差7个碱基(图2)，结合牛HMGB3基因转录本2的基因表达结果，表明，启动子P3负责启动转录本2的转录。为了进一步研究该SNP(g.+2690C＞T)对P3启动子的活性是否有影响。将序列包含C和T等位基因的g.+2253～g.+3035两个启动子片段分别构建入pEGFP-N1载体，命名为pEGFP-N1-P3-WT和pEGFP-N1-P3-MT。转染293T细胞24和48小时后，在荧光显微镜下观察其荧光强度，分析发现含有T等位基因的启动子片段活性高于含有C等位基因的片段活性(图6)，表明T等位基因片段具有更高的启动子活性，可促进HMGB3基因的转录。
为进一步分析启动子P3的g.+2690C＞T突变是否影响转录因子结合位点，用软件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html； http://Zlab.bu.e-du/cluster-buster/cbust.html； http://zlab.bu.edu/cluster-buster/cbust.html)分析P3序列突变前后，转录因子结合位点，结果发现，C突变为T后，删除了1个转录因子E2F结合位点(图7)，导致了HMGB3基因启动子P3具有更强的启动子活性。
选择HMGB3基因序列上P3启动子鉴别到的SNP位点在302头中国荷斯坦奶牛个体中，对SNP进行酶切基因分型，酶切分型结果如图5所示。采用SAS8.1软件进行关联性分析，分析的模型如下：
Yijklmn＝μ+Fi+Gj+Sk+El+Hm+eijklmn
Yijklmn表示观察值；μ表示平均值；Fi表示牛场的固定效应；Gj表示基因型的固定效应；Sk表示公畜的固定效应；El表示季节的固定效应；Hm表示胎次的固定效应；eijklmn表示随机残差效应。
根据关联性分析结果，申请人发现TT基因型个体的SCS显著低于具有CC和CT基因型个体的SCS(见表3)。表明，HMGB3基因g.2690位点的TT基因型是乳腺 炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体，通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。
表2牛HMGB3基因启动子P1、P2和P3构建载体所需要的相应引物
表3牛HMGB3基因g.+2690C＞T基因型和体细胞数表型关联性分析
选择奶牛核心群个体，利用上述分子生物学相关技术检测HMGB3基因g.+2690位点的基因型，选取有利的等位基因型个体留种，可改良奶牛群体的抗乳腺炎病性能，降低奶牛乳腺炎病的发病率，减少经济损失，最终为育成抗乳腺炎的优良奶牛新品系打下一定的基础。
实施例1：
利用265头中国荷斯坦奶牛作为实验动物，这些奶牛血样来自青岛和济南奶牛场。这265头牛的DHI数据记录完全。
利用HMGB3F/R引物扩增牛的DNA片段，采用直接DNA测序的方法对HMGB3基因g.+2690位点在在上述的265头奶牛进行SNP基因分型。同时对这个SNP位点的基因型与DHI记录中的SCS表型进行关联性统计分析，见表4。
表4牛HMGB3基因SNP(g.+2690C＞T)基因型和体细胞评分关联性分析
分析结果表明HMGB3基因的SNP位点g.+2690C＞T，T等位基因为抗性基因，C等位基因为易感基因。基因型TT个体的体细胞评分最低，表明TT型个体对乳腺炎具有更高的抗性，TT基因型个体是抗乳腺炎病奶牛的选育改良所需要的优良基因型个体。
本发明利用牛HMGB3基因P3启动子区的1个功能性SNP位点的信息，并且采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在这个位点的基因型，选择具有乳腺炎抗性的基因型个体。
本发明鉴别了1个功能性的SNP位点，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛HMGB3基因此位点的基因型，并且通过和奶牛乳中体细胞评分的关联分析，选择有利的基因型个体留种，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群体中的频率，从而提高群体抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶牛患乳腺炎的发病率，减少经济损失。本发明为奶牛的乳腺炎抗性遗传改良提供了一种新的方法。
Claims (4)
1.一种改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于包括：
改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法：通过反转录RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR的方法提供一个奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候选基因，同时为了深入研究HMGB3两个转录本的表达调控模式，利用在线软件分析发现牛HMGB3基因共有3个启动子区：P1、P2和P3，进一步通过构建载体、细胞转染、启动子活性测定和荧光强度测定实验发现了牛HMGB3基因3个启动子的核心区域，并且在第3个启动子P3的核心区域内发现了一个SNP，构建EGFP-HMGB3-P3载体，经293T细胞转染后，发现该SNP位点可影响启动子P3活性，属于功能性位点，利用该SNP与奶牛乳中体细胞评分SCS的关联分析表明该SNP与奶牛乳腺炎有关，选择有利的等位基因型个体留种，从而改善种群奶牛的抗乳腺炎能力；
影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心启动子区的鉴定方法：通过实时反转录RT-PCR和荧光定量RT-qPCR的方法发现目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺组织中mRNA存在差异表达；构建不同长度片段的pGL3-basic-HMGB3双荧光素酶报告基因载体，以及具有野生型和突变型碱基的pEGFP-N1-HMGB3载体，分别转染293T细胞，确定牛HMGB3基因的核心启动子区；通过对牛HMGB3基因核心启动子区进行直接测序分析，在HMGB3基因的第3启动子P3内发现一个单核苷酸突变g.+2690 C＞T，它位于潜在的转录因子结合位点上，可影响启动子P3的转录活性；通过奶牛群体基因型和乳中体细胞评分的关联分析，证明这个位点为功能性位点，且与奶牛乳腺炎相关；
具体步骤是：
a、筛选HMGB3基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因
a.a RT-PCR检测HMGB3基因两个转录本在不同组织中的表达
提取患乳腺炎奶牛的乳腺组织样品和正常牛的不同组织样品的mRNA，反转录后用来分析HMGB3 mRNA的相应组织的表达量，
利用RT-PCR定量的结果，反映转录本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各组织中的表达情况，来确定HMGB3基因与奶牛乳腺炎的关系；
a.b荧光定量RT-qPCR检测HMGB3基因在乳腺组织中的表达
为了进一步分析HMGB3的表达量和奶牛乳腺炎的关系，分别选择正常的和患乳腺炎的乳腺组织进行RT-qPCR，相对表达水平用管家基因β-actin做内参，每个样品重复实验，
分析荧光定量RT-qPCR的结果，比较患乳腺炎的组织HMGB3 mRNA的表达量和其在正常奶牛乳腺组织的表达量；结果表明，患乳腺炎的组织HMGB3 mRNA的表达显著高于其在正常奶牛乳腺组织的表达；
b、牛HMGB3基因启动子P1、P2、P3的克隆和活性分析
生物信息学genomatix软件预测发现牛HMGB3基因有3个启动子，为了进一步验证这3个启动子是否具有启动子活性，而且确定其核心启动子区，利用序列递减的方法对P1和P2启动子区不同片段构建入pGL3-basic载体并且转染293T细胞，进行双荧光素酶报告基因分析其不同片段的启动子活性，根据NCBI的牛HMGB3基因参考序列，构建pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4和pGL3-5载体验证分析HMGB3-P1启动子，构建pGL3-C-1和pGL3-C-2载体分析P2启动子，最终实验验证发现HMGB3基因的P1启动子核心区位于g.-655-g.-114，牛HMGB3基因的P2启动子核心区位于g.-116-g.+301区域；
c、HMGB3基因P3启动子区功能性SNP位点的鉴别
设计引物HMGB3F：SEQ ID NO.3和HMGB3R：SEQ ID NO.4扩增HMGB3启动子P3区，通过对DNA直接测序的方法，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果，在P1和P2启动子区未发现SNP位点，但是在P3启动子区内发现了1个SNP位点，即在扩增片段的第454位发生碱基C＞T突变，根据国际通用的SNP命名和编码规则，该SNP突变命名为g.+2690 C＞T，由于这个突变的引入消除了限制性内切核酸酶Sac II的结合位点，因此，Sac II限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段，经2％的凝胶电泳后，TT基因型可分离出两个条带538bp和388bp，CT基因型可分离出四个条带538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分离出三个条带388bp、347bp和191bp；
基因组结构分析发现，启动子P3位于牛HMGB3基因的第三内含子中，与HMGB3转录本2相差7个碱基，结合牛HMGB3基因转录本2的基因表达结果，表明，启动子P3负责启动转录本2的转录，为了进一步研究该SNP g.+2690C＞T对P3启动子的活性是否有影响，将序列包含C和T等位基因的g.+2253～g.+3035两个启动子片段分别构建入pEGFP-N1载体，命名为pEGFP-N1-P3-WT和pEGFP-N1-P3-MT，转染293T细胞24和48小时后，在荧光显微镜下观察其荧光强度，分析发现含有T等位基因的启动子片段活性高于含有C等位基因的片段活性，表明T等位基因片段具有更高的启动子活性，可促进HMGB3基因的转录，为进一步分析启动子P3的g.+2690 C＞T突变是否影响转录因子结合位点，用软件分析P3序列突变前后，转录因子结合位点，结果发现，C突变为T后，删除了1个转录因子E2F结合位点，导致了HMGB3基因启动子P3具有更强的启动子活性；
选择HMGB3基因序列上P3启动子鉴别到的SNP位点在302头中国荷斯坦奶牛个体中，对SNP进行酶切基因分型，采用SAS8.1软件进行关联性分析，发现TT基因型个体的SCS显著低于具有CC和CT基因型个体的SCS，表明HMGB3基因g.2690位点的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体，通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。
2.根据权利要求1所述的一种改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于牛HMBG3基因启动子1的核心序列为SEQ ID NO.1；牛HMBG3基因启动子2的核心序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述的一种改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于一对扩增牛HMGB3启动子3的引物序列，上游引物HMGB3F序列为：SEQ ID NO.3，下游引物HMGB3R序列为：SEQ ID NO.4，其PCR扩增的产物大小为798bp，序列如SEQ ID NO.5。
4.根据权利要求1所述的一种改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于：一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核苷酸序列及其可影响启动子活性的功能性单核苷酸位点SNP g.+2690 C＞T，其序列如SEQ IDNO.5，并且扩增片段的第454bp处的单核苷酸位点为C或T。
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