CN112538533B - 一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家兔分子标记育种技术领域，具体涉及一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记包括KRT26基因的突变体，所述KRT26基因如SEQ ID NO:1所示，所述KRT26基因的突变体为KRT26基因位点第41844263处碱基G突变为A，构成GG、GA、AA三种基因型，其中GG型、AG型的绒毛长度极显著高于AA型的绒毛长度。本发明的KRT26基因多态位点的检出，为长毛兔绒毛长度性状的选择提供了标记辅助手段。

Description

一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及家兔分子标记育种领域，尤其是涉及一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记及其应用。

背景技术

长毛兔被毛主要由粗毛和绒毛构成，其中绒毛是其主体部分，在长毛兔体表分布很密，呈波浪形弯曲，细长而柔软，有着良好的理化特性和可纺性，在纺织业具有极高的纺织价值，被称为媲美山羊绒的“黄金纤维”。近年来，国内外对高品质精纺兔绒的需要量日益增加，但目前生产上缺乏优质绒毛型长毛兔群体，开展绒毛型长毛兔育种有较大市场前景。

长毛兔绒毛纤维的纺织价值主要取决于绒毛长度、细度和同质性。长期以来，长毛兔育种和生产过度追求产毛量，忽视对纤维品质的改良，因所产兔毛的长度不够，导致兔毛纺织品易掉毛，严重影响纺织价值。人们对绒毛长度选育方法的研究很少，常规选育方法受养毛周期、测定水平、群体规模、遗传评估技术等影响，选择准确性相对较低。

角蛋白是蛋白质的一种，广泛存在人和动物的表皮，并且是毛发、羽毛、蹄、壳、角的主要成分，属于纤维性的、非营养性的蛋白质，是结缔组织重要的结构蛋白(管峰，2007)。角蛋白分为角蛋白中间丝(KRT)和角蛋白关联蛋白(KAP)两类，角蛋白中间丝(KRT)是角蛋白家族中的重要成员。KRT有Ⅰ型和Ⅱ型两种类型，KRT26、KRT27、KRT31、KRT38属于Ⅰ型KRT基因，主要在毛囊的内根鞘、髓质及内层表达，调控整个毛囊的生长发育；KRT85属于Ⅱ型KRT基因，主要在毛囊的基质与角质层表达，调控毛纤维的微观和宏观结构。KRT26(keratin26)基因能够编码一种含468个氨基酸的蛋白质，作为特殊的一类Ⅰ型角蛋白特异地表达于毛囊的内根鞘中，主要调控整个毛囊的生长发育，其基因结构和功能变异可影响到动物的毛发纤维特性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记，该分子标记对长毛兔绒毛长度有显著的遗传效应，可应用于长毛兔绒毛长度的分子选育。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记，所述分子标记包括KRT26基因的突变体，所述KRT26基因如SEQ ID NO:1所示，所述KRT26基因的突变体由KRT26基因位点第41844263处的碱基G突变为A所形成。

在本发明的技术方案中，长毛兔KRT26基因位点第41844263处的碱基G突变为A形成为突变体，GG型、AG型的绒毛长度极显著长于AA型的绒毛长度。在实际育种中，可以分别选择等位基因G纯合的群体，或通过杂交获得基因型为AG的群体，提高杂交后代的绒毛长度。

本发明还提供了一种检测上述分子标记的扩增引物。所述扩增引物包括扩增KRT26基因的引物，所述扩增KRT26基因的引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了上述的分子标记在长毛兔绒毛长度性状选择中的应用。

此外，本发明还提供了一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记的筛选方法，包括以下具体步骤：构建基因组DNA混池，分别采用上述引物序列对待测长毛兔个体样品基因组DNA进行PCR扩增得PCR产物，根据PCR产物筛选出基因SNP位点，然后采用飞行质谱检测方法进行SNP分型，确定KRT26基因位点第41844263处的碱基为G还是突变为A。

作为本发明所述筛选方法优选实施方式，所述飞行质谱检测方法进行SNP分型步骤为：

S1.根据SNP位点信息，设计PCR反应和单碱基扩增引物，进行基因组DNA样本质检，获得合格基因组DNA样本；

S2.将合格基因组DNA样本进行PCR反应，再进行SAP消化和延伸反应，最终得反应产物；

S3.将反应产物稀释，使用树脂脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，然后上机进行质谱检测，收集数据。

作为本发明所述筛选方法优选实施方式，所述PCR产物长度为250bp。

本发明采用飞行质谱检测方法对KRT26基因存在的SNP位点进行SNP分型，通过序列对比发现，长毛兔KRT26基因位点第41844263处的碱基G突变为A，将长毛兔绒毛长度与KRT26基因进行关联分析和群体验证，结果发现SNP分型得到的三种基因型与长毛兔的绒毛长度性状密切相关，长毛兔KRT26基因位点第41844263处碱基G突变为A，构成GG、AG和AA三种基因型，其中GG型、AG型的绒毛长度均极显著长于AA型的绒毛长度(P＜0.01)，其余产毛性状在该位点均无显著影响(P>0.05)。KRT26基因多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，也为长毛兔性状的标记辅助选择，提供了科学依据和辅助手段。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记，该分子标记为KRT26基因，该KRT26基因位点第41844263处碱基G突变为A，GG型、AG型的绒毛长度极显著长于AA型的绒毛长度。在实际育种过程中，可以分别选择等位基因G纯合的群体，或通过杂交组合获得基因型为AG的群体，以提高长毛兔后代的绒毛长度。

附图说明

图1为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果示意图；

图2为KRT26基因的PCR扩增产物克隆测序结果示意图；

图3为KRT26基因的PCR扩增产物基因测序峰图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1.样品采集：本发明以山东蒙阴益达兔业有限公司和山东农业大学联合培育的长毛兔为试验材料，有效样本共计957只，在同一条件下饲养。在其出生后第283天(第四次剪毛)，养毛期73天，分别测定每只个体产毛量、绒毛长度等指标。用剪刀紧贴皮肤剪下体侧中心部位的毛样，用手术剪剪取一块黄豆粒大小的耳组织，将剪下的耳组织放入盛有75％酒精的1.5mL离心管中，带回试验室，-20℃保存，用于基因组DNA的提取。

2.实验方法：所采耳组织样品用高盐法提取基因组DNA，用分光光度计检测DNA浓度和质量。提取的DNA于-20℃保存。

3.混池测序筛选基因SNP位点

(1)DNA混池构建：随机抽取100个基因组DNA样品，每20个基因组DNA样品等体积混成一个DNA池。

(2)候选基因引物设计：获取ensemble数据库中上兔KRT26的基因序列，采用Primer5.0设计上述基因5＇、3＇调控区以及外显子编码区引物，引物由上海生工技术服务有限公司合成，引物信息见表1。

表1扩增基因组DNA引物

4.PCR扩增：

根据合成的引物信息进行梯度PCR，摸索最佳退火温度，然后利用最佳的退火温度扩增目的片段。PCR扩增反应体系如下表2所示：

表2 PCR扩增体系

PCR扩增温度的设置：

预变性95℃10min；

35个循环：变性95℃，45sec；

退火温度为53℃；

延伸72℃，30sec；

延伸72℃，10min；

反应完成后将PCR产物置于4℃冰箱内保存，用于上样检测和后续分析。

PCR产物检测：采用琼脂糖凝胶电泳的方法对上述得到的PCR产物进行检测，结果见图1，发现PCR产物的特异性较好，扩增片段与目的片段大小一致。

产物测序：将合格的PCR产物送至上海生工技术服务有限公司进行测序，筛选出基因SNP位点；采用飞行质谱检测方法进行SNP分型，将测序结果用DNAMAN和Chromas软件进行序列比对找寻SNPs(图1、图2和图3)。

5.SNP分型：SNP分型试验由北京康普森生物科技有限公司完成，具体步骤如下：

(1)引物设计：根据SNP位点信息，利用MassARRAY公司设计软件AssayDesignSuitev2.0设计PCR反应和单碱基扩展引物，通过UCSC在线检验引物特异性。

(2)基因组DNA质检：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，纯度和降解程度，检测结果判读标准：电泳检测胶图中，DNA条带单一、清晰、无杂质，没有弥散、拖尾现象。

(3)电泳条件：

①0.8％琼脂糖凝胶，170V，25min

②上样量：500ng样品+3μl Loading Buffer

③Marker：Trans2000 Plus3μl

(4)PCR反应：

①PCR反应体系如下表3所示：

表3 PCR反应体系

②PCR反应的循环参数如下表4所示：

表4 PCR反应的循环参数

(5)SAP消化

①SAP消化的反应体系如下表5所示：

表5 SAP消化的反应体系

②SAP消化的循环参数如下表6所示：

表6 SAP消化的循环参数

(6)延伸反应

①延伸反应体系如下表7所示：

表7延伸反应体系

②延伸反应的循环参数如下表8所示：

表8延伸反应的循环参数

(7)上机检测：

①将反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；

②将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；

③上机进行质谱检测，并收集数据。

根据分型结果，运用R软件、SAS软件进行SNPs群体遗传学分析及其与长毛兔毛纤维直径性状的关联分析。

通过分析图2，结果显示：通过序列比对发现，在KRT26基因位点第41844263处碱基G突变为A；也可通过峰图3所示同一序列位点上出现不同的峰，表明该处发生了碱基突变，双峰说明是杂合子，单峰说明是纯合子。

实验例、长毛兔绒毛长度性状与KRT26基因关联分析

运用SAS9.2的GLM程序进行方差分析，对多态位点的各个基因型与产毛性状进行关联分析。BLUP模型为：

Y＝Xb+Za+e

Y：产毛性状表型值；X：与固定效应有关的个体数矩阵；b：固定效应(SNP位点、性别效应)；Z：个体加性遗传效应的个体数矩阵；a：个体加性遗传效应；e：随机误差。

按照GBT13835《兔毛纤维试验方法》测定绒毛长度该性状，根据KRT26基因SNPs进行等位基因及基因型频率计算，并对其进行哈代温伯格平衡检验，分别得到基因型AA、AG和GG，各基因型对应绒毛长度的结果见表9，绒毛长度单位为cm。

表9 KRT26基因与长毛兔绒毛长度性状关联分析结果表

如表9的数据所示，KRT26基因位点第41844263处的碱基G突变为A对绒毛长度影响极显著(P<0.01)，其中AA型比GG型和AG型分别低0.37cm、0.40cm；GG型、AG型的绒毛长度极显著长于AA型的绒毛长度。在实际育种过程中，可以分别选择等位基因等位基因G纯合的群体，或通过杂交组合获得基因型AG的杂交群体，以提高后代的绒毛长度。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学，山东新合心技术有限公司

<120> 一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记及其应用

<130> 2020.10.10

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> KRT26基因

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cttcccagcc cacgagtagg acgctggatg ggaagaggag cagccagaac ttgaacaaca 60

actcggacat agggtttggg agaagcaaac cgcagcttag ctccctggga cagatgaaag 120

catacaccgc cattgcactt tgcatattca cagccttcct tggttcctct cacagaaaga 180

gtcctacgag agctccttgg cggagatgga aggaaattac tgcctccagc tccagcaaat 240

ccaggatcag atcggggcca tggaggggca gctgcagcag atccggacgg aaaccgccgg 300

ccagaagctg gagcacgagc agctgctaga catcaaagtc ttcttagaga aggagatcga 360

gacgtactgc aacttactcg acggccaaga caggtgagcc acccgccctc acgtcagcca 420

ggctttctcc gcgtgtttcc cgagagcgcg tcctagaatt tcctgctagg aggatcacgc 480

cccagaggtc ctcactcacg tactgcggcg cgtcgcagtc aaagcagagc acagtctaga 540

aagtacccgt atgcatccta atataaagga ggcttgttta gaaacaggat gtctgccggt 600

<210> 引物序列

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaagagtcct acgagagctc 20

<210> 引物序列

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctgtcttggc cgtcgagtaa 20

Claims (2)

1.一种与长毛兔绒毛长度相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为KRT26基因的突变体，所述KRT26基因的突变体由SEQ ID NO:1所示序列中第289位的碱基G突变为A所形成。

2.一种如权利要求1所述的分子标记在长毛兔绒毛长度性状标记辅助选择中的应用。

Images