CN102796769B

CN102796769B - 乙醇酸的酶促生产

Info

Publication number: CN102796769B
Application number: CN201210290815.9A
Authority: CN
Inventors: R.迪科西莫; M.S.佩恩; A.帕诺瓦; D.P.奥基夫; J.S.汤普森
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: High Purity Technology Science Co ltd
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2025-12-21
Also published as: WO2006069110A2; WO2006069110A3; CN101128583B; JP2008525030A; CN102796771A; CN102796770B; CN102796771B; CN102796772A; JP4776629B2; EP1828385A2; CN102816799B; CN102899362A; CN102796769A; EP1828385B1; CN102796772B; CN102796770A; CN102899362B; CN102816799A; CN101128583A

Abstract

本发明涉及乙醇酸的酶促生产。具体地，提供了由乙醇腈酶促生产乙醇酸的多种方法。这些方法包括：1)利用具有改善的用于将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，和2)改善催化剂稳定性和/或生产率的方法。该改善催化剂稳定性和/或生产率的方法包括利用反应稳定剂，在基本上无氧的条件下运行反应以及控制反应混合物中底物的浓度。

Description

乙醇酸的酶促生产

本申请是申请日为2005年12月21日的中国专利申请200580048285.5“乙醇酸的酶促生产”的分案申请。

本申请要求都于2004年12月22日提交的美国临时申请第60/638,176和60/638,127号的权益。

技术领域

本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地说，提供了一种使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，由乙醇腈酶促生产乙醇酸的方法。

背景技术

乙醇酸(HOCH₂COOH；CAS登记号为79-14-1)是羧酸的α-羟基酸家族的最简单成员。其特性使之理想地广泛用于消费和工业用途，包括用于水井修复、皮革工业、油气工业、洗衣和纺织工业、在聚乙醇酸(PGA)制备中作为单体、以及作为个人护理产品成分。在多个行业中，乙醇酸还是的清洁剂的主要成分(乳制品和食品加工设别清洁剂、家用和机构用清洁剂、工业清洁剂[用于运输设备、砖石建筑、印刷电路板、不锈钢锅炉和加工设备、冷却塔/热交换器]、以及金属加工[用于金属酸洗、铜抛光、蚀刻、电镀、电解抛光])。最近，已报道聚乙醇酸作为阻气性材料(即显示高阻氧特性)用于包装食品及汽水(WO 2005/106005A1)。然而，乙醇酸的传统化学合成产生了大量的杂质，在用于制备作为阻气性材料的聚乙醇酸之前必须除去。商业化生产乙醇酸的新技术，特别是一种以高纯度及低成本生产乙醇酸的技术，将是工业上所渴望获得的。

已知多种使用相应的α-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备α-羟基酸的方法。所产生的α-羟基酸的例子包括：乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3-二甲基-4-丁内酯和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherich ia)、微球菌属(Micrococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、枝动杆菌属(Mycoplana)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、假丝酵母属(Candida)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、镰孢菌属(Fusarium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌属(Gordona)的那些微生物(相应于US 5,223,416的JP-A-4-99495、JP-A-4-99496和JP-A-4-218385；相应于US 5,234,826的JP-A-4-99497；相应于US 5,296,373的JP-A-5-95795；JP-A-5-21987；相应于US 5,326,702的JP-A-5-192189；相应于EP-A-0610048的JP-A-6-237789；相应于EP-A-0610049的JP-A-6-284899；相应于US 5,508,181的JP-A-7-213296)。

然而，大多数已知的上述由相应的α-羟基腈制备α-羟基酸的方法并不产生并以足够高的浓度积聚产物，以满足商业上的需要。经常的结果是在反应初期酶就失活。US 5,756,306教导了“当使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合α-羟基腈以产生α-羟基酸或α-羟基酰胺时，所出现的问题是在短时间内酶失活。因此，难以以高浓度和高产率获得α-羟基酸或α-羟基酰胺”(第1栏，第49-54行)。维持反应混合物中醛浓度(由α-羟基腈解离为醛和氰化氢所形成的)和/或α-羟基腈浓度在规定的范围内是一种避免该问题的方法。

US 5,508,181提出了涉及酶快速失活的更多困难。特别是，U.S.5,508,181提及根据解离平衡，α-羟基腈化合物部分解离为相应的醛。这些醛通过与蛋白结合，在短时间内失活酶，因此很难由α-羟基腈以高产率获得高浓度的α-羟基酸或α-羟基酰胺(第2栏，第16-29行)。阻止由于醛积聚所引起的酶失活的解决方案是将磷酸盐或次磷酸盐离子添加到反应混合物中。US 5,326,702使用亚硫酸盐、二亚硫酸盐或连二亚硫酸盐离子来螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通过使用上述这样的添加剂，所产生和积聚的α-羟基酸的浓度仍然是不高的。

U.S.6,037,155教导了α-羟基酸产物的低积聚与由于解离的醛积聚所引起的短时间内酶失活相关。这些发明人提出在水中α-羟基腈部分解离所产生的氰化氢(Agricultural Biological Chemistry，Vol.46，pages 1165(1982))以及相应的醛或酮(Chemical Reviews，Vol.42，pages 189(1948))存在下，酶活性受抑制。本发明人通过使用微生物解决了醛诱导的酶失活问题，所述微生物酶活性能通过将氰化物添加到反应混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了α-羟基腈解离为醛和氰化氢。

具体就乙醇酸生产来说，已知乙醇腈能可逆解离为氰化氢和甲醛，两者都可失活酶活性。US 3,940,316描述了一种由相应的腈制备有机酸的方法，使用了具有“腈水解(nitrilasic)”活性的细菌，并列出乙醇腈作为底物。具体来说，该专利描述了对于该目的使用芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、微球菌属和短杆菌属细菌。虽然被描述具有腈水解活性，但是短杆菌R312(Brevibacterium R312)是在US 3,940,316所有实施例中使用的唯一菌株。已知短杆菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但没有腈水解酶活性(Toumeix等，Antonie van Leeuwenhoek，52：173-182(1986))。

一种通过利用属于棒状杆菌(Corynebacterium spp.)的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法披露于日本专利公开号昭61-56086中。JP 09028390披露了一种通过红球菌属或戈登氏菌属水解酶起作用，由乙醇腈制备乙醇酸的方法。报道了对乙醇酸的选择性几乎为100％，没有乙醇酸酰胺生成。US 6,037,155披露了由α-羟基腈产生包括乙醇酸的α-羟基酸的方法的例子。该公开内容承认由于前述问题之故并非所有的微生物催化剂都能产生高浓度的乙醇酸，并教导应当进行筛选研究以便发现在工业上有益的微生物。US 6,037,155具体鉴定了抗α-羟基腈或α-羟基酸抑制效应的Variovorax spp.和节杆菌(Arthrobacter spp.)微生物，具有持久的活性，并能在高浓度下产生期望的产物。

敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC 55746)具有脂族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性，以及腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性组合的特征。US 5,814,508披露了于35-70℃，在适合的缓冲液中加热敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)悬浮液一段短时间以钝化全细胞催化剂不需要的腈水合酶和酰胺酶活性，不产生明显减少的期望的腈水解酶活性。

已克隆并重组表达了编码敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因((相应于US 6,870,038的WO 01/75077)和Chauhan等，ApplMicrobiol Biotechnol，61：118-122(2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶能以高产率将α-羟基腈转化为相应的α-羟基羧酸(US 6,383,786)，包括乙醇酸(US 6,416,980)。然而，对于降低工业生产成本，用于以高达100％转化的高产率将乙醇腈转化为乙醇酸的具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶应当是十分有用的。

一种使用酶催化剂经济地生产乙醇酸的方法需要利用能以高浓度将乙醇腈转化为乙醇酸，并具有高催化剂生产率(公斤乙醇酸/公斤酶催化剂)和容积生产率(乙醇酸克数/升/小时)的催化剂。酶催化剂可用于多步连续分批反应(multiple consecutive batch reactions)中，或用于恒量添加乙醇腈并移除乙醇酸的连续反应中；在任何一种操作方式中，催化剂活性和寿命应以致于获得高容积生产率和催化剂生产率，并且在分批反应情况下，催化剂应当在多个反应循环中得到利用，而不在连续分批反应之间明显损失酶活性。具有改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的突变的腈水解酶能提供改善的容积生产率。鉴于在乙醇腈反应混合物中游离甲醛(以及可能的其他杂质)的失活效应会不同程度地消极影响所有腈水解酶催化剂的事实，还需要在用于乙醇腈水解的反应条件下稳定酶活性的改善(产生相对增加的催化剂生产率)。

待解决的问题是提供一种利用具有明显改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的酶催化剂增加乙醇酸体积生产率的方法。待解决的额外问题是提供一种增加用于乙醇酸生产的酶催化剂生产率和稳定性，由此降低酶催化剂成本和生产总成本的方法。

发明内容

本发明提供了由乙醇腈酶促生产乙醇酸的方法。提供了一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括：

a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，所述多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

(1)在氨基酸残基第168位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和

(2)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；

由此产生乙醇酸；和

b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。

在本发明的另一方面，提供了一种编码具有腈水解酶活性的多肽的分离的核酸分子，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和

b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；

其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。

在又一方面，提供了一种当将乙醇腈转化为乙醇酸时，显示明显改善的腈水解酶活性的分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和

序列表和生物学保藏简述

以下序列描述和附于此的序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825所列的指导专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列披露的规定。序列描述包含符合Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984)(它们在此并入作为参考)中所述的IUPAC-IYUB标准规定的对于核苷酸序列字符的单字母编码和对于氨基酸的三字母编码。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822的规定。

SEQ ID NO：1是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的引物165的核苷酸序列。随后，将所扩增的PCR产物克隆入pUC19(NewEngland Biolabs，Beverly，MA；

L09137)以创建质粒pSW138。

SEQ ID NO：2是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的引物166的核苷酸序列。随后，将所扩增的PCR产物克隆入pUC19(NewEngland Biolabs，Beverly，MA；

L09137)以创建质粒pSW138。

SEQ ID NO：3是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的核苷酸序列，包含由TTG至ATG的起始密码子改变以利于在大肠杆菌中重组表达。

SEQ ID NO：6是推断的由SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码的敏捷食酸菌72W腈水解酶的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含由TTG至ATG的起始密码子改变以利于在大肠杆菌中重组表达。

SEQ ID NO：7是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201Q；Leu→GIn)。

SEQ ID NO：8是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→GIn)。

SEQ ID NO：9是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201A；Leu→Ala)。

SEQ ID NO：10是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Ala)。

SEQ ID NO：11是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201C；Leu→Cys)。

SEQ ID NO：12是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Cys)。

SEQ ID NO：13是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201T；Leu→Thr)。

SEQ ID NO：14是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Thr)。

SEQ ID NO：15是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201G；Leu→Gly)。

SEQ ID NO：16是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Gly)。

SEQ ID NO：17是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201H；Leu→His)。

SEQ ID NO：18是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→His)。

SEQ ID NO：19是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201K；Leu→Lys)。

SEQ ID NO：20是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Lys)。

SEQ ID NO：21是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201N；Leu→Asn)。

SEQ ID NO：22是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Asn)。

SEQ ID NO：23是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201S；Leu→Ser)。

SEQ ID NO：24是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201→Ser)。

SEQ ID NO：25是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168K；Phe→Lys)。

SEQ ID NO：26是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168→Lys)。

SEQ ID NO：27是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168M；Phe→Met)。

SEQ ID NO：28是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：27)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168→Met)。

SEQ ID NO：29是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168T；Phe→Thr)。

SEQ ID NO：30是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：29)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168→Thr)。

SEQ ID NO：31是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168V；Phe→Val)。

SEQ ID NO：32是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168→Val)。

SEQ ID NO：33是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(T210A；Thr→Ala)。

SEQ ID NO：34是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第210位包含单个氨基酸取代(Thr210→Ala)。

SEQ ID NO：35是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(T210C；Thr→Cys)。

SEQ ID NO：36是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第210位包含单个氨基酸取代(Thr210→Cys)。

SEQ ID NO：37是在大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177；US6,870,038，在此并入作为参考)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38是推断的在大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列。

业已依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约条款的规定进行了以下生物学保藏：

如本文所使用的，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，位于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA的国际保藏机构。“国际保藏编号”是在ATCC保藏的培养物的保藏号。

所列的保藏物应当在所指明的国际保藏机构保藏至少三十(30)年，并且公众在得到披露其的专利授权之后可以获得。保藏物的可利用性并不构成对实施本发明的许可，这种实施会破坏通过政府行为授予的专利权。

具体实施方式

已通过提供了一种利用具有改善的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，以高产率及在高浓度下由相应的乙醇腈制备乙醇酸的方法解决了所述问题。该解决所述问题的方法包括：1)利用具有改善的腈水解酶活性和/或改善的用于将乙醇腈转化为乙醇酸的催化剂生产率的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，和2)在用于将乙醇腈转化为乙醇酸的反应条件下，改善催化剂稳定性和/或生产率的方法。该在用于将乙醇腈转化为乙醇酸的反应条件下，改善催化剂稳定性/生产率的方法，包括1)利用添加剂来稳定酶催化剂活性，2)在基本上无氧的条件下运行反应，和3)控制乙醇腈到反应混合物中的进料速度，以便保持乙醇腈的目标浓度。

定义：

在本文中，使用了许多术语和缩写。除非另作明确说明，否则使用以下定义。

如本文所使用的，术语“包含”表示如权利要求中所提及的规定的特征、整体、步骤或组分的存在，但其并不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、组分或它们的组的存在或添加。

如本文所使用的，修饰所使用的本发明成分或反应物的数量的术语“约”指数量上的变化，所述变化可例如通过用于在真实世界中制备浓缩物或使用溶液的标准量度和液体处理工序；通过在这些工序中的疏忽过失；通过用于制造组合物或执行方法的产品、原料或配料纯度的差异等产生。术语“约”还包含由于由特定的初始混合物产生的组合物的不同的平衡条件之故所相异的量。无论是否为术语“约”所修饰，权利要求包括相等的量。在一个实施方案中，术语“约”表示在所报告的数值的10％之内，优选在所报告的数值的5％之内。

如本文所使用的，术语“回收”表示分离、纯化或转移利用本发明方法所生成的产物。分离和纯化来自反应混合物的产物的方法是本领域众所周知的，可包括但不限于选择性沉淀、结晶、过滤、反应性溶剂萃取、离子交换、电渗析、聚合、蒸馏、热分解、醇解以及它们的组合。在一个实施方案中，术语“回收”还可包括将反应混合物(通常在滤除酶催化剂之后)转移到另一种反应中以产生一种或多种额外的产物。

如本文所使用的，术语“酶催化剂”或“微生物细胞催化剂”指具有用于将乙醇腈转化为乙醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化剂(即包含至少一种具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化剂可以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。酶催化剂可以是游离的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循环的酶催化剂”指在分批反应中被再生为酶催化剂的酶催化剂。

如本文所使用的，术语“催化剂生产率”和“酶催化剂生产率”指每克催化剂产生的产物总量。在本发明中，所述催化剂是腈水解酶(EC3.5.5.7)，所产生的产物是乙醇酸和/或乙醇酸铵(取决于反应的pH)。一般而言，在基本上pH中性的条件下进行本发明方法，以便所产生的乙醇酸主要以乙醇酸相应的盐(即乙醇酸铵)的形式存在。一般来说，在具有催化剂再循环的分批反应中，随每一次循环反应催化剂活性而降低(酶失活)。

如本文所使用的，术语“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)”和“敏捷食酸菌(A.facilis)”可交换地使用，并指保藏在美国典型培养物保藏中心(国际保藏机构)，具有保藏号55746(“ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。

如本文所使用的，术语“大肠杆菌(Escherichia coli)”和“大肠杆菌(E.coli)”可交换地使用。一些适合用于重组表达的大肠杆菌菌株描述于此，包括但不限于具有国际保藏编号ATCC 47076的大肠杆菌MG1655、具有国际保藏编号ATCC 53911的大肠杆菌FM5、具有国际保藏编号ATCC 27325的大肠杆菌W3110、具有国际保藏编号ATCC 35695的大肠杆菌MC4100和具有国际保藏编号ATCC 12435的大肠杆菌W1485。在一个实施方案中，适合的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌FM5(ATCC53911)和大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)。

如本文所使用的，术语“大肠杆菌SS1001”或“SS1001”指表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的转化的大肠杆菌菌株，具有ATCC登记号PTA-1177(US 6,870,038；其全文在此并入作为参考)。与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO：6)相比，重组表达的大肠杆菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO：38)含有2个小的序列改变。起始密码子由GTG变为ATG以利于重组表达，并在克隆过程中导入在C-末端附近引起单个氨基酸改变(Pro367[CCA]→Ser[TCA])的人工序列。

如本文所使用的，术语“乙醇腈”缩写为“GLN”，并且与羟基乙腈、2-羟基乙腈、羟基甲腈以及CAS登记号107-16-4的所有其他异名同义。

如本文所使用的，术语“乙醇酸”缩写为“GLA”，并且与羟基乙酸(hydroxyacetic acid)、羟基醋酸(hydroxyethanoic acid)以及CAS登记号79-14-1的所有其他异名同义。经本发明方法产生的乙醇酸可以质子化的羧酸和/或相应的铵盐的形式存在。

如本文所使用的，术语“乙醇酸铵”缩写为“NH₄GLA”。

如本文所使用的，术语“乙交酯”指CAS登记号502-97-6的化合物。

如本文所使用的，术语“适合的含水乙醇腈反应混合物”和“适合的含水反应混合物”指其中乙醇腈和酶催化剂得到接触的物质和水。

如本文所使用的，术语“腈水解酶催化剂”指具有腈水解酶活性(EC3.5.5.7)特性的酶催化剂。腈水解酶直接将脂族腈转化为相应的羧酸，不形成作为中间体的相应的酰胺(方程式1)。

方程式1.

如本文所使用的，术语“改良的腈水解酶”、“腈水解酶突变体”、“敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体”和“蛋白质工程的腈水解酶”可交换地使用来指在相同的反应条件下，与敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比，具有明显改善的将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的本发明的腈水解酶。在一个实施方案中，当重组表达(使用相同的表达系统)并在基本上相同的反应条件下测定时，可通过比较本发明突变的腈水解酶催化剂与天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，测定腈水解酶活性的改善。SDS-PAGE分析显示本发明突变体及其相应的对照(SEQ IDNO：6)之间的蛋白表达水平是基本上相的敏感的。同样地，认为腈水解酶活性的改善是天然敏捷食酸菌72W腈水解酶结构修饰的结果。

术语“腈水解酶活性”指当将乙醇腈转化为乙醇酸(或相应的乙醇酸铵)时，每单位质量(例如毫克)蛋白、细胞干重或珠子重量(固定的催化剂)的酶活性。比较测量的腈水解酶活性，与细胞干重或珠子重量成正比。由于使用SDS-PAGE凝胶的激光光密度分析，在量上难以区分在敏捷食酸菌72W对照(SEQ ID NO：6)和改良的突变体之间的腈水解酶表达水平，因此相对于细胞干重(dcw)或珠子重量(bw)，比较并测量报道的改善的腈水解酶活性。

如本文所使用的，术语“一单位酶活性”或“一单位腈水解酶活性”或“U”规定为在规定温度(如25℃)下，每分钟产生1μmol乙醇酸产物需要的酶活性的量(GLA U/g细胞干重或珠子重量)。

如本文所使用的，术语“相对的腈水解酶活性”、“改善的腈水解酶活性”和“在腈水解酶活性方面相对的改善”指表示为参照(对照)腈水解酶活性的倍数(或分数)的腈水解酶活性。相对于使用天然敏捷食酸菌72W腈水解酶所观察到的腈水解酶活性，本发明突变的腈水解酶显示明显改善的腈水解酶活性。在本发明中，相对腈水解酶活性的“明显改善”是在相同的反应条件下，与对照(敏捷食酸菌72W腈水解酶；SEQ ID NO：6)的腈水解酶活性相比，至少1.5倍更高的腈水解酶活性的改善。在另一个实施方案中，在相同的反应条件下，与对照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少2倍更高的腈水解酶活性。在另一个实施方案中，在相同的反应条件下，与对照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少4倍更高的腈水解酶活性。

如本文所使用的，术语“初始反应速率”在规定的反应条件下，乙醇腈转化为乙醇酸的速率的大小，其中刚一添加乙醇腈到反应混合物中，就产生的反应速率的大小，其中在反应过程中乙醇腈浓度保持在高于约50毫摩(mM)的一段时间内测定反应速率。根据每单位时间产生的乙醇酸浓度(如摩尔乙醇酸/升/分钟或毫摩乙醇酸/小时)的改变测定反应速率。

如本文所使用的，术语“重组生物”、“转化宿主”、“转化体”、“转基因生物”和“转化的微生物宿主”指已用异源或外源DNA转化的宿主生物。本发明的重组生物表达编码活性腈水解酶的外源编码序列或基因。“转化”指DNA片段转移入宿主生物中。所述转移的DNA片段可在染色体或染色体外掺入(即通过载体)宿主生物中。如本文所使用的，“转化盒”指含有一组便于准备插入宿主细胞中的遗传元件的DNA特定片段，通常作为质粒的一部分。如本文所使用的，“表达盒”指含有一组便于准备插入宿主细胞中的遗传元件的DNA特定片段，通常作为质粒的一部分，还供在宿主中增强基因表达之用。

如本文所使用的，术语“核酸片段”和“核酸分子”指可编码完整基因、编码序列和/或编码序列前(5′，上游)或后(3′，下游)的调节序列的DNA分子。在一方面，本发明的核酸分子编码具有腈水解酶活性的多肽。

如本文所使用的，“基因”指表达特定蛋白的核酸分子。如本文所使用的，其可以或不必包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”指在自然界中发现的带有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中不同时出现的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于相同来源的调节序列和编码序列，但排列方式与天然排列方式不同。“内源基因”指位于生物的基因组中的天然位点上的天然基因。“外源基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通过基因转移导入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化操作导入基因组的基因。

如本文所使用的，术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。如本文所使用的，“适合的调节序列”指影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译并位于编码序列的上游(5′非编码序列)、之中或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以完全来源于天然基因、或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA区段。能使基因在大部分细胞类型中在大多数时间下或在大多数的环境条件下表达的启动子，通常称为“组成型启动子”。能使基因仅在特定化合物或环境条件存在下表达的启动子，通常称为“诱导型启动子”。由于在大多数情况下，调节序列的确切边界还未完全确定，因此不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”指核酸序列在单一核酸分子上的结合，使得一条序列的功能受另一条影响。例如，当启动子能影响编码序列表达时，其就是与编码序列可操作地连接的(即编码序列受启动子转录控制)。编码序列可沿有义或反义方向可操作地与调节序列连接。

如本文所使用的，术语“3′非编码序列”指位于编码序列下游并包括多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列的DNA序列。多腺苷酸化信号(通常限于真核生物)一般特点在于影响多聚腺苷酸束添加到mRNA前体的3′末端上。

本领域技术人员应充分意识到，在使用核苷酸密码子来表示所给定的氨基酸中，特定宿主细胞具有“密码子偏倚”。因此，当合成用于改善在宿主细胞中的表达的基因时，期望设计能使其密码子使用反映优选的宿主细胞密码子偏倚的基因。对其中序列信息可得到的来源于宿主细胞的基因的调查，可以确定其的密码子偏倚。密码子优化是本领域众所周知的，且已被描述用于不同的系统，包括但不限于酵母(Outchkourov等，Protein Expr Purif，24(1)：18-24(2002))和大肠杆菌(Feng等，Biochemistry，39(50)：15399-15409(2000))。

敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶

敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC 3.5.5.1)是一种用于由脂肪族或芳香族腈产生羧酸的稳定催化剂(WO 01/75077；US 6,870,038和Chauhan等，(同上))。还已显示能催化α-羟基腈(即乙醇腈)转化为α-羟基羧酸(即乙醇酸)(见US 6,383,786和US 6,416,980；它们的全文在此并入作为参考)。

所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有亲核的半胱氨酸(Cowan等，Extremophiles，2：207-216(1998)；Pace，H.和Brenner，C，Genome Biology，2(1)：reviews 1-9(2001)；和Chauhan等，同上)且都易受硫醇试剂(1.0mM浓度的氯化铜、硝酸银、乙酸汞或氯化铁，每一种都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅降低)影响而失活。半胱氨酸残基也能被不可逆地氧化为亚磺酸，导致酶活性损失。尽管腈水解酶对多种失活机制敏感，但是固定的敏捷食酸菌72W细胞是稳定的，在多次再循环反应后能保持其大部分腈水解酶活性(US 6,870,038)。

已报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶与其他细菌腈水解酶的序列比较(US 6,870,038；Chauhan等，同上)。该72W腈水解酶具有几个保守的特征结构域，包括邻近氨基末端的16-氨基酸区(SEQ ID NO：6的氨基酸残基40-55)和含有必需半胱氨酸残基的催化区(SEQ ID NO：6的氨基酸残基160-173)。该半胱氨酸残基(SEQ ID NO：6的Cys164)与保守的谷氨酸(SEQ ID NO：6的Glu48)以及赖氨酸残基(SEQ ID NO：6的Lys 130)一起形成见于所有腈水解酶中的催化三联体基序(Pace，H.，和Brenner，C，同上)。尽管在所报道的腈水解酶之中某些结构相似性是保守的，但是底物特异性变化很大(O′Reilly，C.和Turner，P.，J Appl Microbiol，95：1161-1174(2003))。

突变的腈水解酶特性

之前已报道了一些来源于敏捷食酸菌72W腈水解酶的突变的腈水解酶(US 10/919182；在此并入作为参考)。在US 10/919182中，为了将3-羟基腈(即3-羟基丁腈和3-羟基戊腈)转化为3-羟基酸的腈水解酶活性的相对改善(相对于重组表达的、天然的72W腈水解酶的活性)，选择并筛选各种突变的腈水解酶。

US 10/919182中所述的腈水解酶突变体使用的表达系统是基于质粒pTrcHis2-

和大肠杆菌宿主TOP10(两者都来自于Invitrogen，LaJoIIa，CA)的。使用实施例12所述的方法，在相同的表达系统中比较腈水解酶突变体F168L(SEQ ID NO：6中第168位残基由Phe变为Leu)、F168V(第168位残基由Phe变为VaI；SEQ ID NO：32)、F168K(第168位残基由Phe变为Lys；SEQ ID NO：26)、T210A(第210位残基由Thr变为Ala；SEQ ID NO：34)和T210C(第210位残基由Thr变为Cys；SEQID NO：36)与天然的酶(“对照”；SEQ ID NO：6)的活性。当将GLN转化为GLA时，突变体F168L、T210A和T210C最初被鉴定可能具有明显改善的腈水解酶活性，但是随后发现它们与72W腈水解酶对照具有类似的腈水解酶活性。出乎意料地，当将乙醇腈(一种2-羟基腈)转化为乙醇酸时，US 10/919182中所述的两种突变的腈水解酶(F168K，Phe168→Lys；F168V，Phe168→VaI)(在此分别由SEQ ID NOs：26和32表示)也显示明显改善的腈水解酶活性。然而，当将乙醇腈转化为乙醇酸时，US 10/919182中所述的其他突变的腈水解酶(如T210A，SEQ ID NO：34；T210C，SEQ ID NO：36)并没有显示明显改善的腈水解酶活性。

如本申请实施例所述，易错PCR和定向饱和诱变用于随机突变天然的72W腈水解酶编码序列(SEQ ID NO：5)。导致在氨基酸残基第168位(在野生型序列中为苯丙氨酸)和第201位(在野生型序列中为亮氨酸)的氨基酸取代的突变似乎明显增加了腈水解酶活性。如本文所使用的，术语“氨基酸残基位置”指在相对于由N-末端甲硫氨酸残基起算的参照序列(SEQ ID NO：6)的特定位置上所见的氨基酸。进行定向饱和诱变以评估在两个残基位置(168和210)上的所有氨基酸取代。鉴定了一些具有明显改善的将乙醇腈转化为乙醇酸(如在本发明的反应条件下，以乙醇酸铵盐的形式存在)的腈水解酶活性的额外的突变体。相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶序列(SEQ ID NO：6)，本发明突变的腈水解酶包含至少一个氨基酸取代。同样地，每一个本发明突变的腈水解酶的氨基酸序列具有带有至少一个如本文所述的氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO：6(参照序列)。

在一个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶包含编码具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列带有至少一个选自以下的氨基酸取代：

a)在氨基酸残基第168位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和

b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当将乙醇腈转化为乙醇酸时，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性改善。

在另一个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶具有选自SEQ ID NOs：8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的氨基酸序列。在又一个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶具有选自SEQ ID NOs：7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。

在一方面，本发明包括编码具有腈水解酶活性的多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和

b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性的增加。

在另一方面，本发明包括编码具有选自SEQ ID NOs：8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列的多肽的分离的核酸分子。在又一方面，本发明包括具有选自SEQ ID NOs：7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29的核酸序列的分离的核酸分子。

在一方面，本发明包括具有腈水解酶活性的分离的多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和

在另一个实施方案中，本发明包括具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NOs：8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列。

通过将所测定的活性单位(U)除以催化剂重量计算腈水解酶活性。可根据纯化的蛋白质重量、细胞湿量、细胞干重或固定的催化剂(即使用角叉菜胶和/或GA/PEI-交联的催化剂/藻酸盐珠子)的重量测定催化剂重量。在本发明中，腈水解酶活性记录为每克细胞干重的活性单位(U/gDCW)或每克催化剂珠子的活性单位(比较固定的催化剂)。就基于细胞干重作为单位催化剂重量的腈水解酶活性比较，应当考虑腈水解酶蛋白产生的水平。测定不同转化体及它们各自对照之间的腈水解酶的表达水平，并观察到是基本上相同的(即当在相同的遗传背景中比较时)。因此。对于不同的突变体而言，所报道的腈水解酶活性的改善归因于酶结构上的改变。

在相同的载体背景(pTrcHis2-

或pUC19)和宿主：大肠杆TOP10(Invitrogen)、大肠杆菌FM5(ATCC 53911)或大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)中表达突变的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶对照)的编码序列。相对的改善是基于与使用相同的载体和宿主背景的适当的对照比较的。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析定量)证明了在每种突变体(和对照)中腈水解酶蛋白表达水平基本上相同(如由于使用相同的表达系统和宿主所预期的)。相对酶活性被记录为对不同突变的催化剂所测定的腈水解酶活性相对于在表达敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：6)的各自的大肠杆菌对照转化体中所测定的腈水解酶活性的倍数增加。

对于未固定的催化剂，通过测定每克细胞干重在25℃下将乙醇腈转化为乙醇酸的转化率(μmol GLA/min)，确定突变的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g细胞干重)。对于固定的催化剂比较，通过在25℃下测定乙醇腈转化为乙醇酸的转化率(μmol GLA/min)来确定活性，并记录为每克固定的细胞催化剂珠子的腈水解酶活性单位(U/g珠子)。一单位的腈水解酶活性(U)相当于在25℃下每分钟产生1微摩尔乙醇酸(μmolGLA/min)。

对于特定的突变的腈水解酶，使用下列格式之一，关于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，DNA编码区中的点取代突变以及所得到的氨基酸改变得到了详细说明：

1.扩展格式：提供了SEQ ID NO：6中野生型氨基酸(使用标准的3-字母缩写)和相应的氨基酸残基位置，之后是在相同的残基位置处见于突变体中的新氨基酸，例如。“Phe168改变为Lys”或“Phe168→Lys”描述了一种在SEQ ID NO：6中氨基酸残基第168位处作为突变的结果——苯丙氨酸被改变为赖氨酸的突变。

2.简写形式：野生型氨基酸(表示为标准的单字母缩写)之后是SEQID NO：6的氨基酸残基位置，再后是突变的氨基酸(也表示为标准的单字母缩写)。例如，“F168K”描述了一种在SEQ ID NO：6中氨基酸残基第168位处作为突变的结果——苯丙氨酸被改变为赖氨酸的突变。

使用腈水解酶催化剂将乙醇腈水解为乙醇酸

通过将酶催化剂与包含乙醇腈的含水反应混合物接触进行水解反应。完整的重组微生物细胞(表达本发明的突变的腈水解酶)可用作为酶催化剂而无需任何预处理。微生物细胞催化剂可直接添加到反应混合物中，或使用中空纤维膜柱体或超滤膜保持与主体反应混合物分离。或者，微生物细胞可固定在聚合物基质(如角叉菜胶或聚丙烯酰胺(PAG)颗粒)中或固定在不溶性支持物(如硅藻土)上以便于酶催化剂回收和再生(US6,870,038)。纯化或部分纯化的酶也可分离自全细胞并直接用作为催化剂，或所述酶可固定在聚合物基质中或固定在不溶性支持物上。固定细胞或分离的酶的方法已得到广泛地报道并且是本领域技术人员众所周知的(Methods in Biotechnology，Vol.1：Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。之前已报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶催化剂的固定(US 6,870,038)。

含水反应混合物中酶催化剂的浓度取决于酶催化剂的特定活性，并可选择以获得期望的反应速率。在水解反应中用作为催化剂的微生物细胞的细胞湿重通常为0.001g-0.250g湿细胞/mL总反应体积，优选0.002g-0.050g湿细胞/mL。

选择水解反应的温度以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可在仅仅高于反应混合物凝固点(大约0℃)至约65℃的范围内；优选反应温度在约5℃至约35℃。可通过将细胞悬浮于蒸馏水中，或悬浮于可保持反应初始pH在约5.0和约10.0之间、优选在约5.5和约8.0之间、更优选在约5.5和约7.7之间以及最优选约6.0至约7.7的缓冲水溶液中制备微生物细胞催化剂悬浮液。当反应进行之时，由于由相应的腈官能团形成羧酸铵盐，可改变反应混合物的pH。所述反应可运行直至完全转化乙醇腈，无需pH控制，或在整个反应过程中可添加适合的酸或碱以保持期望的pH。

发现在25℃下乙醇腈能与所有比例的水完全混溶。在其中选择反应条件使得水相中底物(即α-羟基腈)的溶解性也取决于溶液温度和/或盐浓度(缓冲液或产物乙醇酸铵盐，也称为乙醇酸铵)情况下，反应混合物起初可由两相组成：含有酶催化剂和溶解的α-羟基腈的水相以及有机相(不溶解的α-羟基腈)。当反应进行时，α-羟基腈溶解于水相中，并最终获得单相产物混合物。还可通过以大约等于酶促水解反应速率的速率添加α-羟基腈到反应混合物中运行反应，由此保持单相含水反应混合物，并避免在高的起始物料浓度下，潜在的酶底物抑制的问题。

乙醇酸可作为质子化的羧酸和/或其相应的铵盐(取决于产物混合物的pH)的混合物存在于产物混合物中，并可额外地作为羧酸盐与任何能额外地存在于产物混合物中的缓冲液存在于产物混合物中。视所需，乙醇酸产物可作为质子化的羧酸或羧酸盐分离自反应混合物。

在乙醇腈完全转化下，产物混合物中的乙醇酸的终浓度可在0.001M至乙醇酸产物的溶解度极限。在一个实施方案中，乙醇酸的浓度会约0.10M至约9.0M。在另一个实施方案中，乙醇酸的浓度在约0.2M至约4.0M。通过用诸如的浓盐酸或浓硫酸的适合的无机酸调节反应混合物的pH为约1.0至约3.0，并用适合的有机溶剂萃取乙醇酸，可从产物混合物(在除去催化剂后)中分离乙醇酸。在一个实施方案中，所述适合的有机溶剂是

336(一种三烷基叔胺，其中烷基长度为C₈-C₁₀；Cognis Corp.，Cincinnati，OH)与一种或多种稀释剂的混合物，所述稀释剂选自甲基异丁基酮、1-辛醇、1-癸醇、甲苯、二甲苯(混合的)、煤油、甲基叔丁基醚和二氯甲烷(见共同未决的US临时专利申请60/638128；在此并入作为参考)。可利用水从有机溶剂中反萃取乙醇酸。

在一个实施方案中，用氯化钠饱和有机溶剂，并将有机溶剂与适合的干燥剂(如硫酸镁)接触，过滤并除去溶剂(如通过旋转蒸发)以高产率和高纯度(通常98-99％纯)产生期望的产物。视所需，可通过重结晶或蒸馏进一步纯化产物。

在另一个实施方案中，可利用直接脱氨和/或其他纯化方法从乙醇酸铵中直接分离乙醇酸，所述其他纯化方法包括但不限于浓缩、结晶、反应性溶剂萃取、离子交换、电渗析、糖醇解、聚合、蒸馏、热分解(盐裂化)、醇解以及它们的组合(见共同未决的US临时专利申请60/638148和60/638126；每一申请全文在此并入作为参考)。

微生物表达

可在异源宿主细胞中，优选在微生物宿主中产生本发明的腈水解酶突变体。在本发明中特别有用的是易于适应大规模发酵法的细胞。这样的生物体是工业生物工艺领域众所周知的，其例子可见Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications.Murooka等，编，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1994)，并包括发酵细菌以及酵母和丝状真菌。宿主细胞可包括但不限于丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、短杆菌(Brevibacterium sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、固氮菌(Azotobacter sp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、克雷白氏杆菌(Klebsiella sp.)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、糖酵母(Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、毕赤酵母(Pichia sp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)、假丝酵母(Candida sp.)、汉森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、球拟酵母(Torulopsis sp.)、甲基杆菌(Methylobacteria sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、埃希氏杆菌(Escherichia sp.)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)和链霉菌(Streptomyces sp.)。特别优选的是大肠杆菌。其中突变的腈水解酶基因可被表达的适合的大肠杆菌宿主细胞的例子包括，但不限于在此列举的宿主细胞以及MG1655(ATCC47076)、FM5(ATCC 53911)、W3110(ATCC 27325)、MC4100(ATCC35695)、W1485(ATCC 12435)及它们的衍生物。在另一方面，优选的大肠杆菌宿主菌株是MG1655(ATCC 47076)或FM5(ATCC 53911)。

先前已报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的异源表达(Chauhan等，同上和US 6,870,038)。Chauhan等报道了一种表达活性敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：38)的大肠杆菌菌株(大肠杆菌SS 1001(ATCCPTA-1177))。与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NOs：5和6)相比，该重组表达的(大肠杆菌SS 1001)腈水解酶的编码序列含有2个小的序列改变。起始密码子由GTG改变为ATG以利于重组表达，并且在克隆过程中导入引起邻近C-末端的单个氨基酸改变的人工序列(Pro367[CCA]→Ser[TCA])。

在工业上适合的宿主中进行重组表达具有几个优点。首先，与由大多数获得目的基因的微生物可得到的遗传工具相比，对于大多数常用的生产宿主，其遗传工具箱通常得到充分的开发。与在天然宿主中表达相比，在这些宿主中重组表达一般更具成本效率。例如，业已显示当通过发酵培养时，敏捷食酸菌72W细胞得在甘油——一种相当昂贵的碳底物上生长，而使用便宜的葡萄糖却无法成功地生长。与此相反，与敏捷食酸菌72W细胞相比，在约一半时间内，大肠杆菌转化体就可在葡萄糖上生长至相同的细胞密度，明显地降低了生物催化剂生产成本(US6,870,038)。

含有指导高水平外源蛋白表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员众所周知的。这些可用于构建用来生产本发明突变的腈水解酶的基因产物的嵌合基因。然后，通过转化可将这些嵌合基因导入适当的微生物中，以提供高水平的突变的腈水解酶表达。本发明的核酸分子被用来产生具有相对于天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶增加的或改变的腈水解酶活性水平的基因产物。在一方面，本发明突变的基因所编码的多肽提供了至少1.5倍的将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的改善(与SEQ ID NO：6所示的敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比)。

在改变宿主细胞的特性上嵌合基因应当是有效的。例如，在适当的启动子控制下，将至少一个编码本发明的腈水解酶的嵌合基因拷贝导入宿主细胞，赋予了该宿主细胞改善的将乙醇腈转化为乙醇酸的能力。本发明的嵌合基因应包含适合的用于驱动本发明突变的腈水解酶序列基因表达的调节序列。调节序列可包括，但不限于启动子、翻译前导序列和核糖体结合位点。如果这些序列来源于宿主生物体，则是优选的；然而，本领域技术人员应认识到也可以使用异源调节序列。

通过将嵌合基因克隆入适合的表达载体中，其可被导入适当的宿主中。用于转化适合的宿主细胞的载体或表达盒是本领域众所周知的。一般来说，所述载体或表达盒含有指导有关基因转录和翻译的序列、可选择的标记以及容许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含具有转录起始控制的编码序列的5′区和控制转录终止的DNA片段的3′区。尽管这样的控制区无需来源于选择作为生产宿主的特定物种自身的基因，但是当这两个控制区都来源于与宿主细胞同源的基因时，则是最优选的。

在一个实施方案中，所述调节序列应包括启动子。启动子可以是组成型或诱导型的。诱导型启动子一般响应于特定的刺激(如IPTG或乳糖诱导的lac启动子)。诱导型启动子可以响应于多种刺激，包括化学药品、生长周期、温度改变、pH改变和摩尔渗透压浓度改变，不一一例举。

用于在期望的宿主细胞中驱动本发明突变的腈水解酶表达的起始控制区或启动子为数众多，且为本领域技术人员所熟悉，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母中表达)；以及lac、trp、1P_L、1P_R、T7、tac、P_BAD、npr和trc(用于在大肠杆菌中表达)。特别适用于在大肠杆菌中驱动表达的启动子的额外的例子包括，但不限于大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子Ptrp、大肠杆菌的乳糖操纵子启动子Plac、大肠杆菌的Ptac启动子、λ噬菌体右翼启动子P_R、λ噬菌体左翼启动子P_L、T7启动子以及来自甲醇酵母(Pichia pastoris)的GAP基因，或是至少一种分离自微生物组的启动子，所述微生物选自由丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷白氏杆菌属、沙门氏菌属、乳酸杆菌属、曲霉属、糖酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉森氏酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉菌属、球拟酵母属、甲基杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属组成的组。

终止控制区还可来源于不同的基因，优选宿主自身的基因。任选地，终止位点可以是不必需的；然而，如果包括的话，则是最优选的。

此外，所插入的遗传物质可包括核糖体结合位点。所述核糖体结合位点可来自λ噬菌体CII基因或选自：从毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷白氏杆菌属、沙门氏菌属、乳酸杆菌属、曲霉属、糖酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉森氏酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉菌属、球拟酵母属、甲基杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属基因的核糖体结合位点。

任选地，所述基因产物可优选为转化的宿主的分泌产物。期望的蛋白分泌到生长培养基中简化了纯化步骤并降低了成本。分泌信号序列通常用于促进可表达的蛋白主动转运通过细胞膜。可通过将编码分泌信号的DNA序列掺入宿主中创建能分泌的转化宿主。用于选择适当的信号序列的方法是本领域众所周知的(见例如EP 546049；WO 9324631)。所述分泌信号DNA可位于表达控制DNA和本发明的编码序列或编码序列片段之间，以及位于带有后者的读框中。

蛋白质工程

通过诱变生产本发明突变的腈水解酶。预期本发明的核苷酸可用于生产具有进一步增强的或改变的活性的基因产物。用于突变天然基因序列以产生具有改变的或增强的活性的基因产物的多种方法是公知的，包括但不限于1)随机诱变，2)结构域交换(使用锌指结构域或限制性内切酶)，3)易错PCR(Melnikov等，Nucleic Acids Research，27(4)：1056-1062(1999))；4)位点定向诱变(Coombs等，Proteins(1998)，pp 259-311，1plate.Angeletti，Ruth Hogue，编，Academic：San Diego，CA)；和5)“基因改组”(US 5,605,793；US 5,811,238；US 5,830,721；和US 5,837,458，在此并入作为参考)。

通过错误掺入核苷酸，聚合酶链式反应(PCR)可用于扩增带有伴随多个突变产生的DNA片段。这可通过改变PCR条件例如改变dNTPs比率或在反应中添加不同数量的氯化锰而得以实现(Fromant等，AnalBiochem，224(1)：347-53(1995)；Lin-Goerke等，Biotechniques，23(3)：409-12(1997))。然后，可克隆突变的DNA片段库以产生突变质粒文库，在诸如大肠杆菌的宿主中表达后，接着可对所述文库进行筛选。

由于基因改组的方法容易实施且诱变率高并易于筛选，因此其是特别具有吸引力的。基因改组的方法包括在具有与目的基因相似性和/或差异的额外几群DNA区存在下，用限制性内切核酸酶将目的基因切割为特定大小的片段。然后，该片段库应变性并重退火以产生突变的基因。接着筛选改变活性的所述突变的基因。

可通过该方法突变本发明的微生物序列，并筛选改变或增强的活性。该序列应当是双链的且可以具有从50bp到10kB不同的长度。使用本领域众所周知的限制性内切核酸酶，该序列可以被随机消化为约10bp到1000bp的片段(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)；在下文中“Maniatis”)。除本发明的微生物序列之外，可以添加与微生物序列全部或部分能杂交的片段群。同样地，也可以添加不能与本发明序列杂交的片段群。一般来说，与总的核酸相比，这些附加的片段群以约10至约20倍过量添加。一般地，如果执行该方法，则混合物中不同的特定核酸片段的数目会在约100至约1000。对混合的随机核酸片段群变性以形成单链酸片段，然后重退火。只有那些具有与其他单链核酸片段同源的区域的单链核酸片段会重退火。可通过加热变性随机核酸片段。本领域技术人员能确定完全变性双链核酸所必需的条件。优选温度为约80℃-100℃。可通过冷区重退火核酸片段。优选温度为约20℃至约75℃。可通过添加聚乙二醇(“PEG”)或盐加速复性。适合的盐浓度可在0mM至约200mM。然后在核酸聚合酶和dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在下温育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是Klenow片段、Taq聚合酶或任何其他本领域公知的DNA聚合酶。可在退火先前、退火同时或退火后，添加所述聚合酶到随机核酸片段。在聚合酶存在下，变性、复性和温育循环重复期望的次数。优选所述循环重复约2至约50次，更优选所述次序重复10至约40次。所得到的核酸是一种约50bp至约100kB的较大的双链多核苷酸，且通过标准的克隆和表达实验设计，对于表达和改变的活性可进行筛选(Maniatis，同上)。

此外，可通过使用基因改组(外显子改组)方法融合功能域装配杂合蛋白质(Nixon等，PNAS，94：1069-1073(1997))。本发明基因的功能域可与其他基因的功能域相结合以产生具有期望催化功能的新酶。可使用PCR重叠延伸方法构建杂合酶并使用本领域技术人员众所周知的技术将其克隆入不同的表达载体中。

当将乙醇腈转化为乙醇酸时，稳定剂改善了腈水解酶稳定性和生产率

可通过让甲醛与氰化氢反应合成乙醇腈(US 2,175,805，US2,890,238，US 5,187,301和共同未决的US临时专利申请60/638127)。取决于反应物的纯度和用于制备乙醇腈的反应条件，多种杂质可存在于最终产物中。这些杂质能干扰乙醇腈转化为乙醇酸的效率。在一个实施方案中，在进行酶促转化为乙醇酸之前，可处理乙醇腈水溶液以除去不需要的杂质。

另一种增加酶催化剂稳定性/生产率的方法是添加一种或多种会与乙醇腈溶液中不需要的化合物反应的化合物，所述不需要的化合物可干扰催化剂稳定性和/或生产率。不需要的化合物包括，但不限于甲醛、甲醛衍生的杂质、甲醛衍生的低聚物以及聚合物、2-羟乙酰胺、2-羟乙酰胺衍生的杂质、氰化氢衍生的杂质、氰化氢衍生的低聚物和聚合物、乙醇腈衍生的杂质、乙醇腈衍生的低聚物和聚合物、乙交酯、线型乙醇酸低聚物以及可能的氧(反应在改善催化剂稳定性的基本上无氧的条件下进行)。不需要的化合物还可包括那些1)与腈水解酶催化剂反应并失活其的，2)在反应中与乙醇腈竞争的，3)与乙醇腈或乙醇酸反应以形成不需要的副产物的，或4)对重组宿主细胞产生不利影响的(即促进细胞溶解)。能添加到乙醇腈反应混合物中的适合的化合物的例子可包括，但不限于硫代硫酸盐(如硫代硫酸钾，K₂S₂O₃)，连二亚硫酸盐(如连二亚硫酸钠，Na₂S₂O₄)以及氰化物(如HCN、NaCN、KCN等)。在一个实施方案中，所述化合物在酶催化剂添加之前、过程中或之后添加到乙醇腈反应混合物中。在另一个实施方案中，添加所述化合物到反应混合物中使得在反应混合物中的终浓度为至少约0.001M至小于约5wt％的反应混合物。在另一个实施方案中，添加所述化合物到反应混合物中使得终浓度为至少约0.01M。在还一个实施方案中，添加所述化合物到反应混合物中使得化合物的终浓度为约0.01M至约1M。

在本发明的另一方面，在基本上无氧的条件下进行本发明方法。如本文所使用的，术语“无氧的条件”、“无氧的气氛”和“基本上无氧的条件”指其中不起反应的气体例如氮气被用于清洗和/或覆盖反应釜使得分子氧(O₂)不存在于本发明方法过程中的反应条件。本领域技术人员应承认在基本上无氧的条件下可存在痕量的分子氧。在一方面，术语“基本上无氧的”表示其中分子氧浓度低于约5％，优选低于2％，更优选低于1％以及最优选低于0.1％的反应釜中气体的反应条件。在另一方面，本发明方法在基本上无氧的条件下进行，其中氮气(N₂)用于覆盖反应釜中含水反应混合物。

控制乙醇腈浓度以改善催化剂稳定性和生产率

另一种增加腈水解酶稳定性的方法是控制含水反应混合物中乙醇腈的最大浓度。如前所述，乙醇腈在极性溶剂中离解以释放甲醛和氰化氢。反应混合物中的甲醛可与酶催化剂反应，导致过早的失活并降低了催化剂生产率。控制溶液中乙醇腈的浓度能增加催化剂稳定性和催化剂生产率(每克催化剂产生的乙醇酸克数)。如实施例12-15(表9)所示，在含有3M乙醇腈的反应中，仅3次循环反应后来源于敏捷食酸菌72W的腈水解酶催化剂就迅速丧失其活性，浓度降至1M和/或以1M增量逐步添加3M乙醇腈(在之前添加的乙醇腈已转化为乙醇酸铵之后添加)明显增加了催化剂生产率(表9)。在一个实施方案中，逐步添加(等分物)乙醇腈到含水反应混合物中增加了催化剂生产率。在另一个实施方案中，以逐步方式添加乙醇腈到含水反应混合物中，使得反应过程中乙醇腈的总浓度保持在约1M或更低。

如实施例15所示，在几次再循环反应后连续添加乙醇腈也增加了催化剂生产率。在一个实施方案中，由乙醇腈产生乙醇酸铵的方法使用了连续添加乙醇腈。在另一个实施方案中，乙醇腈添加的速率为至少5倍的催化剂Km。本发明的催化剂通常具有约1mM(野生型敏捷食酸菌72W；SEQ ID NO：6)至约2.7mM的对乙醇腈的Km。如本领域已知的，约5倍Km值的底物浓度(即5X 2.7mM＝13.5mM)产生约97％的最大反应速率(Vmax)的反应速率。在又一个实施方案中，控制乙醇腈进料速度以保持反应混合物中乙醇腈浓度为约5mM至约1M，优选约100mM至约1M，更优选约100mM至约500mM。

控制pH

利用本发明的腈水解酶催化剂的反应通常在约5至约10，优选5.5至约8，更优选约5.5至约7.7以及最优选约6至约7.7的pH下运行。

乙醇酸和乙醇腈的分析

适合于分析乙醇酸产生的分析法是本领域众所周知的，包括但不限于HPLC、CE、GC和MS。例如，HPLC分析用于测定乙醇酸产生量，使用了折光率检测器和Bio-Rad HPX-87H柱(30cm x 7.8mm直径)以及在50℃下以1.0mL/min(等度洗脱)的0.01N硫酸作为流动相。HPLC方法适合于定量底物(乙醇腈)和产物(乙醇酸)。

微生物催化剂的工业生产

在期望使用本发明突变的腈水解酶基因工业生产本发明的腈水解酶的情况下，可使用多种培养方法。发酵可以分批、补料分批或连续方式进行，方法是本领域众所周知的(Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，(1989)；Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36(3)：227-234(1992))。

经典的分批培养方法是一种封闭系统，其中培养基组合物在培养开始时就设定好的，在培养过程中不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，就将期望的生物体接种培养基，并且在不添加任何物质到该系统中的情况下，让其生长或进行代谢活动。然而，一般来说，“分批”培养是针对碳源的添加而言的分批，并且通常试图控制诸如pH和氧浓度的因素。在分批系统中，该系统的代谢物和生物量组成稳定地改变着，直到培养结束。在分批培养中，细胞通过静止停滞期到高速生长对数期并最终到达稳定期，其中在稳定期生长速度降低或停止。如果不进行处理。处在静止期的细胞最终会死亡。对数期的细胞通常决定最终产物或在某些系统中的中间产物的产量。静止期或指数期后生产可以在其他系统中获得。

标准分批系统的变化形式是补料分批系统。补料分批培养方法同样适用于本发明，并且包括典型的分批系统，所不同的是，随着培养的进行，以增量形式添加底物。当降解物阻遏倾向于抑制细胞的代谢以及当培养基中需要具有有限量的底物时，可以使用补料分批系统。要测定补料分批系统的实际底物浓度是困难的，因此，根据可测定因素如pH，溶解氧，以及诸如CO₂的废气的分压的变化进行估算。分批和补料分批培养方法是常用的并且为本领域众所周知，其例子可见于Brock(同上)和Deshpande(同上)。

本发明腈水解酶催化剂的工业生产还可以通过连续培养来实现。连续培养是一种开放系统，其中将规定的培养基连续地添加到生物反应器中，并同时将等量的条件培养基取出进行加工。连续培养通常将细胞保持在恒定的高液相密度下，其中细胞主要是在对数期生长。或者，可用固定的细胞进行连续培养，其中连续添加碳和养分以及不断地从细胞团块中将有价值的产物、副产物或废弃产物取出。可使用多种由天然和/或合成材料组成的支持物进行细胞固定。

连续或半连续培养可以调节能够影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任意数目的因素。例如，一种方法能保持限制养分，例如让碳源或氮含量处在固定比例上，并且允许所有其他参数处在适当水平上。在其他系统中，可以连续地改变影响生长的多种因素，同时保持通过培养基浊度测量的细胞浓度恒定。连续系统试图保持稳态生长条件，因此，通过取出培养基所导致的细胞减少，必须与培养物中的细胞生长速度平衡。调节连续培养方法的养分和生长因子的方法，以及用于使产物形成速度最大化的方法在工业微生物学领域中是众所周知的，并且由Brock(同上)详细披露了多种方法。

本发明的发酵培养基必须含有适合的碳底物。适合的碳底物可包括，但不限于诸如葡萄糖和果糖的单糖、诸如乳糖或蔗糖的二糖、诸如淀粉或纤维素或它们的混合物的多糖、以及来自诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖浆和大麦芽的可再生原料的未纯化的混合物。因此，预计用于本发明的碳源可包括多种含碳底物，仅受受限于所选择的生物体。

从乙醇酸铵回收乙醇酸的方法

从相应的铵盐回收和/或获得有机酸的方法是本领域已知的。从包含乙醇酸铵的水溶液回收和/或获得乙醇酸的方法可包括，但不限于离子交换(阴离子和/或阳离子交换)、电渗析、反应性溶剂萃取、热分解、醇解(酯化后将乙醇酸酯水解为乙醇酸)以及它们的组合。

离子交换(阳离子交换)

阳离子交换是一种可逆过程，其中溶解的离子物种以化学计量的方式为支持物所吸收。阳离子交换是本领域众所周知的。在本发明方法中，将乙醇酸铵注入阳离子交换树脂中，其中铵离子与质子交换，形成乙醇酸(见实施例28)。乙醇酸穿过柱子并得到收集。

一旦树脂为铵离子所饱和，就用酸例如硫酸再生，会产生副产物硫酸铵盐。使用模拟移动床或圆盘传送带(carrousel)，可分批进行阳离子交换(见Perry′s Chemical Engineers′Handbook，第7版，Perry，Robert H.，Green，Dow W.和Maloney，James O.，编；McGraw Hill Companies，Inc.，New York，NY，1997；在下文中称为“Perry′s”)。树脂的选择可影响进料浓度，其可为约0.02wt％盐至约50wt％乙醇酸铵，优选约0.02wt％至约40wt％。通常所用的再生酸为约0.5wt％至约20wt％。

离子交换(阴离子交换)

阴离子交换也是本领域众所周知的。除使用弱阴离子交换树脂之外，阴离子交换类似于阳离子交换(见Perry′s，同上)。树脂的选择能影响再次进料浓度，其可为约0.02wt％至约90wt％乙醇酸铵，优选约0.02wt％至约40wt％。通常应使用弱酸进行树脂再生。

溶剂萃取(反应性)

一种已用于分离羧酸的方法是反应性萃取。已报道该方法能用于从乳酸铵中萃取乳酸(Wasewar等，J.Biotechnol.，97：59-68(2002))。反应性萃取包括使用反应性有机溶剂(即胺)络合水相中的酸。该过程中的第一步通常包括酸化含有期望的酸的盐的水溶液。然后，将酸化的水溶液与通常包含反应性叔胺和一种或多种稀释剂的有机溶剂接触。反应性胺(通常为C8-C10三烷基叔胺例如

336，Cognis Corp，Cincinnati，OH)与羧酸反应形成优先溶于有机相中的酸/胺络合物(Tamada等，Ind.Eng.Chem.Res.29：1319-1326(1990)；Tamada等，Ind.Eng.Chem.Res.29：1327-1333(1990))。与使用常规的溶剂萃取所能获得的结果相比，使用叔烷基胺通常提供了更高的分配系数。然后，使用反萃取从有机相中回收酸。

Inci，I.(Chem.Biochem.Eng.Q.，16(2)：81-85(2002)；Inci，I.和UsIu，H.，J.Chem.Eng.Data，50：536-540(2005))报道了使用反应性胺溶剂萃取乙醇酸。然而，这些试验报道的是溶解于纯水中的纯乙醇酸的萃取系数。Inci没有举例说明或教导一种由复杂的含水基质(如包含大量天然盐和其他杂质的乙醇酸水溶液)例如浓缩的乙醇酸铵水溶液获得乙醇酸的方法。

反应性溶剂萃取还可用于由乙醇酸铵水溶液获得乙醇酸(见共同未决的US临时专利申请60/638128；在此并入作为参考)。更具体地说，提供了一种由包含乙醇酸铵的水溶液分离乙醇酸的方法，包括：

a)提供第一相，其中所述第一相是水不混溶的有机溶剂混合物，包含：

i)约30体积百分比至约99体积百分比的所述第一相是至少一种具有以下分子式的叔烷基胺：

其中R₁、R₂和R₃独立地是C8-C12烷基；和

ii)约1体积百分比至约70体积百分比的所述第一相是至少一种选自以下的稀释剂：甲基异丁基酮、1-辛醇、1-癸醇、二氯甲烷、1-氯丁烷、氯苯、氯仿，煤油、甲苯、混合二甲苯、磷酸三丁酯和它们的混合物；

b)提供第二相，其中所述第二相是具有约3或更低的pH的包含乙醇酸的水溶液；所述第二相通过以下步骤形成：

i)提供乙醇酸铵水溶液；所述乙醇酸铵水溶液具有约5重量％至约40重量％乙醇酸铵的浓度；和

ii)添加足以降低(b)(i)的乙醇酸铵水溶液的pH至约3或更低的量的无机酸；由此形成包含乙醇酸的水溶液；

c)在反应性萃取处理中将所述第一相与所述第二相接触；由此形成负荷了乙醇酸的第一相；

d)分离所述负荷了乙醇酸的第一相；

e)在反萃取处理中将所述负荷了乙醇酸的第一相与第三相接触，由此负荷了乙醇酸的第一相中的乙醇酸被萃取到所述第三相中，其中所述第三相是不混溶于所述负荷了乙醇酸的第一相中的水溶液；和

f)由所述第三相回收乙醇酸。

在一个实施方案中，所述三烷基叔胺选自三正辛胺、三异辛胺、三正壬胺、三正癸胺和三-正十二烷胺。在另一个实施方案中，所述三烷基叔胺选自

308(CAS#2757-28-0)、

300(CAS#1116-76-3)、

304-1(CAS#102-87-4)和

336(CAS#68814-95-9)(Cognis Corp.，Cincinnati，OH)。在另一个实施方案中，所述稀释剂选自甲基异丁基酮(MIBK)、煤油、甲苯、混合二甲苯、1-辛醇和它们的混合物。在又一个实施方案中，水不混溶的有机溶剂选自90％(v/v)

336：10％(v/v)MIBK；90％

336：10％1-辛醇；90％336：10％甲苯和90％

336：10％混合二甲苯。

第一相中三烷基叔胺的浓度可为约30％(v/v)至约99％(v/v)，优选约50％(v/v)至约90％(v/v)以及最优选约70％(v/v)至约90％(v/v)。第一相中稀释剂的量可为约1％(v/v)至约70％(v/v)，优选约10％至约50％以及最优选约10至约30％。

适合用于萃取乙醇酸的有机溶剂萃取混合物包含

336与一种或多种稀释剂的混合物，所述稀释剂选自甲基异丁基酮(MIBK)、1-辛醇、1-癸醇、二氯甲烷、1-氯丁烷、氯苯、氯仿、煤油、甲苯、混合二甲苯和磷酸三丁酯。在一个实施方案中，所述有机相萃取剂包含Alamine 336和一种或多种稀释剂，所述稀释剂选自MIBK、1-辛醇、甲苯、二甲苯和煤油。在另一个实施方案中，所述反应性有机溶剂包含约50％至约95％

336，优选占有机溶剂混合物的约65％至约95％。有机溶剂包含约50％至约5％稀释剂的一种或多种稀释剂，优选占有机溶剂混合物的35％至约5％。在一个实施方案中，所述混合的有机溶剂包含约70％

336、约10％MIBK和约20％煤油。在另一个实施方案中，所述混合的有机溶剂包含约90％

336和约10％稀释剂，所述稀释剂选自MIBK、1-辛醇、甲苯和二甲苯。

本领域技术人员能去顶有机相萃取的优选温度。在一个实施方案中，萃取反应在约10℃至约90℃，更优选约20℃至约75℃以及最优选约25℃至约75℃的温度下进行。

从酸化的水相中萃取乙醇酸所需要的混合的有机溶剂的量取决于溶剂负荷度。取决于水相中存在的乙醇酸的量，本领域技术人员能调节用于萃取乙醇酸的混合的有机溶剂的体积。可通过反萃取从有机相中回收乙醇酸。

另一种由乙醇酸铵获得乙醇的方法是在酯化剂存在下的热分解。溶剂可通过保护乙醇酸不与反应性氨反应(由此阻止酰胺形成)起作用，或可作为有机反应性萃取溶剂，由此帮助酸分离(Meng等，US2004/0210087；其全文在此并入作为参考)。任选地，该方法还可包括醇，由此生成酯(其可更多地溶于有机溶剂中)。有机溶剂可选自三烷基叔胺、醇、酰胺、醚、酮、磷酯、氧化膦、硫化膦、烷醚以及它们的组合。然后，在反萃取步骤过程中，从有机溶剂中回收乙醇酸(或相应的酯)。回收的溶剂可再循环到盐裂化反应步骤中。不幸的是，溶剂萃取/反萃取可能有问题，如多种不混溶液体形成难以分离的复杂的物理状态混合物。

醇解(酯化)

乙醇酸铵可与醇反应形成相应的乙醇酸酯。通过酯键水解，乙醇酸酯可转化为乙醇酸和相应的醇。可以化学或酶学方法(即利用酯酶、蛋白酶等)完成水解。水解羧酸酯的方法是本领域众所周知的(见Gurthrie，J.和Cullimore，P.，Can J.Chem.，58(13)：1281-1294和US2004/0138409A1，在此并入作为参考)。

例如，Cockrem(US 6,291,708 B1)教导了快速加热有机酸铵盐与醇的混合物以产生包含酸、酯以及未反应的铵盐的液流。有机酸和/或酯可随后从液体产物流中分离。

或者，共同未决的US临时专利申请US 60/638126提供了一种从包含乙醇酸铵的水溶液获得乙醇酸的方法，包括：

(a)提供

(i)包含乙醇酸铵的水溶液；和

(ii)加热的包含具有以下分子式的醇的醇蒸汽原料流：

R₂-OH

其中R₂是C1-C4直链或支链烷基；和

(iii)反应釜；

(b)在所述反应釜中将所述包含乙醇酸铵的水溶液与所述加热的醇蒸汽原料流接触，由此产生包含乙醇酸酯的第一蒸汽产物流；和

(c)从所述第一蒸汽产物流回收乙醇酸酯。

通过酯键水解，乙醇酸酯可转化为乙醇酸和相应的醇。可以化学或酶学方法(即利用酯酶、蛋白酶等)完成水解。水解羧酸酯的方法是本领域众所周知的(见Gurthrie，J.和Cullimore，P.，Can J.Chem.，58(13)：1281-1294和US2004/0138409A1，在此并入作为参考)。

在一个实施方案中，所述醇选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。在一个优选的实施方案中，所述醇是甲醇。

相对于含水原料流中羧酸铵盐的量，与羧酸铵盐接触的加热的醇蒸汽的量通常是摩尔过量的。加热的醇蒸汽与羧酸铵盐的摩尔比率可以改变，但通常为约5至约300摩尔/摩尔羧酸铵盐(摩尔比率至少约5∶1至约300∶1)，优选约5至约200摩尔/摩尔羧酸铵盐，最优选约20至约100摩尔/摩尔羧酸铵盐。摩尔过量的醇蒸汽倾向于以至酰胺形成。

醇蒸汽原料流(如甲醇)温度一般选择能确保醇通常留在其蒸汽相中的温度，使得醇蒸汽作为酯化剂和解吸气/载气。根据所选择的醇以及具体的装置几何形状，进入反应室的加热的醇蒸汽原料流的温度可改变。加热的醇蒸汽进料作为反应的加热源、酯化剂以及本发明方法所产生的羧酸酯的解吸气/载气。

本发明的实施例举例说明了利用加热的甲醇蒸汽来形成乙醇酸甲酯(其随后水解为乙醇酸)。一般来说，加热的甲醇蒸汽的温度为约140至约350℃。在一个实施方案中，甲醇蒸汽原料流的温度为约170℃至约300℃。在另一个实施方案中，甲醇蒸汽原料流的温度为约230℃至约250℃。

醇解反应器常用的操作温度为约140℃至约300℃，优选约170℃至约200℃。在一方面，所述羧酸铵盐为乙醇酸铵，醇为甲醇。利用了该特定组合的反应器温度通常为约100℃至约300℃，优选约150℃至约250℃，更优选约170℃至约225℃以及最优选约170℃至约200℃。

反应器可任选地包括填充物或高沸点流体/液体以改善期望的羧酸酯的产率。填充或高沸点流体的好处能改善盐水溶液和醇蒸汽之间的接触。填充可以是无规则填充、工程化填充(engineered packing)或不同的蒸馏塔板设计。见Perry′s第7版第14.23-14.61节(Perry′s Chemical Engineers′Handbook，第7版.，Perry，Robert H.，Green，Dow W.，和Maloney，James O.，编；McGraw Hill Companies，Inc.，New York，NY，1997)。气液反应系统的工业化设计图解于Perry′s图23-25、23-26和13.79中。在选定操作条件或容易与所回收的酯分离情况下，应当选择具有低蒸汽压力的高沸点流体。流体可以是对酯化化学反应惰性的(例如矿物油)或可能参与酯化化学反应的，例如聚亚烷基二醇(多元醇)。多元醇是一种分子量大于150并具有至少一个羟基的物质，包括醇类例如癸醇和十二烷醇。常用的多元醇包括聚乙烯醚二醇(PEG)、聚丙烯醚二醇(PPG)和聚四亚甲基醚乙二醇(PTMEG)以及这些聚烷撑醚二醇的共聚物。

电渗析

已提议使用双极性膜电渗析(EDBM)从相应的铵盐回收有机酸。为了让EDBM运行，溶液应当是导电的。对于弱酸的铵盐，EDBM的产物(有机酸和氢氧化铵)是非常弱的导体，造成了溶液高电阻并降低生产率。为弥补其，添加导电盐(即氯化铵)到碱回路(base loop)中(氢氧化铵流)。当碱浓度增加时，氨就从溶液中解吸，而铵盐则再循环以保持电导率。

应仔细监测有机酸铵盐的成分——诸如钙的多价阳离子。这些阳离子通过与羟基缔合能沉淀下来并破坏膜。多价阳离子的浓度为优选低于约5ppm，最优选低于约1ppm。

例如，可建立具有适用于铵盐的膜的通常的实验室规模EDBM系统。首先，建立含有约5wt％氯化铵的再循环碱回路。还建立了大约3M乙醇酸铵的再循环回路。通常的分批试验运行是在约0.5至约1.0kA/m²的恒电流下进行的。保持循环回路约1小时至约5小时。当EDBM进行时，乙醇酸铵回路中的电导率和pH降低了。一般来说，EDBM在应预期将至少约80％的乙醇酸铵转化为乙醇酸的这样的条件下运行。可随后用强阳离子交换树脂或其他方法处理所得到的乙醇酸/乙醇酸铵溶液以达到彻底转化。

聚合

包含羟基的羧酸铵盐可进行缩聚以形成二聚物、低聚物和聚合物，同时释出氨。可使用多种众所周知的技术将所得到的聚合物与反应混合物分离。一旦与反应混合物分离，可通过解聚获得游离酸。

热盐裂化

热分解(“盐裂化”)可用于获得包含乙醇酸的产物(见共同未决的美国临时专利申请US 60/638148；其全文在此并入作为参考)。该方法不需要在热分解基本上无水的乙醇酸铵盐之前添加一种或多种化学药品。热盐裂化可与一种或多种本发明的回收方法结合以进一步分离乙醇酸。

该方法的第一步是从包含乙醇酸铵水溶液的原料流中除去游离水分，以致形成基本上无水的乙醇酸铵盐(在室温(约25℃)下该基本上无水的盐是粘性液体)。从含水反应混合物中除去游离水分的方法是本领域众所周知的，包括但不限于蒸馏、真空蒸馏、冻干和蒸发。

该方法的下一步包括在真空下加热基本上无水的盐至足以热分解铵盐为乙醇酸和氨的温度。所使用的温度应选择以致发生盐热分解，同时使酸分解和/或可产生不需要的副产物例如2-羟乙酰胺的不需要的副反应降至最低的温度。通常在真空(0.5至约385mm Hg绝对压力)下，于约100℃至不超过约140℃的温度，加热基本上无水的乙醇酸铵盐一段足以热分解所述盐为包含乙醇酸的产物的时间。真空用于帮助除去氨。本领域技术人员能确定适合的真空压力。一个常用的真空值的例子为约0.5至约385mm Hg绝对压力。熔融铵盐的热分解可使用任何蒸发器装置，但优选刮膜式蒸发器。

在指定的条件下热分解盐将大部分的熔融乙醇酸铵盐转化为乙醇酸和某些额外的副产物，例如乙交酯(乙醇酸的环状二聚物)、线型多聚形乙醇酸(通常为二聚物，至多五聚物)、线型多聚形乙醇酸的铵盐(通常为二聚物，至多五聚物)和2-羟乙酰胺。本领域技术人员能调节用于热分解乙醇酸铵的条件，以最优化游离乙醇酸的产生，同时使副反应例如产生2-羟乙酰胺减至最少。在热分解过程中产生的氨可回收并再循环。任选地，乙醇酸铵水溶液部分脱氨产生含有明显更少铵离子的脱氨产物。对于后继处理该脱氨产物是特别适合的，因为产生了较少的废物(天然盐)。

除从包含乙醇酸铵的溶液中回收乙醇酸之外，可使用已知技术与腈水解酶催化剂相分离，直接回收包含乙醇酸铵的溶液，所述技术包括但不限于倾析或过滤，以及随后任选地蒸馏滤液中的水而浓缩。

申请特别并入所有在本文中引用的参考文献的全文内容。此外，当给出数量、浓度或其他值或参数的范围、优选的范围，或一列更可取的上限值和下限值时，很清楚所明确披露的所有范围由任何一对的任意上限值或优选值和任意下限值或优选值形成，与范围是否是分别披露的无关。对于本文所列的数值范围，除非另作说明，该范围规定为包括其端点，以及在该范围内的所有整数和分数。当定义范围时，并不意图将本发明的范围限制在所列的特定值。

一般方法

适合于细菌培养物保持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。适用于以下实施例中的技术可见于如Manual of Methods for General Bacteriology(1994)(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，编.)，American Society for Microbiology，Washington，DC.)或Thomas D.Brock，in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology.(1989)第2版，(Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)所述的。

基因组DNA制备、PCR扩增、通过核酸内切酶和核酸外切酶产生期望的末端用于DNA克隆的DNA修饰、连接和细菌转化所需要的操作是本领域众所周知的。在此使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并描述于Maniatis，同上；和T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions.(1984)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，NY；and by Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology.(1994-1998)John Wiley &Sons，Inc.，New York。

说明书中相应于度量单位、技术、特性或化合物的缩写如下：“sec”或“s”表示秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“d”表示天，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“μmol”表示微摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“wt”表示重量，“wt％”表示重量百分数，“g”表示克，“μg”表示微克，“L”表示升，“mL”表示毫升，“μL”表示微升，“kb”表示千碱基对，“kDa”表示千道尔顿，“HPLC”表示高效液相色谱，“OD”表示在指定波长下的光密度，“nm”表示纳米，“rpm”表示每分钟转数，“SDS-PAGE”表示十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，“dcw”表示细胞干重，“U”表示腈水解酶活性单位，“GLA”表示乙醇酸或相应的铵盐，“NH₄GLA”表示乙醇酸铵，“GLN”表示乙醇腈，“Rxn”表示反应，“mMGLA/h”是以mM GLA/小时测定的初始反应速率，“ca.”表示大约，“HCN”表示氰化氢以及“HCHO”表示甲醛。

实施例1

构建高拷贝腈水解酶表达质粒

合成的寡核苷酸引物

165

(5′-CGACTGCAGTAAGGAGGAATAGGACATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTC-3′；SEQ lD NO：1)和

166

(5′-TGATCTAGAGCTTGGAGAATAAAGGGGAAGACCAGAGATG-3′；SEQ ID NO：2)(其分别掺入了PstI和XbaI限制酶切位点(下划线))用于PCR扩增来自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)基因组DNA(SEQ ID NO：5)的腈水解酶基因。

典型的PCR参数如下：

步骤1：在95℃下5分钟

步骤2：在95℃下0.5分钟(变性)

步骤3：在55℃下0.5分钟(退火)

步骤4：在74℃下1分钟(延伸)

步骤2-4重复25个循环。

PCR试剂为Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)所提供，并如其所推荐的使用该PCR试剂。

来自天然敏捷食酸菌72W序列的唯一改变是一种第一个核苷酸由G改变为A以利于在大肠杆菌中表达的改变。在这样的操作中，将腈水解酶基因的起始密码子由天然的GTG改变为ATG。因此，相应的腈水解酶蛋白的第一个氨基酸由天然的缬氨酸改变为甲硫氨酸(SEQ ID NO：6)。寡核苷酸引物165还导入了核糖体结合位点(粗体)和密码子(TAG)以终止在腈水解酶开始翻译之前的lacZ翻译。用PstI和XbaI消化PCR产物，并克隆入用PstI和XbaI消化的pUC19(

L09137；NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.)中以产生称为pSW138的质粒。

实施例2

在大肠杆菌中表达活性腈水解酶

质粒pSW138用于转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)和大肠杆菌FM5(ATCC 53911)以产生两株菌株，分别称为(1)MG1655/pSW138和(2)FM5/pSW138。如前所述，对每株菌株进行培养、诱导、收获并测定腈水解酶活性(将乙醇腈转化为乙醇酸)。每一菌株重复6次。

1.细菌培养

在37℃下，摇动(200rpm)16-18小时，于补充有氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基培养菌株接种物。

2.腈水解酶表达的诱导

将足量的接种物添加到新鲜的补充有氨苄青霉素(50mg/L)和IPTG(1mM)的LB培养基中以给出大约0.1的起始OD(600nm)。在37℃下摇动(200rpm)约6-8小时温育培养物。

3.细菌收获

通过离心收获细菌细胞，尽可能地除去液体，并将细胞沉淀冻在-70℃下。

4.测定腈水解酶活性

向带有微型搅拌棒的20-mL温控(25℃)玻璃闪烁管添加3.0mL底物溶液(0.667M乙醇腈；TCI)和1.0mL细胞悬浮液(400mg细胞湿重/mL，在100mM焦磷酸钠pH 6.0中，1μg/mL脱氧核糖核酸酶)。乙醇腈终浓度为500mM，细胞终浓度为100mg/mL。在5、10、15、30、45和60分钟时取出样品(100μL)并将其添加到分析混合物(100μL去离子水，3μL 6.0N HCL，200μL 200mM丙醇)中，然后涡旋并离心。通过HPLC(HPX 87H柱，30cm x 7.8mm；0.01N H₂SO₄流动相；在50℃下流速1.0mL/min；10-μL注射体积；20分钟分析时间)分析所得到的上清液的乙醇腈(GLN)和乙醇酸(GLA)。对微波干燥的双份样品测定细胞干重(dcw)。腈水解酶活性记录为U/g dcw，其中在25℃下在1分钟内，1单位(U)转化1μmol GLN为GLA(表1)。

表1

菌株腈水解酶活性(U/g dcw)

MG1655/Psw138 22.1

FM5/Psw138 3.3

实施例3

通过易错聚合酶链式反应构建敏捷食酸菌72W腈水解酶随机诱变文库

根据厂商使用说明(Gentra Systems，Minneapolis，MN)，使用DNA分离试剂盒由敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)制备基因组DNA。根据

PCR诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)提供的使用说明，对敏捷食酸菌72W腈水解酶基因(编码序列；SEQ IDNO：5)进行易错PCR，使用标识为SEQ ID NO：3(5′-GCGCATATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCC-3′)和SEQ ID NO：4(5′-ATAGGATCCTTATGGCTACTTTGCTGGGACCG-3′)的引物。使用推荐产生低突变频率(0-3次突变/kb)和中等突变频率(3-7次突变/kb)的反应条件。根据pTrcHis2

TA表达试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的使用说明，将10％的1.1kb PCR产物连接入表达载体pTrcHis2

中。根据供应厂商(Invitrogen)的推荐，将一半的连接混合物转化到大肠杆菌TOP10中。将1％的转化混合物涂布(plated)在补充有50mg/L氨苄青霉素的LB平板上。所得到的转化体共计200-400个克隆，表明所产生的总PCR产物能产生400,000-800,000个克隆，远多于筛选改善的酶活性所需的。通过随机选择的克隆样品的核苷酸序列分析证实了突变频率。如所预计的，序列分析也证实了大约50％的插入物是以正向存在。SDS-PAGE分析证实了当如推荐的进行生长和诱导时(Invitrogen)，基本上所有的克隆都具有表达约41kD腈水解酶蛋白质的正向插入物。

此外，通过标准的PCR扩增了敏捷食酸菌72W腈水解酶基因，使用标识为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，并根据厂商推荐，将所得到的DNA产物克隆入pTrcHis2-

(Invitrogen)中，以产生质粒pNM18。用pNM18转化大肠杆菌TOP10或大肠杆菌FM5(ATCC 53911)产生的菌株用作为各自的对照。除起始密码子由GTG改变为ATG利于在大肠杆菌中表达之外，pNM18中的敏捷食酸菌72W腈水解酶“对照”序列(SEQ ID NO：5)和野生型敏捷食酸菌72W的编码序列相同。

实施例4

对敏捷食酸菌72W腈水解酶随机诱变文库筛选增加的腈水解酶活性

将来自低突变频率易错PCR文库(如实施例3中所述构建的)的大约10,000个克隆涂布在补充有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂上。使用机器人技术在96-孔微量滴定板中进行高通量筛选。在单个克隆于补充有50mg/L氨苄青霉素和1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的液体LB中在37℃下，200rpm摇动培养18h后，培养物在37℃下补充50mM乙醇腈(GLN)持续1h，80Hz线性振荡。通过滤出细菌细胞终止反应，并将待分析的上清液密封在微量滴定板中并贮藏在4℃直至分析。

通过大气压化学电离(APCI)质谱法测定产生的乙醇酸(GLA)，在单离子模式中以阴离子模式监测M-H离子，m/z 75。所用的质谱仪是Micromass(Waters)Quattro Ultima三级四级(triple quad)式质谱仪，具有以下设定：离子源温度＝150℃，探头温度＝300℃，锥孔气＝80L/hr，脱溶剂气＝700-800L/hr，锥孔电压＝35V，电晕电压＝20mA，倍增器＝600V，采样时间＝0.1s，信道间延迟时间＝0.02s。流动相为50/50MeOH/H₂O，每针3.5mL/min，在注入质谱仪之前具有1∶5的洗脱液稀释，使用了LC Packings Acurate分流器。通过Gilson 215自动取样器递送样品，所述Gilson 215自动取样器带有将30mL样品注射到5-mL进样回路中的889次连续注射的8-阀组。Hudson Plate Crane XT平板操作机器人将平板递送至Gilson自动取样器的搁板上。在每8次一组的注射之间，用相同的溶剂以5mL/min洗涤针头和注射口。通过该方法，鉴定并分离了7株具有增加的腈水解酶活性的菌株。

实施例5

鉴定赋予增加的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶中的突变

核苷酸序列分析用于鉴定存在于如实施例4所述分离的7株TOP10突变体菌株的腈水解酶基因中的任何突变，并推断相应的氨基酸改变。所有7株菌株显示了带有单个氨基酸改变的相同的腈水解酶序列(SEQID NO：8)，第201位的Leu改变为GIn(L201Q)，在质粒中称为pNM18-201Q。该改变对通过SDS-PAGE分析所测定的腈水解酶蛋白产生没有可检测到的影响(与天然酶相比)。

实施例6

腈水解酶氨基酸残基第201位饱和诱变

根据厂商使用说明，使用简并寡核苷酸以及

位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La JoIIa，CA)构建敏捷食酸菌72W腈水解酶氨基酸残基第201位饱和诱变文库。如前所述(实施例4)，该文库筛选出大约500个具有增加的腈水解酶活性的成员。核苷酸测序分析用于确定第201位处赋予增加的腈水解酶活性的任何氨基酸改变。除L201Q(SEQ IDNO：8)之外，通过筛选鉴定了以下赋予增加的腈水解酶活性的突变：L201G(SEQ ID NO：16)、L201H(SEQ ID NO：18)、L201K(SEQ ID NO：20)、L201N(SEQ ID NO：22)、L201S(SEQ ID NO：24)、L201A(SEQ IDNO：10)、L201C(SEQ ID NO：12)和L201T(SEQ ID NO：14)，在质粒中分别称为pNM18-201G、pNM18-201H、pNM18-201K、pNM18-201N、pNM18-201S、pNM18-201A、pNM18-201C和pNM18-201T。

实施例7

敏捷食酸菌72W腈水解酶催化域的定向饱和诱变

在增加对2-羟基腈即产生乙醇酸的腈水解酶活性的尝试中，我们假设敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：6)中的催化域可以是适合于突变的区域。

根据厂商使用说明，使用简并寡核苷酸以及

位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La JoIIa，CA)完成敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEO ID NO：6)催化域(160G 161G 162L 163N 164C 165W 166E 167H168F 169Q 170P 171L 172S 173K)中在已知的细菌腈水解酶之间那些并不完全保守的残基(下划线)的饱和诱变。具体来说，构建9个小文库(500-1000个克隆)，一个文库对应一个靶向的活性位点残基(上述下划线的)。如前所述对这些文库筛选增加的腈水解酶活性。核苷酸测序分析用于确定赋予增加的腈水解酶活性的任何氨基酸改变。鉴定了以下赋予增加的腈水解酶活性的改变：F168K(SEQ ID NO：26)、F168M(SEQ ID NO：28)、F168T(SEQ ID NO：30)和F168V(SEQ ID NO：32)，在质粒中分别称为pNM18-168K、pNM18-168M、pNM18-168T和pNM 18-168V。

实施例8

构建MG1655/pSW138-168K、MG1655/pSW138-168M、 MG1655/PSW138-168T、MG1655/pSW138-168V、 MG1655/pSW138-201Q、MG1655/PSW138-201G、 MG1655/pSW138-201H、MG1655/pSW138-201K、MG1655/PSW138-201N 和MG1655/pSW138-201S

用EcoRl切割质粒pNM18-168K、pNM18-168M、pNM18-168T、pNM18-168V、pNM18-201Q、pNM18-201G、pNM18-201H、pNM18-201K、pNM18-201N和pNM18-201S中的每一个，并将较小的EcoRI片段(907bp)亚克隆入也已用EcoRI切割的质粒pSW138(描述于实施例1中)中，以分别产生质粒pSW138-168K、pSW138-168M、pSW138-168T、pSW138-168V、pSW138-201Q、pSW138-201G、pSW138-201H、pSW138-201K、pSW138-201N和pSW138-201S。将质粒pSW138-168K、pSW138-168M、pSW138-168T、pSW138-168V、pSW138-201Q、pSW138-201G、pSW138-201H、pSW138-201K、pSW138-201N和pSW138-201S中的每一个用于转化大肠杆菌MG1655以分别产生菌株MG1655/pSW138-168K、MG1655/pSW138-168Mz、MG1655/pSW138-168T、MG1655/pSW138-168V、MG1655/pSW138-201Q、MG 1655/pSW138-201G、MG1655/pSW138-201H、MG1655/pSW138-201K、MG1655/pSW138-201N和MG1655/pSW138-201S。

实施例9

通过10升发酵产生的突变体的腈水解酶活性

在发酵罐接种之前，于30℃在补充有0.1mg氨苄青霉素/mL的500mL LB培养基中摇动(300rpm)培养大肠杆菌种子培养物6-10h(OD₅₅₀＝1-2)。

在14-L Braun Biostat C发酵罐(B.Braun Biotech International Gmbh，Melsungen，Germany)中培养腈水解酶菌株，使用了含有葡萄糖、氨和盐的矿质培养基。IPTG(对于基于FM5/pNM18的菌株)或乳糖(对于基于MG1655/pSW138的菌株)用于诱导。

预杀菌发酵罐培养基(7.5L)描述于表2中。杀菌后添加剂包括过滤灭菌的微量元素(表3)、0.1mg氨苄青霉素/mL、2g酪蛋白氨基酸(Difco)/L、4g葡萄糖/L和500mL种子培养物。

发酵设定值描述于表4中。NH₄OH(40％w/v)和H₂PO₄(20％w/v)用于pH控制。溶解氧浓度控制在25％的空气，所述空气首先搅拌以增加需氧量并接着通气饱和。IPTG诱导和乳糖诱导所使用的发酵进料方案分别在表5和6中给出。如果葡萄糖蓄积超过5g/L，则降低葡萄糖进料速度。对于基于FM5/pNM18的菌株，在OD₅₅₀＝20-30下添加IPTG到0.5mM。在40-56hrs后，将细胞冷却至5-10℃并通过离心收获。如(实施例2)所述测定腈水解酶活性，结果示于表7。

表2.发酵培养基，预杀菌

(NH₄)₂SO₄	5.0g/L
		K₂HPO₄	4.0g/L
KH₂PO₄	3.5g/L
		MgSO₄ ^＊7H₂O	0.6g/L
柠檬酸三钠^＊2H₂O	1.0g/L
		NZ Amine AS(Quest)	2.5g/L
消泡剂-Biospumex 153K	0.25ml/L

表3.发酵微量元素

	浓度
		柠檬酸	10g/L
CaCl₂ ^＊2H₂O	1.5g/L
		FeSO₄ ^＊7H₂O	5g/L
ZnSO₄ ^＊7H₂O	0.39g/L
		CuSO₄ ^＊5H₂O	0.38g/L
CoCl₂ ^＊6H₂O	0.2g/L
		MnCl₂ ^＊4H₂O	0.3g/L

表4.发酵设定值

表5.IPTG诱导所使用的发酵进料方案

表6.乳糖诱导所使用的发酵进料方案

表7.在10升发酵罐中培养的突变体的腈水解酶活性

实施例10

测定大肠杆菌TOP10/pNM18、大肠杆菌TOP10/pNM18-201A、大肠杆菌TOP10/pNM18-201C和大肠杆菌TOP10/pNM128-201T的腈水解酶活性(摇瓶)

将10mL过夜培养物(LB+50μg/mL氨苄青霉素，37℃摇动)添加到200mL(LB+50ug/ml氨苄青霉素+1mM IPTG)中，并在37℃下摇动温育4-5hrs(最终OD600大约2.0)，一式两份。在4℃下通过离心收集细胞并贮藏冷冻在-80℃下。

向配备有磁性搅拌棒的4-mL玻璃瓶中添加1.0mL 1.0M乙醇腈水溶液，并在温控水浴中将玻璃瓶及其内容物平衡至25℃。搅拌的同时，将预平衡至25℃的含有40-100mg湿细胞糊的1.0mL 0.100M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)添加到玻璃瓶中(最终[GLN]＝0.5M)。在预定时间取出样品(0.100mL)并与包含0.100mL水、0.020mL 6.0N乙酸和0.200mL 0.20M丁酸钠水溶液的溶液(HPLC外标)混合。离心所得到的混合物，并通过HPLC分析所得到的上清液的乙醇酸，使用了

(Sigma AldrichCorp.)LC-18-DB柱(15cm X 4.6mm)；流动相：10mM醋酸钠水溶液(NaOAc)，10mM醋酸(AcOH)，7.5％(v/v)甲醇。测定每一细胞糊的细胞干重(dcw)并用于计算细胞特异性腈水解酶活性。表8概述了与天然腈水解酶相比，腈水解酶突变体的腈水解酶活性增加了。

表8.相对于对照突变体L201A、L201C和L201T的腈水解酶活性(摇瓶)

实施例11

制备固定的大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)

大肠杆菌菌株SS1001(ATCC PTA-1177)是一种表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的转化的大肠杆菌菌株(US 6,870,038；在此并入作为参考)。与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO：5)相比，重组表达的(大肠杆菌SS 1001)腈水解酶(SEQ ID NOs：37-38)的编码序列含有2个小的序列改变。起始密码子由GTG改变为ATG以利于重组表达，并且在克隆过程中导入引起邻近C-末端的单个氨基酸改变的人工序列(Pro367[CCA]→Ser[TCA]).

如前所述在10-L发酵罐中培养该菌株(见US 10/919182的实施例8)，以及细胞糊(乙醇腈(GLN))用于如下将GLN转化为乙醇酸(GLA)的处理中。

首先，按照以下步骤将大肠杆菌SS 1001细胞固定在角叉菜胶珠子中(固定的大肠杆菌SS 1001)。在50℃下将9g角叉菜胶(FMC GP911；FMC Corp.，Philadelphia，PA)缓慢地添加到快速搅拌的231g去离子水中，将所得到的混合物加热至80℃，直至角叉菜胶完全溶解，然后将所得到的溶液搅拌冷却至47℃。在配备有搅拌棒的独立烧杯中，在约25℃下将75.9g冷冻的大肠杆菌SS1001细胞(39.53％dcw)添加到84.1g 0.35M Na₂HPO₄(pH 7.3)中并混合直至细胞悬浮，然后添加脱氧核糖核酸酶I溶液(10μL 12,500U/mL脱氧核糖核酸酶(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)/100mL细胞悬浮液)。在添加角叉菜胶溶液之前，立刻搅拌加热细胞悬浮液至45-46℃。在47℃下将160.0g大肠杆菌SS1001细胞悬浮液添加到搅拌的47℃的角叉菜胶溶液中，并在47℃下将所得到的细胞/角叉菜胶悬浮液经由电热的20标准规格的针头泵出，并在室温下(约21-22℃)滴入搅拌的0.25M KHCO₃(pH＝7.3)中；通过针头的流速设定在5-8mL/min。进行1h的搅拌，使所得到的珠子变硬，并贮藏在0.25MKHCO₃(pH 7.3)中。通过添加0.5g 25％戊二醛(GA)水溶液(Sigma M752-07)到悬浮在48mL 0.25M KHCO₃(pH 7.3)中的20g珠子上，并在室温下搅拌1h，进行珠子的化学交联。然后，向珠子的悬浮液添加2.0g12.5wt％聚氮丙啶水溶液(PEI，BASF LUPASOL PS；BASFAktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany)，然后在室温下再混合1h。在5℃下将GA/PEI-交联的珠子贮藏在1.0M NH₄HCO₃(pH 7.3)中。

GLN生物催化转化为GLA继之以HPLC。将等分物(0.2mL)的反应混合物添加到0.01mL 6M HCL和0.8mL 0.25M正丙醇水溶液(HPLC外标)中，并通过HPLC(HPX 87H柱(Bio-Rad，Hercules，CA)，30cm x 7.8mm；0.01N H₂SO₄流动相；在50℃下流速1.0mL/min；10μL注射体积；折光率(Rl)检测器，20分钟分析时间)分析GLN和GLA。GA/PEI-交联的角叉菜胶/7.5％(dcw)大肠杆菌SS1001珠子的腈水解酶活性为约12U/g珠子，其中在25℃下在1分钟内，1单位(U)转化1μmol GLN为GLA。

实施例12

1M乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g大肠杆菌SS 1001珠子(实施例11)、13.73mL去离子水、0.4mL 5M NH₄GLA和1.87mLGLN(约52wt％水溶液(TCI))，0.89M GLN终浓度，pH调节至pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，倾析产物溶液，并添加14.13mL去离子水和1.87mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 7.6，重复生物催化剂再循环。在第一生物催化剂再循环下NH₄GLA合成的初始速率为143mM/h。相对于再循环次数，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少示于表9(“1M”)。

实施例13

大约3M乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g大肠杆菌SS1001珠子(实施例11)、6.39mL去离子水、4mL 1M KHCO₃和5.61mL GLN(约52wt％水溶液(TCI))，2.68M GLN终浓度，pH调节至pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，倾析产物溶液，并添加6.39mL去离子水、4mL 1M KHCO₃和5.61mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH7.6，重复生物催化剂再循环。在第一生物催化剂再循环下NH₄GLA合成的初始速率为207mM/h。相对于再循环次数，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少示于表9(“3M”)。

实施例14

以大约1M增量(1M+1M+1M)添加大约3M乙醇腈以产生乙醇酸铵 (NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g大肠杆菌SS 1001珠子(实施例11)、8.13mL去离子水、4mL 1M KHCO₃和1.87mL GLN(约52wt％水溶液(TCI))，0.89M GLN，pH调节至pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，添加第二部分的1.87mL GLN，pH调节至pH7.6，并当所有GLN被消耗时，添加第三部分的1.87mL GLN，pH调节至pH 7.6，完成反应产生了大约3M NH₄GLA溶液。倾析产物溶液，并添加8.13mL去离子水、4mL 1M KHCO₃和1.87mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 7.6，继续完成GLN转化，以及GLN、水和缓冲液的添加，pH调节和完成GLN转化被重复两次更多以结束再循环(GLN在三次大约1M增量中逐步转化)，重复生物催化剂再循环。在第一再循环中(每次再循环三个约1M GLN部分)的第一1M GLN溶液中NH₄GLA合成的初始速率为155mM/h。相对于再循环次数，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少示于表9(“(1M+1M+1M)＝3M”)。

实施例15

连续添加乙醇腈(GLN)至0.2M GLN以产生乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g大肠杆菌SS 1001珠子(实施例11)、8mL去离子水、4mL 1M KHCO₃和0.4mL GLN(约52wt％水溶液(TCI))，pH调节至pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，以GLN消耗速率连续添加GLN溶液至3M GLN，以保持GLN浓度约0.2M，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，倾析产物溶液，并添加8mL去离子水、4mL 1MKHCO₃和0.4mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 7.6，并以GLN消耗速率添加GLN至3M GLN，重复新的生物催化剂再循环。对于第一生物催化剂再循环(每次再循环3M GLN总量)，NH₄GLA合成的初始速率为144mM/h。相对于再循环次数，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少示于表9(“0.2M连续”)。

表9.在3M GLN、1M GLN、以三个1M增量添加3M GLN以及以0.2M GLN开始连续添加GLN下，相对于再循环次数，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少(nd＝未测定).

实施例16

制备包含不同交联度的GA/PEI-交联的角叉菜胶/大肠杆菌 FM5/pNM18-210A珠子

来自质粒pTrcHis2-

的表达腈水解酶突变体210AIa(SEQ IDNO：34)的质粒pNM18-210A用于转化大肠杆菌FM5，以产生称为FM5/pNM18-210A的菌株。如前所述在10-L发酵罐中培养该菌株(见US10/919182的实施例8；在此并入作为参考)，并将细胞糊用于如下将GLN转化为乙醇酸(GLA)的处理中。

首先，按照以下步骤将大肠杆菌FM5/pNM18-210A细胞固定在角叉菜胶珠子中。在50℃下将12g角叉菜胶(FMC GP911)缓慢地添加到快速搅拌的228g去离子水中，将所得到的混合物加热至80℃，直至角叉菜胶完全溶解，然后将所得到的溶液搅拌冷却至52℃。在配备有搅拌棒的独立烧杯中，在约25℃下将74.9g冷冻的大肠杆菌FM5/pNM18-210A细胞(26.7％dcw)添加到85.1g 0.35M Na₂HPO₄(pH7.3)中并混合直至细胞悬浮，然后添加脱氧核糖核酸酶I溶液(10μL12,500U/mL脱氧核糖核酸酶(Sigma)/100mL细胞悬浮液)。细胞悬浮液连续过滤通过230微米和140微米的Nupro TF滤网组件过滤器，并在添加角叉菜胶溶液之前，立刻搅拌加热至50℃。在50℃下将160.0g大肠杆菌FM5/pNM18-210A细胞悬浮液添加到搅拌的52℃的角叉菜胶溶液中，并在47℃下将所得到的细胞/角叉菜胶悬浮液经由电热的20标准规格的针头泵出，并在室温下(约21-22℃)滴入搅拌的0.25MKHCO₃(pH＝7.3)中；通过针头的流速设定在5-8mL/min。进行1h的搅拌，使所得到的珠子变硬，并贮藏在0.25M KHCO₃(pH 7.3)中。通过添加0.5g(在下文中称为“生物催化剂1”)或2.0g(在下文中称为“生物催化剂2”)25％戊二醛(GA)水溶液(Sigma M 752-07)到悬浮在48mL 0.25MKHCO₃(pH 7.3)中的20g珠子上，并在室温下搅拌1h，进行珠子的化学交联。然后，向珠子的悬浮液添加2.0g(生物催化剂1)或4.0g(生物催化剂2)12.5wt％聚氮丙啶水溶液(PEI，BASF LUPASOL PS)，然后在室温下再混合18h。在5℃下将GA/PEI-交联的珠子贮藏在1.0M NH₄HCO₃(pH 7.3)中。

GLN生物催化转化为GLA继之以HPLC。将等分物(0.2mL)的反应混合物添加到0.01mL 6M HCL和0.8mL 0.25M正丙醇水溶液(HPLC外标)中，并通过HPLC(HPX 87H柱，30cm x 7.8mm；0.01N H₂SO₄流动相；在50℃下流速1.0mL/min；10μL注射体积；Rl检测器，20分钟分析时间)分析GLN和GLA。对于生物催化剂1和生物催化剂2，GA/PEI-交联的角叉菜胶/5％(dcw)大肠杆菌FM5/pNM18-210A珠子的腈水解酶活性为约13U/g珠子，其中在25℃下在1分钟内，1单位(U)转化1μmol GLN为GLA。

实施例17(比较)

在空气中无添加剂下，乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g生物催化剂1、12.42mL去离子水、0.5mL 4M NH₄GLA和1.78mL GLN(约52wt％水溶液(Fluka))，1M GLN终浓度，pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，添加第二部分的1.78mL GLN，用氢氧化铵调节pH至pH 7.6，当所有的GLN都被消耗时，添加第三部分的1.78mL GLN，pH调节至pH7.6，完成反应产生3.1M NH₄GLA溶液。倾析产物溶液，并添加12.42mL去离子水和1.78mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 7.6，继续完成GLN转化，以及GLN添加、pH调节和完成GLN转化被重复两次更多以结束再循环(GLN在三次1M增量中逐步转化)，重复生物催化剂再循环。相对于再循环次数，对于在再循环中第一1M GLN溶液的转化，初始速率的百分数减少示于表10(再循环反应是反应2-8)。

实施例18

在无氧环境中无添加剂下，乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

在氮气下，向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g生物催化剂1、12.42mL去离子水、0.5mL 4M NH₄GLA和1.78mL GLN(约52wt％水溶液(Fluka))，1M GLN终浓度，pH 7.6，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，添加1.78mL GLN和0.2mL水，用氢氧化铵调节pH至pH 7.6，当所有的GLN都被消耗时，添加第三部分的1.78mL GLN和0.2mL去离子水，pH调节至pH 7.6，完成反应，产生3.1M NH₄GLA溶液。倾析产物溶液，并添加12.62mL去离子水和1.78mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 7.6，继续完成GLN转化，以及1.78mL GLN和0.2mL去离子水的添加、pH调节和完成GLN转化被重复两次更多以结束再循环(GLN在三次增量中逐步转化)，重复生物催化剂再循环。相对于再循环反应次数，对于在再循环反应中第一1M GLN溶液的转化，初始速率的百分数减少示于表10(再循环反应是反应2-8)。

实施例19

在无氧环境中在硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐存在下，乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

除代替12.42mL去离子水，添加12.22mL去离子水和0.2mL 1M添加剂(硫代硫酸钾，K₂S₂O₃或连二亚硫酸钠，K₂S₂O₄，)水溶液以起始再循环，以及在每次添加1.78mL GLN同时，代替0.2mL水，添加0.2mL1M添加剂水溶液到反应釜中之外，如实施例18所述进行生物催化剂再循环。相对于再循环次数，对于在再循环中第一1M GLN溶液的转化，初始速率的百分数减少示于表10(再循环反应是反应2-8)。

表10.在氮气下添加硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐到反应中之后、或对于在氮气或空气下无添加剂的GLN转化，相对于再循环反应次数，对于在再循环反应(每次再循环3M GLN总量)中第一1M GLN溶液的转化，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少(nd＝未测定)。

实施例20

在pH 6.0下在空气中无添加剂下，乙醇腈(GLN) 转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向带高架搅拌的50-mL夹套式反应釜进料4g生物催化剂1、12.42mL去离子水、0.5mL 4M NH₄GLA和1.78mL GLN(约52wt％水溶液(Fluka))，1M GLN终浓度，pH 6.0，在25℃下搅拌混合物，并将0.2mL等分物取出进行通过HPLC的反应处理。当所有的GLN转化为NH₄GLA时，添加第二部分的1.78mL GLN，用氢氧化铵调节pH至pH 6.0，当所有的GLN都被消耗时，添加第三部分的1.78mL GLN，pH调节至pH6.0，完成反应产生3.1M NH₄GLA溶液。倾析产物溶液，并添加12.42mL去离子水和1.78mL GLN到生物催化剂中，pH调节至pH 6.0，继续完成GLN转化，以及GLN添加、pH调节和完成GLN转化被重复两次更多以结束再循环反应(GLN在三次增量中逐步转化)，重复生物催化剂再循环。对于生物催化剂1，相对于再循环反应次数，在再循环反应中第一1M GLN溶液的转化初始速率的减少示于表11(再循环反应是反应2-4)。

表11.对于生物催化剂1，在pH 6.0下，相对于再循环反应次数，对于在再循环反应中(每次再循环3M GLN总量)第一1M GLN溶液的转化，NH₄GLA合成初始速率的百分数减少。

实施例21

在不同的反应pHs下，利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌MG1655/pSW138细胞，乙醇腈(GLN)转化为乙醇酸铵(NH ₄ GLA)

向配备有高架搅拌和温度控制的50-mL夹套式反应釜进料4gGA/PEI-交联的角叉菜胶珠子(使用如实施例11所述方法制备的)，用72mL 0.1M NH₄GLA(pH 7.0)洗涤两次，每次15分钟)，所述珠子含有表达敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：6)的5％(dcw)大肠杆菌MG1655/pSW138。然后，向反应釜添加10.88g蒸馏水和2.98mL 4.0MNH₄GLA(pH 7.5)，适量的70wt％乙醇酸(GLA)(Aldrich)或1∶4稀释的氢氧化铵水溶液(28-30wt％)(表12)，并用氮气吹扫反应釜。混合物在25℃下搅拌，并在pH 4.0、4.7、5.5、6.7或7.5下添加2.15mL 49.88wt％乙醇腈(GLN)水溶液(2.25g，19.6mmol(Fluka))以产生1M GLN(表13)。

在添加GLN后，在预定时间取出四份0.100-mL反应样品，并通过HPLC分析以测定初始反应速率。在每一pH下，作为重复两次操作的速率平均值的初始反应速率列于表13。

表12.70wt％乙醇酸水溶液(GLA)或1∶4稀释的28-30wt％氢氧化铵(NH₄OH)水溶液用于制备所示pH的反应溶液的量。

表13.在不同的pHs下，利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌MG1655/pSW138细胞，GLN转化为NH₄GLA的初始反应速率(重复两次反应的平均值)。

实施例22

在存在或不存在氰化氢(HCN)下，利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌FM5/pNM18，乙醇腈水解为乙醇酸铵

向配备有高架搅拌和温度控制的50-mL夹套式反应釜进料4gGA/PEI-交联的角叉菜胶珠子(使用实施例11所述方法制备的)，用72mL0.1M NH₄GLA(pH 7.0)洗涤两次，每次15分钟)，所述珠子含有表达敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：6)的5％(dcw)大肠杆菌FM5/pNM18。然后，向反应釜添加10.9g蒸馏水和3.0mL 4.0M NH₄GLA(pH 7.5)，并用氮气吹扫反应釜。混合物在25℃下搅拌，并添加含有或不含有0.063mL 50wt％HCN水溶液(0.054g，1mmol)的第一等分物的1.777mL 60.51wt％乙醇腈(GLN)水溶液(1.885g，20.0mmol(Fluka，再蒸馏的))，接着马上添加0.320mL 1∶16稀释的氢氧化铵(28-30wt％)水溶液。在第一GLN添加后，在预定时间取出四份0.100-mL反应样品，并通过HPLC分析以测定初始反应速率。在GLN转化完成之时，添加第二等分物的GLN和氢氧化铵以保持GLN浓度≤1M，pH在7.0-7.5，并在GLN转化完成后，添加第三等分物的GLN和氢氧化铵。在反应完成之时，GLN 100％转化产生乙醇酸(作为铵盐)，产率＞99％，通过添加GLN所产生的乙醇酸铵的浓度为大约2.5M(3.0M总乙醇酸铵，包括初始的乙醇酸铵缓冲液，最终反应体积为约23.7mL)。

在第一反应结束之时，从催化剂中倾析出含水产物混合物(在氮气下)到反应釜中，然后添加13.9mL蒸馏的去离子水，以及通过添加等分物的含水GLN并如上所述马上添加氢氧化铵，在25℃下进行第二反应。对于具有催化剂再循环的连续分批反应，初始反应速率列于表14(再循环反应是反应2-9)。

表14.在存在或不存在HCN下，利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌FM5/pNM18，在具有催化剂再循环的连续分批反应中GLN转化为GLA的初始反应速率。

实施例24

在利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌FM5/pNM18水解乙醇腈为乙醇酸铵的连续分批反应中，添加甲醛或氰化氢的影响

除每一等分物的1.777mL 60.51wt％乙醇腈(GLN)水溶液(1.885g，20.0mmol(Fluka，再蒸馏的))含有0.074mL 37wt％HCHO水溶液(0.081g，1mmol)(再循环1、2、3和6)或0.063mL 50wt％HCN水溶液(0.054g，1mmol)(再循环4、5和7)之外，如实施例23不添加HCN的反应所述，运行反应，进行鉴定并再循环生物催化剂(表15)。重复来自表14的不添加HCHO或HCN的反应数据用于比较。

表15.在添加HCHO(反应1、2、3和6)或HCN(反应4、5和7)的相同反应系列以及不添加HCHO或HCN下，利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大肠杆菌FM5/pNM18，在具有催化剂再循环的连续分批反应中GLN转化为GLA的初始反应速率。

实施例25

利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体L201Q的大肠杆菌 FM5/pNM18-L201Q细胞，乙醇腈水解为乙醇酸铵

向50-mL离心管装入利用6g表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体L201Q(SEQ ID NO：8)的大肠杆菌FM5/pNM18-L201Q获得的1.25mL均匀悬浮液，并添加7.54mL 0.35M Na₂HPO₄(pH 7.5)、35mL 0.35MNa2HPO₄(pH 7.5)，在5000rpm下离心管子20分钟，仔细并完全地从细胞糊中除去上清液，将935mg离心的细胞糊转移到配备有高架搅拌和温度控制的150-mL夹套式反应釜中。然后，向反应釜添加52.54mL0.3M NH₄GLA(pH 7.5)、7.88mL 4.0M NH₄GLA(pH 7.5)和9.63mL蒸馏水，并用氮气吹扫反应釜。在25℃下搅拌混合物，添加7.82mL 54.61wt％乙醇腈(GLN)水溶液(8.18g，78.3mmol(Fluka))，用1∶4稀释的氢氧化铵(28-30wt％)水溶液调节pH至pH 7.5。为测定初始反应速率，在第一GLN添加之后，在预定时间取出四份0.050-mL反应样品，添加到分析混合物(0.025mL 6.0N HCL和0.800mL 0.18M正丙醇)中，涡旋，在12,000rpm下离心6分钟，并如实施例2所述通过HPLC分析上清液。在GLN转化完成之时，添加第二等分物的GLN，用氢氧化铵调节pH至7.5，并在GLN转化完成后，添加第三GLN等分物，并调节pH至pH 7.5。在反应完成之时，GLN 100％转化产生乙醇酸(作为铵盐)，产率＞99％，通过添加GLN所产生的乙醇酸铵的浓度为大约2.5M(2.9M总乙醇酸铵，包括初始的乙醇酸铵缓冲液，最终反应体积为约94.05mL)。

在第一反应结束之时，从细胞糊中离心出含水产物混合物(5000rpm，20分钟)。称重细胞糊并转移回到反应釜中。然后，向反应釜添加52.54mL 0.3M NH₄GLA(pH 7.5)、7.88mL 4.0M NH₄GLA(pH 7.5)和9.63mL蒸馏水，用氮气吹扫反应釜，通过添加等分物的含水GLN并如上所述马上添加氢氧化铵，在25℃下进行第二反应。通过如上所述离心反应溶液，在反应4之后回收的细胞糊重量为964mg。

对于具有催化剂再循环的连续分批反应，初始反应速率列于表16(再循环反应是反应2-4)。

表16.利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体L201Q的大肠杆菌FM5/pNM18-L201Q细胞糊，在具有催化剂再循环的连续分批反应中GLN转化为GLA的初始反应速率。

实施例26

利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶或敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的固定的大肠杆菌MG1655/PSW138转化体，乙醇腈水解为乙醇酸铵

向配备有高架搅拌和温度控制的50-mL夹套式反应釜进料8gGA/PEI-交联的角叉菜胶珠子(使用实施例11所述方法制备的)，用72mL0.1M NH₄GLA(pH 7.0)洗涤两次，每次15分钟)，所述珠子含有敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：6)或敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体F168V(SEQ ID NO：32)、F168M(SEQ ID NO：28)、F168K(SEQ ID NO：26)、F168T(SEQ ID NO：30)和L201Q(SEQ ID NO：8)的5％(dcw)大肠杆菌MG1655/pSW138转化体。然后，向反应釜添加14.632g蒸馏水和6.0mL 4.0M NH₄GLA(pH 7.0)，并用氮气吹扫反应釜。在25℃下搅拌混合物，同时利用可编程的注射泵添加8等分物的1.08mL 59wt％乙醇腈(GLN)水溶液(1.14g，12.0mmol(Fluka，再蒸馏的))和0.288mL 1∶16稀释的氢氧化铵(28-30wt％)水溶液(2.304mL总体积)；同时每隔2小时添加1等分物的GLN和氢氧化铵以保持GLN浓度≤400mM，pH在6.5-7.5。在第一GLN添加之后，在预定时间取出四份0.050-mL反应样品，并通过HPLC分析测定初始反应速率。在反应完成之时，GLN 100％转化产生乙醇酸(作为铵盐)，产率＞99％，通过添加GLN所产生的乙醇酸铵的浓度为大约2.4M(3.0M总乙醇酸铵，包括初始的乙醇酸铵缓冲液，最终反应体积为约39.5mL)。

在第一反应结束之时，从催化剂中倾析含水产物混合物(在氮气下)，留下约10.3g的固定的细胞催化剂(8.0g)和残留的产物混合物(约2.3g)的混合物。然后，向反应釜添加18.3mL蒸馏的去离子水，通过添加等分物的含水GLN并如上所述马上添加氢氧化铵，在25℃下进行第二反应。对于具有催化剂再循环的连续分批反应，初始反应速率列于表17(再循环反应是反应2-55)。

根据产生100％乙醇腈转化的具有催化剂再循环的连续分批反应的总次数，对每种腈水解酶计算催化剂生产率(产生的GLA总克数/克细胞干重(dcw)酶催化剂)。每种酶催化剂的催化剂生产率为：大肠杆菌MG1655/pSW138-F168V，1001g GLA/g dcw(55次连续分批反应)；大肠杆菌MG1655/pSW138-F168M，473g GLA/g dcw(26次连续分批反应)；大肠杆菌MG1655/pSW138-F168K，473g GLA/g dcw(26次连续分批反应)；大肠杆菌MG1655/pSW138-F168T，364g GLA/g dcw(20次连续分批反应)；大肠杆菌MG1655/pSW138-L201Q，346g GLA/g dcw(19次连续分批反应)；大肠杆菌MG1655/pSW138，182g GLA/g dcw(10次连续分批反应)。

表17.利用表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶或敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的固定的大肠杆菌MG1655/pSW138转化体，在具有催化剂再循环的连续分批反应中，GLN转化为GLA的初始反应速率(nd＝未测定)。

实施例27

利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体F168V的固定的大肠杆菌 MG1655/PSW138转化体，通过GLN转化获得的乙醇酸铵的鉴定

为确定通过固定的MG1655/pSW138-F168V生物催化剂水解GLN(Fluka，再蒸馏的)获得的产物溶液成分(见实施例26，表17)，通过HPLC和¹H NMR波谱鉴定反应5、10和38产生的产物溶液。通过HPLC测定的乙醇酸盐的浓度为3.1M。利用在500MHz下操作的Varian UnityInova波谱仪(Varian，Inc.，Palo Alto，CA)获得定量¹H NMR波谱。通过将150μL反应产物与400μL D₂O一起添加到5mm NMR管中制备样品。

用设置在5ppm、90-度脉冲(在49db的发射机功率下，5.9微秒)的发射机，利用6000Hz的谱宽获得¹H NMR波谱。使用4秒的采集时间，其产生48,000点的总数据量。最长的¹H Ti(8秒)与甲醇CH₃质子有关，因此采集前的总延迟时间设定在50秒(即大于5倍的甲醇CH₃T₁)。在-6db的发射机功率下，该预延迟时间分隔在单次(simple)延迟时间(“d1”)和施加于残留水共振的30秒的溶剂饱和脉冲之间。在4次稳态(“模拟”)扫描前加上32次扫描的信号平均值给出了大约32分钟的总试验时间。通过比较¹H NMR化学位移和在前述2-维NMR相关性试验中获得哪些化学位移，并通过加同位素指示剂试验，获得归属。

通过¹H NMR波谱，对在乙醇酸铵产物溶液中观察到的杂质进行基于它们官能团的分类，分为以下官能团类别：甲醛衍生的、甲酸衍生的、甲醇衍生的和甲基衍生的。对于每一类别，质子信号的积分峰面积归属如下：两个质子归属为甲醛官能团、一个质子归属于甲酸官能团，三个质子归属于甲醇官能团以及三个质子归属于甲基官能团。对于乙醇酸铵，将积分峰面积除以2(乙醇酸铵质子数目)并分配100％的数值。对于每种杂质官能团分类，将观察到的质子的积分峰面积除以相应的质子数目(见上)，并将所得到的积分峰面积除以样品中一个乙醇酸盐质子的积分峰面积以测定相对于所存在的乙醇酸铵的浓度，所存在的杂质的浓度。乙醇酸铵产率(基于GLN的100％转化)和乙醇酸铵％纯度(基于乙醇酸盐和总杂质的相对浓度)列于表18。

表18.利用表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体F168V的固定的大肠杆菌MG1655/pSW138转化体，转化GLN产生的乙醇酸铵的产率和纯度。

反应#	乙醇酸铵产率(％)	乙醇酸铵纯度(％)
			实施例26，反应5	99％	98.5
实施例26，反应10	99％	98.5
			实施例26，反应38	99％	98.8

实施例28

通过固定床离子交换层析从乙醇酸铵中分离乙醇酸

无添加剂(除反应体积按比例增大18倍之外)，如实施例12所述，将共同未决的US临时申请60/638127(在此并入作为参考)的实施例4-8中所述的由氰化氢和甲醛合成的GLN转化为乙醇酸铵，并用固定床离子交换将乙醇酸铵产物溶液转化为乙醇酸。

使用配备有

PTFE端盖和H+型的

G-26强酸阳离子交换树脂(Dow Chemical Co)的5cm ID x 60cm硅酸硼玻璃柱(Spectrum-Chromatography)。5加仑聚丙烯进料罐用于供应超纯水(18+MΩ，通过Sybron-Bamstead Nanopure Il单元生产的)给柱进料泵(带有全头的Cole-Parmer变速隔膜泵)用于树脂预冲洗和后冲洗。无论何时聚丙烯进料罐总是用氮气吹扫，以阻止吸收大气中的CO₂。在用超纯水预冲洗填料柱(初始高度＝23″，柱床体积＝1147mL)至＞5MΩ的流出液后，泵入乙醇酸铵(1.3升(1428g)，pH＝7.09)穿过柱床向上流出40mL；当乙醇酸盐消耗时，将单元切换回超纯水，以相同的速率泵入超纯水以连续推送进料穿过柱床。在柱运行期间，使用预冲洗的HDPP(高密度聚丙烯)样品瓶以50mL增量连续捕获流出液；连续采集了总共38份50-mL流出液样品，并分析pH(pH计)、乙醇酸盐浓度(HPLC)和铵离子含量(通过离子交换层析)。

使用配备有CD20电导率检测器和Dionex CS17柱(3-11mM甲磺酸，1.0mL/min，用Dionex CSRS ultra装置校正(suppressed)到100微安，1.0mL/min，100微升样品回路)的Dionex IP25泵进行铵离子含量测定，并将阳离子3-11mM CS 17法应用于该分析。

合并级分12-23(总共600mL)，与5g新鲜的

G-26树脂(用45mL去离子水预冲洗3次，每次20分钟)一起搅拌过夜，通过过滤收集651g乙醇酸溶液。通过旋转蒸发浓缩溶液产生70wt％乙醇酸(140g产物)。分析70wt％乙醇酸的杂质，显示乙醇酸纯度大于99.9％。

Claims

1.一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括：

a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，由此产生乙醇酸，所述多肽如SEQ ID NO: 18所示；和

b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少1.5倍腈水解酶活性增加。

2.权利要求1的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于保藏号为ATCC 55746的敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性提供了至少约2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。

3.权利要求1的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于保藏号为ATCC 55746的敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性提供了至少约4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。

4.权利要求1的方法，其中酶催化剂以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。

5.权利要求4的方法，其中所述完整的微生物细胞是重组表达所述多肽的转化的微生物宿主细胞。

6.权利要求4的方法，其中转化的微生物宿主细胞选自：丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌。

7.权利要求6的方法，其中转化的微生物宿主细胞是大肠杆菌。

8.权利要求7的方法，其中转化的微生物宿主细胞是选自大肠杆菌MG1655和大肠杆菌FM5的大肠杆菌菌株。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中酶催化剂固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。

10.权利要求1的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为0.02 wt %至90 wt %。

11.权利要求10的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为0.02 wt %至40 wt %。

12.权利要求9的方法，其中含水反应混合物中乙醇腈的浓度为5 mM至1 M。

13.权利要求12的方法，其中通过连续或等分物添加保持含水反应混合物中的乙醇腈浓度。

14.权利要求1的方法，其中含水反应混合物中pH保持在5.5至7.7。

15.权利要求1的方法，其中在基本上无氧的条件下进行乙醇腈酶促转化为乙醇酸。

16.权利要求1的方法，其中含水反应混合物进一步包含小于5 wt %浓度的选自硫代硫酸钾和连二亚硫酸钠的稳定剂。

17.权利要求1的方法，其中酶催化剂是再循环的酶催化剂。

18.权利要求1的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少300克乙醇酸的催化剂生产率。

19.权利要求18的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少450克乙醇酸的催化剂生产率。

20.权利要求19的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少1000克乙醇酸的催化剂生产率。