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CN102781960A - Hsa相关组合物及使用方法 - Google Patents

Hsa相关组合物及使用方法 Download PDF

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CN102781960A CN2011800123754A CN201180012375A CN102781960A CN 102781960 A CN102781960 A CN 102781960A CN 2011800123754 A CN2011800123754 A CN 2011800123754A CN 201180012375 A CN201180012375 A CN 201180012375A CN 102781960 A CN102781960 A CN 102781960A
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Abstract

本发明提供具有相比天然HSA改善的特性的人血清白蛋白(HSA)组合物。

Description

HSA相关组合物及使用方法
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2010年2月16日提交的美国临时申请No.61/304,954以及2010年7月15日提交的美国临时申请No.61/364,503的优先权，以上两个申请的全文均以引用方式并入。
2.序列表的引用
本申请通过引用方式并入以文本文件通过EFS-Web与本申请一起提交的序列表，所述序列表命名为“MED0554PCT ST25”，于2010年2月14日创建，并且大小为38.5千字节。
3.发明背景
新生儿Fc受体(FcRn)通过依赖pH的机制延长IgG与人血清血蛋白(HSA)的生命周期，在核内体的酸性pH下特异性结合这两种分子并将其再循环至细胞表面，从而从默认的溶酶体降解途径将这两种分子转移出去。已证实FcRn结合能力对于白蛋白的结构域III为固有的。
4.发明概要
本公开提供HSA相关组合物及使用方法。本公开提供包含人血清白蛋白(HSA)部分的嵌合多肽以及包含与药物载体组合的嵌合多肽的组合物，所述人血清白蛋白部分包含新生儿FcRn结合片段和异源性多肽或其生物活性片段。还公开了用于产生这类嵌合多肽的构建体。此外，本公开教导制备嵌合多肽和编码其的构建体的方法。本公开还提供包含人血清白蛋白(HSA)部分的多肽，所述HSA部分包含HSA结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，其中所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于其中HSA部分不包括氨基酸取代的对照多肽增加多肽对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或二者。本公开亦提供包含人血清白蛋白(HSA)部分的嵌合多肽，所述HSA部分包含HSA结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段以及异源蛋白质，其中所述嵌合多肽保留异源蛋白质的功能活性并可与FcRn结合，并且HSA结构域III包含至少一个氨基酸取代以相对于其中HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照嵌合多肽增加嵌合多肽对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或二者。此外，本文公开使用嵌合多肽的方法(例如)以增加蛋白质的血清半衰期。还公开了用于产生腺病毒文库的方法和载体，所述腺病毒文库用于筛选大量不同的多肽群。此类方法用于筛选和鉴定增加对FcRn的亲和力或血清半衰期中的一者或二者的HSA结构域III氨基酸取代。
在某些实施方案中，相对于不包含HSA部分的对照多肽，嵌合多肽具有对FcRn增加的亲和力和增加的血清半衰期中的一者或二者。在某些实施方案中，嵌合多肽具有增加的血清半衰期。在某些实施方案中，嵌合多肽具有对FcRn增加的亲和力和增加的血清半衰期二者。在某些实施方案中，嵌合多肽在酸性pH下(例如，pH为约5.5)具有对FcRn增加的亲和力。在其他实施方案中，嵌合多肽在酸性pH下(例如，pH为约5.5)具有增加的FcRn，嵌合多肽在中性pH下(例如，pH为约7.4)对FcRn的亲和力基本上不改变。
本公开预期任何前述方面和实施方案的所有组合，以及与在详细描述中提出的任何实施方案和实施例的组合。
5.附图简述
为阐明本发明，以图示方式描绘本发明的某些实施方案。然而，并不将本发明限制于图中所示的实施方案的精确配置和手段。
图1提供与人血清白蛋白(HSA)结构域III结合的人FcRn的动力学与平衡分析。图中呈现了在pH5.5下与固定结构域III结合的人FcRn的源自SPR的缔合、离解动力学和平衡结合常数。图1A呈示考马斯亮蓝(Coomassie)染色的PAGE凝胶，证明来自比赤酵母(PichiaPastoris)的HSA的结构域III的成功表达和纯化(如箭头所示)。图1B呈示通过在固定于CM5薄片上的结构域III上注入一系列FcRn浓度而产生的结合传感图。图1C呈示在平衡时的结合反应与适合稳态亲和力模型的FcRn浓度的关系的图。
图2提供各种构建体设计的示意性表示，以及关于与HSA融合的IgG和与结构域III融合的IgG的纯化和表征的信息。图2A呈示重组IgG-HSA或IgG-结构域III融合蛋白的重链以及YTE变体的DNA构建体。图2B呈示在还原和非还原条件下，纯化的融合蛋白(5μg/泳道)的SDS PAGE分析。图2C呈示纯化的IgG融合蛋白的分析尺寸排阻层析。
图3提供和与HSA融合的IgG以及与结构域III融合的IgG结合的人FcRn的源自SPR的平衡常数。对每次FcRn注入在平衡时的响应单位(Req)与人FcRn浓度的关系以图表示，并且使数据适合稳态亲和力模型以计算固定IgG(图A)、与HSA融合的IgG(图B)和与结构域III融合的IgG(图C)的KD。插图中的传感图显示在消除空位后Y轴上的结合于固定配体的FcRn的质量(共振单位)与X轴上的时间的关系。
图4提供指示FcRn在HSA上的表位为构象表位的证据。在pH5.5下，将以用三种不同方式处理的琼脂糖凝胶(S)-HA、S-IgG或S-Tris与人FcRn孵育。洗脱所结合的FcRn并通过用抗-β2微球蛋白抗体进行免疫印迹来定量。示出分子重量标准(M，以kD计)的位置。泳道1包含20μg的人FcRn，将这一数量添加至每一吸附样本中。
图5显示保留FcRn结合能力的酵母细胞(S.Cerevisiae)表面上展示的HSA与结构域III。图5A呈示使用FITC缀合的抗-HSA抗体，用半乳糖可诱导的pYD1细胞表面展示质粒转化的酿酒酵母(S.Cerevisiae)细胞上的HSA或结构域III的流式细胞术检测。用半乳糖诱导细胞持续指定的时间。图B呈示生物素化的人FcRn与酿酒酵母细胞上展示的HSA或结构域III的结合，诱导48小时并通过使用流式细胞仪用抗-链霉亲和素藻红蛋白显形。将用scfv转化的酵母细胞用作FITC以及藻红蛋白的背景荧光性的对照。实验以荧光强度(对数刻度)与细胞数量的关系柱状图表达。
图6提供来自不同物种(人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马)的结构域III的氨基酸序列比对。图A至D中的比对包括鸡，而图EH中的比对将鸡排除在外。在不同物种间保守的氨基酸残基用实线标记，并且保守的半胱氨酸残基用虚线标记。阴影部分的氨基酸残基为物种间非保守的。应注意，图6中的氨基酸编号仅针对于人结构域III而言，而并非针对相对于全长成熟HSA的结构域III的编号而示。
图7示出HSA与具有野生型的IgG的融合使血清持久性增加至与IgG-YTE变体所见相似的水准。将血清中剩余的注射样本的百分数随时间(1至240小时)作图。
图8描绘scFv-Fc细胞表面展示文库入门载体的质粒图。图A描绘pENDisplay载体的质粒图，其包含可操作链接至启动子(此处为CMV启动子)的scFv-Fc-GPI-锚盒(anchor cassette)且用聚腺苷酸序列(此处为BGH聚腺苷酸序列)终止。Sfi I与Not I限制酶位点位于scFv部分的两侧以有助于克隆不同的scFv序列。attL1与attL2位点位于scFv-Fc-GPI-锚表达盒的两侧。图B描绘pENDisplay-OriP载体的质粒图，其基于图A中所示的载体，但在scFv-Fc-GPI-锚盒的聚腺苷酸尾部后并入了OriP序列(参见图9C)。
图9提供EBNA-1与OriP的代表。图A与B中分别提供EBNA-1的氨基酸序列与核苷酸序列。图C中提供OriP的序列。
图10提供用于表达目标蛋白质的代表性一般腺病毒表达载体的示意图。所描绘载体包括：用于编码一种或多种目标蛋白质的目标DNA序列、OriP序列和任选的EBNA-1编码区域。这些组分任选地两侧可为已用于载体构建的att重组位点。在E1和/或E3基因缺失的情形下，这些组分的一侧可为腺病毒基因组并且这些组分的一侧可为ITR序列。所示为3’与5’ITR序列。为便于构建、增殖和选择，载体还提供用于在细菌细胞中进行复制(例如大肠杆菌(E.coli)起点)及抗生素选择(例如氨苄青霉素抗性)的序列，这些成分以不会并入援救的腺病毒的方式定位。
图11示出哺乳动物细胞(293F细胞)表面上展示的HSA保留FcRn结合能力。图A描绘命名为pEN-HSA-GPI的哺乳动物表达构建体，其包含CMV启动子(粗线)、信号序列(粗虚线)、N端Flag标签(细虚线)、两侧为HSA部分(阴影线框)和DAF-GPI序列的(G4S)3接头(细实线)。图B呈示使用FITC缀合的抗-HSA抗体(图A)，用产生自pEN-HSA-GPI的腺病毒感染16小时和24小时后或用编码对照scFv-Fc融合蛋白的对照质粒的293-F细胞表面上的HSA的流式细胞术检测。图C与D呈示生物素化的人FcRn(分别为25μg/ml与5μg/ml)与293F细胞上展示的HSA的结合，使用流式细胞术通过抗-链霉亲和素藻红蛋白显形。实验以荧光强度(对数刻度)相对于细胞数量的柱状图表示。
图12示出生物素化的人FcRn与野生型HSA(HSA-wt)以及293F细胞上展示的两个HSA突变体文库(HSA-DIII-lib1和HSA-DIII-lib2)的结合的分布的变化。图A呈示用野生型与突变HSA-DIII文库感染的293-F细胞表面上的HSA的流式细胞术检测。图B呈示结合细胞表面上HAS的生物素化人FcRn的HSA的流式细胞检测，通过抗-链霉亲和素藻红蛋白显形。实验以荧光强度(对数刻度)相对于细胞数量的柱状图表示。
图13示出表达野生型HAS(HSA-wt，图A)和两个HSA突变体文库(分别为图B和图C中的HSA-DIII-lib1和HSA-DIII-lib2)的细胞的FACS分选分布，这些细胞被生物素化的人FcRn(10μg/ml)染色，用抗-链霉亲和素藻红蛋白检测。
图14示出在分选前以及第一轮和第二轮分选后，生物素化的人FcRn与293F细胞结合的分布变化，所述293F细胞在其细胞表面表达野生型HSA(HSA-wt)、HSA-DIII-lib1突变体文库。图A呈示在分选前以及第一轮和第二轮分选后，对表达野生型、HSA-DIII-lib1的293F细胞表面上的HSA的流式细胞术检测。图B及C呈示生物素化的人FcRn(分别为1μg/ml和0.1μg/ml)与同组细胞的结合，使用流式细胞术通过抗-链霉亲和素藻红蛋白显形。实验以荧光强度(对数刻度)相对于细胞数量的柱状图表示。
图15示出FcRn与细胞表面上展示的突变体HSA的结合是pH依赖性的。图A及B示出在pH5.5(0.1μg/ml FcRn，图A)和pH7.2(10μg/ml，图B)下，在293F细胞的表面上用抗-链霉亲和素藻红蛋白检测的生物素化的人FcRn的流式细胞术检测，所述293F细胞表达对照scFv-Fc融合蛋白质、野生型HSA以及三种代表性突变(参见表5)。图C显示使用FITC缀合的抗-HSA抗体对这些细胞表面上的HSA的流式细胞术检测。
图16示出如通过流式细胞术所测量，大多数分离的HSA突变对于FcRn具有更高的亲和力。通过流式细胞术分析野生型HSA和一组选定的突变体在不同浓度下结合生物素化的人FcRn。对数据用MFI随FcRn浓度的变化作图。
图17描绘HSA的分析结构上的许多变体的定位(PDB存取号：1BM0)。大部分结构呈示为带状图，其中残基L463、E495、T508、I523和K534用条形表示并且用箭头指出。环6和7以及围绕残基492-536的螺旋7和8为环绕的。在此区域中发现了大部分热点和优选点。
6.发明详述
6.1 引言
新生儿FC受体(FcRn)通过pH依赖机制延长IgG与人血清白蛋白(HSA)生命周期，在核内体的酸性pH下特异性结合这两种分子并将其再循环至细胞表面，从而从默认的溶酶体降解途径将这两种分子转移出去。已证实FcRn结合能力对白蛋白的结构域III为固有的。如本文所证实，添加HAS的FcRn结合片段可用于增加蛋白质的血清半衰期和/或治疗剂的FcRn结合亲和力，所述治疗剂例如抗体、抗体替代物、蛋白质、蛋白质支架和肽。具体而言，如本文所证实，在酸性pH(例如，pH为约5.5)下，FcRn结合亲和力增加，而在中性pH(例如，pH为约7.4)下，亲和力基本不变。包含本公开的FcRn结合结构域变体的嵌合多肽可增加蛋白质的血清半衰期或FcRn结合亲和力，甚至进一步大于野生型FcRn结合结构域。本发明的HSA变体多肽可用作支架以用于与治疗靶标结合或可偶联至治疗制剂。
本公开提供结构域III的变体。结构域III的此类变体可单独使用或用于另外的HSA序列的情形中，以增加异源蛋白质和/或非蛋白质制剂的血清半衰期和/或FcRn结合亲和力。
本文中公开的嵌合多肽和HSA变体具有大量用途。应理解，有时可相对快速地从动物或人体中清除蛋白质和其他分子。快速清除会逐渐削弱研究动物模型内的蛋白质和其他分子的能力，且会逐渐削弱使用其有效用于治疗目的的能力。在一些例子中，快速清除蛋白质以使其没有治疗效果。在其他例子中，以需要频繁给药的速度清除蛋白质。频繁给药增加了治疗成本，且也增加了不遵照治疗方案的风险。在一些例子中，以需要施用较大剂量的速度清除蛋白质。较大剂量的活性剂会增加副作用的风险，包括免疫反应。
本公开的嵌合多肽和变体HSA多肽有助于通过增加血清半衰期和/或对FcRn的亲和力解决与快速或相对快速的蛋白质清除有关的问题。同样，非蛋白质物质可与本公开的变体HSA多肽缀合以增加血清半衰期和/或对FcRn的亲和力。
6.2 术语
在继续进一步详细描述本发明之前，应了解，并未将本发明限制于特定的组合物或处理步骤，因为这些组合物或处理步骤都可以改变。必须注意的是，除非上下文中清楚地指出，否则如本说明书及所附专利要求中所用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示对象。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及的本领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，theConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology，Juo，Pei-Show，第二版，2002，CRC Press；The Dictionary of Cell andMolecular Biology，第三版，1999，Academic Pres；以及the OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，修订版，2000，Oxford University Press为技术人员提供在本发明中所用的许多术语的常用词典。
本文中的氨基酸可由其一般已知的三个字母符号表示或由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (IUPAC-IUB生物化学命名委员会)推荐的一个字母符号来提及。同样地，核苷酸可由其一般公认的单一字母代码来提及。如本文所用的“氨基酸取代”是指用另一氨基酸代替在母体多肽序列中的特定位置处的氨基酸。例如，取代L463N是指其中在位置463处的亮氨酸用天门冬酰胺代替的变体多肽。
除非另外指出，抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)和骨架区域(FR)中的氨基酸的编号均遵循Kabat等在Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，N ational Institutesof Health，Bethesda，MD.(1991)中所提出的Kabat定义。使用这一编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于一给定的抗体，残基的Kabat编号可以通过在抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列的同源区域进行比对来确定。骨架残基的最大比对经常需要在编号系统中插入“间隔”残基，以用于Fv区域。此外，由于物种间或等位基因趋异，在任何给定Kabat位点号码处的某些个别残基的身份可因抗体链而异。
如本文所用术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”，也称为免疫球蛋白，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，双特异抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、表现所需生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫化物连接的Fv(dsFv)，以及抗个体基因型(抗-Id)抗体(包括(例如)针对本发明的抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体，以及以上任何表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含至少一个抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可为任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，例如，Glm(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em和Km(1、2或3))。抗体可源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等，或其他动物诸如鸟类(例如鸡)。
如本文所用的术语“全长HSA”是指成熟全长人血清白蛋白蛋白质或指编码这种蛋白质的核苷酸序列。全长HSA蛋白质为大约585个氨基酸(移除N端前序列(pro-sequence)和前体原序列(prepro-sequence)之后)。成熟全长HSA(也称为全长成熟HSA)蛋白质在SEQ ID NO：2中示出。在某些实施方案中，全长HSA是指没有前序列的HSA的成熟全长形式。前体原HSA的序列(在移除N端前序列和前体原序列之前)为609个氨基酸且在GenBank登录号NP000468中示出。此外，由于等位基因趋异，某些个别残基的身份可与SEQ IDNO：2中所呈现的那些不同。出现在HSA结构域III中的等位基因变化包括：残基410处R→C；残基466处K→E；残基479处E→K；残基494处D→N；残基501处E→K；残基505处E→K；残基533处V→M；残基536处K→E；残基541处K→E；残基550处D→A或D→G；残基560处K→E；残基563处D→N；残基565处E→K；残基570处E→K；残基573处K→E；残基574处K→E；残基572至585处GKKLVAASQAALGL→PTMRIRERK；以及残基575至585处LVAASQAALGL→TCCCKSSCLRLITSHLKASQ PTMRIRERK，如相对于全长成熟HSA中的位置所进行的编号。
如本文所用术语“HSA的结构域III”是指跨越全长成熟HSA的氨基酸381-385的HAS的常规结构域III，约为205个氨基酸，或编码此种蛋白质的核苷酸序列。在本文中，HSA结构域III也缩写成结构域III或简单的DIII。结构域III多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中示出。如上所述，由于等位基因趋异，某些个别残基的身份可与SEQ ID NO：1中呈现的那些不同。
如本文所用术语“嵌合多肽”是指包含至少两个彼此不是异源的部分的多肽。例如，嵌合多肽，也称为融合多肽或融合蛋白，其包含接合至异源蛋白质部分的至少一个HSA部分。HSA部分与异源蛋白质部分自身可融合至(例如)Fc或其他部分。HSA部分和异源蛋白质部分可经由共价或非共价相互作用接合。例如，HSA部分和异源蛋白质部分可彼此化学共轭或以重组的方式融合(例如框内的平移融合)。
如本文所用术语“异源蛋白质”是指非HSA的蛋白质的全部或部分。尽管本文中使用一般术语“异源蛋白质”，但该术语意欲涵盖不同长度的生物活性肽，以及全长或基本上全长蛋白质，包括抗体和抗体片段。优选的异源蛋白质可为治疗目的而使用或研究。异源蛋白质的示例性种类包括但不限于酶、细胞因子和生长因子。
如本文所用HSA多肽包括各种生物活性片段和变体、融合蛋白和野生型HSA多肽的修饰形式。这些生物活性片段或变体、融合蛋白和HSA多肽的修饰形式具有至少一部分与天然HSA蛋白质基本序列同一性的氨基酸序列，且保留至少天然HSA蛋白质的FcRn结合活性。在某些实施方案中，HSA多肽的生物活性片段、变体或融合蛋白包含与HSA多肽具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。如本文所用的术语“片段”应理解为包括表现FcRn结合活性的生物活性片段或生物活性变体。合适的生物活性片段可用于制备嵌合多肽，且这些嵌合多肽可用于本文所述的任何方法中。
如本文所用的术语“突变的”、“突变”等是指分子，尤其是指HSA多肽，其通过使用用于定点诱变的熟知方法或任何其他常规方法经历一或多个氨基酸的缺失、添加或取代。
6.3 HSA结构域III
在某些方面，本公开提供人血清白蛋白(HSA)变体多肽，其包含HSA结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，其中所述变体多肽可与FcRn结合，且其中所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于缺乏所述氨基酸取代的对照HSA多肽增加所述变体多肽的血清半衰期或增加对FcRn的亲和力。
在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加HSA变体多肽对FcRn的亲和力。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加HSA变体多肽的血清半衰期。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加HSA变体多肽对FcRn的亲和力和HSA变体多肽的血清半衰期二者。在某些实施方案中，在酸性pH(例如，pH为约5.5)下，一至十八个氨基酸取代增加HSA变体多肽对FcRn的亲和力。在某些实施方案中，在酸性pH(例如，pH为约5.5)下，一至十八个氨基酸取代增加HSA变体多肽对FcRn的亲和力，而在中性pH(例如，pH为约7.4)下，基本上不改变HSA变体多肽对FcRn的亲和力。
在某些实施方案中，HSA变体与FcRn结合，且具有与所述对照HSA多肽不同的解离速率或结合速率。例如，在某些实施方案中，HSA变体与FcRn结合，且具有较快的结合速率和/或较慢的解离速率。在其他实施方案中，结合速率较慢和/或解离速率较快。
在某些实施方案中，本公开提供嵌合多肽，其包括HSA部分，所述HSA部分包含结构域III或其FcRn结合部分以及异源蛋白质，其中所述嵌合多肽保留异源蛋白质的功能活性。在某些实施方案中，HSA部分包含整个HSA多肽或包含HSA结构域III的生物活性片段，或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段。在某些实施方案中，HSA部分包含HSA结构域III，或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段以及HSA的另一结构域的至少一部分，例如，HSA结构域I的至少一部分、或HSA结构域II的至少一部分，或HSA结构域I和II中的至少一部分。如相对于长成熟HAS中的位置进行编号，如本文所用的HSA结构域I包含残基1-197；HSA结构域II包含残基189-385；HSA结构域III包含残基381-585。
在某些实施方案中，嵌合多肽相对于不包含HSA部分的对照多肽具有对FcRn增加的亲和力和增加的血清半衰期。在某些实施方案中，嵌合多肽具有对FcRn增加的亲和力。在某些实施方案中，嵌合多肽具有增加的血清半衰期。在某些实施方案中，嵌合多肽具有对FcRn增加的亲和力和增加的血清半衰期中的两者。在某些实施方案中，嵌合多肽在酸性pH(例如，pH为约5.5)下具有对FcRn增加的亲和力。在其他实施方案中，嵌合多肽在酸性pH下(例如，pH为约5.5)具有增加的FcRn，嵌合多肽在中性pH下(例如，pH为约7.4)对FcRn的亲和力基本上不变
此外，如本文中所述，在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包括一至十八个氨基酸取代以相对于其中HSA部分不包含所述氨基酸取代的对照嵌合多肽增加对FcRn的亲和力和嵌合多肽的血清半衰期中的一者或二者。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加嵌合多肽对FcRn的亲和力。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加嵌合多肽的血清半衰期。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代增加嵌合多肽对FcRn的亲和力和嵌合多肽的血清半衰期两者。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸取代。同样，在包含结构域III或其FcRn结合部分的HSA变体多肽的情形中，结构域III包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸取代。在某些实施方案中，氨基酸取代并不仅仅是单个氨基酸对等位基因变体中存在的另一残基的取代。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含以下任何位置处的至少一个氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基381、残基383、残基391、残基401、残基402、残基407、残基411、残基413、残基414、残基415、残基416、残基424、残基426、残基434、残基442、残基445、残基447、残基450、残基454、残基455、残基456、残基457、残基459、残基463、残基495、残基506、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基519、残基521、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基531、残基535、残基538、残基539、残基541、残基557、残基561、残基566、残基569。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含在以下任何位置处的氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
在某些实施方案中，相对于不同的对照，评估增加的对FcRn的亲和力和/或血清半衰期。例如，可相对于缺少HSA部分的异源蛋白质特性评估嵌合多肽的特性，或可相对于缺少氨基酸取代和/或缺少异源蛋白质的相同或类似HSA部分的特性评估嵌合多肽的特性。类似地，可相对于不具有氨基酸取代的HSA分子的特性评估HSA变体多肽。
在某些实施方案中，嵌合多肽/HSA变体多肽以比所述对照多肽更高的亲和力与FcRn结合。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代在酸性pH(例如，pH为约5.5)下增加嵌合多肽/HSA变体多肽对FcRn的亲和力。在某些实施方案中，一至十八个氨基酸取代在酸性pH(例如，pH为约5.5)下增加嵌合多肽/HSA变体多肽对FcRn的亲和力，但在中性pH(例如，pH为约7.4)下基本上不改变嵌合多肽对FcRn的亲和力。在某些实施方案中，嵌合多肽在酸性pH下以较高的亲和力与FcRn结合且具有增加的血清半衰期。
在某些实施方案中，嵌合多肽/HSA变体多肽与FcRn结合且具有与所述对照多肽不同的解离速率和结合速率。例如，在某些实施方案中，嵌合多肽/HSA变体多肽与FcRn结合且具有较快的结合速率和/或较慢的解离速率。在其他实施方案中，结合速率较慢和/或解离速率较快。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体或具有HSA部分的嵌合多肽)的HSA结构域III包含一至十个氨基酸取代以相对于其中HSA部分不包含所述氨基酸取代的对照多肽增加多肽对FcRn的亲和力和/或增加多肽的血清半衰期。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一个氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III包含11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III包含至少一个氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III包含至少十个氨基酸取代。
示例性氨基酸取代包括：(i)用丙氨酸取代；(ii)保守氨基酸取代；(iii)非保守氨基酸取代。本公开预期，在给定多肽的结构域III中的所有氨基酸取代均可为这些取代类型中的一者，且还预期给定多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)的结构域III中的每个氨基酸取代可个别且独立地选自这些类型。
在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)是将HSA中的残基取代为丙氨酸。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用另一中性氨基酸残基置换HSA中给定的中性氨基酸残基。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用另一酸性氨基酸残基置换HSA中给定的酸性氨基酸残基。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用另一碱性氨基酸残基置换HSA中给定的碱性氨基酸残基。本公开预期以下实施方案，其中每一取代均独立选自前述取代类型。特别预期包含前述取代类型的任何组合的多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)。
在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸一个置换某一种氨基酸：赖氨酸((K；Lys)；精氨酸(R；Arg)；组氨酸(H；His)。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一氨基酸置换某一氨基酸：天冬氨酸(aspartate)(D；Asp；天冬氨酸)和谷氨酸(glutamate)(E；Glu；天冬氨酸)。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：天冬酰胺(N；Asn)，谷氨酰胺(Q；Gin)、丝氨酸(S；Ser)、苏氨酸(T；Thr)和酪氨酸(Y；Tyr)。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：丙氨酸(A；Ala)、缬氨酸(V；Val)、异亮氨酸(I；lie)、亮氨酸(L；Leu)、脯氨酸(P；Pro)、苯丙氨酸(F；Phe)、色氨酸(W；Trp)、蛋氨酸(M；Met)、半胱氨酸(C；Cys)和甘氨酸(G；Gly)。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在某些实施方案中，取代(至少1、2、3、4、5、6等数目的HSA结构域III取代)用以下组中的另一种氨基酸置换某一种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。本公开预期以下实施方案，其中每一取代均独立选自前述取代类型。特别预期包含前述取代类型的任何组合的多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)。
在特定实施方案中，具有对FcRn增加的亲和力和/或增加的血清半衰期的多肽(例如，HSA变体多肽或具有HSA部分的嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包括选自由下列组成的组中的至少一个氨基酸取代：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、K557A、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P。在某些实施方案中，结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在其他特定实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含选自由下列组成的组中的至少一个氨基酸取代：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L407N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。在某些实施方案中，结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在其他特定实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含选自由下列组成的组中的至少一个氨基酸取代：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。在某些实施方案中，结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在其他特定实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含选自由下列组成的组中的至少一个氨基酸取代：L407Y、V415T、V424I、V424Q、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、S517W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。在某些实施方案中，结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含选自由下列组成的组中的HSA结构域III的氨基酸取代：(a)E383G/K413S；(b)Y401E/I523G；(c)L407N/P447S；(d)L407N/P447S/A539I；(e)L407N/F509M；(f)L407Y/Q526T；(g)Y411Q/H535N；(h)K414S/V456N；(i)V415T/A569P；(j)V426H/Q526Y；(k)E442K/E450D/Q459R；(1)L463N/T508R；(m)T508R/K519I/K525V；(n)F509I/T527Y；(o)I523Q/K538Y；(p)Q526M/K557G；以及(q)K541F/A561F。在某些实施方案中，结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，多肽(例如HSA变体多肽或嵌合多肽)的HSA部分的结构域III包含选自由下列组成的组中的HSA结构域III的氨基酸取代：(a)L407N/P447S；(b)L407N/P447S/A539I；(c)L407N/F509M；(d)Y411Q/H535N；(e)K414S/V456N；(f)V426H/Q526Y；(g)L463N/T508R；(h)F509I/T527Y；(i)I523Q/K538Y；(j)Q526M/K557G；以及(k)K541F/A561F。
此外，片段或变体可使用本领域已知的技术以化学方法合成，例如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学法。所述片段或变体可(以重组方式或化学合成)而产生并对其测试以鉴定(例如)可与天然HSA蛋白质同样发挥作用或与天然HSA蛋白质的基本相似地发挥作用的那些片段或变体。
在某些实施方案中，本发明预期对HSA多肽的结构进行修饰以用于这样的目的，诸如增强治疗或预防功效或稳定性(例如，血清半衰期、活体外保质期和对体内的蛋白降解的抗性)。这类修饰的HSA多肽具有与天然存在(即，天然或野生型)的HSA多肽相同或基本相同的生物活性。如本文中所述，可将修饰的HSA多肽缀合至其他治疗部分(例如，蛋白质或非蛋白质物质)。修饰的多肽可通过(例如)氨基酸取代、缺失或添加来产生。例如，可以合理预期(例如)，用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸类似地置换另一氨基酸的单独取代(例如，保守氨基酸取代)将对所得分子的生物活性不具有主要影响。保守置换是在其侧链有关联的氨基酸的家族中发生的那些。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在多个物种中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自于人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自与人高度保守的物种(例如猿和猴)。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自非哺乳动物的血清白蛋白蛋白质中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自与人高度保守的物种(例如猿和猴)。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自非哺乳动物的血清白蛋白蛋白质中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马中的大部分。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少两个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少三个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少四个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少五个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的两至五个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马中的大部分。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少两个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少三个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少四个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的至少五个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自选自由下列组成的组中的两至五个物种：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。还预期包含前述氨基酸取代类别的任何组合的多肽(例如，HSA变体和嵌合多肽)。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基442、残基499和残基502。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基392、残基399、残基403、残基411、残基412、残基414、残基416、残基418、残基420、残基423、残基434、残基437、残基438、残基445、残基448、残基450、残基453、残基461、残基476、残基477、残基484、残基485、残基487、残基488、残基494、残基497、残基507、残基509、残基514、残基529、残基534、残基537、残基540、残基551、残基558、残基559、残基567、残基568、残基572。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)或甚至所有氨基酸取代均在前述残基中。特别预期包含任何一或多个前述残基中的氨基酸取代的所有组合的多肽(例如，HSA变体和嵌合多肽)。
在某些实施方案中，在结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA结构域III中的位置进行编号：残基383、残基391、残基411、残基414、残基416、残基434、残基442、残基445、残基450和残基509。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代选自由下列组成的组：E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y411Q、Y411N、K414S、K414T、Q416H、Q416P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、E450D、E450E、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W和F509Y。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA结构域III中的位置进行编号：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547、残基576。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)或甚至所有氨基酸取代均在前述残基中。特别预期包含任何一或多个前述残基中的氨基酸取代的所有组合的多肽(例如，HSA变体和嵌合多肽)。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA结构域III中的位置进行编号：残基381、残基401、残基424、残基457、残基463、残基495、残基508、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基531、残基535和残基539。
在某些实施方案中，在结构域III中的至少一个氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、Y401D、Y401E、V242A、V242G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V424V、L457F、L457W、L457Y、L463N、L463Q、E495D、T508K、T508R、T508S、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、A539I、A539L和A539V。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中为不保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在多个物种中为不保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为不保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、大鼠、狗、兔和牛。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为不保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、大鼠、狗、兔和牛。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中为不保守的残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、大鼠、狗、兔和牛。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在血清白蛋白蛋白质中的非保守残基，这些血清白蛋白蛋白质来自人、大鼠、狗、兔和牛。还预期包含前述氨基酸取代类别的任何组合的多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基382、残基385、残基390、残基397、残基400、残基402、残基415、残基429、残基432、残基435、残基439、残基440、残基443、残基444、残基446、残基447、残基459、残基471、残基472、残基478、残基479、残基483、残基490、残基492、残基493、残基503、残基511、残基517、残基518、残基519、残基521、残基538、残基541、残基542、残基546、残基549、残基550、残基552、残基554、残基556、残基560、残基562、残基563、残基565和残基566。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)或甚至所有氨基酸取代均在前述残基中。特别预期包含任何一或多个前述残基中的氨基酸取代的所有组合的多肽(例如HSA变体和具有HAS部分的嵌合多肽)。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基402、残基415、残基447、残基459、残基511、残基517、残基519、残基521、残基538、残基541和残基566。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代选自由下列组成的组：K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、V415C、V415S、V415T、P447S、P447T、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、A511F、A511W、A511Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、K538F、K538W、K538Y、K541F、K541W、K541Y、T566F、T566W和T566Y。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均是表面可及残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中为保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基422、残基499和残基502。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代位于以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基391和残基442。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)或甚至所有氨基酸取均在前述残基中。特别预期包含前述氨基酸取代类别的任何组合的多肽(例如，HSA变体和嵌合多肽)。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代选自下列组成的组：E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、E442K、E442R。在某些实施方案中，在结构域III中的一个以上的氨基酸取代(例如，2、3、4、5...)或甚至所有氨基酸取代均选自前述取代。
在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代不仅仅是R410C；K466E；E479K；D494N；E501K；E505K；V533M；K536E536；K541E；D550A或D550G；K560E；D563N；E565K；E570K；K573E；或K574E的取代。
在某些实施方案中，多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)包含HSA结构域III，其包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％或至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，HSA部分包含与SEQ IDNO：2的对应部分具有至少80％、85％或至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，HSA部分包含与SEQ ID NO：2的对应部分具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，HSA部分包含与SEQ ID NO：2的对应部分具有至少98％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开预期，除HSA结构域III中的一个或多个氨基酸取代外，多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)可包括结构域III以外的HSA部分中的一或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，本公开预期，除HSA结构域III中的一或多个氨基酸取代，多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)也可包括结构域III中的一或多个氨基酸缺失和/或插入(例如，1、2、3、4、5、6、7、8)。应注意，当HSA部分包含一或多个氨基酸缺失和/或插入时，这些插入或缺失的残基可使用字母表示，以致不干扰相对于天然HSA的残基的编号。例如，若在残基414与415之间插入氨基酸残基，则可将此残基表示为414a。在某些实施方案中，所插入的氨基酸残基插在表面可及环中以增加此环的大小。在某些实施方案中，插入的氨基酸残基插在螺旋中以增加此螺旋的大小和/或改变其结构。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至五个(1、2、3、4、5)氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环2中的一至五个(1、2、3、4或5)氨基酸取代，且另外包括不在环2中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至五个(1、2、3、4、5)氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环3中的一至五个(1、2、3、4或5)氨基酸取代，且另外包括不在环3中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至十八个(1、2、3、4、5、6等)氨基酸取代，其中所述一至十八个氨基酸取代均在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环6中的一至十八个(1、2、3、4、5、6等)氨基酸取代，且另外包括不在环6中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至六个(1、2、3、4、5或6)氨基酸取代，其中所述一至六个氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的螺旋7中的一至六个(1、2、3、4、5或6)氨基酸取代，且另外包括不在螺旋7中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至三个(1、2或3)氨基酸取代，其中所述一至三个氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环7中的一至三个(1、2或3)氨基酸取代，且另外包括不在环线7中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至十八个(1、2、3、4、5、6等)氨基酸取代，其中所述一至十八个氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的螺旋8中的一至六个(1、2、3、4、5、6等)氨基酸取代，且另外包括不在螺旋8中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至五个(1、2、3、4或5)氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环8中的一至五个(1、2、3、4或5)氨基酸取代，且另外包括不在环8中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环9中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至四个氨基酸取代，其中所述一至四个(1、2、3、4)氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含HSA结构域III的环9中的一至五个(1、2、3、4或5)氨基酸取代，且另外包括不在环9中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。如上所述，在每一位置处的可能的氨基酸取代均独立地选自上述任何取代类型(例如，丙氨酸取代、保守性取代等)。同样预期包含前述氨基酸取代类别的任何组合的多肽(例如，HSA变体和嵌合多肽)。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，所述氨基酸取代不在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，所述氨基酸取代不在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的环9中。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9组成的组中的至少两个环中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9组成的组中的至少三个环中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9组成的组中的至少四个环中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述氨基酸取代不在螺旋7或8中。
在某些实施方案中，结构域III包含至少两个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少两个环和/或螺旋中。在某些实施方案中，结构域III包含至少三个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少三个环和/或螺旋中。在某些实施方案中，结构域III包含至少四个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少四个环和/或螺旋中。在某些实施方案中，结构域III包含至少五个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少五个环和/或螺旋中。在某些实施方案中，结构域III包含至少六个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少六个环和/或螺旋中。在某些实施方案中，结构域III包含至少五个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2、3、6、7、8和9的每一个中。在某些实施方案中，结构域III包含至少六个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2、3、6、7、8和9的每一个中。在某些实施方案中，结构域III包含至少两个氨基酸取代且所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7和8的每一个中。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环2中且选自：残基415、残基416、残基417、残基418和残基419。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5)的氨基酸取代在环2中且选自：残基415、残基416、残基417、残基418和残基419。在某些实施方案中，在HSA结构域III环2中的至少一个所述氨基酸取代选自：V415C、V415S、V415T、Q416H和Q416P。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环3中且选自：残基439、残基440、残基441、残基442和残基443。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5)的氨基酸取代在环3中且选自：残基439、残基440、残基441、残基442和残基443。在某些实施方案中，在HSA结构域III环3中的至少一个所述氨基酸取代选自：E442K和E442R。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环6中且选自：残基492、残基493、残基494、残基495、残基496、残基497、残基498、残基499、残基500、残基501、残基502、残基503、残基504、残基505、残基506、残基507、残基508和残基509。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代在环6中且选自：残基492、残基493、残基494、残基495、残基496、残基497、残基498、残基499、残基500、残基501、残基502、残基503、残基504、残基505、残基506、残基507、残基508和残基509。在某些实施方案中，在HSA结构域III环6中的至少一个所述氨基酸取代选自：T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W和F509Y。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在螺旋7中且选自：残基510、残基511、残基512、残基513、残基514和残基515。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5、6)的氨基酸取代在螺旋7中且选自：残基510、残基511、残基512、残基513、残基514和残基515。在某些实施方案中，在HSA结构域III环7中的至少一个所述氨基酸取代选自：A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q和T515S。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环7中且选自：残基516、残基517和残基518。在某些实施方案中，一个以上(2、3)氨基酸取代在环7中且选自：残基516、残基517和残基518。在某些实施方案中，在HSA结构域III环7中的至少一个所述氨基酸取代选自：L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W和S517Y。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在螺旋8中且选自：残基519、残基518、残基519、残基520、残基521、残基522、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基528、残基529、残基530、残基531、残基532、残基533、残基534、残基535和残基536。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代在螺旋8中且选自：残基519、残基518、残基519、残基520、残基521、残基522、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基528、残基529、残基530、残基531、残基532、残基533、残基534、残基535和残基536。在某些实施方案中，在HSA结构域III螺旋8中的至少一个所述氨基酸取代选自：K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E和H535P。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环8中且选自：残基537、残基538、残基539、残基540和残基541。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4、5)氨基酸取代在环8中且选自：残基537、残基538、残基539、残基540和残基541。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在环9中且选自：残基561、残基562、残基563、残基564。在某些实施方案中，在HSA结构域III环8中的至少一个所述氨基酸取代选自：K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y。在某些实施方案中，一个以上(2、3、4)的氨基酸取代在环9中且选自：残基561、残基562、残基563、残基564。在某些实施方案中，在HSA结构域III环9中的至少一个所述氨基酸取代选自：A561F、A561W和A561Y。
另外预期结构域III中的插入和缺失，其(例如)增加或减少HSA结构域III环的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环2的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环3的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环6的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变螺旋7的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环7的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变螺旋8的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环8的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变环9的长度。在某些实施方案中，结构域III中的所述插入或缺失改变选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少两个环和/或螺旋的长度。在某些实施方案中，结构域III中的所述插入或缺失改变选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少三个环和/或螺旋的长度。在某些实施方案中，结构域III中的所述插入或缺失改变选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少四个环和/或螺旋的长度。在某些实施方案中，结构域III中的所述插入或缺失改变选自由环2、3、6、7、8和9以及螺旋7和8组成的组中的至少五个环和/或螺旋的长度。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所述插入或缺失改变HSA结构域III的环2、3、6、7、8和9中的每一个的长度。应注意，当多个环和/或螺旋改变时，本公开预期这些环和/或螺旋均独立地发生改变，从而可以通过插入增加一或多个环/螺旋，或可以通过缺失减少一或多个环/螺旋。
对于其中结构域III包括氨基酸的插入或缺失的实施方案，本公开预期一个氨基酸的插入或缺失。同样预期超过一个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的插入或缺失。在某些实施方案中，本公开预期超过10个氨基酸残基，例如10至20、20至40、40至50、50至100个氨基酸的插入或缺失。与本公开的嵌合多肽和HSA变体多肽相一致，对包括插入或缺失的组合物进行测试以证实其保留FcRn的结合活性。优选的组合物为相对于对照提供增加的FcRn结合和/或血清半衰期的组合物。
为清晰的目的，本公开特别预期任何前述或下列方面和实施方案的组合。在包含HSA部分的嵌合多肽情形中，以及在包含HSA部分的变体HSA多肽情形中，此种HSA部分包含结构域III或其FcRn结合部分。此外，如上所述，HSA部分的结构域III包括一至十八个氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA部分的结构域III包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸取代。示例性的氨基酸取代包括：(i)用丙氨酸置换；(ii)保守的氨基酸取代；(iii)非保守的氨基酸取代。本公开预期给定多肽的结构域III中的所有氨基酸取代均可为这些氨基酸取代类型中的一者，且预期给定多肽的结构域III中的每一氨基酸取代均可个别地且独立地选自这些类别。在某些实施方案中，结构域III中的天然半胱氨酸残基得以保留并且未被取代。在某些实施方案中，结构域III中的天然脯氨酸残基得以保留并且未被取代。在某些实施方案中，结构域III中的天然半胱氨酸残基和天然脯氨酸残基得以保留并且未被取代。在某些实施方案中，半胱氨酸残基未被取代(例如，未使用半胱氨酸置换天然残基)。在某些实施方案中，脯氨酸残基未被取代(例如，未使用脯氨酸置换天然残基)。在其他实施方案中，使用二十种氨基酸中的任一种取代给定的天然残基。
同样期望包含前述氨基酸取代类型的任何组合的HSA变体和嵌合多肽。
本发明涵盖具有HSA部分的变体和嵌合多肽，所述HSA部分包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的序列中的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代的序列，以及氨基酸缺失和/或插入。保守氨基酸取代是指第一氨基酸被具有与第一氨基酸的化学和/或物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)类似特性的第二氨基酸置换。保守氨基酸取代包括一种氨基酸被用下列组中的另一种氨基酸置换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
在某些实施方案中，所述HSA变体多肽是实质上纯化的。在某些实施方案中，所述嵌合多肽是实质上纯化的。在某些方面，本公开提供组合物，其包含本公开的HSA变体或嵌合多肽，以及药物上可接受的载体。在某些实施方案中，组合物是无菌组合物。在某些实施方案中，组合物为非致热的。
6.4 组合的结构域III突变体
本发明进一步预期产生包含结构域III的HSA部分的组合突变体以及截短突变体的组，且本发明尤其可用于鉴定生物活性变体序列。可产生源自组合的变体，其相对于天然存在的HSA多肽具有选择性潜能。同样，诱变可产生具有与对应的野生型HSA多肽显著不同的细胞内半衰期的变体。例如，可使改变的蛋白质对蛋白降解或导致目标蛋白质破裂或失活的其他细胞过程更稳定或较不稳定。此类变体可用于通过调节其半衰期来改变HSA多肽水平。存在许多借此可例如由简并寡核苷酸序列产生潜在的HSA变体序列的文库的方法。可在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且接着将合成基因连接至适当的基因用以表达。简并基因组的目的是在一个混合物中提供编码所需潜在多肽序列组的所有序列。简并寡核苷酸的合成在本领域中是众所周知的(参见，例如，Narang，SA(1983)Tetrahedron39：3；Itakura等，(1981)Recombinant DNA，Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，编著.AG Walton，Amsterdam：Elsevier pp273-289；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，(1984)Science 198：1056；Ike等，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。此类技术已用于其他蛋白质的定向进化(参见，例如，Scott等，(1990)Science249：386-390；Roberts等，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及美国专利No：5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
或者，可使用其他诱变形式以产生组合文库。例如，可使用例如丙氨酸扫描诱变等通过筛选从一文库中产生和分离HSA多肽变体(Ruf等，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等，(1994)J.Bio1.Chem.269：3095-3099；Balint等，(1993)Gene 137：109-118；Grodberg等，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman  等，(1991)Biochemistry30：10832-10838；以及Cunningham等，(1989)Science 244：1081-1085)；通过接头扫描诱变(Gustin等，(1993)Virology 193：653-660；Brown等，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等，(1982)Science232：316)；通过饱和诱变(Meyers等，(1986)Science 232：613)；通过PCR诱变(Leung等，(1989)Method Cell Mol Biol：11-19)；或通过随机诱变，包括化学诱变等(Miller等，(1992)A Short Course in BacterialGenetics，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY；以及Greener等，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其以组合设置的形式的接头扫描诱变对于鉴定HSA多肽的截短(生物活性)形式是很有吸引力的方法。本文还提供产生和筛选HSA多肽变体文库的其他方法，参见(例如)命名为“举例说明”的第8章节。具体而言，章节8.10和8.11是用于产生和筛选组合HSA结构域III突变体文库的特定方法。
本公开的多肽中的氨基酸取代的上述任何实施方案均可用于产生肽文库。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的残基中产生源自组合的变体。在某些实施方案中，在以下一或多个情形下，引入且筛选结构域III突变：(i)仅变体结构域III构建体；(ii)变体结构域III构建体存在于全长HSA情形下；或(iii)在为截短HSA或包含至少结构域III的嵌合多肽的情形下。在某些实施方案中，从肽文库筛选出变体，其相对于初始多肽具有对FcRn增加的亲和力和增加的血清半衰期中的一者或两者。在某些实施方案中，使用本申请所述的标准体外测定(例如，流式细胞仪)评估变体。在某些实施方案中，鉴定出展示对FcRn增加的亲和力的变体。在其他实施方案中，筛选变体以确定对FcRn增加的亲和力是否仅出现在酸性pH下(例如，pH为约5.5)，而不出现在中性pH下(例如，pH为约7.4)。
在某些实施方案中，源自组合的变体包含在以下任何位置处的至少两个氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基407、残基415、残基463、残基495、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基521、残基523、残基524、残基526、残基527和残基557。
在某些实施方案中，源自组合的变体包含选自由下列组成的组中的至少两个氨基酸取代：L407N、L407Y、V415T、L463N、L463F、E495D、T508R、T508S、F509M、F509W、F509I、A511F、D512Y、D512M、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523F、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526A、Q526M、Q526Y、T527Y和T557G。
在某些实施方案中，源自组合的变体包含在以下位置的HSA结构域III中的氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：这些位置选自由以下组成的组：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407、447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442、450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
在某些实施方案中，在于多个物种中保守的残基中产生源自组合的变体。在某些实施方案中，在表面可及残基中产生源自组合的变体。在某些实施方案中，在表面可及且于多个物种中保守的残基中产生源自组合的变体。在某些实施方案中，在于多个物种中保守而在鸡HSA中不保守的残基中产生源自组合的变体。
在某些方面，本公开提供包含多个多肽的文库，其中所述多个多肽中的每一个都包含HSA结构域III、或其FcRn结合片段，且其中所述多个多肽中的每一个都独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述残基在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中为保守的。
在某些方面，本公开提供包含多个多肽的文库，其中所述多个多肽中的每一个都包含HSA结构域III、或其FcRn结合片段，且其中所述多个多肽中的每一个都独立包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述残基在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中为保守的，而在来自鸡的血清白蛋白中为不保守的。
在某些方面，本公开提供包含多个多肽的文库，其中所述多个多肽中的每一个都包含HSA结构域III或其FcRn结合片段，且其中所述多个多肽中的每一个都独立包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述残基为表面可及残基。
在某些方面，本公开提供包含多个多肽的文库，其中所述多个多肽中的每一个都包含HSA结构域III、或其FcRn结合片段，且其中所述多个多肽中的每一个都独立包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述残基既为(i)表面可及残基，且(ii)在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中为保守的。
在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，所述表面可及残基在HSA结构域III的环9中。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代在以下位置中，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基442、残基499和残基502。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基392、残基399、残基403、残基411、残基412、残基414、残基416、残基418、残基420、残基423、残基434、残基437、残基438、残基445、残基448、残基450、残基453、残基461、残基476、残基477、残基484、残基485、残基487、残基488、残基494、残基497、残基507、残基509、残基514、残基529、残基534、残基537、残基540、残基551、残基558、残基559、残基567、残基568、残基572。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA结构域III中的位置进行编号：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547、残基576。
在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的环2中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环2中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的环3中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环3中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的环6中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环6中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的螺旋7中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在螺旋7中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的环7中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环7中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的螺旋8中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在螺旋8中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III的环8中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环8中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环9中。在某些实施方案中，HSA结构域III包含在HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代，且另外包括不在环9中的HSA结构域III中的一或多个另外的氨基酸取代。
在任何前述或以下方面或实施方案中的某些实施方案中，氨基酸取代可为将残基变为丙氨酸。在任何前述或以下方面或实施方案中的某些实施方案中，氨基酸取代可为保守性氨基酸取代，其中用具有相似的电荷和其他特性的另一种残基取代一种残基。在任何前述或以下方面或实施方案中的某些实施方案中，氨基酸取代可为非保守性氨基酸取代，其中用不具有相似电荷和相似其他特性的另一种残基取代一种残基。在任何前述或以下方面或实施方案中的某些实施方案中，氨基酸取代可为将残基变为任何其他残基。当HSA部分包括一个以上的氨基酸残基时，可以预期取代可落入前述氨基酸取代类别中的任何一个或任何组合中。例如，所有取代可变为丙氨酸取代或可为保守性氨基酸取代，或可为非保守性氨基酸取代。或者，氨基酸取代可包括，例如，一个丙氨酸的变化、一个保守性氨基酸取代和一个非保守性氨基酸取代中的任何组合。
本领域已知广泛范围的以下技术：用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物，并且就此而言用于筛选cDNA文库的具有某种特性的基因产物。此类技术将通常适用于快速筛选通过对HSA多肽的组合诱变产生的基因文库。用于筛选大量基因文库最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆至可复制的表达载体，用所得载体文库转化适当的细胞，且在以下的条件下表达组合基因：其中，所需活性的检测有助于相对容易地分离编码其产物被检测的基因的载体。必要时，使以下描述的每个说明性测定均适用于高通分析以筛选通过组合诱变技术产生的大量简并序列。
在某些实施方案中，HSA多肽可包括肽和模拟肽。如本文所用术语“模拟肽”包括可化学上修饰的肽和肽样分子，其含有非天然存在的氨基酸、类肽等。模拟肽提供超越肽的各种优点，包括当施用于受试者时增强的稳定性。鉴定模拟肽的方法在本领域众所周知，并且包括筛选含有潜在模拟肽文库的数据库。例如，剑桥结构数据库含有超过300,000种具有已知晶体结构的化合物的集合(Allen等，ActaCrystallogr.章节B，35：2331(1979)。当没有靶分子的晶体结构可用时，可使用(例如)程序CONCORD产生结构(Rusinko等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989)。另一数据库，现有化学品目录数据库(Available Chemicals Directory)(Molecular Design Limited，InformationsSystems；San Leandro Calif.)含有大约100,000种可商购的化合物并且也可对其搜索以鉴定HSA多肽的潜在模拟肽。
在某些实施方案中，HSA多肽可进一步包含翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化(sumoylation)、生物素化或添加多肽侧链或疏水基团。因此，修饰的HSA多肽可含有非氨基酸组分，例如脂类、聚糖或单糖，以及磷酸盐。可测试此种非氨基酸组分对HSA多肽的功能性的作用以测试其生物活性，例如结合FcRn的能力。假定可以使天然HSA多肽糖基化，则在某些实施方案中，使用于根据本公开的嵌合多肽中的HSA多肽糖基化。在某些实施方案中，糖基化的水平和模式与天然HSA多肽相同或基本相同。在其他实施方案中，糖基化的水平和/或模式与天然HSA多肽不同(例如，低糖基化、过度糖基化、未糖基化)。
在本发明的某些实施方案中，包含HSA部分的多肽(例如，HSA变体或嵌合多段)可缀合至非蛋白质物质。此类非蛋白质物质包括但不限于核酸分子、化学剂、有机分子等，其中每一个可从天然来源获得(例如天然产物筛选)或可通过化学方式合成。在某些实施方案中，将HSA部分以化学方式缀合至非蛋白质物质。
在本发明的一个具体实施方案中，可用非蛋白质聚合物修饰HSA多肽。在一具体实施方案中，聚合物为聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，如以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所列的方式。PEG是熟知的水溶性聚合物，其可商购或可根据本领域熟知的方法通过乙二醇的开环聚合制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。
在某些实施方案中，HSA多肽的片段或变体将优选保留至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％与天然HSA多肽相关的生物活性。在某些实施方案中，HSA多肽的片段或变体具有相对于天然蛋白质增加的半衰期(t1/2)。对于其中半衰期增加的实施方案中，HSA片段或变体的半衰期相对于天然HSA蛋白质的半衰期增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％或甚至1000％。在一些实施方案中，在体外，例如在缓冲生理盐水或血清中，测定蛋白质半衰期。在某些实施方案中，蛋白质的半衰期为体内半衰期，例如在动物的血清或其他体液中的蛋白质的半衰期。
在某些方面，包含HSA部分的多肽可为进一步包含一或多个融合结构域的融合蛋白。此类融合结构域的熟知的例子包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G以及免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)，这些尤其可用于通过亲和层析分离融合蛋白。为进行亲和纯化，使用用于亲和层析的相关载体，例如与谷胱甘肽、淀粉酶以及镍或钴缀合的树脂。融合结构域还包括“附加表位”，其通常为可获得特异性抗体的短肽序列。可容易获得特异性单克隆抗体的熟知附加表位包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)以及c-myc标签。在一些情形下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如因子Xa或凝血酶，其允许相关蛋白酶局部消化融合蛋白，并从而从中释放出重组蛋白。接着可通过后续的层析分离从融合结构域分离出所释放的蛋白质。在某些实施方案中，HSA多肽可含有一种或多种能够使多肽稳定的修饰。例如，此类修饰增加多肽的体外半衰期，增加多肽的循环半衰期或减少多肽的蛋白水解降解。同样，在为嵌合多肽的情形下，前述修饰类型可另外附加至嵌合多肽的异源蛋白质部分。
在一些实施方案中，包含HSA部分的多肽可为具有免疫球蛋白的全部或部分Fc区域的融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白包含IgG的FcRn结合结构域或其片段。同样，在某些实施方案中，免疫球蛋白的全部或部分Fc区域可用作接头以将HSA部分连接至异源蛋白质。已知每一免疫球蛋白重链恒定区包含四或五个结构域。结构域按以下顺序命名：CH 1-铰链-CH2-CH3(-CH4)。重链结构域的DNA序列在免疫球蛋白类中具有杂交同源性，例如，IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域以及IgM和IgE的CH3结构域都是同源的。如本文所用术语“免疫球蛋白Fc区域”应理解为是指免疫球蛋白链恒定区的羧基端部分，优选为免疫球蛋白重链恒定区或其部分。例如，免疫球蛋白Fc区域可包含：1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；或5)两或两个以上结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在优选实施方案中，免疫球蛋白Fc区域包含至少一个免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选缺乏CH1结构域。在一个实施方案中，重链恒定区源自其中的免疫球蛋白类型为IgG(Igγ)(γ子类1、2、3或4)。可使用其他类型的免疫球蛋白，如IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。美国专利No.5,541,087，和5,726,044中详述了适当的免疫球蛋白重链恒定区的选择。认为从某些免疫球蛋白类型和子类型中选择特定的免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果在本领域技术人员的水平内。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选地包含铰链区的至少一部分，且优选为Fcγ的CH3结构域或IgA、IgD、IgE或IgM任何一个中的同源结构域的至少一部分。此外，可以预期，在免疫球蛋白重链恒定区中的氨基酸的取代或缺失可用于本发明的实践中。一实例为在上CH2区域中引入氨基酸取代以产生对Fc受体具有减少的亲和力的Fc变体(Cole等(1997)J.IMMUNOL.159：3613)。本领域普通技术人员可使用熟知分子生物技术制备此类构建体。同样，在嵌合多肽的情形下，可将前述修饰类型另外附加至嵌合多肽的异源蛋白质部分。
在某些方面，HSA多肽可为支架。在某些实施方案中，将蛋白质用以选择或设计可特异性与靶标结合的蛋白质骨架。当由支架设计蛋白质时，保留对骨架的有利特性重要的氨基酸残基，而可改变其他残基。在某些实施方案中，支架可具有少于或等于50％的在具有不同特性的蛋白质衍生物之间变化的氨基酸残基，以及大于或等于50％的在此类衍生物之间恒定的残基。在某些实施方案中，支架可具有少于或等于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的在具有不同特性的蛋白质衍生物之间变化的氨基酸残基，以及大于或等于55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的在此类衍生物之间恒定的残基。在某些实施方案中，支架可具有大于或等于55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的在具有不同特性的蛋白质衍生物之间变化的氨基酸残基，以及少于或等于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的在此类衍生物之间恒定的残基。在某些实施方案中，这些恒定残基赋予所有变体结构域相同的整体三维折叠，而不论其特性如何。在某些实施方案中，可如本公开的其他方面和实施方案中所述，可修饰HSA多肽支架。在某些实施方案中，HSA多肽支架为治疗剂。在某些实施方案中，HSA多肽支架对靶标可以是激动的。在某些实施方案中，HSA多肽支架对靶标可以是拮抗的。
6.5 嵌合多肽
本公开的包含HSA部分的多肽，包括HSA变体多肽可与任何异源蛋白质缀合。在某些实施方案中，异源蛋白质为治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂为抗体或肽。在某些实施方案中，嵌合多肽的异源蛋白质部分包含抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包含IgG免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，异源蛋白质包含非抗体治疗蛋白质。在某些实施方案中，嵌合多肽的异源蛋白质部分包括生长因子或细胞因子。在某些实施方案中，嵌合多肽进一步包括表位。例如，用于检测和/或纯化的表位(例如，His标签、FLAG标签等)。
在某些实施方案中，用将HSA部分化学缀合至异源蛋白质。在某些实施方案中，将HSA部分重组缀合至异源蛋白质。在某些实施方案中，使用编码HSA部分与异源蛋白质两者的重组载体产生嵌合多肽。
在某些实施方案中，在原核细胞或真核细胞中产生HSA变体。在某些实施方案中，在原核细胞或真核细胞中产生嵌合多肽。在某些实施方案中，真核细胞选自酵母细胞、鸟类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
可以各种方式制备本发明的嵌合多肽。在某些实施方案中，可将HSA部分的C端连接至异源蛋白质(例如，抗体或治疗肽)的N端。或者，可将异源蛋白质(例如，抗体或治疗肽)的C端连接至HSA部分的N端。在某些实施方案中，将HSA部分缀合至异源蛋白质的内部氨基酸。在某些实施方案中，可能的构象包括在需要时使用抗体的重链和轻链序列的截短部分以保持所连接的HSA部分和/或所连接的异源蛋白质的功能完整性。在某些其他实施方案中，HSA部分包含HSA结构域III、或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，以及HSA结构域I、或HSA结构域II、或HSA结构域I和II中的至少一部分。此外，可将异源蛋白质连接至HSA部分或其变体的暴露的内部(非末端)残基。在另外实施方案中，可使用HSA与异源蛋白质构象的任何组合，从而使得HSA与异源蛋白质的比率大于1∶1(例如，2个HSA分子：1个异源蛋白质)。
可将HSA部分与异源蛋白质彼此直接缀合。或者，可将其经由一接头序列彼此连接，所述接头序列将HSA部分与异源蛋白质分离一定距离，此距离足以确保每个结构域适当地折叠为二级结构和三级结构。在某些实施方案中，接头为可裂解接头。优选的接头(1)应采用柔性延伸构象，(2)不应展现发展有序的二级结构的倾向，所述二级结构可与HSA多肽或异源蛋白质的功能性结构域相互作用，并且(3)应具有最小的疏水性或带电特性，此会促进与功能性蛋白质结构域的相互作用。
在某些实施方案中，接头长度为至少80埃或至少
Figure BDA00002097186100472
或至少或至少
Figure BDA00002097186100474
或至少或至少
Figure BDA00002097186100476
或至少
Figure BDA00002097186100477
在某些实施方案中，接头长度介于约
Figure BDA00002097186100478
至约
Figure BDA00002097186100479
之间，或介于约
Figure BDA000020971861004710
至约
Figure BDA000020971861004711
之间，或介于约
Figure BDA000020971861004712
至约之间。
在某些实施方案中，接头为肽接头。在某些实施方案中，接头为肽接头，且所述肽接头具有一或多个以下特征：a)其允许异源蛋白质序列和HSA部分相对于彼此旋转；b)其对蛋白酶消化有抗性；以及c)其不与异源蛋白质序列或HSA部分互相作用。在柔性蛋白质区域中的典型表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。期望含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的排列以满足上述接头序列的标准。其他接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用于接头序列中。在某些实施方案中，肽接头中的每个氨基酸均选自由Gly、Ser、Asn、Thr和Ala组成的组中。在某些实施方案中，肽接头包括Gly-Ser组分。在特定的实施方案中，肽接头包含一或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复。在特定的实施方案中，肽接头包含1、2、3、4、5、6或7个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复。在特定的实施方案中，可使用长度为约20个氨基酸的接头序列，以便提供适当分开功能性蛋白质结构域，尽管也可使用较长或较短的接头序列。分开HSA多肽和异源蛋白质的接头序列的长度可为5至500个氨基酸的长度，或更优选5至100个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头序列的长度为约5至60或约5至30个氨基酸。在某些实施方案中，接头序列为约5至约20个氨基酸，且有利地为约10至约30个氨基酸。在其他实施方案中，接合HSA部分与异源蛋白质的接头可为抗体的恒定结构域(例如，抗体的Fc区域的全部或部分)。在某些实施方案中，接头为可分裂解接头。
在某些实施方案中，可使用熟知的交联剂和方案产生本发明的嵌合多肽。例如，存在大量本领域技术人员已知的化学交联剂，并且其可用于使HSA多肽与异源蛋白质(例如，抗体)交联。例如，交联剂为异双官能团交联剂，其可用于以逐步方式连接分子。双官能团交联剂提供设计用于缀合蛋白质的更特异的偶联方法的能力，从而减少不需要的副反应的出现，例如同源蛋白质聚合物。本领域已知大量的异双官能团交联剂，包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基硫代)-丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂可作为N-羟基硫代琥珀酰亚胺类似物而得到，其通常具有更高的水溶性。此外，反而那些在连接链中具有二硫桥的交联剂可合成为烷基衍生物，以便减少体内接头裂解的量。除异双官能团交联剂外，还存在许多其他交联剂，包括同双官能团交联剂和光敏交联剂。辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、二马来酰亚胺己烷(BMH)和庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(DMP)是有用的同双官能团交联剂的例子，而双-[B-(4-叠氮水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚胺基-6(4’-叠氮基-2’-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH)为可用于本发明的光敏交联剂的例子。关于蛋白质偶联技术的最新评论参见Means等(1990)Bioconjugate Chemistry.1：2-12，其以引用的方式并入本文。
上文所包括的尤其有用的异双官能团交联剂类型含有伯胺反应基团，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，或其水溶性类似物N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。在碱性pH下的伯胺(赖氨酸ε基团)未质子化，并且其通过在NHS或sulfo-NHS酯上的亲核攻击发生反应。此反应导致酰胺键的形成，并释放出副产物NHS或sulfo-NHS。另一用作异双官能团交联剂部分的反应基团为硫醇反应基团。常见的硫醇反应基团包括马来酰亚胺、卤素和吡啶二硫化物。具体而言，马来酰亚胺在微酸至中性(pH 6.5-7.5)条件下与自由巯基(半胱氨酸残基)在几分钟内反应。卤素(碘代乙酰基官能团)在生理pH下与SH基团反应。这些反应基团都导致形成稳定的硫醚键。异双官能团交联剂的第三种组分是间隔臂或桥。桥是连接两个反应端的结构。桥最明显的特征是对位阻的影响。在一些情况中，较长的桥可以更容易跨越连接两个复杂生物分子所需的距离。
使用异双官能团试剂制备蛋白质缀合物的方法是两步的过程，包括胺反应和巯基反应。对于第一步胺反应，所选蛋白质应含有伯胺。此伯胺可为赖氨酸ε胺或在大多数蛋白质的N端发现的伯α胺。所述蛋白质不应含有自由巯基。在将要缀合的蛋白质都含有自由巯基的情形下，可修饰其中一种蛋白质以便使用(例如)N-乙基马来酰亚胺来阻断所有巯基(参见Partis等(1983)J.Pro.Chem.2：263，其以引用的方式并入本文)。在特定蛋白质中，可使用Ellman试剂计算巯基的量(参见，例如Ellman等(1958)Arch.Biochem.Biophys.74：443和Riddles等(1979)Anal.Biochem.94：75，其以引用的方式并入本文)。
在某些实施方案中，可通过使用以下参考文献中描述的标准蛋白质化学技术产生本发明的嵌合多肽：Bodansky，M.Principles ofPeptideSynthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant G.A.(编著)，SyntheticPeptides：A User′s Guide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)。此外，肽自动合成仪可以商购(例如，Advanced ChemTechModel 396；Milligen/Biosearch 9600)。在任何前述用于将HSA化学缀合至异源蛋白质的交联方法中，均可使用可裂解结构域或可裂解接头。裂解允许将异源蛋白质与HSA多肽分离。例如，在嵌合多肽穿透细胞后，可裂解接头的裂解将允许从异源蛋白质中分离出HSA。
在某些实施方案中，本发明的嵌合多肽可产生为含有HSA部分和异源蛋白质(例如，抗体或治疗肽)的融合蛋白，其表达为一个邻接的多肽链。此类嵌合多肽在本文中称为以重组方式缀合的多肽。在制备此类融合蛋白时，构建融合基因，其包含编码HSA部分和异源蛋白质以及任选的跨越所述HSA部分和异源蛋白质的肽接头序列的核酸。使用重组DNA技术产生融合基因，翻译产物为所需的融合蛋白，这在本领域中是众所周知的。基因的编码序列和其调控区域都可重新设计以改变蛋白质产物的功能特性、所制得蛋白质的量，或其中产生所述蛋白质的细胞类型。可大规模改变基因的编码序列-例如，通过将部分所述基因融合至不同基因的编码序列以产生编码融合蛋白的新型杂合基因。在PCT申请PCT/US87/02968、PCT/US89/03587和PCT/US90/07335以及Traunecker等(1989)Nature 339：68中描述了用于产生融合蛋白的方法的实例，所述文献以引用的方式并入本文。本质上，采用用于连接、限制酶消化的平端或交错端，根据常规技术进行对编码不同多肽序列的各种DNA片段的接合，以提供适当的末端，酌情加入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的结接合和酶连接。或者，可通过常规技术，包括DNA自动合成仪来合成融合基因。在另一方法中，可使用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，其产生两个连续基因片段之间互补的突出，所述连续基因片段可随后进行退火以产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等John Wiley & Sons编著：1992。如本领域众所周知的，可使用各种表达系统以重组方式产生由融合基因编码的嵌合多肽(同样参见下文)。
重组缀合的嵌合多肽包括其中将HSA部分缀合至异源蛋白质的N端或C端的实施方案。
在一些实施方案中，如美国专利公布No.2003/0166877中所述，通过鉴定在跨越嵌合多肽的连接区域内的候选T细胞表位且改变连接区内的氨基酸来降低嵌合多肽的免疫原性。
术语嵌合蛋白用来指包含HSA部分(例如HSA变体多肽)和异源蛋白质的蛋白质，而不管这些部分是否互连(例如，化学缀合或重组缀合)。就其本身而言，术语嵌合蛋白、融合蛋白和缀合蛋白质可互换使用。
示例性的异源蛋白质种类包括但不限于酶、生长因子和细胞因子。在某些实施方案中，异源蛋白质是抗体。
用于包含HSA部分的嵌合多肽中的异源蛋白质可为治疗蛋白质，或其片段，例如生长因子、酶、骨形态发生蛋白质和可溶受体片段。示例性的异源多肽包括生长因子，例如肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF；生长因子的EFG家族的成员)、成纤维细胞生长因子(FGF；生长因子的FGF家族的成员)、转化生长因子(例如TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3)、血管内皮生长因子(VEGF；例如，VEGF-2)、干扰素(例如，INF-α、INF-β)、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2)、细胞因子和胰岛素。其他示例性的异源蛋白质包括酶。其他示例性的异源多肽包括骨形态发生蛋白质(BMP；蛋白质BMP家族的成员)、促红细胞生成素(EPO)、肌肉抑制素(myostatin)以及肿瘤坏死因子(例如，TNF-a)。其他示例性的异源多肽包括跨膜受体的细胞外结构域，包括细胞受体及其任何变体(包括突变体、片段和模拟肽形式)的任何天然存在的细胞外结构域。
用于包含HSA部分的嵌合多肽中的异源蛋白质可为治疗蛋白质或其片段，包括抗体或其抗原结合部分。示例性的抗体和抗体片段包括但不限于
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Figure BDA00002097186100522
Figure BDA00002097186100523
等。
6.6 HSA相关核酸和表达
在某些方面，本公开提供包含核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列编码本公开的任何多肽(例如，HSA变体和具有HSA部分的嵌合多肽)。此外，本发明使用此类核酸以产生嵌合多肽或HSA变体多肽(例如，HSA部分-包括其生物活性片段、变体和融合物)。在某些特定实施方案中，核酸可进一步包括DNA，其编码异源蛋白质(例如，抗体或治疗肽)以制备本发明的重组嵌合蛋白。所有这些核酸可统称为HSA核酸。
在某些方面，本公开提供核酸构建体，其包含(i)编码人血清白蛋白(HSA)部分的核苷酸序列，所述HSA部分包含HSA结构域III或其FcRn结合片段，所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代，其可操作地连接至(ii)编码异源蛋白质的核苷酸序列，其中所述核酸构建体编码保留异源蛋白质的功能活性且可与FcRn结合的嵌合多肽，且其中所述嵌合多肽相对于其中HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照嵌合多肽，具有增加的半衰期和/或对FcRn的亲和力。
在某些实施方案中，由核酸构建体编码的嵌合多肽以比所述对照嵌合多肽更高的亲和力与FcRn结合。在某些实施方案中，由核酸构建体编码的嵌合多肽相对于所述对照嵌合多肽具有增加的血清半衰期。在某些实施方案中，由核酸构建体编码的嵌合多肽具有上述两种特性。
在某些实施方案中，(i)包含编码人血清白蛋白(HSA)部分的核苷酸序列，所述HSA部分包含HSA结构域III或其FcRn结合片段，所述HSA结构域III包含一至十八个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)氨基酸取代。
在某些实施方案中，在由核酸构建体编码的HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中保守的残基。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均是在多个物种中保守的残基。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，在HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。在某些实施方案中，HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
在某些实施方案中，(i)包含编码与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的HSA结构域III的核苷酸序列。在某些实施方案中，(i)包含编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的HSA构域III核苷酸序列。在某些实施方案中，(i)包含编码与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的HSA部分的核苷酸序列。
在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。在某些实施方案中，至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
在某些实施方案中，(ii)包含编码异源蛋白质的核苷酸序列，所述异源蛋白质包含抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，(ii)包含编码异源蛋白质的核苷酸序列，所述异源蛋白质包括治疗蛋白质。
在某些实施方案中，核苷酸序列另外编码IgG免疫球蛋白的恒定区。
在某些实施方案中，(ii)包含编码异源蛋白质的核苷酸序列，所述异源蛋白质包括生长因子或细胞因子。在某些实施方案中，核苷酸序列另外包含编码接头的核苷酸序列。
核酸可为单链或双链DNA或RNA分子。在某些实施方案中，本公开涉及分离或重组的核酸序列，其编码与HSA序列(例如，SEQID NO：1和2)的相同区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的HSA部分。在另外的实施方案中，可对HSA核酸序列进行分离、重组和/或与异源核苷酸序列融合或在DNA文库中。
在某些实施方案中，HSA核酸还包括这样的核苷酸序列，其在高严格度条件下与上述天然HSA核苷酸序列或其互补序列杂交。本领域技术人员将容易理解，可改变促进DNA杂交的适当的高严格度条件。例如，可在大约45℃下于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，之后在50℃用2×SSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃下约2×SSC的低严格度至50℃下约0.2×SSC的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从约22℃室温下的低严格度条件增加至约65℃下的高严格度条件。温度和盐均可改变，或者温度或盐浓度可保持恒定而改变其他变量。在一实施方案中，本发明提供核酸，其在室温下于6×SSC的低严格度条件下杂交，接着在室温下以2×SSC洗涤。
由于遗传密码的简并性而与天然HSA核酸不同的分离核酸也在本发明的范畴内。例如，许多氨基酸由一个以上的三联体命名。明确指明相同氨基酸或同义词(例如，CAU和CAC为组氨酸的同义词)的密码子可导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预期确实导致受试者蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员应理解，由于天然等位基因变化，在编码特定蛋白质的核酸的一或多个核苷酸(高达约3-5％的核苷酸)的这些变化可存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变化和产生的氨基酸多态性均在本发明的范畴内。
在某些实施方案中，可将重组HSA核酸操作地连接至表达构建体中的一或多个调控核苷酸序列。调控核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。本领域已知用于多种主宿主胞的许多类型的合适的表达载体和合适的调控序列。通常，所述一或多个调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。本发明预期如本领域已知的组成型可诱导型启动子。启动子可为天然存在启动子或组合一个以上启动子组分的杂交启动子。表达构建体可存在于细胞内附加体(例如质粒)上，或表达构建体可插入染色体中。在优选的实施方案中，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择标记基因在本领域中众所周知且其将随所用宿主细胞而不同。在某些实施方案中，本发明涉及包含核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列编码HSA多肽且可操作地连接至至少一个调控序列。调控序列为本领域所公认的且其经选择以指导所编码的多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性的调控序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。应理解，表达载体的设计可取决于这样的因素，诸如对待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型。此外，还应考虑载体的拷贝数量、控制拷贝数量的能力和由所述载体编码的任何其他蛋白质(例如抗生素标记)的表达。
本发明还涉及用编码本发明的HSA多肽或嵌合多肽的重组基因转染的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，可在细菌细胞中表达HSA多肽或嵌合多肽，例如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒属表达系统)、酵母或哺乳动物细胞。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员所已知。
本发明进一步涉及产生本发明的HSA多肽、异源蛋白质和/或嵌合多肽的方法。例如，可在适当的条件下培养用编码HSA多肽或嵌合多肽的表达载体转染的宿主细胞以允许多肽的表达。多肽可分泌并从细胞和含有多肽的培养基的混合物中分离。或者，多肽可保留在细胞质或细胞膜部分中和所收获、溶解的细胞中以及所分离的蛋白质中。细胞培养物包括宿主细胞、介质和其他副产物。适于细胞培养基的介质在本领域中众所周知。可从细胞培养基、宿主细胞中分离出多肽，或同时使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳以及用对多肽的特定表位(例如，HSA多肽)特异的抗体进行的免疫亲和纯化。在优选实施方案中，多肽为含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。
可通过将克隆基因或其部分连接至载体来产生重组HSA核酸，所述载体适合在原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达。用于产生重组多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括用于在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达的以下类型的质粒：pBR322衍生质粒、pEMBL衍生质粒、pEX衍生质粒、pBTac衍生质粒和pUC衍生质粒。优选的哺乳动物表达载体含有有助于载体在细菌中增殖的原核序列以及在真核细胞中表达的一或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生载体为适合转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。这些载体中的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列修饰，以有助于在原核细胞和真核细胞中的复制和抗药性选择。或者，可使用诸如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)的病毒的衍生物以用于在真核细胞中暂时表达蛋白质。制备质粒和转化宿主生物所采用的各种方法在本领域中众所周知。对于适合原核和真核细胞的其他表达系统以及一般重组程序参见Molecular Cloning ALaboratory Manual，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)第16、17章。在一些实例中，期望通过使用杆状病毒表达系统表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括PVL衍生载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生载体(例如含有pBlueBac III的β-gal)。
制备融合基因的技术众所周知。本质上，采用用于连接、限制酶消化的平端或交错端，根据常规技术进行对编码不同多肽序列的各种DNA片段的接合，以提供适当的末端，酌情加入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的接合和酶连接。在其他实施方案中，可通过常规技术，包括DNA自动合成仪，来合成融合基因。或者，可使用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，其产生两个连续基因片段之间互补的突出，所述连续基因片段可随后进行退火以产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著.John Wiley&Sons：1992)。
6.7 治疗方法
在某些实施方案中，本公开提供使用本公开的嵌合融合物的异源蛋白质治疗可治疗病症的方法。在某些实施方案中，本公开提供增加受试者体内蛋白质的血清半衰期和/或增加对FcRn的结合亲和力的方法，包括将所述蛋白质缀合至HSA部分，所述HSA部分包含结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段。在某些实施方案中，HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于所得对照多肽，增加相关嵌合多肽对FcRn的亲和力和增加血清半衰期中的一者或两者。这些方法对需要其的个体施用治疗有效量的如上所述的嵌合或HSA变体多肽。在某些实施方案中，所述方法包括施用嵌合多肽，其包含(a)HSA部分或其生物活性片段以及(b)异源蛋白质。这些方法尤其针对动物而言的治疗或预防治疗，并且更具体为人。
应注意，可治疗的特定疾病和病症取决于嵌合蛋白的异源蛋白质部分。此外，本公开预期，包括适用于治疗特定疾病或病症的异源蛋白质的嵌合多肽可作为治疗方案的一部分与一种或多种其他化合物或其他适合治疗特定疾病或病症的治疗形式一起施用。此外，本公开预期，给定患者年龄、体重、健康状况、病情等，以与医学上适当的治疗一致的方式施用嵌合多肽。
举例而言，若异源蛋白质为Humira，则嵌合多肽可用于(例如)治疗类风湿性关节炎、银屑病、幼年关节炎和克罗恩氏病。若异源蛋白质为胰岛素，则嵌合多肽可用于(例如)胰岛素的治疗。
本文所用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等通常指获得所需的药理学和/或生理学的效果。就完全或部分预防疾病、病症或其症状而言，效果可为预防性的，和/或就部分或完全治疗疾病或病症和/或归因于疾病或病症的不利影响而言，效果可为治疗性的。本文所用的“治疗(treatment)”涵盖哺乳动物，尤其是人的疾病或病症的任何治疗，其包括：(a)防止疾病或病症出现在可能倾向于患所述疾病或病症但仍未诊断为患有所述疾病或病症的受试者中；(b)抑制疾病或病症(例如，阻止其发展)；或(c)缓解疾病或病症(例如，使疾病或病症消退，提供一种或多种症状的改善)。根据本领域中已知的标准方法和技术可容易地评估任何病症的改善。通过所述疾病的方法治疗的受试者群体包括患有不期望的病症或疾病的受试者，以及病症或疾病有发展风险的受试者。
术语“有疗效的剂量”或“有效量”是指对施用对象产生所需效果的剂量。精确的剂量取决于治疗目的，且本领域技术人员可使用已知技术来确定(参见，例如Lloyd(1999)The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
在某些实施方案中，可一起(同时)或在不同时间(按顺序)施用本发明的一种或多种嵌合或HSA变体多肽。此外，可与用于治疗相同疾病或症状的一种或多种其他化合物或疗法组合施用本发明的嵌合或HSA变体多肽。例如，可连同一种或多种治疗化合物共施用一种或多种嵌合或HSA变体多肽。组合治疗可包括同时或交替施用。此外，组合可包括急性或慢性施用。任选地，本发明的嵌合或HSA变体多肽和另外的化合物以相加或协同的方式作用以治疗疾病或症状。用于组合治疗的另外的化合物包括但不限于小分子、多肽、抗体、反义寡核苷酸和siRNA分子。此外，组合治疗还包括本文公开的方法连同其他非药物治疗。根据组合治疗、的性质，可在施用其他治疗的同时和/或之后，继续施用本发明的嵌合或HSA变体多肽。可以单剂量或多次剂量施用嵌合或HSA变体多肽。在某些实施例中，嵌合或HSA变体多肽的施用在其他治疗之前至少几天开始，而在其他情况中，在施用其他治疗之前或同时开始施用。
6.8 施用方法
在某些实施方案中，对所述受试者施用包括全身施用HSA变体或嵌合多肽。在某些实施方案中，对所述受试者施用包括通过口服施用HSA变体或嵌合多肽。在某些实施方案中，对所述受试者施用包括通过静脉内施用所述HSA变体或嵌合多肽。
在某些方面，本公开提供包含本公开的HSA变体或嵌合多肽以及药学上可接受载体的组合物。在某些实施方案中，组合物为无菌组合物。在某些实施方案中，组合物为非致热的。
已知各种递送系统且其可用于施用本公开的嵌合或HSA变体多肽，例如，封装在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见(例如)Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入方法可为肠内或肠外途径，其包括但不限于皮内、透皮、肌肉内、腹膜内、静脉、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外、局部或经口服的途径。在特定实施方案中，肠外引入包括经肌肉内、皮下、静脉内、血管内和心包内的施用。
可以任何方便的途径施用嵌合或HSA变体多肽，例如通过输注或弹丸注射、通过经由上皮细胞或黏膜皮肤内层(例如口腔黏膜、直肠和肠道黏膜等)吸收，且可将其与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身的或局部的。也可例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的制剂采用经肺施用。
在某些实施方案中，期望将本发明的嵌合或HSA变体多肽局部施用于需要治疗的区域(例如，肌肉)；此可通过例如以下方法实现，但不仅限于这些方法：外科手术期间局部输注、局部敷用，例如，通过注射、借助导管或借助植入物，所述植入物可为多孔的、非多孔的或凝胶状材料，包括膜，诸如sialastic膜、纤维或市售皮肤替代品。
在其他实施方案中，可在泡囊中，尤其是在脂质体中递送本公开的嵌合或HSA变体多肽(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533)。在另一实施方案中，可在控释系统中递送本公开的嵌合或HSA变体多肽。在另一实施方案中，可使用泵(参见Langer，1990，同上文)。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在某些特定实施方案中，可通过静脉内递送本公开的嵌合或变体多肽。
在某些实施方案中，可通过静脉输注施用嵌合或HSA变体多肽。在某些实施方案中，在至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟或至少30分钟的时间段内输注嵌合或HSA变体多肽。在其他实施方案中，在至少60分钟、90分钟或120分钟的时间段内输注嵌合或HSA变体多肽。不论输注时间如何，本公开预期每次输注为整个治疗方案的一部分，其中根据定期计划(例如，每周、每月等)施用嵌合或HSA变体多肽。
6.9 评估方法
本公开的嵌合多肽基于以下来表征：(i)基本保留异源蛋白质的功能以及(ii)相对于缀合至非修饰HSA部分的嵌合多肽或相对于另一适当的对照，具有对FcRn增加的亲和力和/或增加的血清半衰期。本公开的HSA变体多肽基于以下来表征：相对于天然HSA部分或相对于另一适当的对照，具有对FcRn增加的亲和力和/或增加的血清半衰期。可在在体内或体外进行的任何一种或多种适当的测定中，评估嵌合多肽或HSA变体多肽的特性。
举例而言，可使用(例如)实施例中所述的任何一种或多种测定或其他结合测定来体外评估对FcRn的亲和力(Ka和/或Kd)。同样，可使用(例如)实施例中所述的任何一种或多种测定或其他结合测定体外评估Koff和/或Kon。
对抗原和抗体之间结合的亲和力常数和特异性的测量是决定使用抗-HSA抗体的治疗、诊断或研究方法的功效的关键因素。“结合亲和力”一般是指在分子(例如，抗体、HSA部分)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原、FcRn)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外说明，如本文所用“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可表示为平衡解离常数(Kd或KD)，计为Koff/Kon之比率。参见，例如Chen，Y.等，(1999)J.Mol Biol293：865-881。可用本领域已知的常见方法，包括本文所述和例举的那些(例如BIAcore)测量亲和力。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原且趋于保持更长久的结合。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。
在某些实施方案中，嵌合多肽或变体HSA多肽相对于对照，对FcRn具有增加约1.5、2、2.5、3、4倍或约5倍的亲和力。在其他实施方案中，嵌合多肽相对于对照，具有提高大于5倍或甚至大于10倍的亲和力。在某些实施方案中，嵌合多肽或变体HSA多肽相对于对照，具有提高大于20、25、40倍或大于50倍的亲和力。在某些实施方案中，嵌合多肽或变体HSA多肽相对于对照，具有提高大于约5至10倍、约10至20倍、约25至40倍、约40至50倍、或约75至100倍的亲和力。当通过计算Ka评估亲和力时，亲和力的这些提高转化成Ka的增加(例如，如上所述，2倍、5倍、10倍等)。当通过计算Kd评估亲和力时，亲和力的这些提高转化成Kd的减少(例如，如上所述，2倍、5倍、10倍等)。
在某些实施方案中，对FcRn的亲和力在低pH(例如，pH～5.5)下增加。在某些其他实施方案中，对FcRn的亲和力在低pH(例如，pH～5.5)下增加，而在中性pH(例如，pH～7.2)不变。
进一步举例来说，可在人或动物模型内测量血清半衰期。任何动物模型(包括但不限于具有人FcRn的转基因动物)中血清半衰期的增加足以将嵌合或has变体多肽表征为：相对于对照，具有增加的血清半衰期。
在一实施方案中，嵌合多肽或HSA变体多肽在血中具有不少于10天、优选不少于约14天的半衰期，且最优选不少于天然血清白蛋白蛋白质或其同系物50％的半衰期。在另一实施方案中，嵌合多肽或HSA变体多肽的半衰期相对于对照多肽，增加约1.5、2、2.5、3、4倍或约5倍。在某些实施方案中，嵌合多肽或HSA变体多肽的半衰期相对于对照多肽，增加大于5倍，或甚至大于10倍。在某些实施方案中，嵌合多肽或HSA变体多肽的半衰期相对于对照多肽，增加大于20、25、40倍，或大于50倍。在某些实施方案中，嵌合多肽或变体HSA多肽的半衰期相对于对照多肽，增加约5至10倍、约10至20倍、约25至40倍、约40至50倍、或约75至100倍。
评估嵌合多肽是否基本上保留异源蛋白质功能的合适的测定将取决于异源蛋白质及其天然功能。然而，可在任何适当的体外或体内(包括在动物模型中)测定中评估功能。示例性的功能包括但不限于(i)与特定受体结合的能力；(ii)诱导或抑制经由特定信号转导途径的信号转导的能力；(iii)诱导或抑制细胞凋亡的能力；(iv)诱导或抑制血管生成的能力；(v)刺激或抑制细胞增殖的能力；(vi)促进或抑制细胞分化的能力；(vii)促进细胞存活的能力；以及(viii)促进或抑制另一种蛋白质因子分泌的能力。
在某些实施方案中，组成生物活性异源蛋白质的本公开的嵌合多肽比生物活性异源蛋白质本身(例如，未融合至HSA部分)更有效。例如，嵌合多肽的活性比单独的生物活性蛋白质序列的活性的高2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或甚至1000倍，例如，多1、2或甚至3个数量级。因此，在其中生物活性肽序列抑制生物活性的实施方案中，嵌合多肽的IC50比单独的生物活性蛋白质的IC50低10倍、100倍或甚至1000倍，并且在其中生物活性蛋白质序列诱导或促进生物活性的实施方案中，嵌合多肽的EC50比单独的生物活性肽的EC50低10倍、100倍或甚至1000倍。在其中生物活性蛋白质序列与生物分子(例如，核酸、肽或碳水化合物)结合的实施方案中，嵌合多肽与其所结合的生物分子的解离常数Kd可比生物分子与单独的生物活性蛋白质的Kd低10倍、100倍或甚至1000倍，例如，两个实体的结合逐步胜过其解离。
6.10 药物组合物
在某些实施方案中，将本公开的主题嵌合或HSA变体多肽与药学上可接受的载体配制。可将一种或多种嵌合或HSA变体多肽单独施用或作为药物制剂(组合物)的组分施用。嵌合或HSA变体多肽可经配制用于以任何便利的方式施用来用于人或兽医医学中。在组合物中还可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬质酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
主题嵌合或HSA变体多肽的制剂包括适合口服、鼻、局部、肠胃外、直肠和/或叶鞘内施用的那些。制剂可方便地以单位计量形式存在且可用药剂学领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂量形式的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定的施用模式而变。可与载体材料组合以产生单一剂量形式的活性成分的量一般为产生疗效的化合物的量。
在某些实施方案中，制备这些制剂或组合物的方法包括将其他类型的治疗剂和载体以及任选的一种或多种助剂组合。一般而言，可用液体载体，或精细分离的固体载体，或其两者制备制剂，并且如有需要则然后给产物定型。
口服施用的制剂形式可为胶囊、扁囊剂、药丸、片剂、锭剂(使用调味基底，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、粉末、颗粒、或在水溶性或非水溶性液体中的溶液或悬浮液，或水包油或油包水液体乳化液，或酏剂或糖浆，或糖果锭剂(使用惰性基底，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)，和/或漱口水等，每一形式均含有预定量的主题多肽治疗剂作为活性成分。除活性化合物外，悬浮液可含有悬浮剂，例如乙氧基异硬酯醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶，及其混合物。
在用于口服施用的固态剂形(胶囊、片剂、药丸、糖衣丸剂、粉末、颗粒等)中，可将本发明的一种或多种多肽治疗剂与一种或多种药学上可接受载体(诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或下列任何试剂混合：(1)填料或填充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和/或硅酸；(2)粘结剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖，和/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻朊酸、某些硅酸盐，以及碳酸钠；(5)溶液阻燃剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如十六烷基醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和药丸的情形下，药物组合物还可包含缓冲剂。还可使用赋形剂，诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等，将相似类型的固体组合物用作软式和硬式填充的明胶胶囊中的填料。用于口服施用的液体剂形包括药学上可接受的乳化剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂形可含有本领域常用的惰性稀释剂(例如水或其他溶剂)，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。
适合肠胃外施用的药物组合物可包含与一种或多种与药学上可接受的以下试剂组合的一种或多种嵌合或HSA变体多肽：无菌等渗水溶性或非水溶性溶液、分散液、悬浮液或乳化液或无菌粉末，所述无菌粉末可仅在使用之前重组于无菌可注射溶液或分散液中，所述无菌可注射溶液或分散液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明的药物组合物的适合的水溶性和非水溶性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。例如，借助使用包衣材料(例如卵磷脂)，通过保持在分散体情形下所需颗粒的尺寸，以及借助使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸苯酚等)确保防止微生物的作用。还期望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过纳入延迟吸收的试剂(例如单硬质酸钠和明胶)引起可注射药物形式的延迟吸收。
在某些实施方案中，本公开的组合物，包括药物组合物，为非致热的。换言之，在某些实施方案中，组合物基本为无热源的。在一实施方案中，本发明的制剂为无热源制剂，其基本上无内毒素和/或相关的致热物质。内毒素包括限制在微生物体内且仅当微生物破裂或死亡时才释放出来的毒素。致热物质还包括来自细菌和其他微生物的外膜的发热诱导的耐热性物质(糖蛋白类)。如果这些物质施用于人时均会导致发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从通过静脉内施用的药物溶液中移除。食品药物管理局(″FDA″)已规定对静脉药物施用在单个一小时内，每公斤体重每一剂量的内毒素单位(EU)的上限为5(The United States PharmacopeialConvention，Pharmacopeial Forum 26(1)：223(2000))。当对每公斤体重以几百或几千毫克的量施用治疗蛋白质时，即使存在抗体的情形下，甚至微量的有害和危险的内毒素也必须清除。在某些特定的实施方案中，组合物中的内毒素和热源水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。
通过在可生物降解的聚合物(例如聚交酯-聚乙交酯)中形成一种或多种多肽治疗剂的微胶囊基体来制备可注射的沉淀物形式。根据药物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。还可通过使药物陷入与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备沉淀物可注射制剂。
在某些实施方案中，根据常规程序将本公开的嵌合或HSA变体多肽配制为适合静脉内施用于人的药物组合物。需要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。在通过输注施用组合物时，可配含有无菌医药级水或盐水的输液瓶。在通过注射施用组合物时，可提供用于注射的一安瓿无菌水或盐水以在施用前可使其成分混合。
可通过标准临床技术确定对治疗组织相关病症或及疾病有效的本公开的嵌合或HSA变体多肽的量。此外，任选地可采用体外测定以有助于鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径和病症的严重程度，且应根据行医者的判断和每一受试者的情况来决定。然而，用于静脉施用的适当剂量范围一般为每公斤体重约20-5000毫克的活性嵌合或HSA变体多肽。用于鼻内施用的适当剂量范围一般为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断有效剂量。
6.11 制品和试剂盒
在某些实施方案中，本公开还提供药物包或试剂盒，其包含装有本公开的至少一种嵌合或HSA变体多肽的一个或多个容器。在特定的实施方案中，本公开的制剂包含嵌合或HSA变体多肽，其以重组方式融合或化学缀合至另一部分，所述部分包括但不限于异源蛋白质、异源多肽、异源肽、大分子、小分子、标记序列、诊断或可检测剂、治疗部分、药物部分、放射性金属离子、第二抗体以及固体支架。在特定的实施方案中，在单剂量小瓶中将本公开的制剂配制为无菌液。可在目标体积为1.2mL的3cc USP Type I的硼硅酸盐琥珀小瓶中提供本公开的制剂(West Pharmaceutical Serices-Part No.6800-0675)。示例性的容器包括但不限于小瓶、瓶子、预填充注射器、IV包、吸塑包装(包含一或多个药丸)。任选地，与这样的容器相关的可是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映对人诊断和/或施用时政府机构对制造、使用或销售的许可。
在某些实施方案中，还提供包含嵌合或HSA变体多肽的试剂盒，其适用于各种目的，例如增加治疗剂的血清半衰期或增加FcRn结合亲和力。为分离和纯化试剂，试剂盒可含有偶合至珠子(例如琼脂糖珠子)的多肽。可提供含有多肽的试剂盒，用于(例如)在ELISA或Western blot(蛋白质印记)中检测和量化体内靶标。至于制品，试剂盒包含容器和在容器上或与其相关的标签或说明书。所述容器容纳包含本公开的至少一种嵌合或HSA变体多肽的组合物。还可包括其他容器，其含有(例如)稀释液和缓冲液、对照诊断剂。标签或说明书可提供组合物的描述以及意欲体外或诊断使用的说明。
6.12 腺病毒载体和方法
适用于自宿主细胞产生重组腺病毒颗粒的DNA载体在本领域众所周知且商用试剂容易获得(参见，例如，Invitrogen，目录No.V493-20和V494-20)。本公开提供一种用于通过将OriP序列并入用于产生腺病毒颗粒(本文亦称作腺病毒载体)的DNA载体来增强重组腺病毒产生的方法。含有腺病毒载体的OriP可进一步包含用于表达EBNA-1蛋白质的序列或作为选择表达EBNA-1蛋白质的宿主细胞用于产生重组腺病毒颗粒。含有腺病毒载体的OriP尤其可用于产生重组腺病毒群，其包含目标DNA序列(例如，编码HSA结构域III变体的DNA序列)的不同/复合文库。
使用本领域已知的大量技术可容易地将OriP序列设计成任何已知的腺病毒载体。例如，若使用网关重组系统，则OriP序列应位于入门载体或腺病毒目的载体的att重组位点之间。当将序列添加至腺病毒载体时，应小心避免将其插入会干扰腺病毒DNA复制或组装的位点中。或者或任选地，可将含有OriP序列的腺病毒载体设计成也表达EBNA-1蛋白质(参见图10)。通过自腺病毒载体直接表达EBNA-1蛋白质，宿主细胞不需要表达EBNA-1基因。
本发明的腺病毒载体包含OriP序列和腺病毒基因组序列。本发明的腺病毒载体可进一步包含一种或多种以下元件：
(i)重组位点(例如，attR1和attR2)，其用于与另一载体的重组克隆，此类位点可用于影响在自当前载体产生的重组腺病毒中表达的目标DNA序列的克隆；
(ii)抗生素/药物(例如，氯霉素)抗性基因和/或毒素表达基因(例如，ccdB基因)，其可用于选择和/或逆选择；
(iii)克隆位点(可为多克隆位点)，其可用于亚克隆目标DNA序列；
(iv)目标DNA，其可包含编码一种或多个种目标蛋白质的一种或多种目标基因；
(v)启动子，其用于在范围广泛的哺乳动物细胞中表达目标基因(例如，人巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子)，所述启动子可为组成型的或可为可诱导型的；
(vi)表位标签(例如，His6X表位)，其用于检测和/或纯化目标蛋白质。所述表位标签可存在于目标重组蛋白的5’或3’端；
(vii)聚腺苷酸化(polyA)序列(例如，类人猿40病毒聚腺苷酸序列)，其用于有效的mRNA的转录终止和聚腺苷酸化；
(viii)复制起点，其用于以高拷贝复制和保持大肠杆菌中的质粒；
(ix)抗生素抗性基因，其用于在大肠杆菌中的选择；
(x)限制酶位点(例如，PacI)，其用于线性化载体，所述限制酶位点可在元件(viii)与(ix)的侧面；以及
(xi)DNA序列，其编码EBNA-1蛋白质。
质粒DNA合成的Epstein-Barr病毒(EBV)起点oriP有效支持多种高等真核细胞中的DNA合成。图9C中提供代表性的OriP序列。此起点仅使用一种病毒蛋白质EBNA-1，而所有的其他因子由细胞提供。在某些实施方案中，由宿主细胞(例如，293E细胞)提供EBNA-1蛋白质。在其他实施方案中，本发明的腺病毒载体进一步包含元件(xi)编码EBNA-1蛋白质的DNA序列。图9A和图9B分别提供代表性的EBNA-1蛋白质和DNA序列。
特别预期腺病毒基因组序列(例如，人腺病毒5型序列)将编码适当包装和产生腺病毒所需的基因和其他元件(例如，左右反向末端重复(ITR)、衣壳化信号序列、晚期基因)(Hitt等，1999，TheDevelopment of Human Gene Therapy，T.Friedmann，编著(Cold SpringHarbor，N Y：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第61-86页；Russell，2000，J.Gen.Virol.81，2573-2604)。腺病毒基因组序列可编码完整的腺病毒基因组。或者，腺病毒基因组序列可编码除一种或多种蛋白质和/或调控元件之外的所有蛋白质和其他调控元件，所述一种或多种蛋白质和/或调控元件以反式提供以产生无法重复的腺病毒。例如，编码E1蛋白质((E1a和E1b)的E1区域可从本发明的腺病毒载体中排除(Russell，2000，J.Gen.Virol.81，2573-2604)。缺失的蛋白质和/或其他元件则通常将由用于产生腺病毒的宿主以反式提供，例如，293细胞系含有E1区域的基因组拷贝。在特定的实施方案中，腺病毒基因组序列包含对应于野生型序列1-458和3513-35935的人腺病毒5型序列或基本上由其组成。
本领域技术人员应了解，将组合提供某些元件和/或可将其并入其他元件，例如元件(iv)可并入元件(v)至(vii)。应进一步了解，将在其他元件的5’和/或3’提供某些元件，例如，元件(x)可用于腺病毒载体的线性化，当并入元件(x)以用于线性化时，应提供其在5’ITR的5’和/或3’ITR的3’。同样，当存在元件(viii)和(ix)时，其一般使得其不会并入援救腺病毒而定位，例如这些元件可位于5’ITR的5’以及3’ITR的3’。OriP与元件(i)至(vii)(若存在)在一侧为包括3’ITR的腺病毒基因组序列，另一侧为5’ITR序列(例如图10)
图10提供本发明的代表性腺病毒载体，其并入元件(i)、(ii)、(iv)、(viii)至(x)以及任选的(xi)。
7.实施方案
1.一种嵌合多肽，其包含：(a)人血清白蛋白(HSA)部分，所述HSA部分包含HSA结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，以及(b)异源蛋白质，其中所述嵌合多肽保留异源蛋白质的功能活性且可与FcRn结合，且其中所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于其中HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照嵌合多肽增加嵌合多肽对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或两者。
2.根据实施方案1所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合。
3.根据实施方案1或2所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合，且其中所述亲和力在酸性pH下测得。
4.根据实施方案3所述的嵌合多肽，其中所述酸性pH介于5.0和6.0之间。
5.根据实施方案4所述的嵌合多肽，其中酸性pH为5.5±0.2。
6.根据实施方案1至3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在酸性pH下以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合，但在中性pH下，所述嵌合多肽并没有以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合。
7.根据实施方案6所述的嵌合多肽，其中所述中性pH介于6.9和7.9之间。
8.根据实施方案7所述的嵌合多肽，其中所述中性pH为7.4±0.2。
9.根据实施方案1至6中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽与FcRn结合，且具有与所述对照嵌合多肽不同的解离速率或结合速率。
10.根据实施方案9所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽与FcRn结合，且相对于所述对照嵌合多肽具有增加的结合速率和/或减少的解离速率。
11.根据实施方案9所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽与FcRn结合，且相对于所述对照嵌合多肽具有增加的解离速率。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA结构域III包含一至十个氨基酸取代以相对于其中所述HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照嵌合多肽，增加所述嵌合多肽的血清半衰期。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中的保守的残基。
14.根据实施方案13所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在多个物种中的保守的残基。
15.根据实施方案1至13中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
16.根据实施方案15所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
17.根据实施方案1至13中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自表5中所列出的那些。
18.根据实施方案1至15中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA(SEQ ID NO：2)中的位置进行编号：残基381、残基383、残基391、残基401、残基402、残基407、残基411、残基413、残基414、残基415、残基416、残基424、残基426、残基434、残基442、残基445、残基447、残基450、残基454、残基455、残基456、残基457、残基459、残基463、残基495、残基506、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基519、残基521、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基531、残基535、残基538、残基539、残基541、残基557、残基561、残基566、残基569。
19.根据实施方案1至15中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含在HSA结构域III中的选自由下列组成的组的位置处的氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
20.根据实施方案1至15或18中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P。
21.根据实施方案1至15、18或20中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L407N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。
22.根据实施方案1至15或18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的一个氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L407N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。
23.根据实施方案21所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组中：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
24.根据实施方案22所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的一个氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
25.根据实施方案1-14或18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)E383G/K413S；(b)Y401E/I523G；(c)L407N/P447S；(d)L407N/P447S/A539I；(e)L407N/F509M；(f)L407Y/Q526T；(g)Y411Q/H535N；(h)K414S/V456N；(i)V415T/A569P；(j)V426H/Q526Y；(k)E442K/E450D/Q459R；(l)L463N/T508R；(m)T508R/K519I/K525V；(n)F509I/T527Y；(o)I523Q/K538Y；(p)Q526M/K557G；以及(q)K541F/A561F。
26.根据实施方案25所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)L407N/P447S；(b)L407N/P447S/A539I；(c)L407N/F509M；(d)Y411Q/H535N；(e)K414S/V456N；(f)V426H/Q526Y；(g)L463N/T508R；(h)F509I/T527Y；(i)I523Q/K538Y；(j)Q526M/K557G；以及(k)K541F/A561F。
27.根据实施方案1-15中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中保守的残基，但在鸡血清白蛋白中不保守。
28.根据实施方案27所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中保守的残基，但在鸡血清白蛋白中不保守。
29.根据实施方案15所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA(SEQ ID NO：2)中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。
30.根据实施方案29所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基391、残基434、残基442、残基445和残基450。
31.根据实施方案30所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、E450D和E450E。
32.根据实施方案29所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基442、残基499和残基502。
33.根据实施方案27所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547和残基576。
34.根据实施方案33所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基381、残基401、残基424、残基457、残基463、残基495、残基508、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基531、残基535和残基539。
35.根据实施方案34所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、Y401D、Y401E、V424N、V424Q、L457F、L457W、L457Y、L463N、L463Q、E495D、T508K、T508R、T508S、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、A539I，以及A539L、A539V。
36.根据实施方案29所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。
37.根据实施方案33所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547和残基576。
38.根据实施方案29或33所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基380、残基381、残基384、残基383、残基387、残基389、残基391、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基410、残基417、残基419、残基421、残基422、残基424、残基425、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基442、残基457、残基458、残基463、残基464、残基465、残基466、残基467、残基468、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基486、残基489、残基491、残基495、残基499、残基500、残基502、残基508、残基510、残基515、残基516、残基520、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基532、残基535、残基536、残基539、残基543、残基544、残基547、残基571和残基576。
39.根据实施方案38所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基381、残基383、残基391、残基401、残基424、残基442、残基463、残基495、残基506、残基508、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基531、残基535和残基539。
40.根据实施方案39所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、E442K、E442R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516S、L516T、L516W、L516Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、A539I、A539L和A539V。
41.根据实施方案1-40所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基。
42.根据实施方案41所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基。
43.根据实施方案1-12中任一项所述的嵌合多肽，其中IISA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守性的残基。
44.根据实施方案43所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
45.根据实施方案43或44所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。
46.根据实施方案45所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基391和残基442。
47.根据实施方案45所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N3911、N391L、N391V，以及E442K、E442R。
48.根据实施方案45所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基442、残基499和残基502。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
50.根据实施方案49所述的嵌合多肽，其中所述HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。
51.根据实施方案49所述的嵌合多肽，其中所述HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的氨基酸序列。
52.根据实施方案1-48中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
53.根据实施方案52所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分包含与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性的氨基酸序列。
54.根据实施方案52所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分包含与SEQ ID NO：2具有至少98％同一性的氨基酸序列。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
56.根据实施方案1-22、27-29、32、33、36-38、41-45或48-55中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环2中。
57.根据实施方案55或56所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
58.根据实施方案1-55所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
59.根据实施方案1-22、27-33、36-54或58中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环3中。
60.根据实施方案58或59所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
61.根据实施方案1-55或58中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
62.根据实施方案1-22、27-29、32、33-45、48-54或61中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环6中。
63.根据实施方案61或62所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至十八个氨基酸取代，其中所述一至十八个氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
64.根据实施方案1-55、58或61中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
65.根据实施方案1-22、27-29、32、33-45、48-54或64中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋7中。
66.根据实施方案67或68所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至三个氨基酸取代，其中所述一至六个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
67.根据实施方案1-55、58、61、64中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
68.根据实施方案1-22、27-29、32、33-45、48-54或67中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环7中。
69.根据实施方案67或68所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至三个氨基酸取代，其中所述一至三个氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
70.根据实施方案1-55、58、61、64或67中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
71.根据实施方案1-22、27-28、37、38、41-44、49-54或70中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的螺旋8中。
72.根据实施方案70或71所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至十八个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
73.根据实施方案1-55、58、61、64、67或70中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
74.根据实施方案1-22、27-28、37、38、41-44、49-54或73中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
75.根据实施方案73或74所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
76.根据实施方案1-55、58、61、64、67、70或73中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
77.根据实施方案1-22、27-28、41-44、49-54或76中任一项所述的嵌合多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
78.根据实施方案76或77所述的嵌合多肽，其包含HSA结构域III中的一至四个氨基酸取代，其中所述一至四个氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用丙氨酸置换氨基酸残基。
80.根据实施方案1-79中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括保守性氨基酸取代。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种碱性氨基酸置换一种碱性氨基酸。
82.根据实施方案1-81中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种酸性氨基酸对置换一种酸性氨基酸。
83.根据实施方案1-83中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种中性氨基酸置换一种中性氨基酸。
84.根据实施方案1-83中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
85.根据实施方案1-84中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。
86.根据实施方案1-85中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
87.根据实施方案1-86中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
88.根据实施方案1-87中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
89.根据实施方案1-88中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
90.根据实施方案1-89中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
91.根据实施方案1-90中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
92.根据实施方案1-91中任一项所述的嵌合多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括非保守性取代。
93.根据实施方案79所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括用丙氨酸置换氨基酸残基。
94.根据实施方案80所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处的保守性氨基酸取代。
95.根据实施方案81所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种碱性氨基酸置换一种碱性氨基酸。
96.根据实施方案83所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种酸性氨基酸置换一种酸性氨基酸。
97.根据实施方案83所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种中性氨基酸置换一种中性氨基酸。
98.根据实施方案84所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
99.根据实施方案85所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。
100.根据实施方案86所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
101.根据实施方案87所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
102.根据实施方案88所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
103.根据实施方案89所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
104.根据实施方案90所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
105.根据实施方案91所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
106.根据实施方案92所述的嵌合多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处的非保守性取代。
107.根据实施方案1-106中任一项所述的嵌合多肽，其中所述异源蛋白质包括抗体或其抗原结合片段。
108.根据实施方案1-107中任一项所述的嵌合多肽，其中所述异源蛋白质包括治疗蛋白质。
109.根据实施方案1-108中任一项所述的嵌合多肽，其进一步包含IgG免疫球蛋白的恒定区。
110.根据实施方案1-109中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分以化学方式缀合至异源蛋白质。
111.根据实施方案1-109中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分以重组方式缀合至异源蛋白质。
112.根据实施方案111所述的嵌合多肽，其中使用编码所述HSA部分与所述异源蛋白质两者的重组载体生产嵌合多肽。
113.根据实施方案111或112所述的嵌合多肽，其中在原核细胞或真核细胞中生产所述嵌合多肽。
114.根据实施方案113所述的嵌合多肽，其中所述真核细胞选自酵母细胞、鸟类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
115.根据实施方案110-114中任一项所述的嵌合多肽，其中将所述HSA部分与所述异源蛋白质彼此直接缀合。
116.根据实施方案110-114中任一项所述的嵌合多肽，其中将所述HSA部分与所述异源蛋白质经由接头缀合。
117.根据实施方案116所述的嵌合多肽，其中所述接头包含一或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复。
118.根据实施方案1-117中任一项所述的嵌合多肽，其中将所述HSA部分缀合至所述异源蛋白质的N-端氨基酸。
119.根据实施方案1-117中任一项所述的嵌合多肽，其中将所述HSA部分缀合至所述异源蛋白质的C-端氨基酸。
120.根据实施方案1-117中任一项所述的嵌合多肽，其中将所述HSA部分缀合至所述异源蛋白质的内部氨基酸。
121.根据实施方案1-120中任一项所述的嵌合多肽，其中所述HSA部分进一步包含HSA结构域I的至少一部分；或HSA结构域II的至少一部分；或HSA结构域I的至少一部分和HSA结构域II的至少一部分。
122.根据实施方案1-121中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽基本上是纯化的。
123.一种组合物，其包含根据实施方案1-122中任一项所述的嵌合多肽，以及药学上可接受载体。
124.根据实施方案123所述的组合物，其中所述组合物为无菌组合物。
125.根据实施方案123或124所述的组合物，其中所述组合物为非致热的。
126.一种治疗需要其的受试者的方法，其包括对所述受试者施用根据实施方案1-122中任一项所述的嵌合多肽或根据实施方案123-125中任一项所述的组合物。
127.一种增加需要其的受试者中的蛋白质的血清半衰期的方法，其包括对所述受试者施用根据实施方案1-122中任一项所述的嵌合多肽。
128.根据实施方案126或127所述的方法，其中对所述受试者施用包括全身施用所述嵌合多肽。
129.根据实施方案126或127所述的方法，其中对所述受试者施用包括通过选自下列组成的组中的途径施用所述嵌合多肽：皮内、透皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、血管内、心包内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬脑膜外、局部和口服。
130.根据实施方案126或127所述的方法，其中对所述受试者施用包括通过静脉内施用所述嵌合多肽。
131.一种核酸构建体，其包含编码根据实施方案1-121中任一项所述的嵌合多肽的核苷酸序列。
132.一种人血清白蛋白(HSA)变体多肽，其包含HSA结构域III，或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，其中所述变体多肽可与FcRn结合，且其中所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于缺乏所述取代的对照HSA多肽，增加所述变体多肽对FcRn的亲和力。
133.根据实施方案132所述的变体多肽，其中所述变体多肽以比所述对照多肽高的亲和力与FcRn结合，且其中所述亲和力在酸性pH下测得。
134.根据实施方案132或133所述的变体多肽，其中所述酸性pH介于5.0与6.0之间。
135.根据实施方案134所述的变体多肽，其中所述酸性pH为5.5±0.2。
136.根据实施方案132中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽在酸性pH下以比所述对照多肽高的亲和力与FcRn结合，但在中性pH下，所述变体多肽并没有以比所述对照多肽高的亲和力与FcRn结合。
137.根据实施方案136所述的变体多肽，其中所述中性pH介于6.9与7.9之间。
138.根据实施方案137所述的变体多肽，其中所述中性pH为7.4±0.2。
139.根据实施方案132中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽比所述对照HSA多肽具有较长的血清半衰期。
140.根据实施方案132-139中任一项所述的变体多肽，其中所述HSA结构域III包含一至十个氨基酸取代。
141.根据实施方案132-140中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中保守的残基。
142.根据实施方案141所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在多个物种中保守的残基。
143.根据实施方案132-140中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
144.根据实施方案143所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
145.根据实施方案132-143中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自表5中所列出的那些。
146.根据实施方案132-143中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基381、残基383、残基391、残基401、残基402、残基407、残基411、残基413、残基414、残基415、残基416、残基424、残基426、残基434、残基442、残基445、残基447、残基450、残基454、残基455、残基456、残基457、残基459、残基463、残基495、残基506、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基519、残基521、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基531、残基535、残基538、残基539、残基541、残基557、残基561、残基566、残基569。
147.根据实施方案132-143中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含在HSA结构域III中的选自由下列组成的组的位置处的氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447以及539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450以及459；(l)残基463和508；(m)残基508和519以及525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
148.根据实施方案132-143或146中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、K557A、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P。
149.根据实施方案132-143、146或148中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L407N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。
150.根据实施方案132-143或146中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含HSA结构域III中的一个氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L409N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。
151.根据实施方案149所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
152.根据实施方案150所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含HSA结构域III中的一个氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
153.根据实施方案132-143或146中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)E383G/K413S；(b)Y401E/I523G，(c)L407N/P447S；(d)L407N/P447S/A539I；(e)L407N/F509M；(f)L407Y/Q526T；(g)Y411Q/H535N；(h)K414S/V456N；(i)V415T/A569P；(j)V426H/Q526Y；(k)E442K/E450D/Q459R；(l)L463N/T508R；(m)T508R/K519I/K525V；(n)F509I/T527Y；(o)I523Q/K538Y；(p)Q526M/K557G；以及(q)K541F/A561F。
154.根据实施方案132-143或146中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)L407N/P447S；(b)L407N/P447S/A539I；(c)L407N/F509M；(d)Y411Q/H535N；(e)K414S/V456N；(f)V426H/Q526Y；(g)L463N/T508R；(h)F509I/T527Y；(i)I523Q/K538Y；(j)Q526M/K557G；以及(k)K541F/A561F。
155.根据实施方案132-143中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中保守的残基，但在鸡血清白蛋白中不保守。
156.根据实施方案155所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中保守的残基，但是在鸡血清白蛋白中不保守。
157.根据实施方案143所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA(SEQ ID NO：2)中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468，残基486，残基499，残基502，残基520，残基532、残基536，残基543和残基571。
158.根据实施方案157所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HS A中的位置进行编号：残基383、残基391、残基434、残基442、残基445和残基450。
159.根据实施方案158所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、E450D和E450E。
160.根据实施方案157所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基417、残基442、残基499和残基502。
161.根据实施方案155所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547和残基576。
162.根据实施方案161所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基381、残基401、残基424、残基457、残基463、残基495、残基508、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基531、残基535和残基539。
163.根据实施方案162所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、Y401D、Y401E、V424N、V424Q、L457F、L457W、L457Y、L463N、L463Q、E495D、T508K、T508R、T508S、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、A539I，以及A539L、A539V。
164.根据实施方案157所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。
165.根据实施方案161所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基380、残基381、残基384、残基387、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基419、残基421、残基422、残基424、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基457、残基458、残基463、残基464、残基466、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基489、残基491、残基495、残基500、残基508、残基510、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基535、残基539、残基544、残基547和残基576。
166.根据实施方案157或161所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基380、残基381、残基384、残基383、残基387、残基389、残基391、残基396、残基401、残基404、残基405、残基406、残基409、残基410、残基417、残基419、残基421、残基422、残基424、残基425、残基428、残基430、残基431、残基433、残基441、残基442、残基457、残基458、残基463、残基464、残基465、残基466、残基467、残基468、残基469、残基470、残基474、残基475、残基480、残基481、残基486、残基489、残基491、残基495、残基499、残基500、残基502、残基508、残基510、残基515、残基516、残基520、残基524、残基525、残基526、残基528、残基531、残基532、残基535、残基536、残基539、残基543、残基544、残基547、残基571和残基576。
167.根据实施方案166所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代选自由下列组成的组的成员：残基381、残基383、残基391、残基401、残基424、残基442、残基463、残基495、残基508、残基515、残基516、残基524、残基525、残基526、残基531、残基535和残基539。
168.根据实施方案167所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、E442K、E442R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516S、L516T、L516W、L516Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、A539I、A539L和A539V。
169.根据实施方案132-166中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基。
170.根据实施方案169所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基。
171.根据实施方案132-166中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
172.根据实施方案171所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
173.根据实施方案171或172所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基389、残基391、残基410、残基417、残基425、残基442、残基465、残基467、残基468、残基486、残基499、残基502、残基520、残基532、残基536、残基543和残基571。
174.根据实施方案173所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所述至少一个氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基383、残基391和残基442。
175.根据实施方案174所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V以及E442K、E442R。
176.根据实施方案132-172中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
177.根据实施方案176所述的变体多肽，其中所述HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。
178.根据实施方案169-177所述的变体多肽，其中HSA结构域III包含与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的氨基酸序列。
179.根据实施方案132-178中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
180.根据实施方案132-150、155-157、161、164-166、169-173、176-179中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环2中。
181.根据实施方案179或180所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
182.根据实施方案132-179所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
183.根据实施方案132-150、155-161、164-166-178或182中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代均在HSA结构域III的环3中。
184.根据实施方案182或183所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
185.根据实施方案132-173或182中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
186.根据实施方案132-150、155-157、160-173、176-178或185中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
187.根据实施方案185或186所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
188.根据实施方案132-173、182或185中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
189.根据实施方案132-150、155-157、160-173、176-178或188中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
190.根据实施方案188或192所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至三个氨基酸取代，其中所述一至六个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
191.根据实施方案132-173、182、185或188中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
192.根据实施方案132-150、155-157、160-173、176-178或191中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
193.根据实施方案191或192所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至三个氨基酸取代，其中所述一至三个氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
194.根据实施方案132-173、182、185、188或191中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
195.根据实施方案132-150、155-157、165-166、169-173、176-178或194中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
196.根据实施方案194或195所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至十八个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
197.根据实施方案132-173、182、185、188、191或194中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
198.根据实施方案132-150、155-157、165-166、169-173、176-178或197中任一项所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
199.根据实施方案197或198所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至五个氨基酸取代，其中所述一至五个氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
200.根据实施方案132-173、182、185或197所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
201.根据实施方案132-150、155、156、169-172、176-178或200所述的变体多肽，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
202.根据实施方案200或201所述的变体多肽，其包含HSA结构域III中的一至四个氨基酸取代，其中所述一至四个氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
203.根据实施方案132-202中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用丙氨酸置换氨基酸残基。
204.根据实施方案132-203中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括保守性氨基酸取代。
205.根据实施方案132-204中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种碱性氨基酸置换一种碱性氨基酸。
206.根据实施方案132-205中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种酸性氨基酸置换一种酸性氨基酸。
207.根据实施方案132-206中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用另一种中性氨基酸置换一种中性氨基酸。
208.根据实施方案132-207中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
209.根据实施方案132-208中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。
210.根据实施方案132-209中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
211.根据实施方案132-210中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
212.根据实施方案132-211中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
213.根据实施方案132-212中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
214.根据实施方案132-213中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
215.根据实施方案132-214中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括用下列组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
216.根据实施方案132-215中任一项所述的变体多肽，其中至少一个所述氨基酸取代包括非保守性取代。
217.根据实施方案203所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括用丙氨酸置换氨基酸残基。
218.根据实施方案204所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处的保守性氨基酸取代。
219.根据实施方案205所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种碱性氨基酸置换一种碱性氨基酸。
220.根据实施方案206所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种酸性氨基酸置换一种酸性氨基酸。
221.根据实施方案207所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用另一种中性氨基酸置换一种中性氨基酸。
222.根据实施方案208所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
223.根据实施方案209所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。
224.根据实施方案210所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
225.根据实施方案211所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
226.根据实施方案212所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
227.根据实施方案213所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
228.根据实施方案214所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
229.根据实施方案215所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处用以下组中的另一种氨基酸置换一种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
230.根据实施方案216所述的变体多肽，其中所有所述氨基酸取代包括独立地在每一位置处的非保守性取代。
231.根据实施方案132-230中任一项所述的变体多肽，其中所述HSA部分进一步包含HSA结构域I的至少一部分；或HSA结构域II的至少一部分；或HSA结构域I的至少一部分和HSA结构域II的至少一部分。
232.根据实施方案132-231中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽是基本上纯化的。
233.根据实施方案132-232中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽进一步包含靶标上表位的结合位点。
234.根据实施方案233所述的变体多肽，其中所述结合位点拮抗所述靶标。
235.根据实施方案233所述的变体多肽，其中所述结合位点激动所述靶标。
236.一种组合物，其包含根据实施方案132-235中任一项所述的变体多肽，以及药学上可接受载体。
237.根据实施方案236所述的组合物，其中所述组合物为无菌组合物。
238.根据实施方案236或237所述的组合物，其中所述组合物为非致热的。
239.一种增加蛋白质的血清半衰期的方法，其包括将所述蛋白质与根据实施方案132-235中任一项所述的变体多肽缀合。
240.一种治疗需要其的受试者的方法，其包括对所述受试者施用根据实施方案233-235中任一项所述的变体多肽。
241.一种核酸构建体，其包含编码根据实施方案132-231中任一项所述的变体多肽的核苷酸序列。
242.一种核酸构建体，其包含(a)编码人血清白蛋白(HSA)部分的核苷酸序列，所述HSA部分包含HSA结构域III或其FcRn结合片段，所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代，其可操作地连接至(b)编码异源蛋白质的核苷酸序列，其中所述核酸构建体编码嵌合多肽，所述嵌合多肽保留异源蛋白质的功能活性且可与FcRn结合，且其中所述嵌合多肽相对于其中所述HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照嵌合多肽，具有增加的血清半衰期和/或对FcRn增加的亲和力。
243.根据实施方案242所述的核酸构建体，其中所述嵌合多肽以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合。
244.根据实施方案242或243所述的核酸构建体，其中所述嵌合多肽以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合，且其中所述亲和力在酸性pH下测得。
245.根据实施方案244所述的核酸构建体，其中酸性pH介于5.0与6.0之间。
246.根据实施方案245所述的核酸构建体，其中所述酸性pH为5.5±0.2。
247.根据实施方案242-247中任一项所述的核酸构建体，其中所述嵌合多肽在酸性pH下以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合，但在中性pH下，所述嵌合多肽并没有以比所述对照嵌合多肽高的亲和力与FcRn结合。
248.根据实施方案247所述的核酸构建体，其中所述中性pH介于6.9与7.9之间。
249.根据实施方案248所述的核酸构建体，其中所述中性pH为7.4±0.2。
250.根据实施方案242中任一项所述的核酸构建体，其中(i)包含编码人血清白蛋白(HSA)部分的核苷酸序列，所述HSA部分包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，所述HSA结构域III包含一至十个氨基酸取代。
251.根据实施方案242-250中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在多个物种中保守的残基。
252.根据实施方案251所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在多个物种中保守的残基。
253.根据实施方案242-250中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
254.根据实施方案253所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是在来自以下物种的血清白蛋白蛋白质中保守的残基：人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
255.根据实施方案242-254中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自表5中所列出的那些。
256.根据实施方案242-254中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在以下任何位置处，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：残基381、残基383、残基391、残基401、残基402、残基407、残基411、残基413、残基414、残基415、残基416、残基424、残基426、残基434、残基442、残基445、残基447、残基450、残基454、残基455、残基456、残基457、残基459、残基463、残基495、残基506、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基519、残基521、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基531、残基535、残基538、残基539、残基541、残基557、残基561、残基566、残基569。
257.根据实施方案242-254中任一项所述的核酸构建体，其中核酸构建体包含在HSA结构域III中的选自由下列组成的组的位置处的氨基酸取代，对这些位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
258.根据实施方案242-254或256中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、K557A、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P。
259.根据实施方案242-254或256中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、E383G、N391V、Y401E、K402A、L407N、L407Y、Y411Q、K414S、K413S、V415T、V415C、Q416P、V424I、V424Q、V426E、V426H、G434C、E442K、R445W、P447S、E450D、S454C、V455N、V456N、L457F、Q459R、L463N、E495D、T506Y、T508R、T508S、F509I、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515P、T515Q、T515S、L516T、L516W、S517C、S517W、K519I、R521W、I523D、I523E、I523Q、I523K、I523G、I523R、I523Y、K524L、K524V、K525V、Q526T、Q526M、Q526Y、T527Y、E531I、H535N、H535P、K538Y、A539I、K541F、K557G、A561F、T566W和A569P。
260.根据实施方259所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
260.根据实施方案242-254或256中任一项所述的核酸构建体，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)E383G/K413S；(b)Y401E/I523G，(c)L407N/P447S；(d)L407N/P447S/A539I；(e)L407N/F509M；(f)L407Y/Q526T；(g)Y411Q/H535N；(h)K414S/V456N；(i)V415T/A569P；(j)V426H/Q526Y；(k)E442K/E450D/Q459R；(l)L463N/T508R；(m)T508R/K519I/K525V；(n)F509I/T527Y；(o)I523Q/K538Y；(p)Q526M/K557G；以及(q)K541F/A561F。
262.根据实施方案261所述的核酸构建体，其中所述嵌合多肽包含HSA结构域III中的氨基酸取代，所述取代选自由下列组成的组：(a)L407N/P447S；(b)L407N/P447S/A539I；(c)L407N/F509M；(d)Y411Q/H535N；(e)K414S/V456N；(f)V426H/Q526Y；(g)L463N/T508R；(h)F509I/T527Y；(i)I523Q/K538Y；(j)Q526M/K557G；以及(k)K541F/A561F。
263.根据实施方案242-254中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基。
264.根据实施方案263中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基。
265.根据实施方案242-250中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
266.根据实施方案265中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的所有所述氨基酸取代是表面可及残基且在多个物种中是保守的残基。
267.根据实施方案242-266中任一项所述的核酸构建体，其中(i)包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的编码HSA结构域III的核苷酸序列。
268.根据实施方案267所述的核酸构建体，其中(i)包含与SEQID NO：1具有至少95％同一性的编码HSA结构域III的核苷酸序列。
269.根据实施方案268所述的核酸构建体，其中(i)包含与SEQID NO：1具有至少98％同一性的编码HSA结构域III的核苷酸序列。
270.根据实施方案242-269中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
271.根据实施方案242-270中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
272.根据实施方案242-271中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
273.根据实施方案242-272中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
274.根据实施方案242-273中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
275.根据实施方案242-273或272中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
276.根据实施方案242-275中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
277.根据实施方案242-276中任一项所述的核酸构建体，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
278.根据实施方案242-277中任一项所述的核酸构建体，其中(ii)包含编码异源蛋白质的核苷酸序列，所述异源蛋白质包括抗体或其抗原结合片段。
279.根据实施方案242-278中任一项所述的核酸构建体，其进一步包含编码接头的核苷酸序列。
280.根据实施方案279所述的核酸构建体，其中所述核苷酸序列编码包含一或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复的接头。
281.根据实施方案242-280中任一项所述的核酸构建体，其中所述HSA部分进一步包含HSA结构域I的至少一部分；或HSA结构域II的至少一部分；或HSA结构域I的至少一部分和HSA结构域II的至少一部分。
282.一种包含复数个多肽的文库，其中所述复数个多肽的每一个包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，且其中所述复数个多肽的每一个独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质为保守的。
283.一种包含复数个多肽的文库，其中所述复数个多肽的每一个包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，且其中所述复数个多肽的每一个独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质为保守的，而在来自鸡的血清白蛋白中不是保守的。
284.一种包含复数个多肽的文库，其中所述复数个多肽的每一个包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，且其中所述复数个多肽的每一个独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代为表面可及残基。
285.根据实施方案284所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环2中。
286.根据实施方案284或285所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环3中。
287.根据实施方案284-286中任一项所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环6中。
288.根据实施方案284-273中任一项所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环7中。
289.根据实施方案284-288中任一项所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环8中。
290.根据实施方案284-289中任一项所述的文库，其中所述表面可及残基在HSA结构域III的环9中。
291.一种包含复数个多肽的文库，其中所述复数个多肽的每一个包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，且其中所述复数个多肽的每一个独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代(i)既为表面可及残基且(ii)在来自人、猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马的血清白蛋白蛋白质中为保守的。
292.一种包含复数个多肽的文库，其中所述复数个多肽的每一个包含HSA结构域III，或其FcRn结合片段，且其中所述复数个多肽的每一个独立地包含在所述HSA结构域III中的残基的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代在来自除人以外的以下组中的两个或两个以上物种中的血清白蛋白蛋白质中为保守的：猪、大鼠、小鼠、狗、兔、牛、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、猫和马。
293.根据实施方案291或292所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环2中。
294.根据实施方案291-293中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环3中。
295.根据实施方案291-294中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环6中。
296.根据实施方案291-295中任一所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋7中。
297.根据实施方案291-296中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环7中。
298.根据实施方案291-297中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的螺旋8中。
299.根据实施方案291-298中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环8中。
300.根据实施方案291-299中任一项所述的文库，其中所述至少一个氨基酸取代在HSA结构域III的环9中。
301.根据实施方案282-300中任一项所述的文库，其中所述复数个多肽的每一个进一步包含HSA结构域I的至少一部分；或HSA结构域II的至少一部分；或HSA结构域I的至少一部分和HSA结构域II的至少一部分。
302.根据实施方案282-301中任一项所述的文库，其中所述文库为展示文库。
303.根据实施方案302所述的文库，其中展示文库的类型选自由酵母、噬菌体和哺乳动物组成的组。
304.一种筛选根据实施方案282-303中任一项所述的文库的方法，所述方法包括：(a)选择用于筛选的复数个多肽；(b)筛选对FcRn具有增加的亲和力或具有增加的血清半衰期的多肽；以及(c)测定对FcRn具有增加的亲和力或具有增加的血清半衰期的多肽的序列。
8 具体实施方式
参考以下实施例可以更容易理解现在所述的本发明，所包括的这些实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并不旨在限制本发明。例如，本文公开的特定构建体和实验设计代表示例性的验证适当功能的工具和方法。同样显而易见的是，所公开的特定构建体和试验计划的任何一者可以在本公开的范畴内被替代。此外，应理解，除非特别指出，特定列出或描述的所用的具体设备和试剂、大小、制造商等不应认为限制本发明。进一步应理解，类似地发挥作用的其他设备和试剂可以很容易地被替代。
8.1 实施例1：人FcRn与人血清白蛋白(HSA)的结构域III结合的动力学和亲和力分析
此实施例使用表面等离子体共振法(SPR)测量HSA的结构域III对人FcRn的缔合常数、解离常数和平衡亲和力常数。结构域III(也缩写为“Dili”)是跨越氨基酸残基381-585的人血清白蛋白蛋白质的片段。结构域III的氨基酸序列以SEQ ID NO：1示出。全长成熟HSA的氨基酸序列以SEQ ID NO：2示出。自比赤酵母(Pichia Patoris)表达和纯化结构域III以用于这些实验中。
8.1.1 重组蛋白质表达和纯化
Geneart AG，Regensburg，Germany获得编码结构域III基因的重组质粒。使用限制酶EcoRI和Notl从供应商提供的载体切除结构域III基因并将其克隆至pPICZ-α-A比赤酵母表达载体中(Invitrogen，目录号Vl95-20)。以制造商说明中描述的方式表达重组结构域III蛋白。将重组结构域III蛋白质分泌至介质中，且使其通过疏水相互作用色谱法在来自GE Healthcare的Hi Trap丁基琼脂糖快流柱上纯化(目录no.17519701)。简言之，首先将培养基的盐度调整为1.5M硫酸铵和50mM磷酸钠，pH调整为7.0。过滤培养基并使其通过丁基琼脂糖柱，接着使用pH7.0的低盐磷酸钠缓冲液洗脱所结合的结构域III。将纯化的蛋白质部分通过具有保持在50℃下的循环水套的Hydroxyaloxypsopyl Dextran(Sigma-Aldrich，目录no.H6258)柱而去脂化。如使用考马斯亮蓝染色通过4-12％SDS PAGE可见(图1A)，去脂化和未去脂化形式的纯度都为99％。通过A280测定蛋白质浓度。通过近-UV-CD和远-UV-CD测量确认纯化的结构域III的适当折叠，所述测量与先前公布的测量紧密相关(参见，例如Giancola等，International Journal ofBiological Macromolecules 20(1997)193-204)
8.1.2 动力学测量
在25℃下于BIAcore T100仪器(Uppsala，Sweden)上测量平衡、缔合和解离速率常数，并使用BIAcore T100求值软件，版本1.1(BIAcore，Inc，Uppsala，Sweden)分析数据。使用标准胺偶联(BIAcore Handbook，2002)，将结构域III的非去脂化和去脂化形式以偶联密度分别为1016和1184RU共价固定在CM4(目录号BR-1005-39)或CM5芯片(目录号BR-1000-14)上。使用没有蛋白质的同一个固定方案模拟偶联其中一个流动细胞以用作空白。所有的注射都在pH 5.5下的50mM磷酸盐溶液和150mM NaCl缓冲液中进行，且在具有pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)的注射之间重新产生芯片表面。为在单一实验中测量缔合常数(kon)、解离常数(koff)和平衡解离常数(KD)，在固定结构域III蛋白质上以50μL/min的速度注射递增浓度的人FcRn(39nM-40nM)(图1B，左图)。允许结合以达到平衡，且通过同时将曲线的缔合(4分钟)相与解离(1分钟)相拟合成1：1langmuir模型来获得动力学常数kon和koff。通过使用非线性回归分析将平衡时的结合响应(Req)与分析物浓度的关系曲线拟合为稳态亲和力模型来获得KD(图1B)。结构域III的去脂和非去脂化形式显示类似的结合传感图以及Req与Ligand浓度关系图。
FcRn与结构域III的相互作用显示快速缔合(kon≈7e3)与解离(koff≈4e-2)动力学(表1)。结构域III对FcRn的KD在5-8μM之间，其比全长HSA对FcRn的KD大约7倍(例如，更大的解离常数)(表1)。KD的不同主要归因于结构域III相对于HSA，具有更快的Koff，而两种分子的Kon却相当。源自Kon和Koff的KD与通过实验获得的值接近一致，从而验证了动力学测量。此外，具有可变羧基部分的两种不同的传感器芯片(CM4和CM5)具有类似的亲和力。动力学常数与平衡常数在结构域III的去脂化和非去脂化形式之间是相当的，说明脂质分子不介导或促进FcRn与结构域III的结合。
表1.该表提供与人血清白蛋白(HSA)的结构域III结合的人FcRn的源自SPR的动力学与平衡常数，以及与公布的全长HSA的动力学常数的比较(表格最下方)。
Figure BDA00002097186101181
8.2 实施例2：与全长HSA或结构域III单独融合增强人IgG对FcRn的亲和力
此实验证明HSA的结构域III与治疗蛋白质或抗体或其变体的融合增强了治疗蛋白质/抗体在酸性pH下对FcRn的亲和力，而不会影响互相作用的pH依赖性。在pH5.5下对FcRn的亲和力增加转化成增加的血清半衰期(例如，体内或适当的模型系统内增强的使用寿命)。可在(例如)表达单拷贝人FcRn基因(但缺少鼠FcRn)的转基因小鼠中进行包含融合至治疗剂蛋白质的结构域III的HSA部分的药物动力学半衰期测量，以评估与包含野生型或变体结构域III的部分的融合对半衰期的影响。
8.2.1 构建体设计
作为代表性蛋白质，使用人IgG1来比较单独的IgG和与HSA或结构域III融合的IgG之间的FcRn亲和力。经由包含4个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复单元的接头将HSA或结构域III融合至人IgG1重链的C-末端(图2A)。接头的长度基于FcRn上的IgG结合位点与HSA结合位点之间的距离来设计，以允许两个配体同时结合其各自的结合位点。同样以类似方式产生先前所述的IgG的高亲和力变体的HSA和结构域III融合形式(IgG-YTE，参见DalPAcqua等，2002，JImmunol.，169：5171-5180)，所述IgG变体相对天然IgG显示对FcRn提高10倍的亲和力。因此，制备并使用以下构建体：
IgG
IgG(YTE)
IgG-(G4S)4-HSA
IgG-(G4S)4-结构域III
IgG-(YTE)-(G4S)4-HSA
IgG(YTE)-(G4S)4-结构域III
8.2.2 纯化和表征
简言之，将全部6个构建体克隆至表达载体中，且通过暂时表达在293F细胞中(GIBCO目录号R79007)纯化蛋白质。使用来自GEHealthcare的HiTrapTM蛋白质A亲和力柱(目录号17-0403-03)纯化分泌至培养基中的IgG1和融合蛋白。在还原和非还原的条件下通过SDSPAGE分析纯化的蛋白质，并且如通过考马斯染色可见，观察到99％的纯度(图2B)。
IgG-(G4S)4-HSA融合蛋白的估计分子量为284千道尔顿(KDa)，而IgG-(G4S)4-结构域III估计的分子量为196KDa。所观察到的分子量与这些估计值非常相关。为评估这些融合蛋白形式是否因其较大尺寸或改变的物理化学特性而聚集，使用Agilent Technologies 1200系列SEC通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析这些融合蛋白(图2C)。IgG-(G4S)4-HSA与IgG-(G4S)4-结构域III在A280保留时间(分钟)上均显示对应于单体的单一峰，说明融合蛋白并未聚集为任何可测量的范围。IgG-YTE变体的融合蛋白的SEC分布与IgG-(G4S)4-HSA或IgG-(G4S)4-HSA嵌合蛋白质的SEC分布不可区分。
8.2.3 平衡结合常数(KD)的测量
在BIAcore T100仪器(Uppsala，Sweden)上测量人FCRn对融合蛋白质的亲和力(Kd)。简言之，使用仪器制造商所述的标准胺偶联化学法，将人IgG、IgG-(G4S)4-结构域III、IgG-(G4S)4-HSA、IgG-YTE、IgG-YTE-(G4S)4-结构域III和IgG-YTE-(G4S)4-HSA以高密度固定在两个Series 5传感器芯片(GE Healthcare)上的分离的流动细胞上。最终表面IgG密度分别为5116、5258、6097、5256、5561和5531RU。使用同一个固定方案，另在无任何蛋白质的每一传感器芯片上制备参考流动细胞。将在pH5.5下的50mM PO4和150mM NaCl缓冲液中的人FcRn的两倍连续稀释液(范围在5.86nM至3000nM)以5μL/min的流速注射至偶联蛋白质的表面和参考细胞表面上。收集结合数据50分钟，接着多次60秒注射含有0.05％Tween20的pH7.4的磷酸盐缓冲液以重新产生数据。使用BIAcore T100求值软件1.1版本(BIAcore，Inc，Uppsala，Sweden)，将每次注射平衡时的结合响应(Req)与浓度的绘图并使其拟合为稳态亲和力模型(图3)，以获得平衡结合常数KD。插图呈示一系列浓度的FcRn与固定配体的结合。仍以同一种方式获得IgG-YTE变体及对应的融合蛋白的KD(数据未显示)
IgG-(G4S)4-HSA的KD为183nM，并且IgG-(G4S)4-结构域III的KD为305nM，相较于单独的IgG的1.51μm，证明将HSA或结构域III融合至IgG分别提高FcRn亲和力10倍和5倍(表2)。同样还观察到YTE变体的类似但较不显著的趋势，其中，相对于IgG-YTE，IgG-YTE-(G4S)4-HSA展示亲和力增加3.8倍(42.5nM)，并且IgG-YTE-(G4S)4-结构域III显示亲和力增加2.5倍(65.1nM)。
表2.该表提供在pH5.5下，与和融合HSA融合的IgG或与结构域III融合的IgG及其YTE变体类似物结合的人FcRn的源自SPR的平衡常数。
  构建体   KD(nM)
  IgG   1510
  IgG-(G4S)4-HSA   183
  IgG-(G4S)4-DIII   305
  IgG-YTE   161
  IgG-YTE-(G4S)4-HSA   42.5
  IgG-YTE-(G4S)4-DIII   65.1
然而，在pH5.5下亲和力的提高并不影响在中性pH下的FcRn结合。此通过在pH7.2下于相同固定表面上注入1μm FcRn来测试。相较于IgG/IgG-YTE对照，在与任何融合蛋白偶联表面结合的FcRn中未检测出可测量的差异(数据未显示)。
在酸性pH(～5.5-6.0)下使HAS融合物与FcRn结合，并且在中性pH(～7.4)释放与体内功效相关，因为此类特征模拟体内结合。因此，优选的HSA变体为(i)相对于天然HSA或包含天然HSA的缀合物具有提高的亲和力的变体，以及(ii)在酸性pH下观察到提高的亲和力的变体。此外，在中性pH下对FcRn具有增加的结合亲和力的变体可损坏功效并减少在酸性pH下增加的亲和力的有利影响。
8.3 实施例3：与全长HSA的融合增强人IgG的血清持久性
此实验证实HSA与抗体融合增加抗体的血清半衰期。如图7中所示，实施例1中所述的IgG-HSA融合的血清持久性相较于单独的IgG增加。血清半衰期的增加与从IgG-YTE变体所见相当。然而，在此研究中，添加HSA至IgG-YTE变体似乎不会导致比单独的YTE有显著的增强。
使用4-5个月龄的人FcRnC57BL/6转基因小鼠(JAX实验室)进行PK研究，所述转基因小鼠具有用单拷贝人FcRn(huFcRn)取代的鼠新生儿Fc受体(mFcRn)。经由尾部静脉对小鼠注射15mg/kg剂量的在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中稀释的适当蛋白质。使所有动物在注射1小时后从眼眶后血管放血来收集(75μm)血清以测定循环中注射的实际量。接着在注射后的24、72、168和240小时收集血清样本并将其储存在-80℃下。通过ELISA分析血清中保留的指示蛋白质的量。简言之，使用抗-HSA涂覆的板捕获各种IgG融合构建体，并使用抗-Kappa检测抗体检测所述板。对于IgG和YTE构建体，使用抗原涂覆的板捕获IgG并使用抗-重链检测抗体检测所述板。对血清中保留的蛋白质的百分比绘图为所注射的量(1小时样本)与时间的分数。
8.4 实施例4：HSA上对FcRn的抗原为构象的
如通过用抗-β-2微球蛋白抗体的免疫印迹所见，观察到人FcRn以浓度依赖性方式与天然HSA孔结合。然而，使用在类似实验条件下测试的变性HSA未观察到类似结果。
以10mg蛋白质/ml琼脂糖(Sepharose)的配比，将来自Sigma-Aldrich的人血清白蛋白(HSA；目录号A-8763)、人IgG(hlgG；目录号1-4506)、Tris缓冲液固定于CNBr激活的琼脂糖4B(GEHealthcare)上。通过用0.1M Trizma碱、0.5M NaCl(pH8)阻断CNBr激活的琼脂糖4B的活性基团来制备琼脂糖-Tris。在SDS存在下，将连接至HSA、hlgG或Tris的琼脂糖珠子(20μL珠子相当于约180μg连接的蛋白质)煮沸10分钟，所述SDS含有在还原(1％2-巯基乙醇)或非还原条件下或未处理的样本缓冲液(60mM Tris(pH 6.8)，2.3％SDS，10％甘油，0.01％溴苯酚蓝)。在pH5.5下用含有0.1％鱼胶(BIOFX Laboratories Inc，目录号PFGP-1000-01)的50mM磷酸钠、150mM NaCl缓冲液洗涤如此处理的蛋白质或Tris偶联珠子，并且接着使其与pH5.5缓冲液中的200μL不同浓度的人FcRn(0-20μg)在室温下孵育2小时。使用pH 5.5的缓冲液洗除未结合的蛋白质。通过将结合的蛋白质与含有1％2-巯基乙醇的含SDS的样本缓冲液煮沸来将其洗脱，并在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析，接着用抗-β2微球蛋白抗体(Abeam目录号Ab6608)进行免疫印迹。
在整个FcRn浓度范围内，对于天然HSA，人FcRn与琼脂糖-HSA的结合为最大的。然而，当在还原和非还原条件下使HSA变性时，结合显著减少，说明HSA上FcRn的表位最可能为构象表位(图4)。如所预期，琼脂糖-IgG结合人FcRn，而Tris阻断的珠子在任何条件下都未结合FcRn。
8.5 实施例5：HSA和结构域III可在酵母细胞表面上展示且所展示的蛋白质保留FcRn结合能力
如在酸性pH下进行的改良流式细胞术所评估，此实施例证明在酵母细胞表面上可成功表达HSA和结构域III两者，并且这些展示的蛋白质以pH依赖性方式结合FcRn。因此，在酵母细胞上的表达提供一种筛选含有结构域III中有变化的构建体(例如，单独的结构域III、全长HSA、截短的HSA或包含至少结构域III的嵌合多肽)的方法，以评估此类构建体(i)结合FcRn的能力，以及(ii)以相对于(例如)非变体构建体增加的亲和力结合FcRn的能力。
8.5.1 酵母细胞表面展示
将HSA、结构域III或单链Fv片段(scfv)克隆至pYD1酵母展示载体(Invitrogen目录号V835-01)中，并将其转化至啤酒酵母(S.cerevisiae)中以在酵母细胞表面上呈现。pYD1将目标蛋白质展示为在半乳糖可诱导启动子控制下与啤酒酵母蛋白质Aga2p的C-末端融合。如供应商手册中所述进行所有试验步骤。使用营养缺陷型选择标记尿嘧啶和色氨酸选择转化的细胞，并将其在适当的选择培养基(TeknovaInc.，目录号C8140)中培养。将培养基用半乳糖诱导达48小时以允许表达Aga2p融合蛋白。在0、24和48小时对细胞进行取样。将细胞样本洗涤并用含有0.1％鱼胶的的PBS(pH7.2)阻断，用FITC缀合的兔多克隆抗-HSA抗体(Abeam Inc.，目录号AB34669)染色，并通过流式细胞术分析。
在0小时时未观察到HSA或结构域III的细胞表面表达，而在24小时时观察到酵母细胞上这两种蛋白质的表达。这样的表达在诱导后保持48小时。使表达通过阳性FITC染色显现。图5A显示可在酵母细胞表面上成功表达HSA和结构域III两者。如所预期，scfv转化的细胞并未用抗-HSA染色(例如为阴性的)。因此，scfv转化的细胞用作阴性对照。
8.5.2 表面表达的HSA或结构域III的FcRn结合能力
将表达HSA、结构域III或scfv且用半乳糖诱导48小时的的酵母细胞用含有0.1％鱼胶的pH 5.5的50mM磷酸钠、150mM NaCl缓冲液(也称为FACS缓冲液)阻断1小时。接着使细胞与在pH 5.5磷酸盐缓冲液中的生物素化的FcRn(70μM)孵育，并且使用链霉亲和素藻红蛋白(PE)(Invitrogen Inc.)使结合的FcRn显形。用pH 5.5的50mM磷酸钠、150mM NaCl缓冲液而非常规使用的PBS通过流式细胞术分析如此染色的细胞。
如从柱状图中的转变可见，相较于scfv(图5B)，HSA和结构域III表达细胞对PE都呈阳性染色，而阴性对照scfv表达细胞却不是，此证明在酵母细胞表面表达的HSA和结构域III保留FcRn结合能力且因此具有功能性。在单独的实验中，以与针对FcRn结合的低pH流式细胞术类似的方式处理细胞，且使用高产量取样技术
Figure BDA00002097186101251
System(IntelliCyt Corporation)评估细胞，取得类似结果。
8.6 实施例6：包含OriP的腺病毒哺乳动物细胞表面展示载体用于产生具有高度多样性的文库
在
Figure BDA00002097186101252
入门载体中构建哺乳动物表面展示文库，所述文库使用糖基磷脂酰基醇(GPI)锚以在表面展示scFv-Fc蛋白质，所述入门载体经设计含有命名为pENDisplay的scFv-Fc表达盒(参见图8A)。很容易将不同scFv序列的文库插入Sfi/NotI位点中。按照制造商将pENDisplay载体中的文库与pAd/PL-DESTTM载体(Invitrogen目录号V494-20)组合，以产生腺病毒表达文库，从而获得总共约5×106菌落形式单位(cfu)。为产生腺病毒，用腺病毒表达文库转染293A细胞(Invitrogen目录号R70507)，所述细胞含有E1基因的稳定整合拷贝，其提供反式产生重组腺病毒所需的E1蛋白质(E1a和E1b)，腺病毒表达文库已经线性化以暴露左右反向末端重复(ITR)。通过FACS分析发现，至少50％的用线性化腺病毒文库直接转染的293A细胞在其表面展示抗体。然而，当将线性化腺病毒文库转染至293A细胞中以产生腺病毒时，每110mm(直径)培养皿获得少于50个噬斑。第10天收获腺病毒并将病毒DNA分离，使用PCR扩增重新克隆回至pENDisplay载体中的scFv编码区域，挑选96个克隆并对其进行测序。从分析的96个克隆中仅鉴定出14个唯一的VH序列。噬斑恢复的低效率可能归因于线性化腺病毒载体的降解且导致腺病毒文库复杂性的显著降低。
Epstein-Barr核抗原1(EBNA-1)含有核定位信号(NLS)且与含有核酸的OriP(诸如质粒)结合。EBNA-1蛋白质(参见图9A)可有助于经由NLS使含有核酸的OriP易位至细胞核并增强游离体维持。尽管并不认为腺病毒援救需要游离体维持，但仍在scFv-Fc盒的聚腺苷酸序列之后，在pENDisplay载体的attL1与attL2序列之间引入OriP序列(参见图9C)。图8B描述命名为pENDisplay-OriP的新载体。将pENDisplay-OriP中的文库与pAd/PL-DESTTM载体(Invitrogen目录号V494-20)组合以产生也具有约5×106cfu的第二腺病毒表达文库。将自pENDisplay-OriP产生的文库线性化并转染至293E细胞(Invitrogen目录号R620-07)中，所述293E细胞稳定表达Epstein-Barr病毒核抗原(EBNA-1)和腺病毒E1a蛋白质，导致每110mm(直径)培养皿大大超过10,000个噬斑。在第7天收获病毒并如上所述分析96个克隆。与自不含OriP位点的第一文库中分离出的低数量的唯一克隆相比，所分析的全部96个VH序列都是唯一的。这些结果一起证明添加OriP序列至腺病毒表达文库载体极大地提高自表达EBNA-1的细胞援救腺病毒的能力和腺病毒文库的多样性。
添加OriP序列(例如，图9C)至腺病毒载体提高在EBNA-1蛋白质的存在下宿主细胞产生重组腺病毒颗粒的效率。当构建腺病毒表达文库时，增强的病毒产生效率通过减少丢失的克隆数量保持文库的多样性/复杂性。下文实例7详述表达HSA结构域III变体的哺乳动物表面展示文库的构建和筛选，所述变体将OriP序列并入基本如上所述的腺病毒表达载体中。
图10提供表达目标蛋白质的代表性一般腺病毒表达载体的示意图。在此实施例中，提供突变腺病毒基因，其中删除了E1和/或E3部分。通过宿主细胞反式提供缺失的病毒基因以用于病毒援救。此删除防止用于表达目标蛋白质的宿主细胞中的腺病毒的复制。目标DNA将包括表达蛋白质所需的所有成分，其包括但不限于编码序列、启动子序列、终止信号、聚腺苷酸序列等。目标蛋白质可为可溶的且可包括将蛋白质锚定至细胞表面的序列，例如跨模结构域或GPI锚信号。如本文中所举例，腺病毒载体可设计成表达变体蛋白质的文库。图10中描绘的腺病毒表达载体提供att重组位点的位置，所述位点源自使用用于构建的GatewayTM入门和目的质粒。还描绘了可能存在EBNA-1DNA序列的一个可能的位置。预期载体组分的其他位置和方位。本领域技术人员应理解，载体区域的方位和/或相对位置可改变。
8.7 实施例7：用于HSA和结构域III的其他展示平台的使用
同样评估噬菌体展示和哺乳动物细胞表面展示技术作为HSA和结构域III的潜在展示平台。噬菌体展示平台不在细菌细胞表面表达HSA或结构域III中任一者，推测这归因于这些分子中存在大量的二硫键(数据未显示)。然而，使用293-F细胞中的短暂表面表达的哺乳动物细胞展示系统成功展示HSA和结构域III，所述293-F细胞经由来自衰变加速因子(Decay Accelerating Factor)(例如，US2007/0111260中所述的突变DAF)的糖基磷脂酰基醇(GPI)锚信号所介导。所展示的蛋白质保留FcRn结合能力(数据未显示)。
产生命名为pEN-HSA-GPI的其中添加表位标签(例如，Flag标签)的另外哺乳动物细胞表达构建体，以用于双染色，且在HSA的5’与3’添加接头以增加融合蛋白质的柔性并有利于HSA与FcRn结合(图11A)，此构建体直接用于短暂转染或用于产生命名为pAd-HSA-GPI且同样并入OriP序列的腺病毒表达载体。既在短暂转染测定中(数据未显示)且使用腺病毒表达系统，在来自此构建体的哺乳动物细胞(例如，293F细胞)的表面上表达功能性HSA。图11显示用抗HSA(图11B)或25μg/ml和5μg/ml FcRn(分别是图11C和图11D)染色的细胞在柱状图中所得转变。因此，存在若干潜在系统用以表达HSA和结构域III变体，且用于筛选满足以下条件此类变体：(i)与FcRn结合且(ii)具有以相对于(例如)非变体构建体增加的亲和力与FcRn结合的能力。
转染293F细胞以在细胞表面上展示HSA：将1.5μg质粒和2.25μL293fectin添加至单独试管中的100μL Optimem培养基中，室温下孵育5分钟，接着使两种组分组合在一起。在于室温下再孵育20分钟后，将混合物添加至在24深孔板中密度为1×106细胞/ml的2ml 293F细胞中。在8％CO2存在下以250rpm转速使转染细胞生长24小时。
腺病毒表达载体的产生和使用：使用
Figure BDA00002097186101281
技术(Invitrogen)将入门载体(pEN-HSA-GPI)中的HSA重组至Invitrogen目的载体以产生腺病毒表达载体。简言之，将150ng pEN-HSA-GPI载体、300ngpAd/PL-DEST(Invitrogen)、2μl LR Clonase II(Invitrogen)和TE缓冲液添加至总共10μl的反应混合物。在于25℃下孵育过夜后，遵循制造商方案将2μl反应混合物用于转化One-shot Top 10组分细胞(Invitrogen)。将转化的TOP 10细胞接种氨苄西林板上并在37℃下孵育过夜。挑选单一菌落至LB培养基中以制备质粒。将含有腺病毒表达载体的HSA基因在转染之前用Pac I线性化以产生腺病毒。用2μg线性化腺病毒载体和6μl lipofecatine-2000转染293E细胞以产生腺病毒。在经过7天的转染后，通过交替冷冻(在-80℃下)和融化(在37℃下)2至3次从转染的细胞中释放出腺病毒。将细胞碎片通过3000rpm离心分离10分钟移除，并将含有上清液的腺病毒等分至新试管中且在-80℃下保存。根据制造商的使用说明，使用Adeno-XTM快速滴定试剂盒(Clontech：PT3651-2)确定病毒滴度。在MOI为1下使用腺病毒以表达HSA构建体。
8.8 实施例8：DIII上表面暴露环的丙氨酸扫描诱变以鉴定FcRn结合表位
此实施例描述DIII上表面暴露环在调节FcRn与HSA结合中的作用。
结构域III由205个氨基酸残基组成且编码经由9个环连接且通过6个二硫键稳定的10个螺旋(Sugio等，1999，Protein Eng.12：439-46和PDB：1BM0)。下面列出包含这些环的氨基酸残基的位置以及每个环的长度。对氨基酸相对于全长成熟HSA蛋白质(SEQ ID NO：2)中这些环的位置进行编号：
环1：残基398-400＝3个氨基酸
环2：残415-419＝5个氨基酸
环3：残基439-443＝5个氨基酸
环4：残基468-470＝3个氨基酸
环5：残基480-482＝3个氨基酸
环6：残基492-509＝18个氨基酸
环7：残516-517＝2个氨基酸
环8：残基537-541＝5个氨基酸
环9：残基561-564＝4个氨基酸
编号为2、3、6、8和9的环为溶剂可及的且暴露在分子表面上(Sugio等，ibid，和PDB：1BM0)。
在某些实例中，将每一个别表面可及环中的交替的氨基酸突变成丙氨酸(除不被突变的脯氨酸和半胱氨酸外)，其中一组中突变奇数编号的残基，另一组中突变偶数编号的残基。除环9外，每个环都产生这样两个突变组，其中环9仅需要一个构建体以满足实验设计。在载体中产生总共9个此类构建体以进行细胞表面展示(例如，pYD1酵母展示载体)，且用于评估FcRn结合能力。可使用本申请中所述的标准体内测定来评估变体(例如，流式细胞术)。鉴定对FcRn展示增加的亲和力的变体。还筛选每一种变体以确定对FcRn提高的亲和力是否仅在酸性pH下出现，而在中性pH下不会出现。针对(i)单独的变体结构域III构建体；(ii)存在于全长HSA情形的变体结构域III构建体；或(iii)在包含至少结构域III的截短HSA或嵌合多肽的情形中，可测试对FcRn亲和力在酸性pH下增加，而在中性pH下未增加。将前述与野生型结构域III、野生型全长HSA或不含突变的嵌会多肽比较。
在某些实例中，自前述筛选获得的信息鉴定出，表面可及环中的残基经得起变化同时保持(或甚至提高)FcRn结合能力。构建一系列变体，其中此类鉴定的位置突变为其他20种氨基酸每一种，并同时筛选此类变体。接着构建和筛选在一个以上位置处包含突变的其他变体。
在某些实例中，产生和评估变体文库。
8.9 实施例9：保守、表面暴露残基的丙氨酸扫描诱变
通过氨基酸序列比对鉴定在13个不同动物物种中的结构域III中保守的表面可及氨基酸残基。将此类保守性残基单独突变成丙氨酸以确定其在FcRn结合中的作用。
将HSA的结构域III氨基酸序列与来自12个不同物种的血清白蛋白结构域III序列比较，这12个物种包括大鼠、小鼠、牛、狗、兔、猪、鸡、驴、蒙古沙鼠、羊、锚和马，并鉴定在所有这些物种中保守的残基(图6A-D)。由于鸡HSA与哺乳动物HSA蛋白质明显不同，因此提供仅为哺乳动物物种的第二对比(图6E-H)。通过ELISA、免疫印迹和SPR，显示来自猪、大鼠、小鼠、狗、羊、兔和牛的的血清白蛋白已与人FcRn结合(数据未显示)。在单独的分析中，使用可在互联网上获得的GET ARE A 1.0beta软件鉴定结构域III中的表面暴露残基。此软件计算个别原子的可及表面面积及其梯度，并且对每一种氨基酸残基的表面可接近性的可能性进行打分，表示成“i”或“o”，分别表示不可及和可及(表3)。如通过软件所计算且通过对HSA晶体结构的人工检测所证实，鉴定出在所有不同物种中为保守的且为表面暴露的氨基酸。
将如此鉴定的全部18种氨基酸残基单独突变成丙氨酸并使用细胞表面展示(例如，pYD1酵母展示系统)评估对FcRn结合的影响。在一或多个以下情形下引入并筛选结构域III突变：单独的结构域III、全长HSA蛋白质、截短HSA或包含至少结构域III的嵌合多肽。在此分析中不包括保守、表面暴露的半胱氨酸和脯氨酸。
在另一实例中，将全部18种氨基酸残基(若丙氨酸实验表明特定位置不能容许取代，则比全部18更少)单独地突变成其他19种氨基酸残基的每一种并使用pYD1酵母展示系统(或另一展示系统)评估对FcRn结合的影响。
在另一实例中，构建并评估包括突变的组合的变体。可使用本申请所述的标准体外测定(例如流式细胞术)评估变体。鉴定出展示出对FcRn提高的亲和力的变体。还可筛选每一变体以确定对FcRn提高的亲和力是否仅在酸性pH出现，而在中性pH下不会出现。对以下一种或多种测试在酸性pH而非中性pH下对FcRn提高的亲和力：(i)单独的变体结构域III构建体；(ii)在全长HSA情形下的变体结构域III构建体，或(iii)在截短HSA或包含至少结构域III的嵌合多肽的情形下。将前述与野生型结构域III、野生型全长HSA或不含突变的嵌合多肽相比较。
表3.该表描述结构域III中的所有氨基酸的溶剂可及性参数。图6A-D中比对的在所有物种中保守的残基(相对于SEQ ID NO：2中呈现的成熟全长HSA序列进行编号)以粗体显示且进行标记(##)，并且对既为表面可及且在所有比对的物种中为保守的残基加框。
http://curie.utmb.edu/getarea.html.此外，对在图6E-H中比对的在除鸡以外的所有物种中都是保守的残基进行标记()。将残基注释为(i)和(o)以分别表示表面不可及和可及。
Figure BDA00002097186101331
Figure BDA00002097186101351
8.10 实施例10：结构域III上的每一残基诱变成所有可能的氨基酸以产生单一氨基酸突变体的文库
除半胱氨酸和脯氨酸外，将结构域III中的每一种氨基酸突变为全部20种氨基酸(即野生型氨基酸和19种非野生型氨基酸)以产生突变体的文库，从而使每一种个别突变体仅在一个位置处有单一突变。文库构建中涵盖205种氨基酸的整个长度；因此单独突变184种残基导致总文库多样性达到3496。在一或多个以下情形中引入并筛选结构域III突变：单独的结构域III、全长HSA蛋白质、截短HSA或包含至少结构域III的嵌合蛋白质。可使用标准诱变方法产生结构域III突变体的文库。任选地或作为选择，用商业设备(例如GeneartAG，Germany)制备结构域III突变体的文库。将突变体的文库克隆至展示载体中，并使用本申请中所述的标准体外测定(例如流式细胞术)筛选其FcRn结合能力，所述展示载体例如上述pYD1酵母展示载体或哺乳动物展示载体pEN-HSA-GPI，其包含OriP序列以增强重组腺病毒的产生(参见图10中包含OriP的一般入门载体的示意图)。鉴定出展现对FcRn提高的亲和力的变体。也可筛选每一变体以确定对FcRn提高的亲和力是否仅在酸性pH下出现，而在中性pH下不出现。针对(i)单独的变体结构域III构建体；(ii)存在于全长HSA情形中的变体结构域III构建体；或(iii)嵌合多肽的情形，测试对FcRn亲和力在酸性pH下提高，而在中性pH下未提高。将上述情形与野生型结构域III、野生型全长HSA或不含突变的嵌合多肽比较。实验设计允许鉴定结合表位，以及提高对FcRn亲和力的突变。
如上所述产生合成结构域III(DIII)文库，其具有6x10e4个独立的转变体。尽管将文库设计成使每一个别的突变体仅在一个位置具有单独的突变，但仍然产生多个双重或甚至三重突变。将合成的DIII文库通过PCR扩增且与DI和DII组装以通过重叠PCR形成全长HSA文库。将PCR用Sfi I和EcoR I消化并克隆至类似的消化载体pEN-HSA-GPI中，其为如上文所述的包含OriP序列的增强的哺乳动物展示GatewayTM入门载体(参见，例如图8B和10)。用于扩增DIII文库的引物在N和C末端具有6个野生型氨基酸残基，因此消除在结构域III的12个氨基酸的多样性。在pEN-HSA-GPI载体中产生两个文库且除了使用12μg PAC I线性化腺病毒表达载体用于文库产生外，基本如上所述产生相应的腺病毒文库。每一文库的尺寸显示于(表4)中。检查pEN-HSA-GPI中的多样性，在文库1中，约50％克隆为野生型，而在文库2中，约30％克隆为野生型。
表4：DIII文库大小
  pEN-HSA   pAd-HSA
 文库1   1.3×106   5.4×106
 文库2   6.4×106   1.7×107
基本如实施例5中所述，将感染腺病毒表达野生型HSA、HSA-DIII文库1或HSA-DIII文库2的细胞用抗-HSA-FITC抗体和FcRN-生物素(用SA-PE检测)染色，且如下所述通过FACS分析/筛选。野生型HSA和两个文库的表达水平相当(体12A)。当用10μg/mlFCRn染色时，仅表达HSA-DIII文库的细胞群在柱状图中显示转变(图12B)。图13显示相应的双染色的FACS分布图。如下所述，富集的细胞群由分选恢复、扩增，并且通过分选经受第二轮富集或用于分离个别克隆。自图14A中的柱状图可见，野生型HSA的表达水平、起始文库和分选文库相当。然而，用FcRn染色显示针对表达HSA-DIII突变体的文库已使第一轮和第二轮分选的文库富集，所述突变体可以1μg/ml，甚至0.1μg/ml的低浓度与FcRn结合(图14B和C)。
基本如实例2中所述，除了实验是在pH7.2下进行外分离多个个别克隆(如下所述)并筛选pH依赖性FcRn结合。图15显示在pH5.5(图A)和pH7.2(图B)下对照细胞、野生型HSA和几个代表性克隆的代表性柱状图。在这些HSA突变体和野生型HSA之间的表达水平相当(图15C)。如图16中所示，对鉴定为保留pH依赖性结合(即，在低pH的优选结合)的16个克隆进行测序且可使用若干FcRn浓度(例如，0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的FcRn-生物素)使这些克隆连同野生型HSA和对照细胞经受额外的FACS分析以分析这些突变对FcRn的相对亲和力。在进行任何其他表征之前，对来自富集群的另外的约1100个克隆进行测序。表5提供在自文库分离和/或测序的克隆中鉴定出的氨基酸取代的汇总。加粗的位置表示在约1-5％克隆之间的位置发现取代且可称为“优选点”。加粗且加下划线的位置表示在超过5％克隆中的位置处发现取代且可称为“热点”。仅在双重/三重突变的情形下鉴定出以斜体列出的氨基酸取代(取代的AA栏)。在5个或5个以上的克隆中发现的氨基酸取代(取代的AA栏)以粗体表示。在三个或三个以上克隆中发现的组合物也以粗体示出，其中鉴定的克隆数量在括弧中示出。对氨基酸相对于SEQ ID NO：2中提供的成熟全长has进行编号。分离含有在相同位置处的相同氨基酸取代和/或在相同位置具有不同氨基酸取代的多个克隆(参见表5)，表明这些位置可代表突变热点。
图17显示在HSA溶解结构上的若干优选和/或热点的位置。除氨基酸407、415和463外，发现大部分热点和优选点都在图16中圈出的环6和7(分别涵盖残基492-509和516-518)以及螺旋7(分别涵盖残基510-515和519-536)中。
表5鉴定的DIII突变的汇总
Figure BDA00002097186101381
Figure BDA00002097186101391
Figure BDA00002097186101411
Figure BDA00002097186101421
Figure BDA00002097186101431
*相对于成熟全长HSA(SEQ ID NO：2)进行编号；取代的氨基酸之后为数字表示发现该残基的次数；针对在组合中发现的每个位置一般在该行中列出所述组合
Ω对于3个克隆中的2个在位置407不确定的序列
Figure BDA00002097186101432
首先鉴定为克隆12的L463N
Figure BDA00002097186101433
首先鉴定为克隆45的L463N/T508R
Figure BDA00002097186101434
偶尔地w/a第三个取代(例如，Y411L、V433T、E495D、A504G、E531G、571K)
这些克隆也可在523处有一缺失
￡首先鉴定为克隆46的I523Y
通过定点诱变产生若干如此鉴定的突变体为可溶蛋白质并如下所述纯化以用于进一步分析。通过ProteOn(如下所述)和/或BIAcore(基本如上所述)确定结合亲和力(在pH5.5的KD)和pH依赖性(7.2vs.5.5)。表6提供结合研究的汇总且包括用于这些研究的蛋白质密度。发现多个突变体在pH5.5下具有增强的结合，包括L407Y/Q526T；L463N/T508R；I523G；V424Q；L83N/128R/I143G；以及K144，表6中以粗体显示。所有这些测试显示在pH5.5增强的结合的突变体同时也发现保持pH依赖性结合(见表6的最后一列)。测定的若干突变体发现在pH5.5下具有未变或甚至增加的KD(即未变或更坏的结合)。为什么鉴定出这样的克隆存在若干的可能的理由，例如，这些突变可增强在展示系统中的蛋白质表达或稳定性。也有可能的是，用于展示的GPI锚对结合有些影响，这些突变体可以补偿当突变体HSA表达为可溶分子时不会重复的影响。此外，筛选方法的设计最佳化捕获解离速率稳定的突变体，这些突变体可能或者可能不转化成整个亲和力提高。也有可能影响这些突变当与一种或多种其他突变组合时提供增强。在组合中发现多个突变(参见表5)。
表6结合研究汇总
Figure BDA00002097186101451
空白表示未测试；nb表示在所用条件下未结合。
*估计-在10μM下弱亲和力+高浓度导致Req与浓度的等温线的仅有边缘曲率。
**估计-强亲和力-低浓度结合曲线不会达到“真正的”稳态。
细胞染色和FACS分析及分选：用HSA腺病毒文库以MOI＝1感染密度为1×106/ml的3千万个293F细胞。在转导后的16小时通过离心作用收获细胞，并用冷FACS缓冲液洗涤，且以约1×107个细胞/ml再悬浮。在第一轮分选中以10μg/ml(212nM)添加生物素化FcRn。将细胞在4℃下孵育60分钟后，用FACS缓冲液洗涤两次且以1∶500的稀释比将其再次悬浮于链霉亲和素-PE中。在于4℃下孵育30分钟后用FACS缓冲液清洗一次且针对FcRn结合进行分选，这使得在pH5.5下结合FcRn的这些细胞富集。扩增所分选的细胞以进行另外的筛选。对于第二轮分选，基本上如上所述分选富集的细胞群，除了以1μg/ml(21.2nM)使用生物素化FcRn以进一步富集高亲和力HSA突变体。同样以0.1μg/ml(2.12nM)对富集文库进行另外的分析，参见(例如)图14。在一些筛选中，在第一或第二轮筛选中并入“取消选择”步骤，其中分选细胞的富集群以移除在中性pH(pH 7.4)下结合FnRc的细胞。为鉴定个别克隆，自富集的细胞群提取病毒DNA且将DIII HSA变体克隆至哺乳动物表达载体中以短暂转染293F细胞。基本上如上所述，通过流式细胞术，筛选个别克隆的在pH 5.5和pH 7.4下的pH依赖性结合。
HSA-DIII突变体的产生和表达：用标准方案(
Figure BDA00002097186101461
II XL定点诱变试验盒，Agilent目录号200521)突变野生型HSA以在使用特定诱变引物的哺乳动物表达载体中产生若干DIII突变体。根据制造商的方案，用293fectinTM转染试剂(Invitrogen，目录#Catalog#Sku12347-019)通过短暂转染在293F细胞中表达突变体，且使用标准程序在ANTI-FLAG M2亲和力凝胶(Sigma-Aldrich目录#A2220)上纯化突变体。将这样纯化的所有突变体通过SDS PAGE和尺寸排阻层析法分析以评估纯度和聚集程度。判断所有突变体为约99％纯度，无显著聚集(超过95％单体)(数据未显示)。
ProteOn分析：在ProteOn XPR36蛋白质交互阵列系统(BioRad)上测量人FcRn对HSA变体的亲和力(KD)。简言之，如制造商所述，使用ProteOn胺偶合试剂盒，以高密度将HSA变体固定至ProteOnGLM传感器芯片上的分离流动表面上。最终表面HSA密度在3740-3950RU之间。使用同一个固定方案，另在无任何蛋白质的每一芯片上制备参考流动表面。将在pH5.5下的50mM PO4、150mMNaCl缓冲液中的人FcRn的两倍连续稀释液(5.86nM至10000nM)以25L/min的流度注射至偶联蛋白质的表面和参考细胞表面上。收集结合数据8分钟，接着多次60秒注射含有0.05％Tween20的pH7.4的磷酸盐缓冲液以重新产生数据。使用ProteOn Manager软件，将每次注射在平衡时的结合响应(Req)与浓度的关系绘成曲线图并拟合为稳态亲和力模型，以获得平衡结合常数KD。
基于此分析，对鉴定的组合突变进行进一步分析以评估每一个别突变的活性。此外，进一步进行筛选以鉴定突变的不同组合物(例如，在筛选中未直接鉴定的一个以上位置处具有突变的构建体)是否提供对FcRn提高的亲和力。
8.11 实施例11：结构域III上选定的残基的组合诱变
为检查实施例10(如上文)中鉴定的最常见突变的组合，产生合成结构域III文库，使得残基：407；415；463；495；508；509；511；512；515；516；517；521；523；524；526；527；以及557突变成表7中所示的残基，从而产生使每一个别突变体具有2-4个突变的突变体文库。或者，可产生文库使得每一所列的残基突变成全部20个氨基酸(即，野生型氨基酸和全部19个非野生型氨基酸)以检查更广泛的组合的组。
在以下一种或多种情形下引入结构域III组合突变并加以筛选：单独的结构域III、全长HSA蛋白质、截短HSA或包含至少结构域III的嵌合蛋白质。可使用标准诱变方法产生结构域III突变体文库。任选地或作为选择，通过商业设备(例如Geneart AG，Germany)制备结构域III突变体的文库。
将组合突变体的文库克隆至展示载体(例如上述pYD1酵母展示载体或哺乳动物展示载体pEN-HSA-GPI)中，并使用本申请中所述的标准体外测定(例如，流式细胞术)筛选其FcRn结合能力。可采用阳性和/或阴性选择方法，如实例10中所述的那些。鉴定展示对FcRn提高的亲和力的组合变体。还可筛选每一组合变体以确定对FcRn提高的亲和力是否仅在酸性pH出现，而在中性pH下不出现。针对(i)单独的变体结构域III构建体；(ii)存在于全长HSA情形的变体结构域III构建体；或(iii)存嵌合多肽情形中，测试对FcRn亲和力在酸性pH下提高，而在中性pH下未提高。可将前述与野生结构域III、野生型全长HSA或不含突变的嵌合多肽比较。或者，或任选地，可将组合突变与结构域III、全长HSA或包含每一单独突变的嵌合多肽相比，以确定该组合是否进一步增强对FcRn的亲和力和/或血清半衰期。实验设计允许鉴定提高对FcRn的亲和力和/或血清半衰期的组合突变。
表7组合文库的突变
Figure BDA00002097186101481
8.12 实施例12：结构域III上的残基的诱变以产生单一氨基酸突变体用以筛选提高的FcRn亲和力
自结构域III中的保守氨基酸选择十八种单一氨基酸且使用本申请所述的标准方法将其分别突变成丙氨酸，从而使每一变体仅在一个位置具有单个突变。引入十八种变体，并在全长HSA蛋白质、或作为选择截短HSA或包含至少结构域III的嵌合蛋白质情形下对其进行筛选。使用本申请中所述的标准体外测定筛选十八种变体的FcRn结合能力。鉴定展示对FcRn提高的亲和力的变体。同样筛选每种变体以确定对FCRn提高的亲和力仅在酸性pH下出现，而在中性pH下不出现。针对(i)单独的变体结构域III构建体；(ii)存在于全长HSA情形中的变体结构域III构建体；或在亲和多肽的情形中，测试对FcRn亲和力在酸性pH下增加，而在中性pH下未增加。将前述与野生型结构域III、野生型全长HSA或不含突变的嵌合多肽进行比较。
基于此分析，进一步进行筛选以鉴定突变的不同组合物(例如，在一个以上位置处具有突变的构建体)是否提供对FcRn提高的亲和力。
9序列
SEQ ID NO：1-人HSADIII蛋白质序列
VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC
CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV
DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD
FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：2-人全长HSA蛋白质序列
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVAD
ESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL
PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECC
QAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFP
KAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEK
PLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARR
HPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE
DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETF
TFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADD
KETCFAEEGKKLVAASQAALGL
图6提供来自不同物种的血清白蛋白蛋白质的结构域III的比对。
大鼠血清白蛋白蛋白质的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：3。小鼠血清白蛋白蛋白质的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：4。牛血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：5。人血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：2。狗血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQID NO：6。兔血清白蛋白蛋白质的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：7。猪血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：8。鸡血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：9。驴血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：10。蒙古沙鼠血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：11。羊血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：12。猫血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：13。马血清白蛋白的结构域III的野生型氨基酸序列在图6中示出为SEQ ID NO：14。
本文所提及的所有公开和专利均全文在此以引用的方式并入，如同每个个别的出版物或专利被明确且单独地提及以引用的方式并入。此外，2010年2月16日提交的美国临时专利申请No.61/304,954以及2010年7月15日提交的美国临时专利申请No.61/364,503均为所有目的全文以引用的方式并入本文。
虽然已讨论本发明的特定实施方案，但上述说明为说明性而非限制性的。在综述本说明书和以下权利要求之后，本发明许多修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。应通过参考权利要求及其等同物的全部范畴以及说明书连同此类变化来确定本发明的全部范畴。
Figure IDA00002097186600011
Figure IDA00002097186600021
Figure IDA00002097186600031
Figure IDA00002097186600041
Figure IDA00002097186600051
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Figure IDA00002097186600171
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Figure IDA00002097186600191
Figure IDA00002097186600201

Claims (21)

1.一种包含人血清白蛋白(HSA)部分的多肽，所述HSA部分包含HSA结构域III或其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段，其中所述HSA结构域III包含一至十八个氨基酸取代以相对于其中所述HSA部分不包括所述氨基酸取代的对照多肽增加所述多肽对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或两者。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽以比所述对照多肽高的亲和力与FcRn结合。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽以比所述对照多肽高的亲和力与FcRn结合，且其中所述亲和力在酸性pH下测得。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自表5中所列的那些。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代在以下任何位置处，对所述位置相对于全长成熟HSA(SEQ ID NO:2)中的位置进行编号：残基381、残基383、残基391、残基401、残基402、残基407、残基411、残基413、残基414、残基415、残基416、残基424、残基426、残基434、残基442、残基445、残基447、残基450、残基454、残基455、残基456、残基457、残基459、残基463、残基495、残基506、残基508、残基509、残基511、残基512、残基515、残基516、残基517、残基519、残基521、残基523、残基524、残基525、残基526、残基527、残基531、残基535、残基538、残基539、残基541、残基557、残基561、残基566、残基569。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含在HSA结构域III中的选自由下列组成的组的位置处的氨基酸取代，对所述位置相对于全长成熟HSA中的位置进行编号：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；以及(q)残基541和561。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523I、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、K557A、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中HSA结构域III中的至少一个所述氨基酸取代选自由下列组成的组：L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含选自由下列组成的组的HSA结构域III中的氨基酸取代：
(a)L407N/P447S；
(b)L407N/P447S/A539I；
(c)L407N/F509M；
(d)Y411Q/H535N；
(e)K414S/V456N；
(f)V426H/Q526Y；
(g)L463N/T508R；
(h)F509I/T527Y；
(i)I523Q/K538Y；
(j)Q526M/K557G；和
(k)K541F/A561F。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，其包含异源蛋白质，其中所述多肽保留所述异源蛋白质的功能活性且可与FcRn结合。
11.根据权利要求10的多肽，其中所述异源蛋白质包括抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求10或11的多肽，其中所述异源蛋白质包括治疗蛋白质。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的多肽，其中使所述异源蛋白质以化学方式或重组方式与所述HSA部分缀合。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，其与非蛋白质物质缀合，其中所述多肽保留所述异源非蛋白质物质的功能活性且可与FcRn结合。
15.根据权利要求10-14所述的多肽，其中使所述异源蛋白质或所述非蛋白质物质与所述HSA部分的N-末端氨基酸、所述HSA部分的C-末端氨基酸或所述HSA部分的内部氨基酸缀合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其中所述HSA部分进一步包含HSA结构域I的至少一部分；或HSA结构域II的至少一部分；或HSA结构域I的至少一部分和HSA结构域II的至少一部分。
17.一种组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的多肽，以及一种药学上可接受的载体。
18.一种治疗需要其的受试者的方法，包括对所述受试者施用根据权利要求1-16中任一项所述的多肽或根据权利要求17所述的组合物。
19.一种核酸构建体，其包含编码根据权利要求1-16中任一项所述多肽的核苷酸序列。
20.一种增加蛋白质对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或两者的方法，包括使所述蛋白质与根据权利要求1-9或16中任一项所述的多肽缀合。
21.一种增加非蛋白质物质对FcRn的亲和力和其血清半衰期中的一者或两者的方法，包括使所述非蛋白质物质与根据权利要求1-9或16中任一项所述的多肽缀合。
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