CN102755649A

CN102755649A - 药物组合物及相关方法

Info

Publication number: CN102755649A
Application number: CN2012102198145A
Authority: CN
Inventors: T·滕宁鲍姆; L·布赖曼-维克斯曼; I·索罗莫尼克; O·莱维-哈查姆; E·布雷纳
Original assignee: Healor Ltd
Current assignee: Healor Ltd
Priority date: 2007-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2012-10-31
Also published as: WO2009016629A2; EP2653166A3; US20130336952A1; US20140227243A1; RU2010106661A; JP5411857B2; NZ582556A; JP2014024862A; AU2008281374B2; KR20130121678A; CN101835486B; RU2013142159A; AU2008281374A1; EP2653166A2; EP2185184A2; CN101835486A; RU2502520C2; CA2694927A1; US20100310542A1; WO2009016629A3

Abstract

本公开涉及用于加速创伤愈合、增加皮肤创伤闭合以及减少皮肤创伤部位感染的组合物和方法。具体而言，本发明涉及包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。本发明还涉及包含胰岛素或胰岛素类似物和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。

Description

药物组合物及相关方法

相关申请

本申请是2010年1月29日提交的申请号为200880101239.0、发明名称为“药物组合物及相关方法”的中国专利申请的分案申请。

优先权

本申请要求2007年7月30日提交的标题为“药物组合物”的美国临时专利申请60/962,706号的优先权，在此将其全文引入本文作为参考。

发明领域

本公开涉及用于加速创伤愈合、增加皮肤创伤闭合以及减少皮肤创伤部位感染的组合物和方法。

背景技术

皮肤是复杂的组织，其构成为不同的层，即表皮、真皮和皮下组织，每一个都拥有不同的细胞特征和生理重要性(Fuchs和Byrne1994；Goldsmith 1991)。

表皮是分层的鳞状上皮组织，其中严格区分了进行生长和分化的细胞(Fuchs和Byrne 1994)。在正常的生理阶段，增殖被限制到与基底膜相粘附的基底细胞。分化是一个空间过程，其中基底细胞丧失了其与基底膜的粘附，停止DNA合成并进行一系列形态和生物化学改变。最终的成熟步骤是角质层的产生，其形成了皮肤的保护屏障(Tennenbaum等，1991；Wysocki 1999)。

真皮主要由基质纤维构成并含有各种细胞类型。此外，所有的皮肤附属部分，即微脉管系统、汗腺和皮脂腺、感觉神经和毛囊均位于真皮中。真皮起到了支持皮肤营养、维持真皮和下述途径的作用，其中通过该途径信号从身体的其它部分到达外部层(Green 1977；Wysocki 1999)。皮下组织是皮肤的最深层，其主要由脂肪细胞组成，也被称为皮下脂肪层。直到最近，还认为这一层具有隔离外部温度变化的作用并且给皮肤的上层提供机械支持(Nash等2004；Querleux等2002)。

在皮肤中，分层表皮的持续更新是由导致产生没有活力的、角质化的鳞的顺序的且高度特化的过程维持的，所述鳞与衍生自分泌的片层体的脂质一起构成了身体的保护性水屏障。正在增殖的基底细胞与表皮特异性的基底膜粘附。角质化细胞的分化过程与和基底膜接触的细胞的丧失紧密相关；当基底细胞迁移至更外表的棘层时，它们丧失了增殖能力。进一步成熟为颗粒细胞区域，随后形成硬的角质化的包层，这与细胞内细胞器的自溶以及程序性细胞死亡相关联，产生成熟的鳞(Adams和Watt 1990；Eckert 1989；Yuspa等1980)。

开放的皮肤创伤通常通过包括6个主要要素的过程愈合：(i)发炎；(ii)成纤维细胞增殖；(iii)血管增生；(iv)结缔组织合成；(v)上皮形成；以及(vi)创伤收缩。当这些要素个别地或作为整体不恰当地发挥作用时，创伤愈合即会受损。许多因素可影响创伤愈合，包括营养不良、感染、药剂(例如，放线菌素和类固醇)、高龄和糖尿病(Keast和Orsted1998；Kirsner和Eaglstein 1993；Williams和Armstrong 1998)。

糖尿病(Diabetes mellitus)是糖尿病(Diabetes)的常见形式，其特征在于受损的胰岛素信号传导、升高的血浆葡萄糖和在若干个特定组织上发生慢性并发症的易感性。在所有糖尿病的慢性并发症中，导致足部溃烂的受损的创伤愈合是研究最少的(Goodson和Hunt 1979；Grunfeld 1992)。然而糖尿病患者的皮肤溃疡花费了大量人力和财力。而且，足部溃烂以及尔后的下肢截断是最常见的糖尿病患者住院的原因。在糖尿病中，创伤愈合过程受到损坏，以及愈合的创伤的特征在于创伤强度减小(Shaw和Boulton 1997)。组织修复中的缺陷与几种因素有关，这些因素包括神经病、血管病和感染(Mousley 2003；Silhi1998)。但是，尚不明了其它机制，通过该机制，与反常的胰岛素信号传导相关的糖尿病状态损坏创伤的愈合并改变皮肤生理。还有一个普遍存在的问题是在身体各个部分中的外科手术之后的创伤愈合受到年龄和诸如糖尿病和肥胖病等的慢性病发展的影响。在外科手术设置中，三分之一的患者由于它们的生理状态以及在创伤部位的相关感染的发展而延迟创伤愈合(Diegelmann和Evans 2004)。

皮肤创伤通常在包括马、狗、猫和家畜的动物中被发现。在动物创伤中，有各种常见的疾病提示需要创伤管理。因此，兽医皮肤病学是兽医医学中增长最快的学科之一。

一般而言，许多这些创伤通过第二期愈合而治愈。这一过程花费很长的时间，尤其是涉及四肢时尤其如此。在动物中，以及在人类中，创伤愈合过程可能因诸如污染、感染或骨间裂隙的因素而被复杂化，这些因素通常是延长愈合时间或不恰当的创伤闭合的原因(Grunfeld1992；Knol和Wisselink 1996；Yeruham等，1992；Yim等，2007)。

典型地，创伤愈合需要诱导(活化)新表皮和肉芽组织的形成以及减少感染。这些过程在动物中对于各种急性和慢性创伤，诸如手术后创伤、肢端舔的溃疡和糖尿病溃疡等的愈合也是必要的。马遭受由肉芽组织过剩引起的慢性创伤(例如，“赘肉”)，其中成纤维细胞增殖和血管发生均病理学地升高。这一反常的肉芽组织过度生长在上皮组织水平之上，并且物理地阻断邻近皮肤的接近，否则该邻近皮肤可能生长在这一区域之上。成纤维细胞的这一不受控制的生长的机制还是未知的。仅有的可利用的治疗涉及手术移除过度无约束的组织、压力包扎和皮质类固醇。该治疗花费延长的时间(5-8个月)并且病损常常复发(De、我和Theoret 2004；Stone 1986)。

动物中其它特定的病理包括狗中的肢端舔的皮肤炎和咬的溃疡。肢端舔的皮肤炎是狗中常见的问题，其是指与狗病损相关的增加的变红、粗糙、有弹力的组织，其产生自相同区域的反复舔。尽管在肢端舔的皮肤炎的治疗中有许多策略，但是治愈率和效果都还不足并且在许多情况下会发生溃疡的复发(White 1990；Yeruham等1992)。

蛋白激酶C(PKC)是磷脂依赖性酶家族，其催化磷酸从ATP共价转移至蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上，并且其在调节皮肤生理中起着重要的作用。底物蛋白质的磷酸化诱导构象改变，其导致它们功能性质的修饰。到目前为止，发现了11种同种型参与各种细胞功能和调节增殖、分化、细胞存活和死亡的信号转导路径(Nishizuka 1995)。特异性辅因子的需求、组织定位和细胞区室化提示对于每一同种型的不同功能和特定信号传导级联的精确调谐。因此，通过由它们在特定生物设定中的表达、定位和磷酸化状态调节的同种型特异性的PKC信号，特异性的刺激可以导致不同的反应。PKC同种型被各种细胞外信号活化，并且依次修饰细胞蛋白质的活性，所述蛋白质包括受体、酶、细胞骨架蛋白和转录因子。因此，PKC家族在细胞信号处理中起着中心作用。

丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白激酶C(PKC)家族的原型首先被Nishizuka及其同事(Kikkawa等，1989)描述，它们首先发现了被作为磷脂酰肌醇的降解产物的二酰基甘油(DAG)活化的PKC(Castagna等，1982)。其它研究揭示了PKC是促进肿瘤的佛波酯的细胞内受体。

所有的PKC家族成员共有一个结构骨架，其可被划分为两个主要的结构域：处于N端的调节结构域和处于C端的催化结构域。将这些区域分类为保守区(C1-C4)和在同种型之间变化的区(V1-V5)(Nishizuka 1988)，同上。此外，PKC在调节区还展示出与底物识别基序密切相似的假底物结构域，其封闭识别位点并阻止活化(Blumberg1991；House和Kemp 1987)。基于它们的结构特征和辅因子需求，可将PKC同种型家族划分为3个大组。它们包括典型的cPKC(α、βI、βII和γ)、新的nPKC(δ、ε、η、θ)和非典型的aPKC(ζ和ι/λ)同种型(Azzi等1992；Kikkawa等1989；Svetek等1995)。

对于它们的活化，所有同种型均需要磷脂双层的成分。典型的cPKC是钙(Ca²⁺)依赖性的，并且对于活化还需要DAG或DAG类似物诸如佛波酯。新的nPKC不依赖于Ca²⁺，但对于最大化活化仍需要DAG或佛波酯(Kazanietz等1993)。非典型的aPKC不依赖于Ca²⁺，也不需要DAG或佛波酯，但对于活化需要磷脂酰丝氨酸(Chauhan等1990)。此外，底物识别的主要部件是在调控结构域内的假底物区，其控制与细胞信号中PKC同种型的特异性活性有牵连的调控机制，并且与不同靶底物的磷酸化相关联(Eichholtz等1993；Hofmann 1997)。

已经在体内在皮肤表皮中和在培养的角质化细胞中鉴定了五种PKC同种型(α、δ、ε、η和ζ)。然而，在皮肤的真皮层中检测到了诸如β和γ的其它PKC同种型。此外，PKC同种型的类型和PKC分布模式在不同的组织中不同，并且可能还作为表现型的函数而变化。重要的是，在体内和体外中，PKC同种型均分布在基底和分化的皮肤角质化细胞中，并且可能在创伤愈合中起着重要的作用。

因此，需要调控PKC活性以帮助治疗皮肤创伤和其它慢性创伤的改进的组合物和方法。

公开概述

本公开大体上涉及含有不含钙及镁离子的生物活性的皮肤创伤愈合剂和或抗炎剂的药物组合物，并且还涉及使用该药物组合物治疗皮肤创伤和/或炎症的方法。该药物组合物优选地适用于局部或本地给药，尤其是皮下给药。

本公开的一个方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

本公开的另一方面是包含胰岛素、由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的并且在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基的肽以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的水性的药学上可接受的载体的组合物，其中所述的药学上可接受的载体包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄。

所述药学上可接受的载体优选地包括适于缓冲该组合物的磷酸盐或含有磷酸盐的化合物。特别优选的实施方案包括0.2L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄。此类药学上可接受的载体也是本发明的一个方面，并且可以通过混合所需要的组分以提供不含有钙或镁离子的药学上可接受的载体而制备该载体。

本公开的另一方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂、不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体以及药物流出支架的药物组合物。

本公开的另一方面是由包括以下步骤的方法制得的药物组合物：提供δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；以及混合所述δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；由此制得药物组合物。

本公开的另一方面是用于增加动物皮肤创伤闭合的方法，其包括以下步骤：提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此增加皮肤创伤的闭合。

本公开的另一方面是减少动物皮肤创伤部位上的炎症的方法，其包括以下步骤：提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此减少皮肤创伤部位的炎症。

本公开的另一方面是包含胰岛素或胰岛素类似物和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。

本发明的另一方面是包含约0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。

本发明的另一方面是用于增加动物创伤闭合的方法，其包括以下步骤：提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的创伤给药有效量的该药物组合物，其中所述的创伤是选自由糖尿病溃疡、肢端舔的创伤、赘肉创伤、外科手术创伤、慢性日光性脓肿创伤和骨髓炎创伤组成的组中的至少一种；由此增加皮肤创伤的闭合。

本发明的另一方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的另一方面是包含δ-PKC活化剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的另一方面是包含α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的另一方面是减少动物上的皮肤创伤部位的炎症的方法，其包括以下步骤：提供包含α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此减少皮肤创伤部位的炎症。

本发明的其它方面包括应用本发明的诸如本文描述的组合物促进肉芽组织的形成、表皮增殖和皮肤生长。

最后，本文公开的组合物可以完全不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子，或含有不含这些阳离子的药学上可接受的载体。

附图简述

图1A提供了细胞培养皿的照片，其显示了应用所指示的在不同的制剂中配制的药物组合物的体外创伤愈合效力。(在Axiovert 25Zeiss显微镜下放大50倍)。

图1B以处理24小时后的闭合百分比显示了创伤闭合。

图2A是显示了在制剂A中的药物组合物促进显著的创伤闭合的图。

图2B是采用各种制剂处理后的代表性创伤的照片。

图3是显示了在各种制剂中处理后的创伤部位的炎症负担的图。

图4是显示了采用各种制剂处理后的肉芽组织形成的图。

图5是显示了在各种制剂中Myr-假底物PKCα肽抑制PKCα活性的能力的图。

图6A是细胞培养皿的放大图(在Axiovert 25 Zeiss显微镜下放大200倍)，其显示了在各种制剂中胰岛素对创伤闭合及细胞增殖的影响。

图6B是显示了以采用各种制剂在胰岛素存在或不存在的情况下处理24小时后占对照的百分比形式表示的体外创伤闭合的图。

图6C是显示了根据通过胸腺嘧啶掺入测量的细胞增殖的图。

图7是显示了在更换细胞培养基之前或之后胰岛素和胰岛素+PKCα抑制剂对来自7个月大至2年大的小鼠的角质化细胞增殖的影响的图。

图8A提供了显示采用在各种制剂中的药物组合物治疗慢性足溃疡及其增加的闭合的照片和图。

图8B是显示了在各种制剂中在第0天和第60天时患者的慢性糖尿病创伤的治疗和增加的闭合的照片。

图9提供了显示在第0天、3个月和6个月时采用药物组合物治疗马慢性赘肉创伤的照片。

图10提供了显示在第0、30和60天时用药物组合物治疗伴随骨髓炎的慢性日光性脓肿的照片。

图11提供了显示在第0天、2个月和3.5个月时采用药物组合物治疗由自损伤引起的未愈合肢端舔的创伤的进展的照片。

图12是表示以商标

而为人所知的人类胰岛素类似物赖脯胰岛素(rDNA起源)的一级结构的示意图。

图13是表示以商标

而为人所知的人类胰岛素类似物天冬胰岛素(rDNA起源)的一级结构的示意图。

图14是表示商标

而为人所知的人类胰岛素类似物甘精胰岛素(rDNA起源)的一级结构的示意图。

图15是表示也以商标

R而为人所知的人类胰岛素类似物

R的一级结构的示意图。

图16是显示了在用胰岛素类似物(单独在制剂A中提供的)治疗后通过表皮和肉芽组织的形成而测量的创伤愈合的百分比并与未治疗的对照创伤比较的图。所研究的胰岛素类似物是赖脯胰岛素(HumL)、天冬胰岛素(Novo)、甘精胰岛素

和优泌林R(HumR)。

图17是显示了单独用优泌林R(HumR)、USP胰岛素(Ins USP)和PKCα假底物抑制肽(pep)或与胰岛素类似物以及抑制肽组合治疗的、通过肉芽组织的形成测量的促进创伤愈合的图。

图18是显示了单独用优泌林

R(HumR)、赖脯胰岛素(HumL)和PKCα假底物抑制肽(pep)治疗或与胰岛素类似物以及抑制肽协同组合治疗的严重炎症的百分比的图。

图19A和图19B显示了在培养基A和培养基B中培养的原代皮肤角质化蛋白中，在用内脏脂肪素(visfatin)或L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐处理后，在7个月大至2年大的小鼠角质化细胞中角蛋白1的表达。

发明详述

本公开的药物组合物包含药学上可接受的载体和PKCα抑制剂和/或胰岛素，其中所述的药学上可接受的载体包含在各种溶剂中的不同的无机盐和有机盐。

示范性的药学上可接受的载体的制剂组合物可以含有水、钾、氯化钠和生理上可耐受的磷酸盐，并且可如下制备：

A)氯化钾0.2g/L(KCl)

B)磷酸二氢钾(无水)0.2g/L(KH₂PO₄)

C)氯化钠8.0(g/L)(NaCl)

D)磷酸氢二钠(无水)1.15(g/L)(Na₂HPO₄)

该制剂必须不含有钙或镁离子。

尽管可以使用任何PKCα抑制剂，但优选地该PKCα抑制剂为豆蔻酰化的相应于PKCα的假底物区的肽(Myr*-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln-OH(SEQ ID NO：1CAS[147217-25-2])。该PKCα假底物区对这一特定同种型的底物区具有特别高的亲和力。可使用的其它PKC抑制剂的实例包括下列表1中所示的肽：

表1.PKC抑制剂肽

此外，以下PKC抑制剂也可在根据本发明的药物组合物中应用：

A)NPC 15437-二盐酸盐水合物(Sigma)，也被称为(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物。

分子式-C₂₅H₅₀N₄O₂·2HCl·xH₂O

分子量-511.61(无水基础上)

CAS号-141774-20-1(无水的)

MDL号-MFCD00210207

PubChem Substance ID-24897504

B)CGP41251-[4’-N-苯甲酰基星形孢菌素][米哚妥林]。该星形孢菌素衍生物PKC412(CGP 41251)是蛋白激酶C(CGP 41251)的常规同种型的更具选择性的抑制剂。

分子式-C₃₅H₃₀N₄O₄

分子量-570.65

C)Ro 31-8220-双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐(UpstateBitotechnology)。

分子式-C₂₅H₂₃N₅O₂S·CH₄O₃S

分子量-553.66

目录号#19-163，结构式显示如下

D)

其为12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑，一种α和PKCβ1抑制剂。

E)GF-109203X 2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺，一种强有力的且选择性的蛋白激酶C抑制剂。

F)ISIS 3521/LY900003，也被称为阿普卡生(aprinocarsen)，20-核苷酸硫代磷酸脱氧寡核苷酸，可购自Isis Pharmaceuticals，Inc.，Carlsbad，CA，其具有以下序列(SEQ ID NO：56)：

5’-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3’

在优选的实施方案中，本公开的药物组合物包含药学上可接受的载体、活化PKCδ的常规胰岛素或其功能类似物以及商业上可获得的由9个氨基酸构成的抑制PKCα的合成肽。

一种优选的药物组合物，其包括：

a)氯化钾0.2g/L(KCl)

b)磷酸二氢钾(无水)0.2g/L(KH₂PO₄)

c)氯化钠8.0(g/L)(NaCl)

d)磷酸氢二钠(无水)1.15(g/L)(Na₂HPO₄)

e)豆蔻酰化的肽(1-100μM)，诸如Myr*-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln-OH(SEQ ID NO：1)

f)常规胰岛素或其功能类似物(治疗剂量：0.1-10单位/ml)

上面列出的浓度是优选的在组合物中的最终浓度。

可以通过在不含有钙和镁离子的药学上可接受的载体中混合胰岛素或其功能类似物和PKCα抑制剂来制备该药物组合物。预期可以通过本领域技术人员已知的方法以溶液、凝胶、软膏、霜剂或乳化剂的形式制备根据本公开的药物组合物。

当配制在溶液中时，两种生物活性成分即胰岛素和PKCα抑制肽一起作用以诱导创伤愈合。胰岛素或其功能类似物的浓度可以是0.1-10单位/ml。PKCα的肽抑制剂的浓度可以是1至100μM。优选的浓度是在1ml溶液中0.1单位的胰岛素(10^-6M)和1μg肽(10^-6M)。

用于根据本公开的药物组合物的胰岛素可以是重组的或来自天然来源，诸如人类胰岛素或适于人类应用的非人类哺乳动物胰岛素。还预期可以用胰岛素类似物诸如胰岛素功能类似物来制备该药物组合物。胰岛素类似物的非限制性实例是赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素和重组的人胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐(本文也称为L-α)。

这些胰岛素类似物中的一些与常规的人胰岛素共享基本的一级结构。赖脯胰岛素与人胰岛素不同，因为在该类似物中B-28处的脯氨酸和B-29处的赖氨酸颠倒了。天冬胰岛素与人胰岛素不同是因为B-28处的脯氨酸被天冬氨酸替代了。甘精胰岛素与人胰岛素不同，因为A-21位的氨基酸天冬酰胺被甘氨酸替代了，并且将两个精氨酸残基添加到β-链的C-端。重组的人胰岛素可与人胰岛素在结构上相同并且通过rDNA技术来制备，例如通过应用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以产生所述的肽。

内脏脂肪素是脂质细胞因子，其可作为胰岛素类似物而起作用并且是能够结合并活化胰岛素受体的胰岛素模拟物。L-α是活化Ca²⁺-不敏感的PKC同工酶δ、ε和η的有机化合物。其通过血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)结构域与磷酸肌醇-1(GRP1)蛋白的通用受体结合，并且还报道其增加NIH/3T3细胞的运动性以及产生肌动蛋白重组和膜边缘波动。

在优选的实施方案中，将治疗有效量的药物组合物给药到有需要的受试者。可通过有效地提供期望治疗的任何已知的给药途径给药该药物组合物，优选地通过以溶液、软膏、凝胶、霜剂形式局部应用或任意局部应用(诸如皮下注射)来给药该药物组合物。还可通过药物流出装置，诸如纱布、贴片、垫片或药棉来给药该药物组合物。

根据本公开的本药物组合物的进一步方面是使用该药物组合物治疗受损的皮肤或皮肤创伤。应当以有序地治疗该创伤及达到期望端点(例如，直到创伤完全消除)所需要的频率和所需要的时间长度来给药该组合物。本领域技术人员能很容易地确定应用根据本公开的组合物和方法的合适疗程。

根据本公开的药物组合物的进一步方面是促进肉芽组织形成、表皮增殖和皮肤生长。根据本公开的药物组合物的另一方面是治疗炎症，例如由炎性皮肤病引起的炎症的方法。

本文中所使用的术语“α-PKC抑制剂”的意思是能够通过任何机制抑制PKCα同种型活性的分子。PKCα同种型的实例包括由登录号NM_002737[人PKCα]、XM_548026[家犬(Canis lupus familiaris)PKCα]、XM_001494589[马(Equus caballus)PKCα]和NM_011101[小鼠PKCα]描述的核酸编码的PKCα同种型，或者与这些PKCα同种型的成熟形式至少95％同一的肽链，如应用CLUSTALW算法的缺省设置所确定的那样。α-PKC抑制剂分子可通过结合、共价修饰或涉及此类分子与PKCα同种型物理相互作用的其它机制而直接地抑制PKCα同种型。α-PKC抑制剂分子还可以通过调节参与PKCα同种型活化的第二分子的活性(例如通过调节PKCα同种型相关信号传导级联的成分的活性以抑制PKCα同种型的活性，或通过使阻止PKCα同种型表达的RNA沉默)而间接地抑制PKCα同种型。

本文中所使用的术语“δ-PKC活化剂”意思是能够在细胞或组织中通过任何机制活化PKCδ同种型或增加PKCδ同种型活性的分子。PKCδ同种型的实例包括由登录号NM_006254[人PKCδ]、XM_001008716[家犬PKCδ]、XM_001915127[马PKCδ]和NM_011103[小鼠PKCδ]描述的核酸编码的PKCδ同种型，或者与这些PKCδ同种型的成熟形式至少85％同一的肽链，如应用CLUSTALW算法的缺省设置所确定的那样。δ-PKC活化剂分子可通过结合、共价修饰或涉及此类分子与PKCδ同种型物理相互作用的其它机制来直接地活化PKCδ同种型，并且可包括PKCδ同种型底物和辅因子。δ-PKC活化剂分子还可通过调节参与PKCδ同种型活化的第二分子的活性来间接地活化PKCδ同种型(例如，通过调节PKCδ同种型相关的信号传导级联的成分，诸如胰岛素受体的活性来活化PKCδ同种型)。δ-PKC活化剂分子还可通过在细胞或组织中产生PKCδ同种型的升高的表达从而增加细胞或组织中的PKCδ同种型活性。

本文中所使用的术语“药物流出支架”的意思是能够释放生理活性分子的固定材料。药物流出支架可以包含固定相材料，其可以是不溶的、可溶的、非生物可吸收的或生物可吸收的。

本文中所使用的术语“胰岛素”的意思是那些天然存在的肽激素或它们的前胰岛素原和胰岛素原前体形式，在它们的成熟形式中，其包含二硫键连接的A链和B链，其可以活化胰岛素受体并且已知可用于治疗糖尿病。来自许多不同的动物物种，诸如人类、牛和猪的胰岛素是公知的，并且本领域技术人员可很容易地识别。重要的是，胰岛素可以是重组产生的。

本文中所使用的术语“胰岛素类似物”的意思是包含没有在天然存在的胰岛素中发现的结构的分子，其能够通过任何机制活化胰岛素受体。此类分子可以是胰岛素的结构类似物，其中天然存在的胰岛素的一个或多个结构方面已经被修饰。此类分子还可以是模拟分子，其不包含在天然存在的胰岛素中发现的结构。胰岛素类似物还可以包括胰岛素样生长因子(例如，胰岛素样生长因子-1)。胰岛素类似物可通过结合、共价修饰或涉及与此类受体物理相互作用的其它机制而直接地活化胰岛素受体。胰岛素类似物还可通过调节参与此类受体活化的第二分子的活性而间接地活化胰岛素受体。不希望被理论所束缚，相信胰岛素受体的活化导致PKCδ的间接活化。许多不同的胰岛素类似物是已知的并且本领域技术人员很容易地识别。

本文中所使用的术语“标准状态”的意思是25℃+/-2℃的温度以及1个大气压的压力。在本文中描述并且以每单位体积为基础表示(例如，mol/L、M、单位/ml、μg/ml等)的溶液、悬浮液和其它制剂的浓度均是在“标准状态”下被确定的。在本领域中术语“标准状态”不是用来指单个领域认可的温度或压力设置，而是一种参照状态，所述参照状态应用特定温度和压力以描述在参照“标准状态”条件下具有特定组成的溶液、悬浮液或其它制剂。这是因为溶液的体积部分地是温度和压力的函数。本领域技术人员将认识到可在其它温度和压力下制备与本文公开的那些组合物等价的组合物。

本文中所使用的术语“药学上可接受的载体”的意思是适于向人或其它动物给药的一种或多种相容的固态或液态填充剂稀释剂或包封物质。

本公开的一个方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。理想地，药学上可接受的载体应当是高纯度的并且低毒性的，以使得它们适于向待治疗的人类或动物给药。此类药学上可接受的载体还应当维持δ-PKC活化剂和α-PKC抑制剂的生物活性。

此类药学上可接受的载体还可包括，例如，基于醋酸盐的缓冲剂、基于2-吗啉代乙磺酸(MES)的缓冲剂、基于邻苯二甲酸氢钾的缓冲剂、基于KH₂PO₄的缓冲剂、基于三(羟甲基)甲胺的缓冲剂和基于硼酸钠(Na₂B₄O₇·10H₂O)的缓冲剂。100mL0.1M邻苯二甲酸氢钾+体积指示的(以ml)0.1M NaOH。此类缓冲液可以被制得或可包含以下配方：

100mL的0.1M KH2PO4，用0.1M NaOH调节至期望的pH；

100mL的0.1M三(羟甲基)甲胺，用0.1M HCl调节至期望的pH；

以及100mL的0.025M Na₂B₄O₇·10H₂O(硼酸钠)，用0.1M HCl调节至期望的pH。

合适的药学上可接受的载体的实例包括水，石油膏，矿脂，矿物油，植物油，动物油，有机和无机蜡，例如微晶蜡、石蜡和地蜡，天然聚合物诸如苍耳烷，麦芽，滑石，明胶，糖，纤维素，胶原，淀粉，或阿拉伯树胶，合成的聚合物，醇，多元醇，磷酸盐缓冲液，可可脂，乳化剂，洗涤剂，例如吐温TM等。载体可以是基本上可在水中混溶的水可混溶的载体组合物，例如诸如，醇。水可混溶的局部药学上可接受的载体可以包括用上述一种或多种组分制得的那些，并且还可包括持续或延迟释放的载体，包括含水的、水可分散的或水可溶的组合物，例如脂质体、微海绵物、微球体或微胶囊，水基油膏，油包水或水包油乳液，或凝胶等。本领域技术人员将认识其它药学上可接受的载体。

其它相容的药物活性剂和添加剂可以被包括在用于本发明组合物的药学上可接受的载体中。例如，局部麻醉剂诸如NOVOCAINETM、利多卡因等可以被包括在药学上可接受的载体中。添加剂诸如苯甲醇和其它防腐剂也可以被包括在药学上可接受的载体中。本领域技术人员将能很容易地识别其它可药用活性剂和添加剂。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。其它胰岛素类似物的实例包括谷赖胰岛素(insulin glulisine)、地特胰岛素和白蛋白胰岛素(albulin)。这些胰岛素类似物中的某些也通过商标名

优泌林

等为人所知。此外，可将优泌林配制为包含0.16mg/ml甘油和0.7μg/ml氯化锌。可用1N盐酸或1N氢氧化钠将这些优泌林R组合物的pH调节至pH7.4。本文中公开的组合物还可包含如上所述的包括Zn²⁺离子的优泌林

R胰岛素类似物制剂的成分。

内脏脂肪素可包含SEQ ID NO：63中所示的人内脏脂肪素氨基酸序列。内脏脂肪素也可包含SEQ ID NO：64所示的小鼠内脏脂肪素氨基酸序列。本领域技术人员将识别其它的内脏脂肪素分子，诸如与SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64具有超过90％的同一性、或超过95％的同一性的那些分子，或它们的生物活性片段或变体。此外，本领域技术人员还将认识到氨基末端处的甲硫氨酸残基典型地被从多肽链例如体内表达的内脏脂肪素和其它的成熟形式中切除。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，胰岛素是重组表达的。可通过本领域技术人员公知的常规技术实施通过用重组的DNA转化宿主细胞的重组表达。宿主细胞可以是原核细胞、古细菌细胞或真核细胞。可通过本领域公知的技术实施重组表达的多肽(诸如重组胰岛素肽链)的分离和纯化，例如，制备色谱法以及应用抗体或与给定多肽特异性地结合的其它分子的亲和纯化。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。本领域技术人员将认识到在所公开的组合物中，PKC抑制剂可以呈盐、水合物和复合物的形式。此外，本领域技术人员还将认识到PKC抑制剂可以被混合在公开的组合物中。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，α-PKC抑制剂是选自由具有以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ED NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

可通过这样的通常使用的方法合成此类肽，所述方法例如为t-BOC或FMOC保护α-氨基基团。这两种方法均涉及逐步的合成，由此从肽的羧基末端处开始，每一步添加单个氨基酸(Coligan等，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，单元9)。还可通过在Merrifield(85 J.Am.Chem.Soc.2149(1962))和Stewart及Young，Solid Phase Peptides Synthesis，(Freeman，San Francisco，1969，第27-62页)中描述的公知的固相肽合成方法，使用含有0.1-1.0mMo1的胺/g聚合物的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，来合成本发明的肽。在化学合成完成之后，可以使肽脱保护，并通过用HF-10％苯甲醚在0℃处理约1/4-1小时而将肽从聚合物上切下。在蒸发试剂后，用1％乙酸溶液从聚合物中提取肽，然后将其冻干以产生粗材料。这通常可以通过诸如应用5％乙酸作为溶剂在Sephadex G-15上凝胶过滤的方法对其进行纯化。将适当的柱的级分冻干将产生均匀的肽或肽衍生物，然后可通过这样的标准技术如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱法、紫外吸收光谱、摩尔旋光和基于溶解度的方法对其进行表征。

还可通过任何生物学方法，例如通过在哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母和细菌以及无细胞系统(诸如体外转录和翻译系统)中重组表达蛋白质来合成肽。可通过大家接受的方法针对每一系统将蛋白质表达最优化。可通过标准方法(Frederich M.Ausubel，等，Current Protocols inMolecular Biology，Wiley Interscience，1989)纯化蛋白质。例如，可如描述的那样(Erangionic和Neel，Analytical Biochemistry，210：179，1993)在细菌中以GST-融合蛋白形式表达并通过谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma)纯化蛋白质。备选地，可在哺乳动物细胞中以分泌产物形式表达并从条件培养基中纯化蛋白质(Cadena和Gill，Protein Expression andPurification 4：177，1993)。可应用自动肽合成仪[诸如AppliedBiosystems 431A-01肽合成仪(Mountain View，Calif.)]或应用Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA82：5131(1985)描述的人工肽合成技术合成通过Merrifield的方法制备的肽。还可通过使用共价修饰、液相肽合成或本领域技术人员公知的任何其它方法合成肽。

可应用氨基酸或氨基酸类似物来合成肽，可如需要的那样应用例如二碳酸叔丁酯(t-BOC)基团或芴基甲氧羰基(FMOC)基团保护氨基酸或氨基酸类似物的活性基团。氨基酸和氨基酸类似物可商购(SigmaChemical Co.；Advanced Chemtec)或应用本领域已知的方法合成。

本文中公开的肽中的氨基酸可通过示范性肽中所示的一个或多个特定氨基酸的氨基酸替换而被修饰。氨基酸替换改变可包括一个碱性氨基酸替换另一个碱性氨基酸，一个疏水氨基酸替换另一个疏水氨基酸或其它保守替换。氨基酸替换还可以包括使用非天然存在的氨基酸，例如，例如鸟氨酸(Orn)或高精氨酸(homoArg)替换Arg。

还可通过其它分子的共价连接或肽中存在的官能团的反应来修饰肽。此类修饰的实例包括连接聚乙二醇分子、脂质、糖类或其它分子。此类修饰的特定实例还包括豆蔻酰化和酰胺化。用于肽共价修饰的技术是本领域中公知的，并且本领域技术人员将知晓许多此类技术。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，α-PKC抑制剂是由SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，α-PKC抑制剂是由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。

本公开的另一方面是组合物，其包含胰岛素、由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成并且在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基的肽以及包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的水性药学上可接受的载体。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述组合物包含约0.0001单位/L至约0.1单位/L的胰岛素和约1μM至约100μM的所述肽。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述组合物包含0.0001单位/L的胰岛素和1μM的所述肽。

本公开的另一方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂、不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体以及药物流出支架的药物组合物。所述药物流出支架可以是能够递送药物组合物的任何固相结构。该药物流出支架可以保持药物组合物并随时间通过手段例如扩散、毛细管作用、重力或其它用于使分子流动的物理过程递送药物组合物。药物流出支架可以包括，例如，层状纤维或纺织纤维、纤维垫、泡沫、凝胶、不同固体的基质或任何其它的固相结构，并且可以以任何形式，例如支架被提供。本领域技术人员将知晓其它合适的药物流出支架。

在该组合物的一个实施方案中，药物流出支架包含多孔固体。此类多孔固体的实例包括海绵、泡沫、纱布、凝胶或其它基质。本领域技术人员将知晓药物流出支架的其它实例。

在该组合物的一个实施方案中，药物流出支架是海绵。

本公开的另一方面是由包括以下步骤的方法制得的药物组合物：a)提供δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；以及b)混合所述δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；由此制得药物组合物。

本文中公开的其它组合物还可通过类似地涉及提供该组合物的成分并然后混合这些成分以制备此类组合物的步骤的方法制备。

本公开的另一方面是用于增加动物皮肤创伤闭合的方法，其包括以下步骤：a)提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及b)向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此增加皮肤创伤的闭合。

可通过鉴定包含正常组织的未受影响的创伤边缘并确定创伤边缘内未治愈的区域来评估皮肤创伤闭合。当创伤边缘内未治愈的区域相对于之前的测量值下降时，则发生了创伤的闭合。最终，增加皮肤创伤的闭合导致创伤的完全闭合，使得没有未治愈的区域。本领域技术人员将知晓用于评估创伤闭合及其是否增加的其它技术。

本领域技术人员可以通过本领域技术人员容易操作的常规实验，通过组织学、H&E染色、角蛋白14染色或免疫化学或通过观察脓肿形成、过度的白细胞增多和血管中高的RBC/WBC比值来确定药物组合物的有效量。本领域技术人员还可通过简单地观察或测量治疗之前和治疗之后合理时间的创伤面积的改变来鉴定有效量的药物组合物已经被给药到具有皮肤创伤的受试者。

适用于在本公开的方法中给药的药物组合物可以以溶液、油膏、乳液、霜剂、凝胶、颗粒、薄膜和硬膏的形式被提供。本领域技术人员将知晓适用于给药的所公开的药物组合物的其它形式。

本发明的另一方面是用于减少动物上的皮肤创伤部位的炎症的方法，其包括以下步骤：a)提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及b)向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此减少皮肤创伤部位的炎症。

当以下参数中的至少两个存在于皮肤创伤部位时，则发生了炎症：在创伤的区域形成脓肿；过度的白细胞增多(在200倍的固定视野中＞100个细胞)；以及在血管中高的WBC/RBC(白细胞/红细胞)比，其中在固定视野(200倍)中显示在血管内＞20％的WBC含量。当没有或仅有上述参数中的一个存在于皮肤创伤部位时，则可认为炎症下降了。备选地，可通过其它公知的临床征兆，例如肿胀、红色、脓等来评估皮肤创伤部位的炎症。当这些临床征兆的严重性下降或完全消失时，则可认为炎症下降了。本领域技术人员还将知晓用于评估炎症及其是否下降的其它技术。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，该组合物包含约0.0001单位/L至约0.1单位/L的胰岛素或胰岛素类似物。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，该组合物包含约0.0001单位/L的胰岛素或胰岛素类似物。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，该组合物包含约0.0001单位/L至约0.1单位/L的胰岛素和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的组合物。

本公开的另一方面是用于增加动物创伤闭合的方法，其包括以下步骤：提供包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的创伤给药有效量的该药物组合物，其中所述的创伤是选自由糖尿病溃疡创伤、肢端舔的创伤、赘肉创伤、外科手术创伤、慢性日光性脓肿创伤和骨髓炎创伤组成的组中的至少一种；由此增加皮肤创伤的闭合。

本公开的另一方面是包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。K⁺阳离子的来源的实例包括氯化钾(KCl)、碳酸氢钾(KHCO₃)和磷酸钾(KH₂PO₄)。本领域技术人员将很容易地知晓其它K⁺阳离子来源。

本公开的另一方面是包含δ-PKC活化剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

本公开的另一方面是包含α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，该药物组合物包含约1μM至约100μM的α-PKC抑制剂肽。

在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，该药物组合物包含1μM的α-PKC抑制剂肽。

本公开的另一方面是减少动物上的皮肤创伤部位的炎症的方法，其包括以下步骤：提供包含α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体的药物组合物；以及向动物上的皮肤创伤给药有效量的该药物组合物；由此减少皮肤创伤部位的炎症。

实施例

材料和实验方法

材料：组织培养基和血清是从Biological Industries(Beit HaEmek，Israel)购买的。增强的化学发光(Enhanced Chemical Luminescence，ECL)使用从BioRad(Israel)购买的试剂盒进行。单克隆抗p-tyr抗体购于Upstate Biotechnology Inc.(Lake Placid，NY，USA)。PKC同种型的多克隆和单克隆抗体购于Santa Cruz(California，USA)和TransductionLaboratories(Lexington，KY)。辣根过氧化物酶抗兔和抗小鼠IgG获自Bio-Rad(Israel)。亮肽素、抑肽酶、PMSF、DTT、原钒酸钠和胃蛋白酶抑制剂购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)。胰岛素(优泌林R-重组人胰岛素)购自Eli Lilly France SA(Fergersheim，France)。IGF1购自Cytolab(Israel)。角蛋白14抗体购自Babco-Convance(Richmond，CA)。BDGF-BB购自R&D系统(Minneapolis)，豆蔻酰化(myristolated)的PKCα假底物购自Calbinochem(San Diego，CA)。快速细胞增殖试剂盒购自Calbiochem(San Diego，CA)。

所使用的胰岛素类似物是赖脯胰岛素(

Eli Lilly)、天冬胰岛素(Novo Nordisk)、甘精胰岛素(

SanofiAventis)和重组常规胰岛素(优泌林

R，Eli Lilly)。其它所使用的胰岛素类似物是鼠内脏脂肪素(ALEXIS Corporation，Lausen，Switzerland，Product Number ALX-201-318-C050)和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐(Calbiochem；目录号524615)(L-α)。

角蛋白1特异性抗体和蛋白质印记分析二抗可商业获得。

鼠角质化细胞的分离和培养：如之前所述从新生皮肤上分离原代角质化细胞。在含有8％的Chelex(Chelex-100，BioRad)处理的胎牛血清的Eagle’s最小必需培养基(EMEM)中培养角质化细胞。为了维持增殖的基底细胞的表型，将最终的Ca2+浓度调节为0.05mM。铺板后五天到七天进行实验。

培养基A和B都是含有经8％CHELEX^TM处理的胎牛血清的来自Biological Industries(以色列)的EMEM eagle’s最小必需培养基。CHELEX^TM是强螯合剂，其与游离的Ca²⁺和Mg²⁺结合以防止这些离子可以被培养的细胞生物利用。培养基A不含有KCl，培养基B含有KCl 0.4mg/ml。

用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备：将含有角质化细胞的培养皿用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤。用机械力使细胞分离，并且在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(20μg/ml亮肽素、10μg/ml抑肽酶；0.1mM PMSF；1mM DTT；200μM原钒酸盐；2μg/ml胃蛋白酶抑制剂)的RIPA缓冲液(50mM Tris·HCl pH7.4；150m MNaCl；1mMEDTA；10mM NaF；1％Triton x100；0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠)中裂解。将此制备物在4℃在微型离心机中以最大速度离心20分钟。将上清液用于免疫沉淀。

免疫沉淀：通过将300μg细胞裂解物与25μl蛋白A/G琼脂糖凝胶(Santa Cruz，CA，USA)混合，并将悬浮液在4℃连续旋转30分钟，进行裂解物的预处理。然后将制备物在4℃以最大速度离心10分钟，向上清液中加入30μl A/G琼脂糖凝胶以及个别抗原的特异性多克隆或单克隆抗体(稀释率1∶100)。将样品在4℃旋转过夜。然后将悬浮液在4℃以最大速度离心10分钟，用RIPA缓冲液洗涤沉淀。然后将悬浮液以15,000xg再次离心(4℃，10分钟)，用TBST洗涤四次。加入样品缓冲液(0.5M Tris·HCl pH6.8；10％SDS；10％甘油；4％2-β-巯基乙醇；0.05％溴酚蓝)，将样品煮沸5分钟，然后进行SDS-PAGE。

腺病毒构建体：按照Saito等人54 J.Virol.711(1985)之前描述的那样构建重组腺病毒载体。

用PKC同种型基因转导角质化细胞：吸出培养基，用编码特定PKC同种型(诸如PKCα)的PKC重组腺病毒感染角质化细胞培养物一小时。然后用MEM洗涤所述培养物两次并重新培养。感染后十小时，将细胞转移至无血清的含低Ca²⁺的MEM中24小时。

PKC活性：在从经适当处理后的角质化细胞培养物新鲜制备的免疫沉淀物中测定特定PKC活性。在不含NaF的RIPA缓冲液中制备这些细胞裂解物。用SigmaTECT蛋白激酶C分析系统(Promega，Madison，WI，USA)测定活性，根据制造商的说明操作。在这些研究中用PKCα假底物作为底物。

细胞增殖：在6孔板中通过[³H]胸苷掺入测定细胞增殖。将细胞用[³H]胸苷(3μCi/ml)脉冲一小时。温育后，用PBS洗涤细胞五次，将5％TCA加入每个孔中持续1小时。除去溶液，将细胞溶于1MNaOH中。在TRI-CARB^TM液体闪烁计数器的³H窗口中对掺入细胞的标记的胸苷进行计数。

PKC免疫激酶检测：纯化的和标准化的PKC同工酶由P.Blumberg博士(NCI，NIH，U.S.)和Marcello G.Kazanietz博士(宾夕法尼亚州大学，医学院)慷慨提供。将原代角质化细胞收集在500μl 1％Triton裂解缓冲液(在1x PBS中的1％TritonX-100、10μg/ml抑肽酶和亮肽素、2μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1mM PMSF、1mM EDTA、200μMNa₂VO₄、10mM NaF)中。在4℃培育胞溶产物30分钟，在4℃以16,000xg旋转30分钟。将上清液转移至新鲜试管中。用5μg/个样品的抗α6/GoH3(PharMingen)和30μl/个样品的蛋白A/G-+琼脂糖浆(Santa Cruz)在4℃对细胞裂解物进行免疫沉淀过夜。用RIPA缓冲液洗涤珠子一次，用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤两次。向每个检测中加入35μl反应缓冲液(1mM CaCl₂、20mM MgCl₂、50mM Tris·HClpH7.5)。对于每个检测，向所述浆中加入5.5μl/个检测的含有DMSO或10mM TPA的磷脂囊泡悬浮液以及标准化量的特异性PKC同工酶。加入10μl/个检测的125mM ATP(1.25μCi/个检测[γ-32P]ATP，Amersham)起始反应，在30℃持续10分钟。用RIPA缓冲液洗涤珠子两次。加入30μl/个样品的负载蛋白质的染料(3x Laemmli，5％SDS)，将样品在水浴中煮沸5分钟。用SDS-PAGE在8.5％的凝胶上分离蛋白质，转移到氯丙嗪膜(Schleicher&Schuell)上，用放射自显影显像。将组蛋白的磷酸化和PKC底物肽的磷酸化用作PKC活性的对照。

体内切开创伤的产生和炎症的诱导：在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。

其它技术：应用公知的标准方案，例如描述于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)中的那些进行其它技术例如蛋白质印记等。

除非另外指出，在实施例和附图中的PKCα抑制剂是豆蔻酰化的在SEQ ID NO：1中所示的肽。类似地，除非另外指出，胰岛素是人重组胰岛素，并且被称为“胰岛素”、“USP胰岛素”或“Ins USP”。

实施例1

进行了以下试验，以应用在各种制剂中制备的胰岛素(10^-6M；0.1单位/ml)和PKCα抑制剂(Myr-假底物PKCα肽，1μM)来确定体外创伤愈合的效果。

首先，分离并培养鼠角质化细胞。简而言之，根据Alt等人2004；Li等人1996，从新生皮肤上分离原代角质化细胞。在含有经8％Chelex(Chelex-100，BioRad)处理的胎牛血清的Eagle’s最小必需培养基(EMEM)中培养角质化细胞。为了维持增殖的基底细胞的表型，将最终的Ca²⁺浓度调节为0.05mM。

5天后，使汇合的角质化细胞进行体外划伤测试并随后愈合伤口。创伤形成后，将在各种制剂中的胰岛素+PKCα抑制剂加入细胞培养物中：制剂A Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS--)；制剂B含有磷酸盐、钾、钙和镁的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)；制剂C三羟甲基氨基乙烷(CASNo.[77-86-1])以及含有三羟甲基氨基乙烷(CAS No.[77-86-1])和KCl0.4mg/ml的制剂D。在约7.2的pH下提供制剂，并且其可包含用来维持给定渗透压所需的其它组分，例如盐等。

随后是创伤闭合。在处理24小时后，与未处理的对照相比，仅有用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂处理的培养物显示出创伤闭合。这一试验以一式三份进行。代表性的细胞培养皿被显示于图1A中。图1B显示了在处理24小时后以闭合百分数表示的创伤闭合。

实施例2

进行了以下试验以进一步评估由在各种制剂中制备的胰岛素+PKCα抑制剂介导的创伤闭合。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于伤口上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的胰岛素(10^-6M；0.1单位/ml)；假底物PKCα肽，1μM(PKCα抑制剂)；或胰岛素+PKCα抑制剂(1μM Myr-假底物PKCα肽和胰岛素0.1单位)治疗创伤。

7天后，切下创伤，并通过检查创伤的形态学和组织学来评估愈合创伤的百分比。以愈合创伤相对于每组创伤总数的百分数形式显示结果。与在制剂B和制剂C中的创伤边缘闭合相比，通过在制剂A中施用的胰岛素+PKCα抑制剂的治疗显著地诱导了创伤的完全愈合。对于所有制剂，相对于仅单独用制剂治疗的对照组，单独用胰岛素或假底物肽治疗没有促进创伤愈合。结果显示于图2A中。治疗7天后创伤的代表性照片被提供于图2B中。

实施例3

进行了以下试验以评估假底物PKCα肽(PKCα抑制剂)的抗炎效果。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于伤口上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的1μM Myr-假底物PKCα肽治疗创伤。

7天后，切下创伤，并进行组织学和免疫组织化学。当以下3个参数中的至少2个存在于皮肤创伤缺口时，则认为炎症负担是严重的：(1)在创伤区域形成脓肿；(2)过度的白细胞增多(在200倍的固定视野中＞100个细胞)；(3)在血管中高的WBC/RBC比，其中在固定视野(x200)中显示在血管内＞20％的WBC含量。以具有严重炎症的创伤相对于该组中创伤数的百分数形式概述和展示结果。如图3中所示，仅当在制剂A中施用假底物PKCα肽时，注意到严重炎症的显著减少。当在制剂B或制剂C中施用治疗时，没有观察到炎症负担的减少。

实施例4

进行了以下试验以评估药物组合物对肉芽组织形成的效果。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于伤口上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的1μM Myr-假底物PKCα肽和0.1单位/ml的胰岛素治疗创伤。

7天后，切下创伤，根据标准方法固定并在H&E染色后以组织化学方式进行评估。应用H&E染色评估肉芽组织形成，并且根据在创伤床处所形成的肉芽组织占总创伤面积的百分数来打分。当用胰岛素+PKCα抑制剂治疗时，仅每天用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂治疗的创伤显示出与对照和制剂B及制剂C治疗的组相比的肉芽组织形成的显著增加。结果被显示于图4中。

实施例5

进行了以下实验以确定制剂的含量是否影响假底物PKCα肽抑制PKCα活性的能力。

如上所述那样分离并培养鼠角质化细胞。5天后，用PKCα重组腺病毒感染汇合的角质化细胞。如Alt等人2001；Alt等人2004；Gartsbein等人2006描述的那样构建重组的腺病毒载体。用含有PKCα重组腺病毒的上清夜感染角质化细胞培养物1小时。然后用MEM洗涤所述培养物两次并重新培养。感染后十小时，将细胞转移至无血清的低Ca²⁺的MEM中24小时。

感染后24小时，用在上述各种制剂(制剂A和B)中的PKCα抑制剂(Myr-假底物PKCα肽，1μM)处理细胞15分钟。

然后对细胞提取物进行PKC活性分析。首先，将原代角质化细胞收集在500μl 1％Triton裂解缓冲液(在1x PBS中的1％TritonX-100、10μg/ml抑肽酶和亮肽素、2μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1mM PMSF、1mMEDTA、200μM Na₂VO₄、10mM NaF)中。然后在4℃培育胞溶产物30分钟，使其在4℃以16,000xg旋转30分钟。将上清液转移至新鲜试管中。用5μg/个样品的抗α6/GoH3(PharMingen)和30μl/个样品的蛋白A/G-Plus琼脂糖浆(Santa Cruz)在4℃对细胞裂解物进行免疫沉淀过夜。用RIPA缓冲液洗涤珠子一次，用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤两次。向每个检测中加入35μl反应缓冲液(1mM CaCl₂、20mMMgCl₂、50mM Tris·HCl pH7.5)。对于每个检测，向浆中加入5.5μl/个检测的含有DMSO或10mM TPA的磷脂囊泡悬浮液，以及标准化量的特异性PKC同工酶。通过加入10μl/个检测的125mM ATP(1.25μCi/个检测[γ-32P]ATP，Amersham)使反应开始，让其在30℃持续10分钟。然后用RIPA缓冲液洗涤珠子两次。加入30μl/个样品的负载蛋白的染料(3x Laemmli，5％SDS)，将样品在水浴中煮沸5分钟。通过SDS-PAGE在8.5％的凝胶上分离蛋白质，转移到氯丙嗪膜(Schleicher&Schuell)上，并且通过放射自显影显像。将组蛋白的磷酸化和PKC底物肽的磷酸化用作PKC活性的阳性对照。

应用SignaTECT蛋白质激酶C分析系统(Promega，Madison，WI，USA)，根据制造商的说明书测量特异性的PKC活性。在这些研究中，应用PKCα假底物作为底物。

仅有在制剂A中的PKCα抑制剂能相对于对照制剂和未处理的细胞培养板显著地抑制过表达细胞中的PKCα活性。一式两份地进行试验。将结果以PKCα活性相对于过表达PKCα的对照细胞中PKCα活性的减少百分数形式显示于图5中。

实施例6

进行了进一步试验以体外评估由在各种制剂中的胰岛素介导的创伤闭合及细胞增殖。

如上所述那样分离并培养鼠角质化细胞。5天后，使汇合的角质化细胞进行体外划伤测试以跟踪创伤愈合。创伤形成后，将在上述各种制剂(制剂C和D)中的胰岛素(胰岛素10^-6M，0.1单位/ml)加入到细胞培养基中。跟踪创伤闭合48小时。一式三份地进行这一试验。代表性的细胞培养皿显示于图6A中。在图6B中，以处理48小时后闭合的百分数形式表示创伤闭合。

然后，应用胸苷掺入评估所培养的创伤中的细胞的增殖(图6C)。在6孔板中通过[³H]胸苷掺入测定细胞增殖。将细胞置于24孔板中，并用[³H]胸苷(3μCi/ml)脉冲一小时。温育后，用PBS洗涤细胞五次，将5％TCA加入每个孔中持续1小时。然后除去溶液，将细胞溶于1MNaOH中。在液体闪烁计数器的³H窗口中对掺入细胞的标记的胸苷进行计数。如图6A-C中所示，KCl的加入改变了胰岛素诱导的创伤闭合及细胞增殖。

实施例7

评估了在培养基B中预温育角质化细胞对胰岛素和胰岛素+PKCα抑制剂对细胞体外增殖效果的影响。允许5天龄的、来自成年小鼠(7-10个月至2年)尾部的汇合的角质化细胞的培养物在体外增殖。在MEM(培养基A)中5天后，将生长培养基更换为培养基B(上述的)。与培养基更换平行或在更换后24小时，用胰岛素或胰岛素+PKCα抑制剂处理细胞。用可商购的快速细胞增殖试剂盒(目录号QIA127；Calbiochem)测量细胞的增殖率。一式六份地进行该试验。以占未处理的细胞(对照)的百分数形式展示结果。正如可从图7所看到的那样，在培养基B中预温育细胞24小时增强了胰岛素和胰岛素+PKCα抑制剂对细胞增殖的效果。

实施例8A

通过每天局部应用在制剂A(结果显示于图8A的下图)或制剂C(结果显示于图8A的上图)中应用的胰岛素+PKCα抑制剂来治疗患有慢性足溃疡的人类患者，历时12周。尽管在制剂A中应用的胰岛素+PKCα抑制剂显示出在第12周前完全的闭合，在用制剂C中的胰岛素+PKCα抑制剂治疗的患者的溃疡中没有观察到显著的愈合。每周跟踪患者创伤并应用

(Smith&Nephew)测量。对于两个患者的每周一次的12个测量值，显示了创伤宽度和创伤长度的随访图(下图)。

实施例8B

通过局部每日应用在制剂A(结果显示于图8B的左图)或制剂C(结果显示于图8B的右图)中应用的胰岛素+PKCα抑制剂来治疗患有糖尿病创伤的人类患者，历时60天。尽管在制剂A中应用的胰岛素+PKCα抑制剂显示出在第60天前完全的创伤闭合及愈合，在用制剂C中的胰岛素+PKCα抑制剂治疗的创伤中没有观察到显著的愈合。图8B显示了在第0天和第60天时的创伤随访记录。

实施例9

一年龄的雌性夸特马(quarter horse)患有冗长肉芽组织(赘肉)创伤，数月未治愈。用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂每天治疗该创伤，历时3个月。这一阶段后，该创伤完全闭合并治愈。6个月的随访显示完全的组织再生。结果被显示于图9中。

实施例10

两年龄的马具有蹄创伤，被诊断为伴有骨髓炎的慢性日光性脓肿。持续几个月的阶段没有发生这一创伤的愈合。通过将该组合物直接应用于该创伤持续30分钟，用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂每天进行治疗。如图10中所示，在一个月的治疗内，该创伤大小显著减小，在两个月内，该创伤完全闭合并治愈。

实施例11

使用常规治疗来治疗由于经常的舔(肢端舔)而在其爪子上患有创伤的狗，历时几个月而未任何愈合。每天应用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂进行治疗，该创伤在2个月内完全闭合并治愈。在治疗3.5个月后，观察到完全的毛皮再生。结果被显示在图11中。

实施例12

研究了在制剂A中制备的四种胰岛素类似物以确定胰岛素是否能单独促进创伤愈合。在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接置于伤口上的在制剂A(上述)中的0.1单位/ml的各种胰岛素类似物治疗创伤。所研究的胰岛素类似物是赖脯胰岛素(HumL)、天冬胰岛素(Novo)、甘精胰岛素

和优泌林

R(HumR)。7天后，切下创伤，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

通过测量表皮基底层形成和肉芽组织形成而独立地评估创伤愈合的百分数。通过应用角蛋白14染色以检测表皮基底层形成，从而评估表皮闭合。展示出完全的表皮重建的创伤被认为是愈合的。应用H&E染色评估肉芽组织形成，并根据在创伤床处所形成的肉芽组织在总创伤面积中所占的百分数进行打分。展示出＞70％肉芽组织形成的创伤被认为是愈合的。

结果表明，在制剂A中单独的胰岛素类似物相对于对照增加了创伤愈合及创伤闭合。结果显示于图16中。在图16中，通过商标名的缩写称呼胰岛素类似物：“HumL”是赖脯胰岛素、“Novo”是天冬胰岛素、

是甘精胰岛素，以及“HumR”是优泌林

R。

实施例13

在如图17中所指示的那样，在用正常重组人胰岛素和USP胰岛素PKCα假底物抑制肽治疗后，通过评估肉芽组织形成来测量创伤愈合，从而鉴定协同作用。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接置于创伤上的如图17中指示的在制剂A(上述)中的PKCα假底物抑制肽(1μg/ml)或0.1单位/ml的常规重组人胰岛素、USP胰岛素和PKCα假底物抑制肽(1μg/ml)治疗创伤。7天后，切下创伤，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

应用H&E染色评估肉芽组织形成，并根据所形成的肉芽组织在创伤床的总创伤面积中所占的百分数进行打分。展示出＞70％肉芽组织形成的创伤被认为是愈合的。

当与对照创伤或与单独给药每一种化合物比较时，结果表明与PKCα假底物抑制肽组合的USP胰岛素产生了与常规人胰岛素+PKCα假底物抑制肽类似的对创伤愈合的协同作用。这一数据指示胰岛素类似物和PKCα假底物抑制肽的组合可能有助于促进肉芽组织的形成和治疗创伤。

结果显示于图17中。在图17中，分别通过缩写“HumR”和“InsUSP”来表示常规重组人胰岛素和USP胰岛素。PKCα假底物抑制肽被称为“pep”。

实施例14

测量了在用胰岛素类似物、重组人胰岛素和PKCα假底物抑制肽治疗后的炎症，以确定这些治疗对炎症的效果。

在C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的皮肤创伤部位测量严重炎症水平。如上所述那样通过切开制备创伤。如图18中所指示的那样，每天用在制剂A中的PKCα假底物抑制肽(1μg/ml)、0.1单位/ml的重组人胰岛素、或0.1单位/ml的赖脯胰岛素进行治疗。应用标准方法制备乳液，并用纱布绷带(其作为药物流出支架起作用)递送至皮肤。7天后，切下皮肤组织，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

应用以下参数评估严重炎症(如上所述)：

(1)脓肿形成；

(2)过度的白细胞增多(在200倍的固定视野中＞100个细胞)；

(3)在血管中高的WBC/RBC比，其中在固定视野(x200)中显示在血管内＞20％的WBC含量。

通过合并根据对每一标本观察到的上述参数的每一个所记录的数据来确定严重炎症的总百分数。当上述3个参数中的至少2个存在于创伤缺口处时，则认为炎症负担是严重的。

结果证实，当与制剂A中的PKCα抑制肽组合时，与对照相比，胰岛素类似物和重组人胰岛素协同地促进了严重发炎的皮肤中炎症反应的减少。这一数据指示可应用图18中显示的治疗来治疗皮肤的炎症疾病，例如由炎性皮肤疾病引起的炎症。这一数据还指示乳液制剂和药物流出支架例如纱布绷带可用于递送本发明公开的药物组合物。

结果被描绘在图18中。在图18中，分别通过缩写“HumR”和“HumL”来表示常规重组人胰岛素和赖脯胰岛素。PKCα假底物抑制肽被称为“pep”。

实施例15

在培养基A和培养基B中温育角质化细胞以及使用鼠内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐(L-α)(Calbiochem；目录号：524615)治疗对角蛋白1表达的影响。

如上所述那样，在培养基A(MEM)中维持从成年小鼠(7-10月至2年)尾部分离的原代皮肤角质化细胞。在(培养基A)中5天后，将一半的培养板中的生长培养基更换为培养基B(如上述)。

随后将内脏脂肪素或L-α单个地加入到在培养基A(图19A)中培养的细胞以及在培养基B(图19B)中培养的细胞中，如图19所示。内脏脂肪素在培养基中的终浓度是0.0001μg/ml内脏脂肪素。在培养基中L-α的终浓度是100ng/ml。

如上所述那样，通过将钙从0.05mM升高至0.12mM而诱导细胞分化。在分化二十四(24)小时后，收集细胞并进行蛋白质印记分析。应用标准蛋白质印记技术使用角蛋白1的特异性抗体评估角蛋白1的表达。然后应用标准密度方法量化角蛋白1的表达。

角蛋白1是棘分化标记。在角质化细胞中角蛋白1的表达与表皮角质化细胞有丝分裂活性的丧失相关，并且被限制在终端分化的中间阶段。减少的角质化细胞分化与角质化细胞迁移及增殖相关，并且因此与表皮形成相关联。

结果指示，在培养基A中用内脏脂肪素和L-α处理后，角蛋白1的表达相对于对照样本下降了(图19A)。相反，在培养基B中培养的角质化细胞的角蛋白1的表达没有受到内脏脂肪素或L-α处理的显著影响(图19B)。一并考虑，这些结果指示，当在培养基A中提供时，胰岛素类似物例如内脏脂肪素或L-α能够抑制角蛋白分化并促进表皮形成。

附图详述

图1

应用在各种制剂中制备的胰岛素+PKCα抑制剂的体外创伤愈合的效力。

对5天龄的、汇合的角质化细胞进行体外划伤测试并检查创伤愈合。

创伤形成后，将在上述各种制剂(制剂A-C)中的胰岛素和PKCα抑制剂(胰岛素10^-6M；0.1单位/ml)、Myr-假底物PKCα肽，1μM)加入到细胞培养物中，并跟踪创伤闭合。在处理24小时后，仅有用在制剂A中提供的胰岛素和PKCα抑制剂处理的细胞相对于未处理的对照显示出创伤闭合。这一试验以一式三份进行。图1A显示了代表性的细胞培养板的照片。图1B显示了处理24小时后的闭合百分数(p＜0.05)。

图2

只有在制剂A中，胰岛素+PKCα抑制剂促进显著的创伤闭合。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于伤口上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的胰岛素(10^-6M；0.1单位/ml)；PKCα抑制剂(假底物PKCα肽，1μM)；或胰岛素+PKCα抑制剂(1μM Myr-假底物PKCα肽和胰岛素0.1单位)治疗创伤。7天后，切下创伤，并通过创伤的形态学和组织学评估愈合创伤的百分比。在图2A中，以愈合创伤占每一组的创伤总数的百分数显示结果。通过在制剂A中施用的胰岛素+PKCα抑制剂的治疗显著地诱导了创伤的完全愈合。相反，在制剂B和制剂C中仅观察到创伤边缘闭合。对于所有制剂条件，与仅用各种制剂治疗的对照组相比，单独用胰岛素或假底物肽治疗没有促进创伤愈合的效力。图2B显示了来自代表性的创伤活组织的照片。

图3

仅当在制剂A中施用时，PKCα抑制剂才减少创伤床处的严重炎症负担。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于伤口上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的PKCα抑制剂(1μM假底物PKCα肽)治疗创伤。7天后，切下创伤，并进行组织学和免疫组织化学。当以下3个参数中的至少2个存在于皮肤创伤缺口处时，则认为炎症负担是严重的：(1)在创伤区域形成脓肿；(2)过度的白细胞增多(在200倍的固定视野中＞100个细胞)；(3)在血管中高的WBC/RBC比，其中在固定视野(x200)中显示在血管内＞20％的WBC含量。以具有严重炎症的创伤在该组中每总创伤数中所占的百分数概括和展示结果。如柱状图所示，仅当在制剂A中施用PKCα抑制剂时，才观察到严重炎症的显著减少。当在制剂B或制剂C中应用治疗时，没有观察到炎症负担的减少。

图4

当在制剂A中治疗时，胰岛素+PKCα抑制剂诱导肉芽组织形成。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接施用于创伤上的在上述各种制剂(制剂A-C)中的胰岛素和PKCα抑制剂(1μM假底物PKCα肽和0.1单位/ml胰岛素)治疗创伤。7天后，切下创伤，固定并在H&E染色后进行组织化学评估。应用H&E染色评估肉芽组织形成，并且根据所形成的肉芽组织相对于创伤床处的总创伤面积的百分数来打分。仅每天用在制剂A中的胰岛素和PKCα抑制剂治疗的创伤显示出与对照和制剂B及制剂C治疗组相比的肉芽组织形成的显著增加。

图5

制剂条件影响假底物PKCα肽抑制PKCα活性的能力。

用编码PKCα的重组腺病毒感染5天龄的、汇合的角质化细胞的培养物。在感染后24小时，用在如图5中所指示的制剂(制剂A和B)中的PKCα抑制剂(Myr-假底物PKCα肽，1μM)处理细胞15分钟。处理后，如上所述那样裂解细胞并进行PKCα活性分析。仅有在制剂A中提供的PKCα抑制剂能相对于对照显著地抑制过表达细胞中的PKCα活性。一式两份地进行试验。以相对于过表达PKCα的对照细胞的PKCα活性的减少的百分数形式显示结果。

图6

应用胰岛素的体外创伤闭合及细胞增殖效力依赖于制剂成分。

对5天龄的、汇合的角质化细胞的培养物进行体外划伤测试并检查创伤愈合。创伤形成后，将在上述各种制剂(制剂C和D)中的胰岛素(10^-6M，0.1单位/ml)加入到细胞培养物中。跟踪创伤闭合48小时。一式三份地进行这一试验。(A)显示了代表性的细胞培养皿的照片。(B)以处理48小时后闭合的百分数形式表示创伤闭合。(C)应用上述的胸苷掺入增殖测试法在培养的创伤细胞中进行增殖测试。当被提供在含有KCl的制剂D中时，胰岛素本身诱导了部分的创伤闭合及细胞增殖。正如图6A-C中所见，制剂C抑制了胰岛素诱导的创伤闭合及细胞增殖。

图7

在培养基B中预温育增强了胰岛素和胰岛素+PKCα抑制剂对细胞体外增殖的效力。

应用可商购的快速细胞增殖试剂盒(目录号QIA127；Calbiochem)，对从成年小鼠(7-10个约至2年)的尾制备的5天龄的、汇合的角质化细胞的培养物进行体外增殖测试。在MEM(培养基A)中5天后，如上所述那样将生长培养基更换为培养基B。

与培养基更换平行或在更换后24小时，用胰岛素或胰岛素+PKCα抑制剂处理细胞。一式六份地进行该试验。以占未处理细胞(对照)的百分数形式展示结果。如可从图7中所看到的那样，在培养基B中预温育细胞24小时增强了胰岛素和胰岛素+PKCα抑制剂对细胞增殖的效力。

图8

在制剂A而非在制剂C中制备的胰岛素+PKCα抑制剂诱导慢性、非愈合创伤的创伤愈合。

通过局部应用在制剂A(图8A，下图)或制剂C(图8A，上图)中应用的胰岛素+PKCα抑制剂来治疗患有慢性糖尿病相关的溃疡(例如糖尿病相关的足或手溃疡)患者，历时12周。在制剂A中应用的胰岛素+PKCα抑制剂显示出在12周完全的闭合，在用制剂C中的胰岛素+PKCα抑制剂治疗的患者的溃疡中没有观察到显著的愈合。每周跟踪患者创伤并应用

(Smith&Nephew)测量。对于两个患者每周一次的12次测量，显示了创伤宽度和创伤长度的随访图(图8A中的右图)。

通过每天局部应用在制剂A(图8B，右图)或制剂C(8B，左图)中应用的胰岛素+PKCα抑制剂来治疗患有糖尿病创伤的人类患者，历时60天。在制剂A中应用的胰岛素+PKCα抑制剂显示出到第60天止完全的愈合及创伤闭合。在用制剂C中的胰岛素+PKCα抑制剂治疗的创伤中没有观察到显著的愈合。图8B显示了在第0天和第60天时的创伤随访照片记录。

图9

在制剂A中制备的胰岛素+PKCα抑制剂诱导马的赘肉慢性创伤愈合。

一年龄的雌性夸特马患有冗长肉芽组织(赘肉)创伤，数月未治愈。用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂每天治疗该创伤，历时3个月。这一阶段后，该创伤完全闭合并治愈。6个月的随访观察到完全的组织再生。

图10

在制剂A中制备的胰岛素+PKCα治愈慢性日光性脓肿和骨髓炎。

两年龄的马具有蹄创伤，被诊断为伴有骨髓炎的慢性日光性脓肿，数月未愈合。通过将该组合物直接应用于该创伤30分钟来进行用在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂进行的每日治疗。如图10中所示，在治疗一个月内，该创伤大小显著减小，并且在两个月内该创伤完全闭合并治愈。

图11

在制剂A中制备的胰岛素+PKCα治愈由自创伤(肢端舔)引起的慢性创伤。

使用常规方法来治疗由于不停的舔(肢端舔)而在其爪子上患有创伤的狗，历时数月而未愈合。每日采用局部应用的在制剂A中的胰岛素+PKCα抑制剂对该创伤进行治疗。该创伤在2个月内完全闭合并治愈。在3.5个月内，观察到完全的毛皮再生。

图12

以商标

为人所知的赖脯胰岛素(rDNA起源)的示意图。显示了赖脯胰岛素的α链(SEQ ID NO：57)和β链(SEQ ID NO：58)各自的氨基酸序列。

图13

以商标

为人所知的人胰岛素类似物天冬胰岛素(rDNA起源)的一级结构的示意图。显示了天冬胰岛素的α链(SEQ IDNO：57)和β链(SEQ ID NO：59)各自的氨基酸序列。

图14

以商标

为人所知的人类胰岛素类似物甘精胰岛素(rDNA起源)的一级结构的示意图。显示了

的α链(SEQ IDNO：60)和β链(SEQ ID NO：61)各自的氨基酸序列。

图15

以商标优泌林

R和R为人所知的常规重组人胰岛素的一级结构的示意图。显示了优泌林R的α链(SEQ ID NO：57)和β链(SEQ ID NO：62)各自的氨基酸序列。

图16

在制剂A中提供的各种胰岛素类似物以类似方式影响创伤愈合。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接置于伤口上的在制剂A(上述)中的0.1单位/ml图6中所指示的各种胰岛素类似物治疗创伤。所研究的胰岛素类似物是赖脯胰岛素(“HumL”)、天冬胰岛素(“Novo”)、甘精胰岛素

和重组人胰岛素(“HumR”)。7天后，切下创伤，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

通过测量表皮基底层形成和肉芽组织形成来评估创伤愈合的百分数。通过应用角蛋白14染色以检测表皮基底层形成，从而评估表皮闭合。展示出完全的表皮重建的创伤被认为是愈合的。应用H&E染色评估肉芽组织形成，并根据所形成的肉芽组织相对于创伤床处的总创伤面积的百分数进行打分。展示出＞70％肉芽组织形成的创伤被认为是愈合的。

通过商标名的缩写来鉴别胰岛素类似物：“HumL”是赖脯胰岛素、“Novo”是天冬胰岛素、

是甘精胰岛素，以及“HumR”是优泌林R。

图17

与PKCα抑制肽组合的USP胰岛素以与优泌林

R+PKCα抑制肽类似的方式促进创伤愈合。

在麻醉的C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)的上背上进行全厚(20mm长)皮肤切口。切开后，每天用直接置于创伤上的在制剂A(上述)中的PKCα假底物抑制肽(1μg/ml)或0.1单位/ml的优泌林

R、或USP胰岛素治疗创伤。7天后，切下创伤，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

应用H&E染色评估肉芽组织形成，并根据所形成的肉芽组织相对于创伤床处的总创伤面积的百分数进行打分。展示出＞70％肉芽组织形成的创伤被认为是愈合的。

分别通过缩写“HumR”和“Ins USP”来鉴别常规的重组人胰岛素和USP胰岛素。PKCα假底物抑制肽被称为“pep”。

图18

与PKCα抑制肽组合的胰岛素类似物协同地促进严重发炎皮肤中炎症反应的减少。

测量在C57BL/6J小鼠(每组6只小鼠)上的皮肤创伤部位的严重炎症水平。如上所述那样，通过切开制备创伤。如图19中所示那样，每天用在制剂A(上述)中的PKCα假底物抑制肽(1μg/ml)、0.1单位/ml的优泌林

R或赖脯胰岛素进行治疗。应用标准方法制备乳液，并通过从纱布绷带(其作为药物流出支架起作用)递送而置于皮肤上。7天后，切下皮肤组织，固定并在H&E染色后进行组织学评估。

应用以下参数评估严重的炎症：

(1)脓肿形成；

(2)过度的白细胞增多(在200倍的固定视野中＞100个细胞)；

当上述3个参数中的至少2个存在于创伤缺口处时，则认为炎症负担是严重的。

通过合并根据对每一标本观察到的上述参数的每一个所记录的数据来确定严重炎症的总百分数。

分别通过缩写“HumR”和“HumL”来鉴别优泌林

R和赖脯胰岛素。PKCα假底物抑制肽被称为“pep”。

图19

在培养基A和培养基B中用内脏脂肪素和L-α处理的老角质化细胞中角蛋白1的表达。

在培养基A(MEM)中3维持从成年小鼠(7-10月至2年)的尾制备的原代皮肤角质化细胞。在培养基A中5天后，将一半培养板中的生长培养基更换为培养基B(如上述)。随后将内脏脂肪素或L-α加入到在培养基A和培养基B中培养的细胞中。

然后通过将培养基中钙的水平从0.05mM升高至0.12mM来诱导细胞分化。在诱导分化二十四(24)小时后，收集细胞并进行蛋白质印记分析。使用商业上可获得的角蛋白1特异性抗体来评估细胞裂解物中角蛋白1的表达。使用标准蛋白质印记和密度测量技术评估角蛋白1的表达。

本文中引用的所有参考文献(例如，杂志文章、专利文件以及登录号)均通过引用此全文并入本文。

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Claims

1.组合物，其包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

2.如权利要求1的组合物，其中所述的δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

3.如权利要求2的组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

4.如权利要求2的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

5.如权利要求4的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

6.如权利要求2的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰基星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。

7.如权利要求2的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂选自由具有在以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

8.如权利要求2的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQ IDNO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化。

9.如权利要求2的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

10.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的组合物，其中所述的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。

11.组合物，其包含胰岛素、由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成的并且在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基的肽以及包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的水性药学上可接受的载体。

12.如权利要求11的组合物，其包含0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素和1μM至100μM的所述肽。

13.如权利要求12的组合物，其包含0.0001单位/L的胰岛素和1μM的所述肽。

14.如组合物，其包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂、不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体以及药物流出支架。

15.如权利要求14的组合物，其中所述的药物流出支架包含多孔固体。

16.如权利要求15的组合物，其中所述的δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

17.如权利要求16的组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

18.如权利要求16的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

19.如权利要求18的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

20.如权利要求16的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰基星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。

21.如权利要求16的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂选自由具有在以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

22.如权利要求16的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化.

23.如权利要求16的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

24.如权利要求23的组合物，其包含0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素和1μM至100μM的所述肽。

25.如权利要求23的组合物，其包含0.0001单位/L的胰岛素和1μM的所述肽。

26.如权利要求14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25的组合物，其中所述的药物流出支架是海绵。

27.如权利要求26的组合物，其包含不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体，该药学上可接受的载体包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄。

28.如由包括以下步骤的方法制得的药物组合物：

a)提供δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；以及

b)混合所述δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂以及不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体；

由此制得药物组合物。

29.如权利要求28的组合物，其中所述的δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

30.如权利要求29的药物组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

31.如权利要求29的药物组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

32.如权利要求31的药物组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

33.如权利要求29的药物组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰基星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。

34.如权利要求29的药物组合物，其中所述的α-PKC抑制剂选自由具有在以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

35.如权利要求29的药物组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化.

36.如权利要求29的药物组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

37.如权利要求36的药物组合物，其包含0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素和1μM至100μM的所述肽。

38.如权利要求36的药物组合物，其包含0.0001单位/L的胰岛素和1μM的所述肽。

39.如权利要求28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的药物组合物，其中所述的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。

40.组合物，其包含胰岛素或胰岛素类似物和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

41.如权利要求40的组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

42.如权利要求40的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

43.如权利要求42的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

44.如权利要求40的组合物，其包含0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素或胰岛素类似物。

45.如权利要求40的组合物，其包含0.0001单位/L的胰岛素或胰岛素类似物。

46.如权利要求40-45中任一项的组合物，其中所述的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。

47.组合物，其包含0.0001单位/L至0.1单位/L的胰岛素和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

48.如权利要求47的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

49.如权利要求48的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

50.如权利要求47、48或49的组合物，其中所述的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。

51.组合物，其包含δ-PKC活化剂、α-PKC抑制剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

52.如权利要求51的组合物，其中所述的δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

53.如权利要求52的组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

54.如权利要求52的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

55.如权利要求54的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

56.如权利要求52的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰基星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。

57.如权利要求52的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂选自由具有以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

58.如权利要求52的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化.

59.如权利要求52的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

60.组合物，其包含δ-PKC活化剂和含有K⁺阳离子而不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

61.如权利要求60的组合物，其中所述的δ-PKC活化剂是选自由胰岛素和胰岛素类似物组成的组中的至少一种。

62.如权利要求61的组合物，其中所述的胰岛素类似物是选自由赖脯胰岛素、天冬胰岛素、甘精胰岛素、内脏脂肪素和L-α-磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，二棕榈酰基-，七铵盐组成的组中的至少一种。

63.如权利要求61的组合物，其中所述的胰岛素是选自由人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素组成的组中的至少一种。

64.如权利要求63的组合物，其中所述的胰岛素是重组表达的。

65.组合物，其包含α-PKC抑制剂和不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体。

66.如权利要求65的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是选自由(S)-2，6-二氨基-N-[(1-(1-氧代十三烷基)-2-哌啶基)甲基]己酰胺二盐酸盐水合物；4’-N-苯甲酰星形孢菌素；双吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸盐；12-(2-氰基乙基)-6，7，12，13-四氢-13-甲基-5-氧代-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺和阿普卡生组成的组中的至少一种。

67.如权利要求65的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂选自由具有在以下中所示的氨基酸序列的肽组成的组中的至少一种：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。

68.如权利要求65的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：25中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基，并且在其羧基末端处被酰胺化.

69.如权利要求65的组合物，其中所述的α-PKC抑制剂是由SEQID NO：1中所示的氨基酸序列组成的肽，其在其氨基末端处具有豆蔻酰化的氨基酸残基。

70.如权利要求69的组合物，其中所述的药物组合物包含1μM至100μM的所述肽。

71.如权利要求70的组合物，其中所述的药物组合物包含1μM的所述肽。

72.如权利要求65-7l中任一项的组合物，其中所述的不含Ca²⁺和Mg²⁺阳离子的药学上可接受的载体是包含0.2g/L KCl、0.2g/L无水KH₂PO₄、8g/L NaCl和1.15g/L无水Na₂HPO₄的水性载体。