CN102692506A - Cd133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤的分子生物学和肿瘤药物治疗领域。本发明提供了CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的用途，以及以CD133为靶标筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物的应用。本发明利用质粒转染、鼠胶质瘤模型建立、活体成像、免疫组化和Transwell技术验证CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，并且CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生体内和体外的侵袭。进一步研究表明，CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭。CD133可以为肿瘤治疗方案的选择和抗肿瘤药物的筛选提供新的思路。

Description

CD133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域。具体地说，本发明涉及一种肿瘤干细胞表面标志CD133在胶质瘤侵袭中的作用，以及CD133与下游通路在肿瘤的药物筛选和治疗中潜在的应用。

背景技术

脑星形胶质瘤是一种致命和常见的颅内肿瘤。在常规手术治疗，放化疗的前提下，病人的平均存活时间在15个月左右。造成胶质瘤难以治愈的原因是胶质瘤细胞易侵袭和播散到周围正常的脑组织中，导致手术切除不完全进而引起肿瘤的复发。然而，目前对胶质瘤侵袭的机制和特性的认识仍然不足，因此，探究胶质瘤侵袭的分子机制是治疗胶质瘤的关键。

现有的研究中表明，CD133是5次跨膜糖蛋白，位于细胞表面。CD133在脑肿瘤干细胞以及白血病干细胞、大肠癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞等多种实体肿瘤干细胞中均有表达，可以作为相关肿瘤干细胞的广谱标志物。在肿瘤的研究中已发现，CD133阳性的肿瘤细胞比CD133阴性的细胞有更强的自我更新和增殖能力，但是目前还没有发现其在胶质瘤侵袭中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供CD133的新用途。本发明提供了CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的用途，以及以CD133为靶标筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物的应用，为肿瘤的鉴定和治疗提供了参考依据。

本发明提供了CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的应用，尤其是针对胶质瘤细胞。

具体检测时，可以先取待测样本，然后分析比较待测样本与正常对照中CD133的表达量。CD133表达量高于正常对照的，肿瘤细胞易发生侵袭。

所述的待测样本可以是细胞样本，组织样本，或者细胞、组织的蛋白抽提物。正常对照可以是正常人的样本，较好的是取自患者本人癌旁或者肿瘤组织周边的组织或者细胞样本。

检测时，通常采用相关抗体等检测样本中CD133含量。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。p＜0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS V13.0软件或者具备类似统计功能的软件分析。实际检测时待测样本比正常对照中CD133的表达量高30%及以上为阳性结果，表明肿瘤细胞趋向侵袭或者迁移。

本发明的CD133是位于细胞表面的跨膜蛋白，其序列及相关信息可以参考genbank数据库。例如使用NP_006008的序列报告。

本发明运用转染了荧光素酶质粒的GL261鼠胶质瘤细胞建立小鼠胶质瘤模型，目的在于对胶质瘤的分布进行定位，并对脑组织切片进行CD133的免疫组化分析，目的在于探究肿瘤中CD133的表达情况与分布。结果表明，CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，明显高于周围正常组织和肿瘤的内部，对人脑胶质瘤组织切片的免疫组化分析也有相同结果。与此同时，本发明通过对GL261鼠胶质瘤细胞转染CD133-Flag质粒，建立了高表达CD133的小鼠胶质瘤模型和体外transwell侵袭能力测验模型，并与转染空质粒Flag组和对照组进行比较，目的是明确CD133在胶质瘤生长中的作用，由此发现CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生侵袭，在另建立的U87-GFP和U87-CD133-GFP的裸鼠模型中也观察到了相同的现象。因此本发明明确了CD133使胶质瘤细胞易发生侵袭的新作用。

本发明运用流式细胞术检测细胞周期、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验和细胞骨架蛋白F-actin染色对转染CD133-Flag质粒、转染Flag空质粒和对照三组细胞进行研究，目的是探究CD133高表达引起胶质瘤侵袭能力增强的原因，结果发现细胞周期、与基质降解有关的MMP酶谱和细胞黏附均无明显差异，而细胞划痕试验与免疫荧光证实了CD133高表达胶质瘤体外的迁移能力也有增强，细胞骨架蛋白F-actin有呈束状排列的现象，明确了CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭，为相关的基础和临床研究提供了新的思路。

本发明还提供了CD133在制备抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用， CD133可以作为筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的药靶。降低CD133表达量的物质是抑制肿瘤细胞侵袭药物的候选药物。所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物可以是消减肿瘤细胞迁移能力的药物，也可以是抑制肿瘤细胞细胞骨架生长的药物。

相应的，本发明提供了一种筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的试剂盒，该试剂盒含有CD133。较好的，该试剂盒针对胶质瘤细胞。

通常，试剂盒中含有标准剂量的CD133蛋白对照品，操作手册，稀释液或者缓冲液等。

本发明运用了Westernblot技术对CD133表达发生改变时PI3K/AKT, FAK以及ERK信号通路进行研究。结果发现CD133高表达细胞中pPDK1、pAkt的水平明显上调，而pFAK和pERK的水平几乎不变，说明了CD133可以激活PI3K/PDK/Akt通路。运用抑制剂Wortmannin可以在体外抑制CD133介导的胶质瘤细胞侵袭，这证明抑制CD133及其下游效应物可以抑制胶质瘤细胞侵袭。这从另一个角度说明，本发明的CD133可以作为筛选抑制胶质瘤细胞的药物的药靶。

本发明涉及肿瘤干细胞表面标志CD133在胶质瘤侵袭中的作用及相关机制。本发明的实验表明，CD133在胶质瘤周围侵袭灶中表达增高，并且CD133过表达的胶质瘤细胞更易发生侵袭；同时本发明发现CD133通过与下游PI3K/Akt相互作用调节细胞骨架蛋白F-actin和细胞的迁移能力，进而使胶质瘤细胞更易发生侵袭。尽管本发明的实施例以胶质瘤细胞为模型，但是，本发明也可以应用于其他一些肿瘤。因此CD133的特性及其与下游通路作用的分子机制可以为肿瘤的基础研究和抗肿瘤药物的研发提供新的思路。

本发明确定了CD133的表达与胶质瘤细胞的侵袭性相关，并且证实CD133通过与下游PI3K/Akt信号通路的作用参与了胶质瘤侵袭的过程，利用PI3K的抑制剂Wortmannin能够抑制胶质瘤的侵袭。本发明的主要实验结果验证了：

（1）CD133在胶质瘤周围侵袭灶中表达增高，CD133高表达的胶质瘤细胞在体内和体外更易发生侵袭；

（2）CD133高表达引起胶质瘤侵袭增强的原因与细胞周期、细胞外基质降解和细胞粘附能力增强无明显关系，而与细胞的迁移能力增强和骨架蛋白F-actin结构改变有关；

（3）CD133下游PI3K/Akt通路相互作用引起胶质瘤迁移能力增强和F-actin结构改变进而使胶质瘤的侵袭能力增强。

本发明应用质粒转染、鼠胶质瘤模型建立、活体成像、免疫组化，Transwell技术验证CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，并且CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生体内和体外的侵袭。应用流式细胞术细胞周期检测、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验和细胞骨架染色技术发现CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭。应用Westernblot技术和PI3K抑制剂发现CD133与下游PI3K/Akt通路相互作用，抑制该通路可以抑制CD133介导的胶质瘤细胞侵袭。因此CD133不仅是胶质瘤干细胞的表面标志，还可以作为胶质瘤侵袭能力的标志，CD133及其与下游的PI3K/Akt通路作用的新机制不仅可以为胶质瘤的基础研究提供新的思路，还可以为临床抗肿瘤药物的研究和筛选提供参考。

附图说明

图1显示具有代表性的人恶性胶质瘤标本CD133免疫组化染色区域主要位于胶质瘤的侵袭区域。

图2显示CD133可以促进胶质瘤的体内侵袭。

A, 显示GL261, GL261-Flag和GL261-CD133-Flag细胞形成的小鼠胶质瘤的HE染色。

B, 显示具有代表性的GL261-CD133-Flag脑内成瘤后的Flag免疫组化染色。

图3-图5显示CD133可以促进胶质瘤细胞的体外侵袭和迁移。

图3, 光镜下GL261-Mock, GL261-Flag和GL261-CD133-Flag细胞的Transwell侵袭实验分析。

图4, GL261-Mock, GL261-Flag和GL261-CD133-Flag细胞的划痕迁移实验分析。

图5, GL261-Mock, GL261-Flag和GL261-CD133-Flag细胞F-actin染色分析。

图6-图10显示CD133通过激活PI3K/Akt通路促进胶质瘤的侵袭。

图6, 利用Western blot分析GL261-Mock, GL261-Flag和GL261-CD133-Flag细胞Akt, PDK, ERK和FAK的磷酸化情况。

图7, PI3K抑制剂Wortmannin抑制CD133诱导的Akt活化。

图8, B中细胞的划痕实验分析。

图9, B中细胞Transwell侵袭实验的定量分析。

图10, B中细胞F-actin染色分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。p＜0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS V13.0软件分析。

一、细胞培养和转染

本实验利用人胶质瘤细胞U87-MG和小鼠胶质瘤细胞GL261。所有细胞均采用含10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素及50 μg/ml链霉素的DMEM培养液，在5%CO2-95%空气，饱和湿度以及37℃的条件下培养。

基因转染参照LipofectAMINE转染试剂盒操作手册。将处于对数生长期的细胞以l×10⁵细胞/孔接种于六孔细胞培养板中，培养16-24 h，细胞密度约60-80%时,置转染试剂（A试剂：1μg质粒+100μl无血清无双抗的1640/DMEM培养基；B试剂：5μl Lipofectamine+100μl无血清无双抗的1640/DMEM培养基）。将A试剂和B试剂小心混匀，室温静置30-45 min，以形成DNA-脂质体复合物。弃去培养孔中培液，用2 ml无血清无双抗的RPMI1640/DMEM培养基洗涤细胞两次。在DNA-脂质体复合物中加入800μl无血清无双抗的 RPMI1640/DMEM培养基，小心混匀，共1.0 ml加入一个培养孔中。37℃，5%CO₂培养5 h，再加入1.0 ml含20%血清的培养基，37℃，5%CO₂培养24 h，更换新鲜完全培养液继续培养。用脂质体法将LV-GFP、LV-Luc、LV-Flag、LV-CD133-Flag（CD133-Flag序列见SEQ ID NO 1）及GST-CD133-CD表达质粒转染相应细胞，筛选后得到稳定转染株。

二、试剂

活性Src蛋白购于Millipore有限公司。抗-CD133抗体(k-18)、抗-GAPDH 抗体购于Santa Cruz生物技术有限公司。抗-p-ERK、抗-p-PDK1 (Ser241)抗体、抗-Akt抗体、抗-p-Akt (Ser473) 抗体、抗-p-Akt (Thr308)抗体、抗-p-FAK (Tyr925) 抗体、抗-鼠-HRP二抗、抗-羊-HRP二抗和抗-兔-HRP二抗均购于Cell Signaling有限公司。抗-Flag抗体和PI3K抑制剂Wortmannin购于Sigma有限公司。

 三、小鼠/裸鼠胶质瘤模型建立

稳转相应质粒72小时后，10⁵个GL261或U87-MG细胞注射入四周龄雄性C57BL/6小鼠或四周龄雄性裸鼠的右侧尾状核。进针部位为右侧脑，Breggma点后移0.5mm，然后侧移2.2mm左右，向下3mm左右。4～6周后以小动物活体成像系统检测颅内肿瘤生长情况。麻醉并以4%多聚甲醛灌流小鼠，取脑，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。

四、组织病理及免疫组化

胶质瘤标本固定于4%多聚甲醛，石蜡包被，切片，HE染色后光镜下观察组织病理形态。脱蜡后以抗-CD133和抗-Flag抗体进行免疫组化检测。照片以Motic Image Advanced 3.2图片分析系统获取。

五、Transwell细胞侵袭试验

在24孔Transwell室聚碳酸酯膜(膜孔径8 mm)上涂1mg/ml的matrigel 40 μl，37℃孵育5 h，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。之后吸出上室残余液体，加70μl不含血清的DMEM水化基底膜，37℃孵育30 min。取对数生长期的A2780/s、A2780/cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA细胞，以不加血清的DMEM培养液调整细胞数为l×10⁵个/ml。取200 μl细胞悬液接种Transwell上室内，下室加入10％FBS的DMEM培养液600 μl，37℃ 5%CO₂培养箱中培养24 h。24 h后弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，d₂H₂O₂洗3遍，将滤膜上层细胞用棉签轻轻抹去，400倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿膜细胞数，求平均值。

六、划痕试验

取生长至80%融合的细胞，细胞重悬于无血清培养液中24小时。胰蛋白酶消化后以l×10⁶个细胞/孔接种于6孔细胞培养板，培养24 h细胞基本融合。用无菌l ml枪头垂直在培养板底划平行、垂直的4条“划痕”，用培液冲洗若干次以洗去被划下的细胞。于指定时间点在倒置相差显微镜下计数距离划痕0.2 mm内的细胞数，每组设双复孔，3次独立实验。

七、细胞黏附试验

细胞重悬于无血清培养液中24小时。24孔板包被基质胶（Matrigel），每孔加入含2.5*10⁵个细胞的0.5 ml细胞悬液，37度孵育1h。PBS洗4次（洗去未贴壁细胞）。0.5%结晶紫（20%甲醇溶液）染色10min。ddH₂O洗涤10min。每孔加入10%醋酸0.25ml，裂解液于590nm处比色。

八、明胶酶谱试验

制备10%凝胶。制备分离胶时，加入10mg/ml gelatin水溶液，65℃水浴，使得gelatin终浓度为1mg/ml。蛋白样品制备：1）上清：细胞无血清培养24h。冰上收集上清，3000rpm×10min离心去除细胞和残骸，浓缩20倍，后于-4℃保存。2） 细胞裂解液：裂解细胞（裂解液：含1% Triton X-100的1×TBS溶液，30l/60mm dish），cocktail 1:200，置于冰上摇30 min，后于-70℃保存。溶解后12000rpm×10min离心，定量吸取上清。加入等体积Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2×)稀释，室温放置10 min，加溴酚蓝0.5l。电泳至溴酚蓝跑出胶。1×Developing Buffer100ml，室温慢摇平衡凝胶30min，37℃平衡过夜。0.5%考马斯亮蓝R-250（甲醇:冰醋酸:水=30:10:60）染色30min，脱色液（甲醇:冰醋酸:水=50:10:40）中脱色，拍照。

九、免疫印迹

取对数生长期细胞，移去培养基，用0.25%胰酶消化，0.01M PBS吹打细胞，收集至10ml EP管，离心，PBS洗涤细胞两次。根据细胞量加入适量SDS蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂cocktail。SDS-PAGE电泳后，湿转蛋白至PVDF膜，5%BSA（TBS/0.1% Tween 20溶解）封闭2小时，之后与一抗在室温下孵育2小时或在4℃孵育过夜，用TBS/0.1% Tween 20洗三遍，每次10min。再室温孵育二抗2小时, TBS/0.1% Tween 20洗三遍，每次10min。用ECL化学发光检测试剂盒检测。

 实施例1

用萤光素酶标记的GL261小鼠胶质瘤细胞构建GL261的C57鼠原位模型，小动物活体成像动态检测肿瘤生长。利用小鼠胶质瘤模型和人恶性胶质瘤标本，通过免疫组化检测CD133（CD133-Flag序列见SEQ ID NO 1, 其荧光素酶序列见SEQ ID NO 2）在胶质瘤内部、胶质瘤和正常组织交界以及正常组织中的表达特点和差异。结果显示胶质瘤向正常脑组织区域明显侵袭。脑片的CD133免疫组化染色显示，肿瘤侵袭区域CD133 高表达，而肿瘤内部以及正常脑组织CD133表达较少。同样的结果也在人的胶质瘤标本中得到了验证。对18例有肿瘤和正常组织交界的胶质瘤标本进行的CD133免疫组化染色提示，交界区的CD133表达量远高于肿瘤内部和正常脑组织。

因此，CD133还可以作为胶质瘤细胞侵袭的标志。

 

实施例2

构建了表达CD133的质粒，在上述两种胶质瘤细胞中过表达CD133。利用GL261的C57鼠模型以及U87的裸鼠模型，观察CD133过表达后肿瘤形成的边界、子体瘤数目、胼胝体侵袭和脑室播散情况。结果显示，Mock和Flag组形成的肿瘤边缘光滑，而CD133组的肿瘤呈现高侵袭性，表现为向正常脑组织侵袭明显，以及大量的脑脊液播散和种植。这些播散灶均为CD133+，提示它们均来源于外源的CD133细胞。U87-GFP和U87-CD133-GFP的裸鼠模型中观察到了与上述相同的现象，即CD133组肿瘤的侵袭性明显强于Flag组，表现为CD133组形成大量的子体瘤，数量约是Flag组子体瘤的5倍。

这说明，CD133能够用于促进肿瘤的侵袭性。CD133不仅是胶质瘤干细胞的表面标志，还可以作为胶质瘤侵袭能力的标志。

 

实施例3

利用过表达CD133的GL261和U87胶质瘤细胞，通过Transwell模型、流式细胞术检测细胞周期、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验以及细胞骨架蛋白F-actin染色进一步分析CD133在胶质瘤侵袭过程中的作用。

Transwell侵袭实验结果显示CD133组侵袭细胞数明显多于Mock组和Flag组，提示CD133在体外可以明显促进GL261胶质瘤细胞的侵袭。三组细胞的细胞周期分布没有统计学差异，这就排除了细胞周期对Transwell侵袭实验结果的影响。MMP酶谱实验结果提示三组细胞MMP-2和MMP-9的活性没有差异，说明CD133对胶质瘤细胞降解基质能力没有明显影响。细胞黏附实验结果说明了CD133对胶质瘤细胞黏附能力同样没有明显影响。最后，在划痕实验中观察到CD133组细胞的迁移能力明显高于其余两组。对F-actin的染色结果证实了这一现象。Flag细胞的actin弥散分布在胞浆中，而CD133细胞的actin聚集成束，形成突起，多分布于细胞边缘。说明CD133能够调节actin细胞骨架的组织。

上述实验进一步证实了CD133能够促进胶质瘤细胞的侵袭。而且，CD133通过增强细胞迁移能力和调节actin细胞骨架促进肿瘤细胞的侵袭。

 

实施例4

通过Western blot检测CD133表达改变对胶质瘤侵袭调节通路，包括PI3K/AKT, FAK以及ERK信号通路的作用。利用PI3K的抑制剂Wortmannin检测PI3K/AKT信号通路在CD133调控胶质瘤细胞侵袭中的生物学功能，其中检测方法包括Transwell模型、体外划痕试验以及细胞骨架蛋白F-actin染色。

结果表明，较之Mock组和Flag组，CD133组细胞中pPDK1、pAkt的水平明显上调，而pFAK和pERK的水平几乎不变，说明了CD133可以激活PI3K/PDK/Akt通路。Western blot结果显示Wortmannin可以明显抑制Akt的磷酸化。划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示Wortmannin可以明显抑制胶质瘤细胞的迁移能力。对F-actin的染色证实了Wortmannin可以显著抑制actin细胞骨架的组织。

因此， CD133及其与下游的PI3K/Akt通路，不仅可以为胶质瘤的基础研究提供新的思路，还可以为临床抗肿瘤药物的研究和筛选提供参考。例如，Wortmannin可以明显抑制Akt的磷酸化，就能够明显抑制胶质瘤细胞的侵袭。CD133及Akt可以用于筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物，尤其是抑制胶质瘤细胞细胞侵袭的药物。

  SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  复旦大学

<120>  CD133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒

<130>  1032

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  9292

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  1

 

agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag     60

 

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tatgctgtgt cctggggctg ctgtttatta ttctgatgcc tctggtgggg tatttctttt   2880

 

gtatgtgtcg ttgctgtaac aaatgtggtg gagaaatgca ccagcgacag aaggaaaatg   2940

 

ggcccttcct gaggaaatgc tttgcaatct ccctgttggt gatttgtata ataataagca   3000

 

ttggcatctt ctatggtttt gtggcaaatc accaggtaag aacccggatc aaaaggagtc   3060

 

ggaaactggc agatagcaat ttcaaggact tgcgaactct cttgaatgaa actccagagc   3120

 

aaatcaaata tatattggcc cagtacaaca ctaccaagga caaggcgttc acagatctga   3180

 

acagtatcaa ttcagtgcta ggaggcggaa ttcttgaccg actgagaccc aacatcatcc   3240

 

ctgttcttga tgagattaag tccatggcaa cagcgatcaa ggagaccaaa gaggcgttgg   3300

 

agaacatgaa cagcaccttg aagagcttgc accaacaaag tacacagctt agcagcagtc   3360

 

tgaccagcgt gaaaactagc ctgcggtcat ctctcaatga ccctctgtgc ttggtgcatc   3420

 

catcaagtga aacctgcaac agcatcagat tgtctctaag ccagctgaat agcaaccctg   3480

 

aactgaggca gcttccaccc gtggatgcag aacttgacaa cgttaataac gttcttagga   3540

 

cagatttgga tggcctggtc caacagggct atcaatccct taatgatata cctgacagag   3600

 

tacaacgcca aaccacgact gtcgtagcag gtatcaaaag ggtcttgaat tccattggtt   3660

 

cagatatcga caatgtaact cagcgtcttc ctattcagga tatactctca gcattctctg   3720

 

tttatgttaa taacactgaa agttacatcc acagaaattt acctacattg gaagagtatg   3780

 

attcatactg gtggctgggt ggcctggtca tctgctctct gctgaccctc atcgtgattt   3840

 

tttactacct gggcttactg tgtggcgtgt gcggctatga caggcatgcc accccgacca   3900

 

cccgaggctg tgtctccaac accggaggcg tcttcctcat ggttggagtt ggattaagtt   3960

 

tcctcttttg ctggatattg atgatcattg tggttcttac ctttgtcttt ggtgcaaatg   4020

 

tggaaaaact gatctgtgaa ccttacacga gcaaggaatt attccgggtt ttggatacac   4080

 

cctacttact aaatgaagac tgggaatact atctctctgg gaagctattt aataaatcaa   4140

 

aaatgaagct cacttttgaa caagtttaca gtgactgcaa aaaaaataga ggcacttacg   4200

 

gcactcttca cctgcagaac agcttcaata tcagtgaaca tctcaacatt aatgagcata   4260

 

ctggaagcat aagcagtgaa ttggaaagtc tgaaggtaaa tcttaatatc tttctgttgg   4320

 

gtgcagcagg aagaaaaaac cttcaggatt ttgctgcttg tggaatagac agaatgaatt   4380

 

atgacagcta cttggctcag actggtaaat cccccgcagg agtgaatctt ttatcatttg   4440

 

catatgatct agaagcaaaa gcaaacagtt tgcccccagg aaatttgagg aactccctga   4500

 

aaagagatgc acaaactatt aaaacaattc accagcaacg agtccttcct atagaacaat   4560

 

cactgagcac tctataccaa agcgtcaaga tacttcaacg cacagggaat ggattgttgg   4620

 

agagagtaac taggattcta gcttctctgg attttgctca gaacttcatc acaaacaata   4680

 

cttcctctgt tattattgag gaaactaaga agtatgggag aacaataata ggatattttg   4740

 

aacattatct gcagtggatc gagttctcta tcagtgagaa agtggcatcg tgcaaacctg   4800

 

tggccaccgc tctagatact gctgttgatg tctttctgtg tagctacatt atcgacccct   4860

 

tgaatttgtt ttggtttggc ataggaaaag ctactgtatt tttacttccg gctctaattt   4920

 

ttgcggtaaa actggctaag tactatcgtc gaatggattc ggaggacgtg tacgatgatg   4980

 

ttgaaactat acccatgaaa aatatggaaa atggtaataa tggttatcat aaagatcatg   5040

 

tatatggtat tcacaatcct gttatgacaa gcccatcaca acatatggac tacaaagacg   5100

 

atgacgacaa gtgataaacc ggtcgccacc agcggccgcg tcgacaatca acctctggat   5160

 

tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt   5220

 

ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc   5280

 

tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg   5340

 

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ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag   5700

 

acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctcg gtacctttaa   5760

 

gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac   5820

 

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc   5880

 

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta   5940

 

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact   6000

 

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta   6060

 

gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg   6120

 

agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt   6180

 

tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg   6240

 

tatcttatca tgtctggctc tagctatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc   6300

 

tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc   6360

 

tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcgtcgagac   6420

 

gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa   6480

 

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct   6540

 

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc   6600

 

agcctgaatg gcgaatggcg cgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg   6660

 

gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct   6720

 

ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg   6780

 

ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag   6840

 

ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg   6900

 

gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc   6960

 

tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat   7020

 

gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcc   7080

 

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac   7140

 

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa   7200

 

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat   7260

 

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc   7320

 

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga   7380

 

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg   7440

 

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc   7500

 

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag   7560

 

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc   7620

 

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg   7680

 

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg   7740

 

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac   7800

 

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac   7860

 

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg   7920

 

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg   7980

 

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg   8040

 

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac   8100

 

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg   8160

 

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg   8220

 

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc   8280

 

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc   8340

 

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt   8400

 

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc   8460

 

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact   8520

 

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac   8580

 

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag   8640

 

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg   8700

 

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg   8760

 

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga   8820

 

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt   8880

 

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct   8940

 

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg   9000

 

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt   9060

 

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta   9120

 

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta   9180

 

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt   9240

 

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg ca           9292

 

 

<210>  2<211>  8304<212>  DNA<213>  Artificial<400>  2

agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag     60

 

caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg    120

 

tacgatcgtg ccttattagg aaggcaacag acgggtctga catggattgg acgaaccact    180

 

gaattgccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacaa taaacgggtc    240

 

tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct    300

 

taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga    360

 

ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg    420

 

cgcccgaaca gggacctgaa agcgaaaggg aaaccagagc tctctcgacg caggactcgg    480

 

cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt    540

 

ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg    600

 

agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa    660

 

ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg    720

 

ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca    780

 

ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa    840

 

aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa    900

 

agtaagacca ccgcacagca agcggccgct gatcttcaga cctggaggag gagatatgag    960

 

ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt   1020

 

agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg   1080

 

agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cctcaatgac   1140

 

gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct   1200

 

gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct   1260

 

ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg   1320

 

gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa   1380

 

taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa   1440

 

caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa   1500

 

tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac   1560

 

aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag   1620

 

aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc   1680

 

gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga   1740

 

aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg   1800

 

gttaactttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga   1860

 

cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa   1920

 

ttttatcgat cacgagacta gcctcgagaa gcttgatatc gaattcccac ggggttgggg   1980

 

ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc tgggcgtggt   2040

 

tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc cgttcgcagc   2100

 

gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc tgctccgccc   2160

 

ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac ggaagccgca   2220

 

cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc gcgccgaccg   2280

 

cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcggggcgcg ccgagagcag cggccgggaa   2340

 

ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct gcccgcgcgg   2400

 

tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct cgttgaccga   2460

 

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cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga   2580

 

agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca   2640

 

tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg   2700

 

ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc   2760

 

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aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa   2880

 

aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta   2940

 

tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc   3000

 

atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga   3060

 

caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc   3120

 

ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa   3180

 

tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta   3240

 

ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag   3300

 

agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc   3360

 

tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg   3420

 

aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt   3480

 

tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga   3540

 

ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag   3600

 

cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt   3660

 

gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct   3720

 

tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac   3780

 

acttcttcat cgttgaccgc ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc   3840

 

ccgctgaatt ggaatccatc ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag   3900

 

gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa   3960

 

agacgatgac ggaaaaagag atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa   4020

 

agttgcgcgg aggagttgtg tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg   4080

 

acgcaagaaa aatcagagag atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt   4140

 

aaagcggccg cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta   4200

 

ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc   4260

 

atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt   4320

 

ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg   4380

 

ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt   4440

 

tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct   4500

 

ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt   4560

 

cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct   4620

 

acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc   4680

 

ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct   4740

 

ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga   4800

 

tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag   4860

 

acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga   4920

 

gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct   4980

 

tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt   5040

 

ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt   5100

 

ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa   5160

 

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca   5220

 

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc   5280

 

ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt   5340

 

atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc   5400

 

ttttttggag gcctaggctt ttgcgtcgag acgtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt   5460

 

attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta   5520

 

cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg   5580

 

cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcgacgcgc   5640

 

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac   5700

 

ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg   5760

 

ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt   5820

 

tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc   5880

 

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct   5940

 

tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga   6000

 

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aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat   6840

 

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ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc   6960

 

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc   7020

 

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg   7080

 

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta   7140

 

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg   7200

 

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga   7260

 

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ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag   7380

 

agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa   7440

 

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag   7500

 

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca   7560

 

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cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa   7680

 

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc   7740

 

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg   7800

 

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc   7860

 

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc   7920

 

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag   7980

 

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa   8040

 

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga   8100

 

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc   8160

 

ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca   8220

 

atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta   8280

 

aagggaacaa aagctggagc tgca                                          8304

Claims (9)

1.CD133在制备肿瘤标志物中的用途，其中，所述的CD133为肿瘤细胞侵袭的标志。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胶质瘤细胞。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，取待测样本，检测CD133的表达量；待测样本的CD133表达量高于正常对照样本的，肿瘤细胞易发生侵袭。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的待测样本是细胞样本，组织样本，或者细胞、组织的蛋白抽提物。

5.CD133在制备抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用，其中，CD133是筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的药靶。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物是降低CD133表达量。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物是消减肿瘤细胞迁移能力的药物。

8.一种筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有CD133。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胶质瘤细胞。

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