CN102670670A - 一种高银杏萜类内酯含量的银杏达莫注射液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高银杏萜内酯含量的银杏达莫注射液的制备方法，其包括以下步骤：1)银杏叶的采集、加工、检测与分类；2)从银杏叶中提取制备银杏叶萜类内酯提取物；3)提取银杏叶黄酮提取物；4)将银杏叶黄酮提取物和部分双嘧达莫加水回流后过滤，制成混合液；5)将混合液、银杏叶萜类内酯提取物、剩余的双嘧达莫及辅料混合，按常规制剂方法制成银杏达莫注射液，所述银杏达莫注射液中，银杏总黄酮和双嘧达莫的含量除应符合常规要求外，银杏萜类内酯的含量应为0.5～1.2mg/mL。

Description

一种高银杏萜类内酯含量的银杏达莫注射液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种注射剂的制备方法，具体地说，涉及一种银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯含量较高的银杏达莫注射液的制备方法。

背景技术

银杏叶和双嘧达莫是生产银杏达莫注射液的主要起始原料。其中，银杏叶系银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功能，临床用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘和高血脂等症。银杏叶的化学成分复杂，主要包括黄酮、内酯、萜类、酚酸、高分子、生物碱、多糖、氨基酸、微量元素等。双嘧达莫(Dipyridamole)的化学名为2，2’，2″，2”’-[4，8-二哌啶基嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，6-二基]双次氮基]-四乙醇，系黄色结晶性粉末；熔点163℃；易溶于氯仿及稀酸，溶于乙醇，微溶于丙酮，几乎不溶于水；无臭，味微苦。在临床上，双嘧达莫主要作为冠脉扩张剂和抗血小板聚集药，用于治疗心绞痛和心肌梗塞，预防心肌梗塞复发和心绞痛。银杏达莫注射液是一个由银杏叶提取物与化学合成药双嘧达莫制备而成的复方注射剂产品。

该药物组合物具有清除体内自由基，保护机体不受活性自由基损伤的作用。在临床上，银杏达莫注射液适用于预防和治疗冠心病、血栓栓塞性疾病，在治疗急危重症领域发挥着重要作用。银杏达莫注射液中所含的银杏总黄酮具有扩张冠脉血管、脑血管，改善脑缺血症状和记忆功能，双嘧达莫能抑制血小板聚集，高浓度可抑制血小板释放，对于急、慢性缺血性脑血管疾病均有较好的预防和治疗作用。根据临床文献报道，银杏达莫注射液对急慢性缺血性脑血管病均有很好的治疗作用，且能显著改善血液流变学指标，降低血液黏度，促进神经功能的恢复，是治疗急性脑梗塞的理想药物之一。另外，银杏达莫注射液还有调脂、改善血流变以及改善心肌供血的作用，是治疗老年冠心病患者的一种有效而安全的药物，也可用于治疗心脑血管病合并高脂血症及高黏血症。

银杏内酯作为银杏叶的提取物具有抗凝血、防治动脉粥样硬化、保护缺血损伤组织、抗休克、抗炎等诸多药理作用，能有效的抑制多种诱导剂所诱导的血小板聚集，并且银杏内酯已被认为是高效特异的PAF拮抗剂，具有抑制血小板活化因子-PAF和对心肌缺血、脑缺血缺氧的保护作用。

但银杏达莫注射液的现有生产工艺中，大多数工艺仅仅跟踪样品的黄酮含量，而未能对萜类内酯成分进行监控，现有生产工艺中，都是对银杏叶用乙醇或者水进行提取，然后吸附，洗脱，得到银杏叶提取液例如：

CN 1939357公开了银杏叶提取工艺：本发明将银杏叶粉碎后，经乙醇回流提取，浓缩过滤，树脂吸附，乙醇洗脱等技术处理，得到银杏叶提取液。

CN 101947247B公开了银杏叶提取工艺，则采用纯化水提取。

我们试验了上述方法，银杏叶提取液中萜类内酯成分含量很低。

银杏叶中的萜类内酯类成分主要有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯，这类成分受到药材产地、采收时间、加工贮藏等条件的限制，其次，不同提取方法对萜类内酯的含量也有较大影响。因此，多个因素与指标影响到银杏达莫注射液中的萜类内酯含量，如果不加重视的话，将严重影响产品的疗效，最终为临床用药带来安全性风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高银杏萜内酯含量的银杏达莫注射液的制备方法，该方法能够显著地提高银杏叶提取物和银杏达莫注射液中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量，提高银杏达莫注射液的临床疗效和质量稳定性。

为了实现本发明的目的，本发明的银杏达莫注射液的制备方法，其包括如下步骤：

1)银杏叶的采集、加工、检测与分类；

2)从银杏叶中提取银杏叶萜类内酯提取物；

3)提取银杏叶黄酮提取物；

4)将含银杏总黄酮10g的银杏叶黄酮提取物和2克双嘧达莫加水回流后过滤，制成混合液1；

5)将上述全量混合液1、含银杏总内酯5g的银杏叶萜类内酯提取物、2克双嘧达莫及辅料混合，按常规制剂方法制成银杏达莫注射液，所述银杏达莫注射液中，银杏总黄酮和双嘧达莫的含量除应符合常规要求外，银杏萜类内酯的含量应为0.5～1.2mg/mL。

上述的制备方法，步骤1)具体为：银杏叶的采收期为6月下旬至10月下旬，将鲜叶在产地于60℃以下进行干燥，选用银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的总含量高于0.35％的银杏叶进行提取。

上述的制备方法，步骤2)具体为：将银杏叶投入到提取装置中，加入7～15倍量药材重量的40～80％的有机溶剂，加热回流提取，其中，有机溶剂可以选用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的任意一种，提取1～3小时，共提取1～3次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣。粗提物加入乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和和乙酸乙酯萃取后的粗提物2。合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入80～100％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用80～100％乙醇溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

上述的制备方法，步骤3)具体为：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的7～15倍的纯化水，加热回流提取，提取1～3小时，共提取1～3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/16～1/8，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，其中，可选用大孔吸附树脂AB-8、ADS-17、D101、DM130、D201、HPD417、HPD600、HPD722、HZ803、HZ806、HZ841中的任何一种，提取液经充分吸附后，用8～12倍柱体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入0.5～2倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物。

银杏叶水提物中加入8～12倍重量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

上述的制备方法，步骤4)具体为：取含银杏总黄酮10g的银杏叶黄酮提取物和2克双嘧达莫和提取物重量10～15倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5～1小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100,000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得制成混合液1，低温贮存。

上述的制备方法，其特征在于，步骤5)具体为：将上述全量混合液1、含银杏总内酯5g的银杏叶萜类内酯提取物、2克双嘧达莫和相关辅料，用注射用水完全溶解，其中，辅料为丙二醇、甘油、吐温80、焦亚硫酸钠、维生素C、依地酸钙钠或聚乙二醇400中的一种或几种，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

本发明的优点在于：本发明的银杏达莫注射液的制备方法，通过优选高内酯含量银杏叶原料进行投料，提过工艺采用一定浓度的有机溶剂进行提取，然后采用有机溶剂、聚酰胺柱和氧化铝柱进行富集，提高了银杏银杏叶萜类内酯的提取率，本发明工艺与CN 1939357、CN 101947247B公开的银杏叶提取工艺比较，其银杏银杏叶萜类内酯的提取率大大高于后二者工艺。其有益效果见实施例5。

本发明的优点还在于：将银杏叶萜类内酯在制剂阶段添加到注射液中，能够有效地避免强酸强碱在中间体长时间加工过程中对内酯类成分的破坏作用。

因此，制得的成品除总黄酮和双嘧达莫的含量稳定可控外，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯等银杏萜类内酯的含量也达到了稳定可控，提高了银杏达莫注射液质量的稳定性与可控性，确保了临床用药的有效性。其有益效果见实施例8。

附图说明

图1银杏萜类内酯对照品的色谱图，图中，1-白果内酯；2-银杏内酯C；3-银杏内酯A；4-银杏内酯；

图2银杏达莫注射液萜类内酯的色谱图，图中，1-白果内酯；2-银杏内酯C；3-银杏内酯A；4-银杏内酯；

图3银杏提取物阴性样品的色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、银杏叶原料：银杏叶采自人工种植的银杏科植物银杏的叶，树龄一般为6～15年，采收期为6月中旬，将鲜叶在产地于60℃左右进行鼓风干燥，水份控制在6％以下，包装好后于通风干燥处贮存，测定银杏叶中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的总含量为0.361％，测定总黄酮的含量为0.897％。

2、银杏叶萜类内酯提取物：将银杏叶投入到提取装置中，按药材投料重量的10倍，加入浓度为70％的乙醇溶液，加热回流提取，提取2小时，共提取二次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣。粗提物加入粗提物3倍量的乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和和乙酸乙酯萃取后的粗提物2。合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入80％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用80％乙醇溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

3、银杏叶黄酮提取物：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的7倍的纯化水，加热回流提取，提取3小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/16，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的HZ841大孔吸附树脂柱进行吸附，提取液经充分吸附后，用8倍柱体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入0.5倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物。

银杏叶水提物中加入8倍重量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

4、银杏达莫注射液的配制：

1)处方组成

注：按银杏总黄酮计：10g，表明投料前测银杏叶黄酮提取物的含量，含10g的银杏叶黄酮提取物的量为投料量。

按银杏总内酯计：5g，表明投料前测银杏萜类内酯提取物的含量，含5g的银杏萜类内酯提取物的量为投料量。

2)制备工艺

A：制成混合液1：取银杏叶黄酮提取物(按银杏总黄酮计：10g)，加入提取物重量2g的双嘧达莫和提取物重量10倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100，000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得混合液1，低温贮存；

B：将上述全量混合液1、银杏叶萜类内酯提取物(按银杏总内酯计：5g)、剩余剂量的2g双嘧达莫和20g吐温80、50g维生素C、1000ml丙二醇、注射用水8000ml搅拌完全溶解，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，滤液补足到10000ml、除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

实施例2

1、银杏叶原料：同实施例1。

2、银杏叶萜类内酯提取物：将银杏叶投入到提取装置中，按药材投料重量的7倍，加入浓度为80％的甲醇溶液，加热回流提取，提取3小时，共提取3次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣。粗提物加入粗提物4倍量的乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和和乙酸乙酯萃取后的粗提物2。合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入90％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用90％乙醇溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

3、银杏叶黄酮提取物：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的15倍的纯化水，加热回流提取，提取3小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/8，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱进行吸附，提取液经充分吸附后，用12体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入2倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物。

银杏叶水提物中加入12量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

4、银杏达莫注射液的配制：

1)处方组成

2)制备工艺

A：制成混合液1：取银杏叶黄酮提取物(按银杏总黄酮计：10g)，加入提取物重量2g的双嘧达莫和提取物重量10倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100，000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得混合液1，低温贮存；

B：将上述全量混合液1、银杏叶萜类内酯提取物(按银杏总内酯计：5g)、剩余剂量的2g双嘧达莫和20g吐温80、50g维生素C、1000ml丙二醇、注射用水8000ml搅拌完全溶解，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，滤液补足到10000ml、除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

实施例3

1、银杏叶原料：同实施例1。

2、银杏叶萜类内酯提取物：将银杏叶投入到提取装置中，按药材投料重量的15倍，加入浓度为40％的丙酮溶液，加热回流提取，提取2小时，共提取二次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣。粗提物加入粗提物3倍量的乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和和乙酸乙酯萃取后的粗提物2。合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入100％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用相同的(具体是什么？)溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

3、银杏叶黄酮提取物：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的10倍的纯化水，加热回流提取，提取3小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/12，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的HPD722大孔吸附树脂柱进行吸附，提取液经充分吸附后，用10倍柱体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入1倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物。

银杏叶水提物中加入10倍重量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

4、银杏达莫注射液的配制：

1)处方组成

2)制备工艺

A：制成混合液1：取银杏叶黄酮提取物(按银杏总黄酮计：10g)，加入提取物重量2g的双嘧达莫和提取物重量10倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100,000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得混合液1，低温贮存；

B：将上述全量混合液1、银杏叶萜类内酯提取物(按银杏总内酯计：5g)、剩余剂量的2g双嘧达莫和20g吐温80、50g维生素C、1000ml丙二醇、注射用水8000ml搅拌完全溶解，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，滤液补足到10000ml、除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

实施例4

1、银杏叶原料：同实施例1。

2、银杏叶萜类内酯提取物：将银杏叶投入到提取装置中，按药材投料重量的10倍，加入浓度为70％的乙腈溶液，加热回流提取，提取3小时，共提取二次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣。粗提物加入粗提物3倍量的乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和和乙酸乙酯萃取后的粗提物2。合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入90％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用90％乙醇溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

3、银杏叶黄酮提取物：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的7倍的纯化水，加热回流提取，提取3小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/16，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的HZ803大孔吸附树脂柱进行吸附，提取液经充分吸附后，用8倍柱体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入0.5倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物。

银杏叶水提物中加入8倍重量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

4、银杏达莫注射液的配制：

1)处方组成

A：制成混合液1：取银杏叶黄酮提取物(按银杏总黄酮计：10g)，加入提取物重量2g的双嘧达莫和提取物重量10倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100,000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得混合液1，低温贮存；

B：将上述全量混合液1、银杏叶萜类内酯提取物(按银杏总内酯计：5g)、剩余剂量的2g双嘧达莫和20g吐温80、50g维生素C、1000ml丙二醇、注射用水8000ml搅拌完全溶解，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，滤液补足到10000ml、除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

实施例5提取银杏萜类内酯工艺的比较：

工艺A

1、银杏叶原料：同实施例1，投料量1公斤。

2、提取银杏萜类内酯工艺同实施例1中2、得提取物-样品A。

工艺B

1、银杏叶原料：同实施例1，投料量1公斤。

2、提取银杏萜类内酯工艺同CN 1939357、将银杏叶粉碎后，经乙醇回流提取，浓缩过滤，树脂吸附，乙醇洗脱等技术处理，得到银杏叶提取液-样品B

工艺C

1、银杏叶原料：同实施例1，投料量1公斤。

2、提取银杏萜类内酯工艺同CN101947247B、将银杏叶粉碎后，经纯化水回流提取，浓缩过滤，树脂吸附，乙醇洗脱等技术处理，得到银杏叶提取液-样品C。

银杏萜类内酯的测定方法见实施例6。

提取银杏萜类内酯工艺的比较见下表1：

表1：银杏萜内酯的测定结果

结论：从表1可以看出，本发明工艺与CN 1939357、CN 101947247B公开的银杏叶提取工艺比较，其银杏萜类内酯的提取率大大高于后二者工艺。

实施例6银杏萜类内酯的测定

一、仪器、药品、试剂

仪器：Agilent 1200系列高效液相色谱仪、Altech 2000ES蒸发光散射检测器；对照品：白果内酯(批号100865-200605)、银杏内酯A(批号100862-200608)、银杏内酯B(批号100863-200508)、银杏内酯C(批号100864-200906)，均购于中国药品生物制品检定所；试剂：乙腈(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、水(去离子水)。

二、测定方法

2.1对照品溶液的制备

取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯对照品，精密称量，加甲醇制成每1ml含银杏内酯A 0.5mg，银杏内酯B、C和白果内酯各0.2mg的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备

银杏达莫注射液，规格为10ml，取批号为20100201的10支样品，敲碎玻璃，倾入250ml的三角瓶中，混合均匀，精密吸取30ml，置于100ml的分液漏斗中，用2％的盐酸溶液调节pH至2.0左右，用乙酸乙酯萃取4次(30ml，20ml，20ml，20ml)，合并乙酸乙酯层，用5％乙酸钠溶液20ml洗涤，分取乙酸钠溶液，用10ml乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，以20ml水洗涤，有机相浓缩至干，残渣加丙酮转移至2ml容量瓶中，并以丙酮定容至刻度，摇匀、滤过，即得。

2.3色谱条件

色谱柱：Welch C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5mm)；流动相：甲醇-异丙醇-水(9∶7.5∶83.5)；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；蒸发光散射检测器的漂移管温度：105℃，载气流速：3.0L/min；理论板数按白果内酯计，不得低于3000。图1、图2和图3分别为银杏萜类内酯对照品、银杏达莫注射液和银杏提取物阴性样品的色谱图。

由图1、图2和图3可见：银杏达莫注射液样品的色谱图在萜类内酯标准品各保留时间对应位置处有对应的色谱峰出现，而银杏提取物阴性样品在相对应的位置处没有干扰，说明该色谱条件可以用于分析银杏达莫注射液中的萜类内酯的含量。

2.4线性关系

精密吸取对照品2、4、6、8、10、15mL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定并记录色谱图。分别以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的质量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。测定结果如下：

银杏内酯A：

标准曲线：y＝1.4511x+6.6004r＝0.9992线性范围：3.12ug～11.73ug

银杏内酯B：

标准曲线：y＝1.4253x+6.5094r＝0.9991线性范围：3.13ug～11.76ug

银杏内酯C：

标准曲线：y＝1.4146x+6.6309r＝0.9985线性范围：3.09ug～11.62ug

白果内酯：

标准曲线：y＝1.958x+2.7728r＝0.9993线形范围：0.96ug～14.40ug

三、样品测定

取实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，平行三份，参照供试品溶液的制备方法，分别进行处理，制得各供银杏萜类内酯含量测定的银杏达莫注射液样品。分别精密吸收对照品溶液10ml、20ml，供试品溶液10～20ml，分别注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量，即得，将各测定值加和即得银杏萜类内酯的总含量。银杏达莫注射液实施例1～4的样品测定结果见下表。

表2银杏达莫注射液萜类内酯的含量测定结果

从上表可见：实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品中，银杏萜内酯的含量为0.5～1.2mg/ml，基本可以通过制备工艺控制制剂成品中的银杏萜内酯的含量，说明制剂工艺与产品质量基本可以达到稳定可控。

实施例7银杏达莫注射液的冻融试验

将实施例1～3制备得到的银杏达莫注射液分别放置在-20℃以下进行冻融试验，分别考察各银杏达莫注射液的外观性状、pH、银杏总黄酮含量、银杏萜类内酯含量及双嘧达莫含量，结果如表1所示。

表3银杏达莫注射液冻融试验结果

根据表2可见：银杏达莫注射液的制备过程中，无论银杏的萜类内酯成分是经有机溶剂提取精制后添加至提取液中，还是在制剂过程中添加，所制得的样品均比较稳定，符合注射剂的各项要求，样品经冷冻结冰再融化后，测定各相关指标，样品均比较稳定，未出现不溶性微粒，说明四个实施案例制备的样品均能达到相关质量要求。

实施例8银杏达莫注射液的稳定性实验研究

1.加速试验

本项试验目的是通过加速药物的化学或物理变化，探讨药物的稳定性，为药品包装、运输及贮存提供必要的资料。实验方法：取实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，于40℃±2℃、相对湿度为75％±5％的条件下放置6个月，于0、1、2、3与6月末分别取样，对外观、不溶性微粒、pH值、银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量进行考察。试验结果见下表。

表4加速试验结果

根据试验结果，实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，按市售产品规格进行包装成10ml/支，在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月。经取样分析，分析结果与0月比较，银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量稍微下降，其他各项检测指标无明显变化，质量基本稳定。

2.影响因素试验

2.1高温试验

取实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，于温度为60℃的恒温干燥箱中放置20天，于第0天、第5天、第10天和第20天取样，观察银杏达莫注射液的外观与不溶性微粒的变化情况，测定各样品pH值、银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量。结果见表5。

表5高温试验结果

根据试验结果，实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，按市售产品规格进行包装成10ml/支，在温度60±2℃的条件下放置20天。经取样分析，分析结果与0天比较，银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量稍微下降，其他各项检测指标无明显变化，质量基本稳定。

2.2强光照射试验

取实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，于照度为4500lx±5001x的条件下放置20天，于第0天、第5天、第10天和第20天取样，观察银杏达莫注射液的外观与不溶性微粒的变化情况，测定样品的pH值、银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量。结果见表6。

表6强光照射试验结果

根据试验结果，实施例1～4制备的银杏达莫注射液样品，按市售产品规格进行包装成10ml/支，在照度为4500lx±500lx的条件下放置20天。经取样分析，分析结果与0天比较，银杏萜类内酯、总黄酮和双嘧达莫的含量下降明显，其他各项检测指标无明显变化。说明样品最好避光保存。

Claims (6)

1.一种银杏达莫注射液的制备方法，其包括如下步骤：

1)银杏叶的采集、加工、检测与分类；

2)从银杏叶中提取银杏叶萜类内酯提取物；

3)提取银杏叶黄酮提取物；

4)将含银杏总黄酮10g的银杏叶黄酮提取物和2克双嘧达莫加水回流后过滤，制成混合液1；

5)将上述全量混合液1、含银杏总内酯5g的银杏叶萜类内酯提取物、2克双嘧达莫及辅料混合，按常规制剂方法制成银杏达莫注射液，所述银杏达莫注射液中，银杏总黄酮和双嘧达莫的含量除应符合常规要求外，银杏萜类内酯的含量应为0.5～1.2mg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：银杏叶的采收期为6月下旬至10月下旬，将鲜叶在产地于60℃以下进行干燥，选用银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的总含量高于0.35％的银杏叶进行提取。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将银杏叶投入到提取装置中，加入7～15倍量药材重量的40～80％的有机溶剂，加热回流提取，其中，有机溶剂选用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的任意一种，提取1～3小时，共提取1～3次，合并提取液，低温下减压回收溶剂，浓缩干燥，制得银杏叶的有机溶剂粗提物，留下提取后的银杏叶药渣，粗提物加入乙酸乙酯，提取后过滤，得到滤液和乙酸乙酯萃取后的粗提物2；合并滤液，减压滤液回收乙酸乙酯，加入80～100％乙醇溶液，使充分溶解，过滤，滤液上于已处理好的聚酰胺色谱柱，用80～100％乙醇溶液进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，浓缩液上于氧化铝柱，用无水乙醇进行洗脱，收集含银杏内酯的流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，过滤，干燥，即得银杏叶萜类内酯提取物。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：将有机溶剂提取后的银杏叶药渣和乙酸乙酯萃取后的粗提物2，加入药渣和粗提物2总重的7～15倍的纯化水，加热回流提取，提取1～3小时，共提取1～3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的1/16～1/8，将浓缩液放置、沉淀、离心、过滤，将滤液上于已处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，其中，可选用大孔吸附树脂AB-8、ADS-17、D101、DM130、D201、HPD417、HPD600、HPD722、HZ803、HZ806、HZ841中的任何一种，提取液经充分吸附后，用8～12倍柱体积量的纯化水洗涤，然后用乙醇洗脱，收集含银杏黄酮部分的洗脱液、浓缩至无醇味，然后加入0.5～2倍银杏叶重量的纯化水，搅拌冷却后静置、沉淀、离心、过滤，将滤液浓缩收膏，干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏水提物；银杏叶水提物中加入8～12倍重量的体积百分浓度为90％以上的乙醇，搅拌至溶解，过滤，滤液浓缩至无醇味，然后加入10倍浓缩后药液体积的纯化水，搅拌冷却后静置，取上清液，经离心分离后浓缩收膏，真空干燥至含水量在6％以下，粉碎，即得银杏叶黄酮提取物。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：取含银杏总黄酮10g的银杏叶黄酮提取物和2克双嘧达莫和提取物重量10～15倍重量的纯化水，充分搅拌，混合均匀，调pH值至3.5～5.5，加热回流0.5～1小时，冷却至室温，重调pH值至3.5～5.5，取上清液，用0.2mm的滤膜过滤，滤液再经100000道尔顿以下的超滤膜超滤，滤液高温高压灭菌，放冷，即得制成混合液1，低温贮存。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)具体为：将上述全量混合液1、含银杏总内酯5g的银杏叶萜类内酯提取物、2克双嘧达莫和相关辅料，用注射用水完全溶解，其中，辅料为丙二醇、甘油、吐温80、焦亚硫酸钠、维生素C、依地酸钙钠或聚乙二醇400中的一种或几种，调pH值为3.5～5.5，低温冷藏放置，过滤，除热原，制得注射液中间体，经检验合格后，用0.22mm微孔滤膜过滤，滤液灌装，高温高压灭菌，即得银杏达莫注射液，低温贮存。

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