CN101250553A - 一种促人血小板生成素表达载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属基因工程和转基因工程技术领域，具体涉及建立人促血小板生成素基因与山羊β－酪蛋白基因启动子的乳腺特异表达载体的方法。构建的载体转染于COS－7和HC－11细胞，在真核细胞水平验证hTPO有表达。将构建的山羊β－酪蛋白启动子指导的促血小板生成素基因表达载体应用于制备转基因动物乳腺生物反应器，在转基因哺乳动物的乳汁中高表达，为临床提供了有用的药物蛋白－hTPO。本发明所提供的hTPO基因以及与山羊β－酪蛋白启动子构建的乳腺特异表达载体，为进一步研究开发提供了基础。
Description
本申请是申请号为02136029.4，申请日为2002年7月13日，发明名称为“一种促人血小板生成素的制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明属基因工程和转基因工程技术领域，涉及一种促人血小板生成素的制备方法。具体涉及利用山羊-β酪蛋白启动子指导的促人血小板生成素(hTPO)基因组DNA和cDNA表达载体的构建以及由这些载体转染的细胞和转基因动物生产hTPO的方法。
背景技术
促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)是一重要的造血因子，其受体c-mpl主要在巨核细胞、血小板和造血前体细胞，因此TPO的主要生物学功能是刺激巨核细胞增殖，分化及血小板成熟，并加速造血前体细胞进入细胞周期。动物实验和临床研究表明，重组人促血小板生成素(rhTPO)能有效促进血小板恢复，缓解由于放疗和化疗而引起的血小板减少症。
hTPO基因组全长6.2kb，由六个外显子和五个内含予组成，在第一个外显子上游可检测到一个额外的外显子，命名为exon0(外显子0)。Southern印迹和荧光原位杂交显示：hTPO为单拷贝基因，位于人第3号染色体(3q26-27)。hTPO cDNA由1774个核苷酸附加一个polyA尾组成。起始密码子位于核苷酸216-218处，其开放阅读框架由1059个核苷酸组成，负责编码353氨基酸的hTPO分子，其中N端前21个氨基酸为信号肽序列，人成熟TPO分子由332个氨基酸组成，理论分子量为36KD。
hTPO基因组序列和cDNA序列已由GeneBank公布，美国津莫吉尼蒂克斯公司的专利申请(PCT/US95/14932)中，公开了TPO的生产中有用的DNA构建体以及通过培养的真核细胞产生TPO多肽的方法。但尚未见用hTPO基因(Genomic DNA，cDNA)与山羊-β酪蛋白启动子构建乳腺特异表达载体的报告，也未见用hTPO基因(Genomic DNA，cDNA)载体及通过转基因哺乳动物生产hTPO的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种促人血小板生成素的制备方法。具体是利用山羊-β酪蛋白启动子指导的促人血小板生成素(hTPO)基因组DNA、cDNA和含有内含子V的hTPO cDNA表达载体的构建以及由所述构建载体转染的细胞和转基因动物技术生产hTPO的方法。
本发明将构建的山羊-β酪蛋白启动予指导的促血小板生成素基因表达载体应用于制备转基因动物乳腺生物反应器，使之在转基因哺乳动物的乳汁中高表达，为临床提供有用的药物蛋白-hTPO。本发明所提供的hTPO基因(Genomic DNA，cDNA)以及与山羊-β酪蛋白启动子构建的乳腺特异表达载体，为进一步研究开发提供了基础。
本发明是通过下述技术方案和步骤实现的。
(一)构建山羊-β酪蛋白启动子指导的hTPO表达载体。
1、通过下述方法获得hTPO基因全长核苷酸序列：
以中国汉族人胎肝基因组DNA为模板，用一对核苷酸为引物-寡核苷酸A1：5’-AGG TACCTGATGACCTGCTGCTGT-3’为正向引物；寡核苷酸A2：5’-CGGCGCTCC CATTTATTCCTTATAC-3’为反向引物，采用Long-PCR Kit(宝生物工程公司)进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃1min；(98℃，20sec；65℃，10min)*30；72℃，10min。然后电泳检测目的片段。
2、扩增、转染获得的hTPO全长序列：
将所获得的PCR扩增产物分别与pGEM-T载体(Promega公司)连接，常规方法转染大肠杆菌Top10F’宿主菌感受态细胞，质粒小量扩增，碱裂解法提取质粒。取少量提取的质粒，用PstI和BamHI酶切初步鉴定。AB1370自动测序仪(Perkin-Elemer，公司)测序，获得6340bp的hTPO全长基因，包括外显子1-6以及全部的内含子。全序列分析表明：上述扩增的hTPO基因组序列中，全部编码序列、全部内含子/外显子剪接识别序列与已知的hTPO的基因序列比对一致；但在349位和1490位发生G→A和G→T突变；在4940位、5887位、分别发生A→G、T→C、A→T突变，均位于非编码区。
3、获得hTPO cDNA核苷酸片段：
以人胎肝mRNA为模板，首先采用RT-PCR Kit(STRATA GENE)，进行逆转录；然后以逆转录得到的cDNA为模板，采用两对(B1/B2、C1/C2)核苷酸为引物：寡核苷酸B1：5’-GCGTCGACAGAATGGAGCTGA-CTGAATT-3’为正向引物，寡核苷酸B2：5’-GGCATTGGGATCCTT-GTGAGCTGTGG-3’为反向引物；寡核苷酸C1：5’-CAGCTCACAA-GGATCCCAATGCCATCTTC-3’为正向引物，C2：5’-CGCAGCTG-ACACGGCAGTGTCTGAGAACCTTA-3’为反向引物，进行PCR扩增。PCR的反应条件为：85-95℃ 3-5min；48-54℃ 3-5min；(85-94℃ 1-5min；58-62℃ 1-5min；65-72℃ 50-90sec)*35；68-72℃，5-10min。然后电泳检测目的片段，分别获得450bp和660bp的两个TPO cDNA片段。
4、获得hTPO cDNA分子全序列：
经PCR扩增的两个cDNA片段分别用Sal I和BamHI酶切，测序质粒pBSK用Sal I单酶切线性化，回收酶切片段，然后将三个片段用T4连接酶(NewEngland Bio公司)连接，并转化JM109感受态细菌，质粒少量扩增，碱裂解提取质粒，经电泳和酶切鉴定，挑选插入hTPO cDNA的重组子，命名为pCTPO。经ABI370测序后得1062bp的hTPO cDNA全分子核苷酸序列。
5、获得hTPO基因组中内含子V：
以人胎肝基因组DNA为模板，用一对核苷酸为引物：寡核苷酸D1：5’-ATAAGGCTCCCCACCCGCTTTTAG-3’为正向引物；寡核苷酸D2：5’-CGGCGCTCCCATTTATTCCTTATAC-3’为反向引物，采用Long-PCRKit(宝生物工程公司)进行PCR扩增。PCR反应条件为：95‘C 1min；(98℃，20sec；65℃，10min)*30；72℃，10min。然后电泳检测目的片段。将上面获得的PCR扩增产物分别与pGEM-T载体(Promega公司)连接，常规方法转染大肠杆菌Top10F’宿主菌感受态细胞，质粒小量扩增，碱裂解法提取质粒。全序列分析表明：在上述扩增的hTPO基因组序列中，全部编码序列、全部内含子/外显子剪接识别序列同已发表的hTPO的基因序列一致；在5887位、5925位分别发生T→C、A→T的突变。
6、利用上述所得hTPO基因组DNA、cDNA、内含子V，构建hTPO基因表达载体：
利用pcDNA3.1(+)的pCMV与hTPO基因组DNA、hTPO cDNA以及含内含子V的hTPO cDNA，构建表达载体：(1)pcDNA3.1(-)的pCMV启动表达的hTPO基因组DNA表达载体；(2)pcDNA3.1(-)的pCMV启动表达的hTPO cDNA表达载体：(3)pcDNA3.1(-)的pCMV启动表达的含内含子V的hTPO cDNA表达载体。
7、利用上述所得hTPO基因组DNA、cDNA、内含子V，与乳腺表达质粒相结合，构建hTPO基因乳腺表达载体：
利用含有山羊β-酪蛋白基因启动子区核苷酸序列SEQ ID No.3的乳腺表达载体，结合上述hTPO基因组DNA、cDNA、内含子V，构建三种人TPO基因乳腺表达载体。如由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6606bp序列共同启动表达的hTPO基因组DNA表达载体、hTPO cDNA表达载体，以及含内含子V的hTPO cDNA表达载体等。
(二)验证上述hTPO和构建的三种载体的有效性及实用性：
1、验证hTPO基因在真核细胞中的表达：
将构建的载体采用脂质体转染法，进行(1)转染非洲绿毛猴肾细胞COS-7，(2)孕中期小鼠乳腺上皮细胞HC-11。经细胞培养，收集细胞培养液，采用hTPO Kit(R&D)检测hTPO的含量，证明hTPO得到了表达。其中由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列共同启动表达的含内含子V的hTPO cDNA表达载体的hTPO表达量最高。
2、建立hTPO转基因小鼠，在个体水平验证hTPO在小鼠乳汁中的表达：
通过显微注射转基因技术建立由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列共同启动表达的hTPO基因组DNA表达载体、hTPO cDNA表达载体，以及含内含子V的hTPO cDNA表达载体整合的转基因小鼠。经PCR和Southern.Blot印迹杂交检测证实，转基因小鼠体内有hTPO基因的整合；采用hTPO Kit(R&D)检测鼠奶中hTPO的含量，证明鼠奶中有hTPO的表达。其中，由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6606bp序列共同启动表达的含内含子V的hTPO cDNA表达载体的hTPO表达量最高达122.8μg/ml。
附图说明
图1是由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列共同启动表达的hTPO基因组DNA表达载体的构建图。
图2是由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列共同启动表达的hTPO cDNA表达载体的构建图。
图3是由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端序列共同启动表达的含内含子V的人TPO cDNA表达载体的构建图。
具体实施方式
本发明所述和以下的实施例中，所使用的技术，包括基因测序、PCR扩增与检测、细胞转染、载体构建、转基因等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明的，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒和载体、细胞株等，除非是本说明书中特别注明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
本发明所采用转基因实验动物包括所有非人哺乳动物。
以下结合具体的实施例，对本发明做进一步的阐述。所述实施例仅用于对本发明所作的说明而不是对本发明的限制。
实施例1：hTPO基因组DNA序列的克隆和测定
1.PCR扩增
以人胎肝基因组DNA为模板，用一对核苷酸为引物；
寡核苷酸A1：5’-AGGTACCTGATGACCTGCTGCTGT-3’为正向引物，
寡核苷酸A2：5’-CGGCGCTCCCATTTATTCCTTATAC-3’为反向引物。
采用Long-PCR Kit(宝生物工程公司)进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃ 1min；(98℃，20sec；65℃，10min)*30；72℃，10min。然后电泳检测目的片段。
2.PCR产物的测序
将上述所获得的PCR扩增产物分别与pGEM-T载体(Promega公司)连接，常规方法转染大肠杆菌Top 10F’宿主菌感受态细胞，质粒小量扩增，碱裂解法提取质粒。取小量提取的质粒，用PstI和BamHI酶切初步鉴定。AD1370自动测序仪(Perkin-Elemer公司)测序，获得6340bp的hTPO全长基因，包括外显子1-6以及5个内含子的全部序列(见序列表1.SEQ ID No.1，其中：121-135位是核苷酸引物A1的结合位点；
6326-6350位是核苷酸引物A2的结合位点；
2046位是起始密码子；
5792位是终止密码子；
4891-5127位是内含子V；
4871位是Pst I的酶切位点；
5159位是BamHI的酶切位点。)。
实施例2：hTPO cDNA序列的克隆和测序
1、RT-PCR
以人胎肝mRNA为模板，首先采用RT-PCR Kit(STRATA GENE)，进行逆转然后以逆转录得到的cDNA为模板，采用两对(B1/B2、C1/C2)核苷酸为引物
B1：5’-GCGTCGACAGAATGGAGCTGACTGAATT-3’为正向引物
B2：5’-GGCATTGGGATCCTTGTGAGCTGTGG-3’为反向引物；
C1：5’-CAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATCTTC-3’为正向引物，
C2：5’-CGCAGCTGACACGGCAGTGTCTGAGAACCTTA-3’为反向引物，进行PCR扩增。
PCR的反应条件为：95℃ 5min；54℃ 5min；(94℃ 1min；62℃1min；72℃ 90sec)*35；72℃，10min。然后电泳检测目的片段，分别获得450bp和660bp的两个hTPO cDNA片段。
2、hTPO两个片段的连接和测序
经PCR扩增的两个cDNA片段分别用SalI和BamH I酶切，然后用T4连接酶(New EnglandBio公司)将两个片段插入测序质粒pBSK。经AB1370测序，发现缺失15个碱基对。为了得到完整的hTPO cDNA分子，首先将hTPO分子克隆于真核表达载体pcDNA3.1/zeo(-)；其次，根据已发表的hTPO cDNA序列，人工合成包含上述缺失核苷酸序列的DNA片段，利用Pst I和BamHI将合成的基因插入pCTPOd中，最后利用T7引物和合成的测序引物完成对pCTPO中TPO分子的全序列测定，得到1062bp的hTPO cDNA分子(见序列表2.SEQID No.2，其中：
1-17位是核苷酸引物趴的结合位点；
416-441位是核苷酸引物B2的结合位点；
419-447位是核苷酸引物C1的结合位点；
1060-1062位是核苷酸引物C2的结合位点；
377位是Pst I的切点；
429位是BamHI的切点。)。
实施例3、乳腺特异表达载体的构建
1、由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6606bp序列共同启动表达的hTPO基因组DNA表达载体的构建
hTPO基因组DNA的PCR产物与T载体连接，经Sal 1和Sma I(NEB公司)双酶切后装入克隆载体pBSK；再经NotI和KpnI酶切，切下hTPO基因组DNA，同样酶切真核基因表达载体pcDNA3.1(-)，电泳回收目的片段，用T4连接酶(NEB公司)将上述片段依次有顺序地装载到pcDNA3.1(-)表达载体中；最后以NotI单酶切将山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列插入到hTPO基因组DNA的5’端，经酶切鉴定挑选方向正确的克隆，并对克隆子的连接处测序，结果正确(见序列表3.SEQ ID No.3)。
2、由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6606bp序列共同启动表达的hTPO cDNA表达载体的构建
hTPO cDNA的N端和C端PCR产物首先分别与T载体连接，然后以SalI和SmaI双酶切，切下两个片段，与经SalI酶切的克隆载体pBSK连接，测序发现得到的hTPO cDNA分子缺失了15个核苷酸；以Kpn I和EcoR V将hTPOcDNA分子克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中；人工合成含缺失片段的核苷酸分子，以PstI和BamHI将缺失片段插入到hTPOcDNA中，得到完整的hTPOcDNA分子。最后以Not I单酶切将山羊β-酪蛋白基因5’端序列插入到hTPOcDNA的5’端，经酶切鉴定挑选方向正确的克隆，并对克隆子的连接处测序，结果正确(见序列表3.SEQ ID No.3)。
3、由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端序列共同启动表达的含内含子V的hTPO cDNA表达载体的构建
hTPO内含子V的PCR产物首先T载体连接，以PstI和BamHI将内含子V插入到pcDNA3.1(-)载体得hTPO cDNA中，得到含内含子5的hTPO cDNA真核表达载体；以Not I和Kpn I将大鼠的WAP启动子插入到hTPO cDNA的5’端；BamHI单酶切以山羊β-酪蛋白基因5’端序列替换大鼠的WAP启动子，得由pcDNA3.1(-)的pCMV和山羊β-酪蛋白基因5’端6609bp序列共同启动表达的含内含子V的hTPO cDNA表达载体。经酶切鉴定挑选方向正确的克隆，并对克隆子的连接处测序，结果正确。
实施例4：hTPO基因在真核细胞中的表达
1、转染Cos-7细胞株：
按常规细胞培养。pcDNA3.1(-)/hTPO cDNA和pcDNA3.1(-)/hTPOcDNA-Intron V质粒转染Cos-7细胞是采用DOTAP(DM公司)脂质体转染法，转染Cos-7细胞48小时，收集细胞上清液，采用hTPO Kit(R&D)检测hTPO的含量，证明hTPO得到了表达。
2、转染HC-11细胞株
pcDNA3.1(-)/hTPO cDNA和pcDNA3.1(-)/hTPO cDNA-htron V质粒转染HC-11细胞(购自瑞士Friedrich Miescher研究所)是采用DOTAP(DM公司)脂质体转染法，按照生长培养期、休克培养期及诱导期培养，三种要求进行培养HC-11细胞，转染HC-11细胞48小时，收集细胞上清液，采用人TPOKit(R&D)检测hTPO的含量，证明hTPO得到了表达。
实施例5：建立转基因小鼠
以QIAquick Kit提取pcDNA3.1(-)/hTPO cDNA和pcDNA3.1(-)/hTPOcDNA-Intron V质粒，纯化定量测定，供显微注射。按照常规程序进行转基因小鼠的制备。经PCR和Southern blot印迹杂交检测证实转基因小鼠其体内有hTPO基因的整合，采用hTPO Kit(R&D)检测其奶汁中hTPO的表达量，最高的达122.8μg/ml。
序列表
Claims (9)
1、一种促人血小板生成素hTPO表达载体，其特征在于，所述表达载体包括含有内含子V的hTPO cDNA，并且利用山羊β-酪蛋白启动子指导所述含有内含子V的hTPO cDNA的表达。
2、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述内含子V具有SEQID NO：1所示第4891-5127位的核苷酸序列。
3、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述hTPO cDNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述山羊β-酪蛋白启动子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
5、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括CMV启动子。
6、一种如权利要求1所述载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、PCR扩增hTPO cDNA片段，并将hTPO内含子V片段插入hTPO cDNA中，构建成含内含子V的hTPO cDNA真核表达载体；
B、将山羊β-酪蛋白启动子插入hTPO cDNA的5’端，构建成由CMV启动子、山羊β-酪蛋白启动子共同启动的含有内含子V的hTPO cDNA的表达载体。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤A的hTPO cDNA片段具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤A的hTPO内含子V片段具有SEQ ID NO：1所示第4891-5127位的核苷酸序列。
9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B的山羊β-酪蛋白启动子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Open date: 20080827 |