CN102600190B

CN102600190B - 阿霉素的脂质药物组合物

Info

Publication number: CN102600190B
Application number: CN201110408340.4A
Authority: CN
Inventors: 夏桂民; 安智娇; 李眉; 马洁; 李子臣; 赵晨; 王玉成; 王旸; 李桂玲
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102600190A

Abstract

本发明涉及阿霉素的脂质药物组合物，其包含(1)阿霉素，(2)磷脂类，(3)胆固醇，和(4)以下式I化合物或式9化合物：或其生理学上可接受的盐，其中n为5至500的整数，m为2至12的整数，p为1至8的整数。本发明还涉及所述脂质药物组合物的方法及其用途；式I化合物或式9化合物及其制备方法和用途。本发明的脂质药物组合物具有良好的pH敏感性以及任选的靶向性，该脂质药物组合物作为脂质体可增加抗肿瘤药物在靶部位的浓度同时减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数。

Description

阿霉素的脂质药物组合物

技术领域

本发明涉及一种脂质药物组合物，特别涉及阿霉素的脂质药物组合物，更特别涉及一种包含聚合物修饰的脂质材料制成的阿霉素的脂质药物组合物。本发明还涉及用于制备该脂质药物组合物的聚合物修饰的脂质材料。

背景技术

盐酸阿霉素是抗有丝分裂和细胞毒性的抗生素类抗肿瘤药物，能成功地诱导多种恶性肿瘤的缓解，包括急性白血病、淋巴瘤、软组织和骨肉瘤、儿童恶性肿瘤及成人实体瘤，尤其用于乳腺癌和肺癌。其不良反应表现为心脏毒性、骨髓抑制和口腔溃疡。用靶向脂质体包裹阿霉素有望提高药物的靶向性、降低毒性，因而在国内外受到广泛关注。

脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。因其具有靶向性，缓释性，组织亲和性、低毒性以及高稳定性等特点，近年来受到广泛关注，许多国内外研究者都在寻找新型的靶向性强且具有良好性能的脂质体载体材料。

叶酸-脂质体是一种通过亲水性直链高分子将叶酸分子间接连接在脂质体表面而获得的受体型靶向脂质体，叶酸(在本文中，可缩写为F)具有很高的肿瘤靶向性，因此叶酸-脂质体为将药物高比例导入肿瘤细胞内提供了一种较为实用的抗肿瘤药物靶向载体。目前已有研究用F-PEG-DSPE作为脂材包裹抗肿瘤药物制成叶酸受体靶向脂质体，研究结果显示这种脂质体具有良好的长循环作用和肿瘤靶向性。

聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz)是由2-乙基-2-噁唑啉(EOz)单体开环聚合得到的聚合物，具有很好的生物相容性以及低毒性等特点。研究表明，PEOz与PEG的作用类似，因此有望成为PEG的替代材料。近几年研究发现PEOz具有pH敏感性，其pKa值(4-6)接近生理pH值，在弱酸性环境下和生理pH环境下会表现出不同的性质。这种pH敏感性非常适合药物在肿瘤组织以及内含体等弱酸性部位的释放。

然而目前人们尚不能获得通过聚(2-乙基-2-噁唑啉)与磷脂类物质和任选的叶酸结合的新颖化合物制备得到的阿霉素的脂质药物组合物，以便获得具有期望性质(例如良好的水溶性、生物相容性和/或低毒性，和任选的肿瘤靶向性)的阿霉素给药载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种新颖的阿霉素的脂质药物组合物，其具有良好的pH敏感性和任选的肿瘤靶向性。本发明人发现，采用2-乙基-2-噁唑啉(在本文中，可缩写为EOz)作为单体经开环聚合得到聚合物聚(2-乙基-2-噁唑啉)(在本文中，可缩写为PEOz)，该PEOz经特定的官能团与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(在本文中，可缩写为DSPE)结合，再任选地进一步与叶酸结合，可以成功地获得聚合物修饰的磷脂类物质，采用这种聚合物修饰的磷脂类物质制备阿霉素的脂质药物组合物，可赋予良好的pH敏感性和任选的肿瘤靶向性。本发明基于上述发现而得以完成。

概括地说，本发明提供一种脂质药物组合物，其包含(1)阿霉素，(2)磷脂类，(3)胆固醇，和(4)以下式I化合物或式9化合物：

本发明还提供了所述脂质药物组合物的方法及其用途；式I化合物或式9化合物及其制备方法和用途。

本发明第一方面提供一种脂质药物组合物，其包含

(1)阿霉素，

(2)磷脂类，

(3)胆固醇，和

(4)以下式I化合物或式9化合物：

或其生理学上可接受的盐，其中n为5至500的整数，m为2至12的整数，p为1至8的整数。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中含有40～90摩尔份(优选50-80摩尔份，更优选60-70摩尔份)的磷脂类、10～50摩尔份(优选20-40摩尔份)的胆固醇和1～20摩尔份(优选1-15摩尔份，更优选2-10摩尔份)的式I化合物或式9化合物。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中含有60～70摩尔份的磷脂类、20～38摩尔份的胆固醇和2～10摩尔份的式I化合物或式9化合物。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中含有磷脂类、胆固醇和式I化合物或式9化合物三者的总量为70-99重量份，阿霉素1-30重量份。在一个实施方案中，该脂质药物组合物中，含有磷脂类、胆固醇和式I化合物或式9化合物三者的总量为80-99重量份，阿霉素1-20重量份。在一个实施方案中，该脂质药物组合物中，含有磷脂类、胆固醇和式I化合物或式9化合物三者的总量为80-98重量份，阿霉素2-20重量份。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中含有磷脂类、胆固醇和式I化合物或式9化合物三者的总量为90-98重量份，阿霉素2-10重量份。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中所述阿霉素是盐酸阿霉素。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中所述磷脂类物质选自氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、豆磷脂。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中p为1至6的整数，或者p为1至5的整数，或者p为1至4的整数，或者p为2。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数，p为1至4的整数。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中式I化合物为以下式Ia化合物(即m＝6，p＝2)：

或其生理学上可接受的盐，其中n为5至500的整数，或者n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其中式9化合物为以下式9a化合物：

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体药物制剂。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体或脂质体药物制剂，该脂质体是pH敏感型脂质体。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体或脂质体药物制剂，该脂质体是具有肿瘤靶向性能的脂质体。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体或脂质体药物制剂，该脂质体是pH敏感型并且具有肿瘤靶向性能的脂质体。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体或脂质体药物制剂，该脂质体是叶酸受体介导的pH敏感型主动靶向脂质体。

根据本发明第一方面的脂质药物组合物，其是脂质体药物制剂，该脂质体混悬于水性溶媒(例如水、生理盐水、葡萄糖溶液)中。

本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述脂质药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：

(i)使磷脂类物质、胆固醇、和式9或式9a的化合物按薄膜分散法进行制备，得到任选具有叶酸靶向性的pH敏感型脂质体药物载体；

(ii)使阿霉素水溶液与上述制得的脂质体药物载体按硫酸铵密度梯度法进行载药脂质体的制备，得到任选具有叶酸靶向性的pH敏感型的阿霉素脂质体，即得本发明的脂质药物组合物。

根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤：

(1)按以下重量份取各组分：阿霉素1～30(优选1-20，优选2-20，优选2-10)重量份、脂质混合物(磷脂类、胆固醇、和PEOz-DSPE(或F-PEOz-DSPE))70-99(优选80-99，优选80-98，优选90～98)重量份，该脂质混合物中，三类成分的摩尔比为：磷脂类40～90摩尔份、胆固醇10～50摩尔份、PEOz-DSPE(或F-PEOz-DSPE)1～20摩尔份；

(2)将磷脂类、胆固醇、和PEOz-DSPE(或F-PEOz-DSPE)各组分用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜(温度为10-50℃，优选为20-40℃，更优选为约35℃)；

(3)将250mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液(pH＝4.5-6.5，优选为pH＝5.0-6.0，优选pH约为5.5)加至脂膜中，超声分散(温度为40-80℃，优选为50-70℃，更优选为约65℃，超声分散5-60min，优选10-30min，更优选约20min)，得空白脂质体混悬液；任选地使该空白脂质体混悬液连续通过孔径在200nm、100nm、80nm的聚碳酸酯滤膜(优选为各滤5次，65℃下挤压)，得硫酸铵溶解的空白脂质体溶液；

(4)采用湿法灌注填充层析柱，连续灌入葡聚糖凝胶G-25，用10％蔗糖溶液洗脱层析柱(用5-20个柱体积，优选为10个柱体积)，加入硫酸铵溶解的空白脂质体溶液(优选为，流速＝1ml/min)，收集乳白色的含有脂质体的液体，用5％葡萄糖溶液洗脱层析柱(用5-20个柱体积，优选为10个柱体积)；

(5)使阿霉素溶于水中，将此溶液加入至收集的空白脂质体溶液中，于热水浴中放置(优选65℃，30min～60min)，不时振摇，将包裹了药物的脂质体加入层析柱，用5％葡萄糖溶液洗脱，以除去未包裹到脂质体内部的阿霉素，收集流出液，即得本发明脂质药物组合物，其中包含阿霉素脂质体。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述脂质药物组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。本领域技术人员理解，所述肿瘤和/或癌症通常是对阿霉素敏感的肿瘤和/或癌症。本领域技术人员理解，所述阿霉素可以参考目前已知的阿霉素临床应用剂量使用，优选比临床应用剂量更低。

本发明第四方面提供了在有需要的受试者中治疗肿瘤和/或癌症的方法，其包括给所述受试者施用有效量的本发明第一方面任一项所述脂质药物组合物。

本发明第五方面提供以下式I化合物：

根据本发明第五方面的式I化合物，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第五方面的式I化合物，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第五方面的式I化合物，其中p为1至6的整数，或者p为1至5的整数，或者p为1至4的整数，或者p为2。

根据本发明第五方面的式I化合物，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数，p为1至4的整数。

根据本发明第五方面的式I化合物，其为以下式Ia化合物：

本发明第六方面提供以下式9化合物：

根据本发明第六方面的式9化合物，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第六方面的式9化合物，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第六方面的式9化合物，其中p为1至6的整数，或者p为1至5的整数，或者p为1至4的整数，或者p为2。

根据本发明第六方面的式9化合物，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数，p为1至5的整数。

根据本发明第六方面的式9化合物，其为以下式9a化合物：

本发明第七方面提供以下式4化合物：

或其盐，其中n为5至500的整数，m为2至12的整数。

根据本发明第七方面的式4化合物，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第七方面的式4化合物，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第七方面的式4化合物，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数。

根据本发明第七方面的式4化合物，其为以下式4a化合物：

本发明第八方面提供了制备本发明第六方面所述式9化合物的方法，其包括以下步骤：

(i)在适宜的催化剂(例如DCC)存在下，在适宜的有机溶剂(例如氯仿)中，使下式所示端炔基的羧酸与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)反应，

得到含端炔基的式6化合物(在本文可称为端炔基DSPE)：

(ii)使以下式4化合物步骤(i)所得式6化合物反应，

得到以下式9化合物(在本文可简称为PEOz-DSPE)：

其中，其中n为5至500的整数，m为2至12的整数，p为1至8的整数。

根据本发明第八方面的方法，其中所述步骤(i)的反应是在30-75℃(例如40-60℃，例如约50℃)下进行5-25小时(例如8-20小时，例如10-15小时，例如约12小时)。

根据本发明第八方面的方法，其中所述步骤(ii)的反应是在配体(例如PMDETA)存在下进行的。

根据本发明第八方面的方法，其中所述步骤(ii)的反应是在试剂(例如CuBr)存在下进行的。

根据本发明第八方面的方法，其中所述步骤(ii)的反应是在30-75℃(例如40-60℃，例如约50℃)下进行15-150小时(例如30-120小时，例如50-100小时，例如约72小时)。

根据本发明第八方面的方法，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第八方面的方法，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第八方面的方法，其中p为1至6的整数，或者p为1至5的整数，或者p为1至4的整数，或者p为2。

根据本发明第八方面的方法，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数，p为1至5的整数。根据本发明第八方面的方法，其中n为10至100的整数，m为4至8的整数，p为1至4的整数。

根据本发明第八方面的方法，其中所述式4化合物(在本文中可称为PEOz)是通过包括以下步骤的方法制备的：

(ia)在试剂(例如NaI)存在下，在有机溶剂(例如DMF)中，使式

所示化合物与叠氮化钠反应，得到式

化合物；

(ib)在试剂(例如三乙胺和/或三甲胺盐酸盐)存在下，在有机溶剂(例如氯仿)中，使式

化合物与对甲苯磺酰氯反应，得到式化合物；

(ic)在有机溶剂(例如乙腈)中，使式

化合物与式

的单体反应，然后充入氨气以中止反应，得到以下式4化合物：

其中，X为卤素(例如氟、氯、溴、碘，优选氯)，n为5至500的整数，m为2至12的整数。

本发明第九方面提供了制备本发明第五方面所述式I化合物的方法，其包括以下步骤：

(a)在有机溶剂(例如三乙胺和/或DMSO)中，在催化剂(例如DCC)存在下，使叶酸与下式N-羟基丁二酰亚胺(NHS)反应，得到以下式8的叶酸活化酯(在本文可简称为F-NHS)：

(b)在碱(例如三乙胺)存在下，在有机溶剂(例如DMSO)中，使式8化合物与以下式9化合物反应，

得到式I化合物：

和任选的

(c)使所得式I化合物纯化和/或成盐，

其中n为5至500的整数，m为2至12的整数，p为1至8的整数。

根据本发明第九方面的方法，其中n为10至250的整数，或者n为10至200的整数，或者n为10至150的整数，或者n为10至125的整数，或者n为10至100的整数，或者n为15至75的整数，或者n为15至65的整数。

根据本发明第九方面的方法，其中m为3至10的整数，或者m为4至8的整数，或者m为5至8的整数，或者m为6。

根据本发明第九方面的方法，其中p为1至6的整数，或者p为1至5的整数，或者p为1至4的整数，或者p为2。

根据本发明第九方面的方法，其中n为10至250的整数，m为2至8的整数，p为1至5的整数。

本发明第十方面提供本发明第五方面所述式I化合物或者本发明第六方面所述式9化合物在制备给药载体中的用途。

根据本发明第十方面的用途，其中所述式I化合物或式9化合物是作为所述给药载体的脂质组分之一应用的。

根据本发明第十方面的用途，其中所述给药载体是pH敏感型给药载体。

根据本发明第十方面的用途，其中所述给药载体是具有肿瘤靶向性能的给药载体。

根据本发明第十方面的用途，其中所述给药载体是pH敏感型并且具有肿瘤靶向性能的给药载体。

根据本发明第十方面的用途，其中所述给药载体是含有或不含有药物活性成分的给药载体。在一个实施方案中，所述给药载体含有活性成分。在一个实施方案中，所述药物活性成分是抗肿瘤药物。

根据本发明第十方面的用途，其中所述给药载体是脂质体。在一个实施方案中，所述给药载体是pH敏感型主动靶向脂质体。在一个实施方案中，所述给药载体是叶酸受体介导的pH敏感型主动靶向脂质体。

本发明第十一方面提供一种给药载体，其中包含本发明第五方面所述式I化合物或者本发明第六方面所述式9化合物，以及任选的药物活性成分。

根据本发明第十一方面的给药载体，其中所述式I化合物或式9化合物是作为所述给药载体的脂质组分之一。

根据本发明第十一方面的给药载体，其是pH敏感型给药载体。

根据本发明第十一方面的给药载体，其是具有肿瘤靶向性能的给药载体。

根据本发明第十一方面的给药载体，其是pH敏感型并且具有肿瘤靶向性能的给药载体。

根据本发明第十一方面的给药载体，其中含有或不含有药物活性成分。在一个实施方案中，所述给药载体含有活性成分。在一个实施方案中，所述药物活性成分是抗肿瘤药物(例如阿霉素)。在一个实施方案中，本发明给药载体含有40～90(优选60-70)摩尔份的磷脂类、20～38摩尔份的胆固醇和2～10摩尔份的式I化合物或式9化合物。在一个实施方案中，本发明给药载体含有磷脂类、胆固醇和式I化合物或式9化合物三者的总量为70-99(优选80-99，优选80-98，优选90-98)重量份，阿霉素1-30(优选1-20，优选2-20，优选2-10)重量份。

根据本发明第十一方面的给药载体，其是脂质体。在一个实施方案中，所述给药载体是pH敏感型主动靶向脂质体。在一个实施方案中，所述给药载体是叶酸受体介导的pH敏感型主动靶向脂质体。

本发明第十二方面提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防疾病的方法，其包括给所述受试者施用本发明第十一方面任一项所述的给药载体，其中所述给药载体含有有效量的药物活性成分。在一个实施方案中，所述疾病是肿瘤或癌症疾病。在一个实施方案中，所述药物活性成分是抗肿瘤药物(例如阿霉素)。

在本发明的任一方面，其中任一实施方案中的任意一个或多个技术特征可以组合到该个方面的另一实施方案中或者组合到其它方面的任一实施方案中，只要这种组合不会相互矛盾；当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。另外，对于在本发明任一方面使用的术语，其含义同样适用于其它方面。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

如本文所述的，术语“药物组合物”，其还可以是指组合物，可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症或不良健康状况。此外，如本文所述的，术语“脂质药物组合物”，是指一种药物组合物，其中含有脂质类成分，包括但不限于本文所述的磷脂类、胆固醇、和式I化合物或式9化合物。本领域技术人员理解，本发明的脂质药物组合物、药物组合物或组合物可以是包裹有药物(例如阿霉素)的脂质体，也可以是未包含药物的空白脂质体，其在临床应用之前与药物(例如阿霉素)混合而成含药脂质体。

如本文所述的，术语“受试者”，亦可指“患者”，其通常是指哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中有效实现治疗、预防、缓解、减轻、消除相关疾病及其并发症的剂量。

如本文所述的，术语“给药载体”，亦可称为“给药系统”，组成该给药载体的重要成分之一是脂质成分，例如本发明获得的具有亲水部分和疏水部分的聚合物修饰的磷脂，例如本发明获得的具有亲水部分和疏水部分并且包含靶官能基的聚合物修饰的磷脂，以及例如本领域技术人员公知的其它磷脂类成分。所述给药载体可以是脂质微球给药系统(例如脂微球)、脂质体给药系统(例如单室脂质体、多室脂质体、多相脂质体)、脂质囊泡给药系统等。该给药载体可以是含药的，亦可以是不含药但是临用时将药物与该给药载体混合从而使药物掺入该给药载体中。此外，本发明的给药载体还可含有其它的药学可接受的赋形剂，例如支架剂。例如，在一个实施方案中，本发明给药载体是通过类似于以下方法制备的：使磷脂类、胆固醇、和式I化合物或式9化合物形成脂质体水悬液；加入赋形剂(例如甘露醇)；冷冻干燥，得到不含药的空白给药载体；在临用前将溶解有药物(例如阿霉素)的溶液(例如水溶液、氯化钠注射液配制的溶液)加入到上述空白给药载体中，使药物包裹进入在脂质体中，从而可供临床使用。

在本发明中，提及阿霉素时，其包括阿霉素本身以及阿霉素的任何药学可接受的盐，例如盐酸，它们在本发明中均可表示为DOX。在一些具有具体上下文含义的情况下，如未另外声明，提及阿霉素均是指盐酸阿霉素。

在本发明中，提及PEOz-DSPE是指PEOz与DSPE的结合物，即如本发明的式9化合物；提及F-PEOz-DSPE时是指在上述PEOz与DSPE的结合物上连接有叶酸，即如本发明的式I化合物；提及PEG-DSPE时是指PEG与DSPE的结合物，例如PEG₂₀₀₀-DSPE是指分子量2000的PEG与DSPE的结合物。

如本文所述的，术语“pH敏感”，例如在说明本发明“给药载体是pH敏感型给药载体”时，是指所指代的物质在不同pH条件下具有不同的性质，例如在弱酸性条件下包含在该给药载体中的活性成分比之于在中性pH条件下更容易释放。

如本文所述的，术语“肿瘤靶向性能”，例如在说明本发明“给药载体是具有肿瘤靶向性能的给药载体”时，是指所指代的物质具有导向到相关组织部位的性能，例如在用包含叶酸部分的本发明式I化合物制备的给药载体给药后，因具有叶酸官能团而可使该给药载体通过叶酸受体介导而主动靶向到相关的组织器官例如肿瘤部位。

本发明主旨之一在于叶酸受体介导的pH敏感型阿霉素主动靶向脂质体的制备及应用。

现有技术中，一些研究合成的含有PEOz嵌段的脂质体载体材料只局限于其单端连有其它功能基团，而PEOz的pH敏感性应用于脂质体的研究很少，更没有关于通过特定官能团将F-PEOz-DSPE三者连接起来以实现本发明目的的教导。

本发明的一个目的是提供一种脂质体载体材料叶酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(F-PEOz-DSPE)的合成方法。

本发明的另一目的是提供一种以F-PEOz-DSPE为脂质体载体材料制备含药(例如阿霉素)的靶向脂质体的方法。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一个实施方案提供如下式I所示结构的新型脂质体载体材料F-PEOz-DSPE：

其中n、m、p如上文所述。

在一个实施方案中，本发明提供了以下式Ia化合物：

其中n、m、p如上文所述。

本发明另一个实施方案提供制备式I化合物的方法。在一个特定的实施方案中，提供了以下式Ia化合物的制备方法：

其中n、m、p如上文所述。

具体而言，以式Ia化合物为例，本发明提供式Ia化合物的合成方法可包括以下步骤：

步骤一：通过两步取代反应制备引发剂6-叠氮-1-对甲苯磺酸己酯(化合物3)，如下反应式所示：

使6-氯-1-己醇(化合物1)与叠氮化钠反应得到6-叠氮-1-己醇(化合物2)，6-叠氮-1-己醇再与对甲苯磺酰氯反应得到6-叠氮-1-对甲苯磺酸己酯；

步骤二：用6-叠氮-1-对甲苯磺酸己酯引发2-乙基-2-噁唑啉(EOz)阳离子开环聚合反应，生成一端氨基、一端叠氮的聚(2-乙基-2-噁唑啉)(化合物4a)，如下反应式所示：

控制单体和引发剂的投料比，可生成不同聚合度的聚合物，本发明已示例性地合成了聚合度(n)分别为18、32和64三种聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz)；

步骤三：通过羧酸与胺的缩合酰化反应制备端炔基二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(化合物6)，如下反应式所示：

用4-戊炔酸与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE，化合物5)反应生成端炔基DSPE(化合物6)；

步骤四：通过酯化反应制备叶酸活化酯(化合物8)，如下反应式所示：

使叶酸(化合物7)与N-羟基丁二酰亚胺反应生成叶酸活化酯(化合物8)；

步骤五：通过“点击(Click)”化学反应，实现步骤二、三中制备的一端氨基、一端叠氮的PEOz和端炔基DSPE相连接，生成PEOz-DSPE(化合物9a)，如下反应式所示：

步骤六：通过酰化反应，实现步骤四、五中制备的叶酸活化酯和PEOz-DSPE相连接，生成F-PEOz-DSPE(化合物Ia)，如下反应式所示：

PEOz的分子量与引发剂和单体的比例、反应时间、反应温度和体系中的水分有关。本发明人先在70℃、反应24h的条件下进行预反应，转化率为60％左右。据此按照三种引发剂和单体的不同比例投料，并适当延长反应时间，控制体系中的水分含量，示例性地合成了分子量分别为1900、3300、6500三种聚合物(聚合度n分别为18、32、64)。

现有的一些研究合成的含有PEOz嵌段的载体材料只局限于其单端连有其它功能基团。本发明成功地将聚合物PEOz的双端连有不同的功能基团，这为实现本发明目的打下了重要基础。本发明首先合成端叠氮基的引发剂，引发阳离子开环聚合反应，用氨气/乙腈溶液终止反应，生成一端为叠氮、一端为氨基的聚合物PEOz，再先后与端炔基的DSPE和叶酸发生反应，生成目标化合物。其中PEOz与DSPE的反应利用了“点击化学”的原理，通过叠氮和端炔基发生1，3-偶极环加成反应将二者连接，因为PEOz和DSPE的分子量都较大，端叠氮和端炔基之间的反应比小分子之间的反应更难进行，因此在本发明的一个实例中将反应温度提高到50℃，反应时间延长到72h，得到PEOz-DSPE。该反应具有很强的选择性，对氨基端没有影响，避免了副反应的发生。本发明惊喜地发现可以将“点击化学”应用到脂质体材料的合成中。

在一个实施方案中，本发明提供了用本发明合成的F-PEOz-DSPE制备阿霉素脂质体的方法。该方法例如可以是通过以下方式进行：

首先，将氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)、和本发明合成的PEOz-DSPE(即式9或式9a的化合物)或F-PEOz-DSPE(即式I或式Ia的化合物)或用于对照的PEG2000-DSPE按薄膜分散法进行制备，即可得到任选具有叶酸靶向性的pH敏感型脂质体药物载体；其中，在该脂质体药物载体中，优选的，各组分按照摩尔份计，可以包含：

应当理解，在本文中，以上(1)、(2)、(3)三者可统称为“总脂质”或“脂质混合物”；并且以上(1)、(2)、(3)三者混合物或者此三者经处理所形成的脂质体药物载体，亦可称为“总脂质”或“脂质混合物”。当然，本领域技术人员理解，短语“此三者经处理所形成的脂质体药物载体”是指三种成分经过脂质体制备过程后所获得的“脂质体药物载体”，该“脂质体药物载体”可以另外还包括其它组分，而在提及“此三者经处理所形成的脂质体药物载体”时，术语“总脂质”是指该脂质体中的上述(1)、(2)、(3)三者。例如短语“总脂质量”是指“脂质体药物载体”中上述(1)、(2)、(3)三者的量之和，而脂质体中的其它成分不计入“总脂质量”中。

然后，将具有水溶性的阿霉素与上述制得的脂质体药物载体(即)按硫酸铵密度梯度法进行载药脂质体的制备，可得到任选具有叶酸靶向性的pH敏感型的阿霉素脂质体或者阿霉素对照脂质体。在一个优选的实施方案中，在由此得到的脂质体中，包含：

(a)	抗肿瘤药物(例如阿霉素)	1～30重量份、和
			(b)	总脂质(即以上(1)、(2)、(3)三者之和)	70～99重量份；

优选地，包含：

(a)	抗肿瘤药物(例如阿霉素)	1～20重量份、和
			(b)	总脂质(即以上(1)、(2)、(3)三者之和)	80～99重量份；

优选地，包含：

(a)	抗肿瘤药物(例如阿霉素)	2～20重量份、和
			(b)	总脂质(即以上(1)、(2)、(3)三者之和)	80～98重量份；

优选地，包含：

(a)	抗肿瘤药物	2～10重量份、和
			(b)	总脂质(即以上(1)、(2)、(3)三者之和)	90～98重量份。

因此，例如，在本发明第七方面的给药载体的一个实施方案中，该给药载体包含如下摩尔比组成的总脂质：

由此，再例如在本发明第七方面的给药载体的一个实施方案中，该给药载体包含：

(a)药物活性成分(例如抗肿瘤药物，例如阿霉素)，和

(b)如下摩尔比组成的总脂质：

并且其中所述(a)药物活性成分与(b)总脂质的重量为：

在一个实施方案中，给药载体(例如为载药脂质体)除了包括以上(a)药物活性成分与(b)总脂质之外，还可以包括其它药物活性成分和其它药学可接受的形剂，例如水、氯化钠溶液、葡萄糖溶液等。

在一个实施方案中，本发明的给药载体是一种脂质体药物制剂，其中各组分按照以下重量百分比组成：

其中在所述混合物中，各组分摩尔比为：

本领域技术人员理解，术语“重量份”是一种重量单位，其可以是微克、毫克、克、千克等。类似地，术语“摩尔份”是一种摩尔量单位，其可以是微摩尔、毫摩尔、摩尔等。

在一个实施方案中，本发明提供了pH敏感型的(主动靶向)脂质体的制备方法，其大体上可以包括以下步骤：

首先，将所述各脂质组分(例如磷脂、胆固醇、本发明的式I或式9化合物)用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加(NH₄)₂SO₄溶液至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液，用高压均质机将混悬液通过聚碳酸酯滤膜；即得空白脂质体；

然后，称取阿霉素，溶于水中，将水溶液加入至空白脂质体中，加热振摇即得本发明的pH敏感型的(主动靶向)脂质体。

在一个实施方案中，本发明提供了pH敏感型的(主动靶向)脂质体的制备方法，其具体地可以包括以下步骤：

(1)按以下重量份取各组分：阿霉素1-30重量份(优选1-20，优选2-20，优选2-10重量份)、脂质混合物(氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和PEOz-DSPE(或F-PEOz-DSPE或PEG₂₀₀₀-DSPE))70-99重量份(优选80-99，优选80-98，优选90-98重量份)，该脂质混合物中，三类成分的摩尔比为：氢化大豆卵磷脂60～70摩尔份、胆固醇20～38摩尔份、PEOz-DSPE(或F-PEOz-DSPE或PEG-DSPE)2～10摩尔份；

(2)将上述各组分用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜(温度为10-50℃，优选为20-40℃，更优选为约35℃)。将250mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液(pH＝4.5-6.5，优选为pH＝5.0-6.0，优选pH约为5.5)加至脂膜中，超声分散(温度为40-80℃，优选为50-70℃，更优选为约65℃，超声分散5-60min，优选10-30min，更优选约20min)，得空白脂质体混悬液。用高压均质机将空白脂质体混悬液连续通过孔径在200nm、100nm、80nm的聚碳酸酯滤膜(优选为各滤5次，65℃下挤压)，得硫酸铵溶解的空白脂质体溶液。采用湿法灌注填充层析柱，连续灌入葡聚糖凝胶G-25，用10％蔗糖溶液洗脱层析柱(用5-20个柱体积，优选为10个柱体积)，加入硫酸铵溶解的空白脂质体溶液(优选为，流速＝1ml/min)，收集乳白色的含有脂质体的液体，用5％葡萄糖溶液洗脱层析柱(用5-20个柱体积，优选为10个柱体积)。另精密称取阿霉素适量，溶于10％蔗糖溶液中，将此溶液加入至收集空白脂质体溶液中，于热水浴中放置(优选65℃，30min～60min)，不时振摇，将包裹了药物的脂质体加入层析柱，用5％葡萄糖溶液洗脱，以除去未包裹到脂质体内部的阿霉素，收集流出液，即得阿霉素脂质体。

经检测，上述方法所制备的脂质体(分别采用三种材料PEOz-DSPE或F-PEOz-DSPE或PEG₂₀₀₀-DSPE)的粒径均在90～200nm之间，药物包封率均在85％～98％之间。

本发明成功的利用阳离子开环聚合反应和“点击”化学反应制备了三种不同分子量的叶酸一聚(2-乙基-2-噁唑啉)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(F-PEOz-DSPE)脂质体载体材料。实验证明，用本发明示例性合成的聚合度分别为18、32、64的PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE制备的脂质体有良好的粒径分布和较高的包封率。在体外实验中，F-PEOz-DSPE脂质体比PEOz-DSPE脂质体和PEG-DSPE脂质体表现出更强的肿瘤靶向性，并未见明显的细胞毒性。

附图说明

图1为PEOz的核磁共振氢谱

图2是端炔基DSPE的核磁共振碳谱

图3是端炔基DSPE的高效液相色谱图

图4是PEOz(图4a)和PEOz-DSPE(图4b)的红外图谱

图5是PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE的紫外图谱

图6是F-PEOz-DSPE的凝胶渗透色谱图

图7是F-PEOz-DSPE的核磁共振氢谱

图8描绘了三种脂质体在pH 7.4和pH 5.0的磷酸盐缓冲液中的累积释放率变化曲线。各图中，纵坐标为累积释放百分数(％)，横坐标为释放时间(小时)。其中图8A是PEG-DSPE脂质体的释放曲线，图8B是PEOz-DSPE脂质体的释放曲线，图8C是F-PEOz-DSPE脂质体的释放曲线。

图9描绘了三种脂质体对SKOV3细胞(图9A)和A549细胞(图9B)的体外药效学评价结果。各图中，纵坐标为抑制率(％)，横坐标为孵育时间(小时)。在图9A中，左侧DOX处的柱表示的是未经脂质体包裹的阿霉素对细胞的抑制率；在0.25、0.5、1、2、4、12、24、或48h的时间点处，各自从左至右的3个柱分别表示包药脂质体PEG-DSPE、PEOz-DSPE、F-PEOz-DSPE对细胞的抑制率；在图9B中，各柱含义与在图9A相同。

图10A 描绘了不同膜材不同浓度的脂质体对细胞摄入的影响。

图10B 描绘了不同膜材的脂质体在不同温度下脂质体对细胞摄入的影响。

图10C 描绘了不同膜材在不同孵育时间下细胞对脂质体摄入的影响。

图10D 描绘了流式分析细胞对不同脂质体的摄入。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。在本发明中，如未另外说明，药物包封率是用经典的葡聚糖凝胶柱分离法测定的，脂质体粒径使用粒径仪测定。

A、实施例部分：制备F-PEOz-DSPE

实施例1至7为F-PEOz-DSPE(以式Ia化合物为例)的合成实例。

实施例1：6-叠氮-1-己醇(化合物2)的制备

如上式，在干燥的250mL三口烧瓶中加入6-氯-1-己醇(化合物1)10g(73mmol)、NaN₃14.3g(220mmol)、NaI 1.1g(7.3mmol)和干燥过的100mLDMF，80℃油浴下搅拌反应18h。反应结束后，减压旋蒸至干，加乙酸乙酯200mL稀释，分别用水和饱和食盐水洗涤两次，K₂CO₃干燥有机相，抽滤，滤液减压浓缩至干得无色液体10.02g，收率为95％。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：1.30-1.71(m，8H)；3.28(t，2H)；3.65(t，2H)。

实施例2：引发剂6-叠氮-1-对甲苯磺酸己酯(化合物3)的制备

如上式，在干燥的500mL单口烧瓶中加入6-叠氮-1-己醇(化合物2)10g(70mmol)、三乙胺20mL(145mmol)、三甲胺盐酸盐1.3g(13.5mmol)和300mL干燥过的氯仿，搅拌溶解，冰浴下逐滴加入对甲苯磺酰氯20g(105mmol)的60mL干燥CHCl₃溶液，0～5℃反应1h后再于室温反应1h，反应液减压旋蒸浓缩，水洗至有机层无色，无水CaCl₂干燥有机相，抽滤，滤液减压旋蒸至干，得无色液体。粗品经硅胶色谱柱分离纯化(洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶30)，得纯品为无色液体10.39g，产率50％。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：1.27(m，4H)；1.41-1.61(m，4H)；2.46(s，3H)；3.23(t，2H)；4.02(t，2H)；7.34(d，2H)；7.79(d，2H)。

核磁共振氢谱(未图示)表明端羟基已经转化成对甲苯磺酸酯。此外，在红外图谱(未图示)中可以看到在2097cm^-1处有叠氮的特征吸收峰。核磁共振氢谱和红外图谱说明合成的端叠氮引发剂结构与预期结构相同。

实施例3：聚(2-乙基-2-噁唑啉)(化合物4a)的制备

如上式，向引发剂(化合物3)中加入适量甲苯，经两次共沸蒸馏以除去残留的水分。向连接在真空线上的三个Schlenk瓶中分别加入EOz单体8.5mL(84mmol)和乙腈25mL，氮气下分别加入引发剂(化合物3)0.620mL(2.5mmol)，0.310mL(1.3mmol)，0.155mL(0.63mmol)(按三种不同分子量设计，分别标为1，2，3号瓶)。将Schlenk瓶密封后70℃下反应，1、2号瓶各反应24h，3号瓶反应48h。将1、2、3瓶连在真空线上通入高纯氮气，冰浴下分别加入NH₃/乙腈溶液(将氨气鼓入乙腈中，分子数比值为1∶16)23.6mL、11.8mL、5.9mL，室温下反应24h，用于终止反应。之后分别加入K₂CO₃ 25g(181mmol)，室温下搅拌24h，用于除去对甲苯磺酸。反应完毕后，抽滤除去K₂CO₃，旋转蒸发除去溶剂，少量氯仿溶解，逐滴加到乙醚中沉淀产物2次，抽滤，真空干燥后得白色固体6.33g、5.08g、4.66g，产率分别为76％、61％、56％(编号为PEOz1、PEOz2和PEOz3)。

聚合物PEOz的表征及分子量的测定：

图1为PEOz的¹H NMR谱图，化学位移δ＝1.13处是侧链上的甲基(-CH₃)质子峰；δ＝2.44处是由侧链上亚甲基(O＝C-CH₂-)质子引起的；主链上亚甲基(-CH₂-CH₂-N-)质子峰出现在δ＝3.57处。此外，在红外图谱中可以看到在2099cm^-1处有叠氮的特征吸收峰，1639cm^-1为叔酰胺(O＝C-N-)的特征峰。以上说明合成的聚合物结构与设计相符。

为测定聚合物的分子量，将三种聚合物(PEOz1、PEOz2和PEOz3)分别与化合物1-乙酰基-2-硝基-4-丙炔基氧基-5-甲氧基苯发生“Click”(“点击”)反应，利用¹H NMR谱图中苯环上的H与重复单元上的H的积分比计算出聚合物的分子量和按转换率计算出的分子量如表1显示，用¹H NMR的计算结果作为聚合物的分子量，聚合度分别为18、32和64。

“Click”反应

表1 PEOz分子量的测定结果

实施例4：端炔基DSPE(化合物6)的制备

如上式，称取4-戊炔酸0.8g(8.2mmol)和DCC 1.2g(5.8mmol)溶解于50mL干燥过的CHCl₃中，室温下活化4h，加入200μL吡啶和DSPE(化合物5)(3g，4mmol)的50mL CHCl₃溶液，50℃加热反应12h，抽滤除去副产物DCU，有机相水洗3～5次，无水NaSO₄干燥2h，旋转蒸发至干燥，真空干燥12h，得白色固体2.48g，产率为75％。

端炔基DSPE的表征

ESI-MS：m/z 826.6[M-H]^-，红外图谱(未图示)中2300cm^-1处为端炔基(H-C≡C-)的伸缩振动特征峰。

¹³C NMR(400MHz，CDCl₃，)δ：173.41(m)；83.12(l)；69.75(k)；69.13(j)；62.11(i)；35.12(h)；34.24(f)；32.75(g)；31.90(e)；29.41(c)；25.12(d)；22.84(b)；14.12(a)(如图2)。

HPLC：Diamond C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为水∶甲醇＝70∶30，流速1.0mL/min；检测波长242am；柱温30℃；进样量20μL。高效液相色谱图见图3，t＝10.784min处为端炔基DSPE的色谱峰，峰面积比为96.94％，可见本实施例获得的端炔基DSPE具有较高纯度。

实施例5：叶酸活化酯(化合物8，F-NHS)的制备

如上式，称取叶酸(化合物7))5g(11.3mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)1.3g(11.3mmol)置于100mL反应瓶中，加入三乙胺25mL，DMSO 40mL，避光通氮气10min，待叶酸完全溶解后加入DCC 2.5g(12.1mmol)，避光室温反应24h。抽滤除去DCU，滤液滴入400mL乙酸乙酯中，产生黄色沉淀，抽滤，用乙醇洗涤滤饼两次，用30mL DMSO溶解滤饼，再滴入300mL乙醚中沉淀产物，抽滤，真空干燥12h，得棕红色固体4.51g，产率为74％。

叶酸(F)¹H NMR(300MHz，D₂O/NaOD)δ：8.01(1H)；7.20(2H)；6.17(2H)；3.98(2H)；3.87(1H)；2.04(2H)；1.751.70(2H)。

F-NHS ¹H NMR(300MHz，D₂O/NaOD)δ：8.16(1H)；7.26(2H)；6.18(2H)；4.15(2H)；4.05(1H)；2.30(4H)；2.10(2H)；1.85 1.80(2H)。δ＝2.30处对应的4个H为连在叶酸上的琥珀酰亚胺环上的H。红外图谱中1726cm^-1处为新生成酯(-C(＝O)O-)的特征峰，综上判断叶酸活化酯结构正确。

实施例6：PEOz-DSPE(化合物9a)的制备

如上式，取PEOz1、PEOz2和PEOz3(化合物4a)各500mg放入聚合管中，分别加入端炔基DSPE(化合物6)400mg(0.48mmol)、250mg(0.30mmol)、140mg(0.17mmol)，并分别加入配体PMDETA(ρ＝0.829g/mL)110μL、69μL、38μL，CHCl₃各2mL。经两次“液氮冷却-抽真空-解冻”循环操作后，通入高纯氮气，分别加入CuBr 72mg(0.5mmol)、45mg(0.3mmol)、25mg(0.17mmol)，抽真空，再进行一次“液氮冷却-抽真空”操作，真空下封管，50℃下反应72h。反应停止后，分别滴入乙醚中沉淀产物，过滤，固体用水溶解，离心(3800rpm×5min)，重复3次，除去不溶物，合并水溶液，冻干。得到浅绿色固体(少量铜盐最后透析时除)447mg、447mg、477mg，产率分别为63％、72％和85％。

测试以上制备的PEOz-DSPE的氢谱(未图示)和红外谱。在¹H NMR(400MHz)图谱中，δ＝7.96处有微弱的“Click”信号峰，为新生成的三氮唑环上的质子峰，δ＝1.17为DSPE碳长链上的质子峰。其红外图谱(如图4b，图4a是PEOz的红外图谱)中2099cm^-1处的叠氮特征峰消失，说明了叠氮和炔基之间发生了“Click”反应，即通过1，3-偶极环加成反应生成三氮唑将PEOz与DSPE连接，生成PEOz-DSPE。

经溶解性测定，以折算成DSPE的摩尔数计，PEOz1-DSPE、PEOz2-DSPE、PEOz3-DSPE在水(20℃)中的溶解度均是DSPE的10倍以上。

实施例7：F-PEOz-DSPE(化合物Ia)的制备

如上式，分别称取PEOz1-DSPE 300mg(0.11mmol)、PEOz2-DSPE 200mg(0.05mmol)、PEOz3-DSPE 300mg(0.04mmol)(化合物9a)于三个反应瓶中，分别加入F-NHS(化合物8)180mg(0.33mmol)、80mg(0.15mmol)、66mg(0.12mmol)；三乙胺900μL、400μL、240μL；DMSO各1.5mL，避光通氮气10min，50℃避光反应72h。反应结束后，分别滴入到乙醚中沉淀出，过滤，用氯仿将固体溶解，过滤，得黄色滤液，旋转蒸发除去溶剂，用少量水溶解，在蒸馏水中透析(MwCO 1000)两天，冷冻干燥，分别得淡黄色固体F-PEOz1-DSPE 165mg、F-PEOz2-DSPE 160mg、F-PEOz3-DSPE 184mg，产率分别为55％、80％、61％。

F-PEOz-DSPE的表征

分别测试PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE在THF中的紫外吸收，如图5显示，PEOz-DSPE的最大吸收峰在244nm处；F-PEOz-DSPE的最大吸收峰出现在256nm和290nm处，而这也是叶酸的特征吸收峰。分别用示差检测(IR)和双波长检测的方法测其凝胶渗透色谱图(色谱柱：Waters Styragel HR柱1×10⁴，1×10³，和

孔径；溶剂：THF；流速：1mL/min；柱温：35℃)，如图6所示，产物峰出现在22.5min处。

图7显示了F-PEOz-DSPE的核磁共振氢谱，¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：8.70(1H)；7.70(2H)；6.71(2H)；4.45(2H)；4.25(1H)为连接在聚合物上的叶酸的质子峰，δ＝8.00(1H)为三氮唑环上的质子峰，δ＝3.35，2.28和0.94为聚合物重复单元的质子峰，δ＝1.26为DSPE中碳长链的质子峰。以上测试的产物结构与预计F-PEOz-DSPE的结构相符。

实施例8：制备m为4或8的式I化合物

参考实施例1-7的方法，在实施例1中分别以4-氯-1-丁醇和8-氯-1-辛醇为起始物质，在实施例3中采用获得n＝32的反应条件，制得n＝32、m＝4、和p＝2的式I化合物，和n＝32、m＝8、和p＝2的式I化合物。所得化合物经实施例1-7类似方法进行表征和性能测定，结果构构与设计的相符。

实施例9：制备p为1或4的式I化合物

参考实施例1-7的方法，在实施例4中分别以3-丁炔酸和6-庚炔酸为起始物质，在实施例3中采用获得n＝18的反应条件，制得n＝18、m＝6、和p＝1的式I化合物，和n＝18、m＝6、和p＝4的式I化合物。所得化合物经实施例1-7类似方法进行表征和性能测定，结果构构与设计的相符。

B、药物组合物的制备例部分：制备含药的脂质药物组合物或给药载体

制备例1；膜材中含PEG ₂₀₀₀ -DSPE的阿霉素脂质体的制备

各组分的用量：阿霉素2-10重量份；脂质混合物(氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和PEG₂₀₀₀-DSPE的混合物)90-98重量份，该脂质混合物中，氢化大豆卵磷脂60-70摩尔份，胆固醇20-38摩尔份；和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)2-10摩尔份。

采用硫酸铵密度梯度法制备，用高压均质机控制粒径得空白脂质体。另称取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至收集空白脂质体溶液中，于热水浴中放置(优选65℃，30min～60min)，不时振摇，将包裹了药物的脂质体加入层析柱，用5％葡萄糖溶液洗脱，以除去未包裹到脂质体内部的阿霉素，收集流出液，即得含PEG₂₀₀₀-DSPE阿霉素脂质体。

以阿霉素10重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇20摩尔份、和PEG₂₀₀₀-DSPE 10摩尔份的混合物)90重量份投料比制备脂质体，以该脂质体进行试验例部分的研究。以阿霉素2重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂60摩尔份、胆固醇38摩尔份、和PEG₂₀₀₀-DSPE 2摩尔份的混合物)98重量份投料比制备脂质体。以阿霉素5重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和PEG₂₀₀₀-DSPE 5摩尔份的混合物)95重量份投料比制备脂质体。这些用PEG制备的脂质体类同于商业化的PEG化DSPE脂质体。

以上三种投料比制得的脂质体粒径在90～200nm之间，药物包封率在85％～98％之间。

制备例2：膜材中含PEOz-DSPE的阿霉素脂质体的制备

各组分的用量：阿霉素2～20重量份；脂质混合物(氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和PEOz-DSPE(实施例6制得，聚合度n分别为18、32、64)的混合物)80-98重量份，该脂质混合物中，氢化大豆卵磷脂60-70摩尔份，胆固醇20-38摩尔份；和聚(2-乙基-2-噁唑啉)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEOz-DSPE，聚合度分别为18、32、64)2-10摩尔份。

参照制备例1的制备方法，取适量氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和PEOz-DSPE(聚合度分别为18、32、64)同法操作，制得含PEOz-DSPE阿霉素脂质体(聚合度分别为18、32、64)。

以阿霉素10重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇20摩尔份、和PEOz-DSPE(n＝18)10摩尔份的混合物)90重量份投料比制备脂质体，以该脂质体进行试验例部分的研究。以阿霉素2重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂60摩尔份、胆固醇38摩尔份、和PEOz-DSPE(n＝32)2摩尔份的混合物)98重量份投料比制备脂质体。以阿霉素5重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和PEOz-DSPE(n＝64)5摩尔份的混合物)95重量份投料比制备脂质体。以阿霉素20重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和PEOz-DSPE(n＝64)5摩尔份的混合物)80重量份投料比制备脂质体。

以上各种投料比制得的脂质体粒径在90～200nm之间，药物包封率在85％～98％之间。

制备例3：膜材中含F-PEOz-DSPE的阿霉素脂质体的制备

各组分的用量：阿霉素2-20重量份；脂质混合物(氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和F-PEOz-DSPE(实施例7制得，聚合度n分别为18、32、64)的混合物)80-98重量份，该脂质混合物中，氢化大豆卵磷脂60-70摩尔份，胆固醇20-38摩尔份；和叶酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(F-PEOz-DSPE，聚合度分别为18、32、64)2-10摩尔份。

参照制备例1的制备方法，取适量氢化大豆卵磷脂、胆固醇、和F-PEOz-DSPE(聚合度分别为18、32、64)同法操作，制得含F-PEOz-DSPE阿霉素脂质体(聚合度分别为18、32、64)。

以阿霉素10重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇20摩尔份、和F-PEOz-DSPE(n＝18)10摩尔份的混合物)90重量份投料比制备脂质体，以该脂质体进行试验例部分的研究。以阿霉素2重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂60摩尔份、胆固醇38摩尔份、和F-PEOz-DSPE(n＝64)2摩尔份的混合物)98重量份投料比制备脂质体。以阿霉素5重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和F-PEOz-DSPE(n＝32)5摩尔份的混合物)95重量份投料比制备脂质体。以阿霉素20重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和F-PEOz-DSPE(n＝32)5摩尔份的混合物)80重量份投料比制备脂质体。以阿霉素30重量份和脂质混合物(氢化大豆卵磷脂65摩尔份、胆固醇30摩尔份、和F-PEOz-DSPE(n＝32)5摩尔份的混合物)70重量份投料比制备脂质体。

C、试验例部分：脂质体的药物组合物或给药载体的性能考察

试验例1、盐酸阿霉素脂质体pH敏感性的测定方法

1、试药：上文制备例1、2、3分别制得的第一种脂质体(即由10份阿霉素和90份脂质混合物制得的脂质体)，分别记为PEG-DSPE、PEOz-DSPE、F-PEOz-DSPE；pH 7.4的PBS(磷酸二氢钾，0.05M，pH 7.4)，pH 5.0的PBS(磷酸二氢钠，0.05M，pH 5.0)。

2、试验方法：精密吸取三种盐酸阿霉素脂质体各1mL装入透析袋(MWCO：1000)中，分别置于100mL的pH 7.4和pH 5.0磷酸盐缓冲液中，将六个烧杯放入旋转式恒温振荡器中，37℃下振摇(40r/min)。定时(15min，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h)取出各烧杯中的释放介质0.5mL，同时补充相应量的新鲜释放介质。用HPLC法测定各时间点释放介质中的药物含量，计算累积释放度，绘制释放曲线。

3、试验结果：三种脂质体在pH 7.4和pH 5.0的磷酸盐缓冲液中，48h内累积释放率变化曲线分别如图8A、图8B、图8C所示。结果表明，PEG-DSPE脂质体在两种pH条件下释药没有明显差异，48h内累积释放率达到50％左右(见图8A)。PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE脂质体在pH 7.4的释放介质中释药速率与PEG-DSPE脂质体的释放曲线相似，48h内累积释放率达到50％左右；但是它们在pH 5.0的释放介质中释药速率明显快于在pH 7.4释放介质中的释药速率，并且在48h内累积释放率达到约100％(见图8B和图8C)，可见PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE两种脂质体显示出明显的pH敏感性。这种性质有利于药物在肿瘤组织以及内含体等弱酸性环境下释放，可以解决PEG脂质体在靶部位沉积且释放缓慢的问题，提高药物疗效，减少用药量。

试验例2、脂质体体外药效评价

1、试药：上文制备例1、2、3分别制得的第一种脂质体(即由10份阿霉素和90份脂质混合物制得的脂质体)，分别记为PEG-DSPE、PEOz-DSPE、F-PEOz-DSPE

2、试验方法：

为考察本发明脂质体的叶酸受体(FR)靶向性，在本试验例中，选取FR(+)的卵巢癌细胞系SKOV3细胞和FR(-)的肺腺癌细胞系A549细胞进行脂质体的体外细胞实验，以验证脂质体的靶向性和有效性。其中FR(+)表示叶酸受体阳性，即高表达叶酸受体，FR(-)表示叶酸受体阴性，即低表达叶酸受体。

由于本试验中使用的两种细胞对药物的敏感性不同，在进行对脂质体毒性和药效评价前，需要测定阿霉素(在本文如未另外注明，本发明所用试药阿霉素指其盐酸盐，可表示为DOX)对两种癌细胞的有效浓度。本试验将杀死80％癌细胞的DOX浓度作为有效药物浓度，即要测定DOX对两种细胞的IC₈₀。该结果将为后续毒性评价和药效评价提供依据。经测定不同浓度的盐酸阿霉素对SKOV3和A549两种细胞的抑制率，结果IC₈₀(SKVO3)＝12.5μg/mL；IC₈₀(A549)＝100μg/mL。另外经测定，三种空白脂质体(参考上文制备例1、2、3分别制得的第一种脂质体制备，但不加药物阿霉素)不会影响两种癌细胞的生长，对其没有毒性作用，对包裹DOX的脂质体的药效作用评价没有影响。

根据药敏试验结果，选择两种细胞(SKOV3，A549)的IC₈₀作为给药浓度，用MTT法来检测三种上文制备例1、2、3分别制得的第一种脂质体(即由10份阿霉素和90份脂质混合物制得的脂质体，分别记为PEG-DSPE、PEOz-DSPE、F-PEOz-DSPE)对不同肿瘤细胞的杀伤效果。

细胞培养方法同药敏试验；配制一定浓度的载药脂质体，使其中所含药物浓度符合两种细胞系的IC₈₀(SKOV3：12.5μg/mL；A549：100μg/mL)；将配制好的三种载药脂质体(PEG-DSPE、PEOz-DSPE、F-PEOz-DSPE)分别与两种细胞系共同孵育，孵育15min、30min、1h、2h、4h、12h、24h、48h后，用普通培养基替换原本含有载药脂质体的培养基继续培养细胞。每个时间段均设置5个平行对照孔，同时设置同等药物浓度下不含脂质体的裸药组作为阳性对照，同等脂质体浓度下的空白脂质体作为阴性对照以及未做任何处理的空白对照；以上所有实验组在培养48h后，统一用MTT法检测细胞活性，计算药物对细胞生长的抑制率，并对各组数据进行统计分析。

3、试验结果：三种载药脂质体对SKOV3和A549两种癌细胞的杀伤效果如图9A和图9B所示，PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE两种脂质体的癌细胞抑制率明显高于商业化的PEG-DSPE脂质体，且在最初的1h内尤为明显，这与三种脂质体体外释放试验结果一致，PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE脂质体在酸性环境下会有药物突释现象，进一步证明了PEOz嵌段可以产生pH敏感性。PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE两种脂质体对FR(-)的A549细胞的杀伤效果没有明显差异，而对于FR(+)的SKOV3细胞，含有叶酸基团的F-PEOz-DSPE脂质体在12h后体现出靶向性，杀伤效果明显高于没有靶向基团的PEOz-DSPE脂质体。

以上这些试验例的实验表明，三种空白脂质体对细胞的生长几乎没有影响，不干扰载药脂质体的药效检测结果；PEOz-DSPE和F-PEOz-DSPE两种脂质体表现出优于商业化PEG-DSPE脂质体的癌细胞抑制作用，可见PEOz嵌段体现出的pH敏感性有利于药物在癌细胞内发挥作用，提高药物对癌细胞的抑制作用，从而提高药物疗效；F-PEOz-DSPE脂质体体现出叶酸靶向性，对FR(+)的SKOV3细胞的抑制作用强于无靶向的PEOz-DSPE脂质体，而对FR(-)的A549细胞则不表现靶向性，这种叶酸靶向性不仅可以提高药物对FR㈩肿瘤组织的疗效，同时还能减少药物对其它组织和器官的毒副作用。

试验例3、F-PEOz--DSPE脂质体的生物学特性

1、试验方法：用SKOV3细胞，体外检测其对各叶酸脂质体的细胞摄入情况。叶酸脂质体利用25-NBD-胆固醇进行标记，可发散绿色荧光，在荧光显微镜下观察。与试验例1和2所用试药不同，本试验例3使用参考实施例1-7和制备例1-3的方法，制备三种不加活性成分的空白脂质体作为试药：

(1)P2000脂质体(在本试验中可简称P2000)：参考制备例3的方法，不加阿霉素，以氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇15摩尔份、25-NBD-胆固醇5摩尔份、和PEOz1-DSPE(实施例6制备)10摩尔份的投料比制备脂质体。

(2)F-P2000脂质体(在本试验中可简称F-P2000)：参考制备例3的方法，不加阿霉素，以氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇15摩尔份、25-NBD-胆固醇5摩尔份、和F-PEOz1-DSPE(实施例7制备)10摩尔份的投料比制备脂质体。

(3)F-P3000脂质体(在本试验中可简称F-P2000)：参考制备例3的方法，不加阿霉素，以氢化大豆卵磷脂70摩尔份、胆固醇15摩尔份、25-NBD-胆固醇5摩尔份、和F-PEOz2-DSPE(实施例7制备)10摩尔份的投料比制备脂质体。

2、不同浓度的脂质体对细胞摄入的影响：将SKOV3与各种配制成不同浓度的脂质体在37℃下孵育2小时，荧光显微镜下观察细胞摄入的情况，结果见图10A。从上图中可以看出，细胞的荧光强度(图中耀斑)随脂质体浓度的增加而增强，而在相同浓度下F-P2000和F-P3000两组的荧光强度明显高于P2000组。说明脂质体浓度的增加可以增强细胞对脂质体的摄入，而叶酸靶向的脂质体在浓度相等的条件下也可以显著提高细胞对脂质体的摄入。后续实验选用200uM浓度的脂质体进行。

3、不同温度条件下对细胞摄入脂质体的影响：将SKOV3细胞在4℃和37℃条件下分别孵育1小时，荧光显微镜下观察，结果见图10B，发现细胞在4℃条件下难以摄入脂质体，而在37℃条件下可以正常摄入脂质体而使细胞发出绿色荧光(图中耀斑)，且荧光强度在叶酸靶向脂质体F-P2000和F-P3000中比P2000明显更高，说明受体介导的叶酸靶向增加了细胞对叶酸脂质体的摄入。

4、不同孵育时间下细胞对脂质体摄入的影响：将SKOV3与各脂质体在37℃下分别孵育不同时间后在显微镜下观察，结果见图10C。发现细胞的荧光强度(图中耀斑)对孵育时间的延长而逐渐增强，且F-P2000和F-P3000在20分钟以后被细胞摄入的量明显比P2000组高，显示了良好的受体介导的靶向摄入。

5、流式分析细胞对不同脂质体的摄入：将SKOV3分别与各种脂质体孵育不同时间后，用胰酶消化后分散成单细胞悬液，利用流式细胞分析细胞发散的绿色荧光强度，结果见图10D，图中三个试药组的4个柱图，从左至右分别为5min、15min、30min和50min的孵育时间。从图中可见，荧光强度数值随孵育时间的延长而增强，在孵育15分钟后，F-P2000和F-P3000组细胞的荧光强度均明显高于P2000组，并随着孵育时间的延长显著增强。

本发明示例性地合成出三种不同聚合度的聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz)，并与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和叶酸通过化学键连接起来，意在合成出同时具有肿瘤靶向性和pH敏感性的高选择性脂质体载体材料。PEOz具有很好的水溶性和生物相容性，毒性低且具有温度敏感性和pH敏感性，其pH敏感性可以促进药物在肿瘤组织中的释放。已有报道的大多数研究是用PEOz嵌段作为胶束的载体材料，研究胶束的性质，证实了其pH敏感性，而将这种性质用于脂质体的研究目前还很少。本发明通过特别的方法将PEOz嵌段作为脂质体载体材料中的亲水性部分，一端连有靶向基团，一端连有疏水部分，合成出新型脂质体载体材料F-PEOz-DSPE，其具有肿瘤靶向性和pH敏感性而可作为一种优良的脂质体材料。