CN102517241B - 一种含有d型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备含D型赖氨酸的蛋白质和多肽的方法：在表达性质粒的特定酶切多克隆位点引入了目的蛋白的表达基因，并且将所述表达基因的目的位点突变成为TAG密码子；在该表达性质粒的另一个特定酶切多克隆位点引入ph氨酰tRNA合成酶的序列，得到重组质粒；制备pAC-ph△-AK3质粒；由pAC-ph△-AK3质粒和重组质粒共转染到宿主中，得到表达系统；在培养基中添加D型赖氨酸，诱导上述表达系统表达目的蛋白，纯化得到目的蛋白。利用来源于Pyrococcushorikoshii的赖氨酰tRNA合成酶、抑制型tRNA分子对对D型赖氨酸能专一选择琥珀密码子TAG的特性在双羰基还原酶中定点引入D型赖氨酸，引入效率接近100%，具有广泛的应用价值。

Description

一种含有D型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备含有D型氨基酸的蛋白质和/或多肽的方法。

背景技术

在蛋白质和多肽中引入非天然氨基酸使其获得新的性质是一种已经广泛运用于蛋白质多肽类药物修饰和制备生物材料等领域的策略。现今能够在蛋白质多肽中引入非天然氨基酸的方法主要包括3种： 

(1) 多肽固相合成法。Merrifield首先采用的多肽固相分步合成方法将D型氨基酸与精氨酸类似物引入到促黄体素释放素中（参见：Science. 1965; 150:178-85.）。该方法能在小于100个残基的多肽中任意位置引入非天然氨基酸。但是具有仅限于合成小于100个氨基酸残基的短肽和需要繁琐的保护和去保护等步骤等缺点。

(2) 体外蛋白质翻译。Larisa M等利用S30体外蛋白质翻译系统在二氢叶酸还原酶和荧光素酶中成功引入D-Met and D-Phe（参见：J. Am. Chem. Soc. 2003 ; 125:6616-7.）。但是该方法具有效率低、成本高和不能放大等缺点。

(3) 遗传密码扩充方法。Schultz 等人通过在活细胞中定向进化外源的tRNA和氨酰tRNA合成酶分子对，将一系列的L型非天然氨基酸通过活细胞的核糖体蛋白合成系统引入到蛋白质中（参见：Science. 2001;292:498-500.）。通过该非天然氨基酸引入技术获得了一系列具有新性质的蛋白质已经广泛的应用于相关领域，如：1. 在蛋白中引入带荧光氨基酸用于细胞内相关蛋白定位；2.引入带酮基团的非天然氨基酸用于点击化学的研究；3. 引入含酮基和叠氮基团的非天然氨基酸用于蛋白质多肽药物的定点修饰。4. 引入带乙酰、甲基等非天然氨基酸用于模拟细胞内乙酰化和甲基化等翻译后修饰。

虽然遗传密码扩充技术能定点在任意大小的蛋白中引入100多种L型非天然氨基酸，相比前人的技术有重大的突破，但是该技术还是不能满足人们希望通过改变氨基酸手性来定点修饰和改造蛋白质和多肽的要求。因此，开发一种有效地在任意大小的蛋白中引入D型氨基酸的方法为定点修饰蛋白质和多肽类药物、研究老年疾病的病理、制备新型的生物材料和定点修饰改变蛋白质的空间结构等领域均具有重大意义。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种大肠杆菌原核表达系统，利用该大肠杆菌原核表达系统可在双羰基还原酶的任意位点引入D型赖氨酸，为制备含D型赖氨酸的多肽和/或蛋白质提供了新的方法。

本发明的原理为：通过在大肠杆菌细胞中表达一对来源于Pyrococcus horikoshii的赖氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA的分子对，通过氯霉素抑制实验和蛋白质水解及手性高效液相分析等方法证明了该分子对在含D型赖氨酸培养基中对D型赖氨酸的偏好，并利用这种偏好性在双羰基还原酶的非活性位点定点引入了D型赖氨酸，引入效率接近100%。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种大肠杆菌原核表达系统，所述大肠杆菌原核表达系统含有带有p15A复制子的pAC-ph△-AK3质粒和带有ColE1复制子的pETDuet-T2^DK-DKR质粒。

上述技术方案中，pAC-ph△-AK3质粒由pACYC184改造得到：pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列。pAC-ph△-AK3能编码来源于Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA分子对，其中赖氨酰tRNA合成酶由谷氨酰胺tRNA合成酶启动子和终止子调控表达，抑制型tRNA由lpp启动子和rrnC终止子调控表达；除此之外，氯霉素乙酰转移酶的112位天冬氨酸密码子突变成为琥珀密码子TAG以检测Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对的表达情况。具体地，pAC-ph△-AK3质粒具有SEQ ID No.1 所述核苷酸序列。

上述技术方案中，pETDuet-T2^DK-DKR由质粒pETDuet-1 改造得到：在第一个多克隆位点引入了双羰基还原酶突变体的序列，106位到143位替换成了双羰基还原酶突变体的序列，第二个多克隆位点引入了ph氨酰tRNA合成酶的序列，298位到354位序列替换成为ph氨酰tRNA合成酶的序列。pETDuet-T2^DK-DKR的第一个多克隆位点连接有第二位带琥珀突变的DKR基因；第二个多克隆位点连接有Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶(ph tRNARS) 的基因；两段基因都由T7promoter 启动并受乳糖操纵子调控表达。优选地，所述pETDuet-T2^DK-DKR质粒包含以下四个特点：(1) 编码的双羰基还原酶的基因第二个密码子由ACC突变成为琥珀密码子TAG，(2) 双羰基还原酶突变基因的N端添加了His6的标签，(3) 双羰基还原酶的突变基因构建到pETDuet-1的第一个多克隆位点，并在T7promoter启动下由乳糖操纵子调控表达。(4) pETDuet-1的第二个多克隆位点添加ph tRNARS的基因来增强ph tRNARS的表达以提高赖氨酰tRNA合成酶分子对的抑制效率。具体地， pETDuet-T2^DK-DKR质粒具有SEQ ID No.2 所述核苷酸序列。

pACYC184和pETDuet-1是商品化的载体，tRNA和tRNA合成酶的序列可参见公开号为US 2006/0177900的美国专利申请公开说明书，具体地，tRNA的序列请参见SEQ ID No.3所示；tRNA合成酶的序列请参见SEQ ID No.4所示。

上述技术方案中，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述技术方案中，所述大肠杆菌原核表达系统由pAC-ph△-AK3质粒和pETDuet-T2^DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞得到。

本发明同时要求保护利用上述大肠杆菌原核表达系统制备含有D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的方法，包括以下步骤：

(1) 在培养基中添加D型赖氨酸，异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导上述大肠杆菌原核表达系统表达，高压破碎，离心取上清；

(2) 采用亲和层析和阴离子交换层析结合的方法纯化上清液得到含D型氨基酸的双羰基还原酶。

上述利用大肠杆菌原核表达系统制备含有D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的方法具体包括以下步骤：

(1) 将pAC-ph△-AK3质粒 和pETDuet-T2^DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞，平板涂布于含4μg/ml 四环素、40μg/ml的氨苄青霉素、20μg/ml的氯霉素的LB平板上37℃培养18～20小时，挑取平板上单菌落于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的LB液体培养基37度培养约20小时；将培养液转接于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的M9液体培养基使其最终OD约为0.1，然后37度培养30小时，转接于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的M9液体培养基使其最终OD约为0.3，37度培养6小时 (OD₆₀₀=0.6) 后加入D型赖氨酸和异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，100mM）37度诱导30小时后，离心收集菌体；

(2) 将离心收集的菌体和0.05M的PH8.0的磷酸钠缓冲液按照质量体积比为1∶5稀释，高压破碎，离心收集上清，利用亲和层析和阴离子交换层析的方法进行纯化即可得到纯的含D型氨基酸的双羰基还原酶突变体。

上述技术方案中，所述D型氨基酸为D型赖氨酸。

上述技术方案中，所述双羰基还原酶是指专利号为200710135391.8的中国发明专利公开的双羰基还原酶。

发明人将上述肠杆菌原核表达系统在含有D型赖氨酸的M9培养基中培养，发现1.2、2.4、3.6、5mM D型赖氨酸不会对菌体造成毒性反而能一定程度上促进菌体生长；除此之外，随着D型氨基酸浓度由1.2mM 增高到5mM时，菌体的氯霉素抗性也随之升高；其中，当培养基中D型赖氨酸的量为3.6mM时，菌体耐氯霉素最高(340μg/ml)；培养基中不添加D型赖氨酸时耐氯霉素较低(120μg/ml)。这两个实验初步证明了该非天然氨基酸引入系统能在蛋白中定点引入D型赖氨酸；随后发明人通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，100μM） 对该菌体诱导、高压破碎，离心取上清，利用亲和层析和阴离子交换层析的方法进行纯化即可得到纯的含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体。

纯化后的双羰基还原酶突变体在10N HCl 110℃水解24小时，旋转蒸干，0.05M PH8.0的磷酸钠缓冲液溶解，与荧光衍生化试剂NBD-F衍生化后上手性高效液相分析，与野生型双羰基还原酶阴性对照相比，双羰基还原酶突变体水解物能检测到明显的D型赖氨酸的峰。经过峰面积计算，D型赖氨酸的插入量为115±3%。

本发明同时适用于其他位点引入，只需将蛋白的表达基因的任意位点突变成为TAG密码子即可实现在其它位点D型赖氨酸的引入。例如，在双羰基还原酶的222位引入D型赖氨酸，只需简单将pETDuet-T2^DK-DKR中的双羰基还原酶基因的222位的TGG密码子定点突变成TAG密码子，利用本发明中所述操作即可获得在222位点含有D型赖氨酸的双羰基还原酶的突变体。本发明同时适用于在其他蛋白中引入D型赖氨酸，只需将pETDuet-T2^DK-DKR中第一个多克隆位点的双羰基还原酶基因替换成所需引入D型赖氨酸的蛋白的表达基因即可。例如，如需在氯霉素乙酰转移酶中引入D型赖氨酸，只需将pETDuet-T2^DK-DKR中双羰基还原酶的基因序列替换成氯霉素乙酰转移酶的基因序列，并在想要引入D型赖氨酸位置的密码子突变成TAG密码子，利用本发明中所述操作即可获得含有D型赖氨酸的氯霉素乙酰转移酶的突变体。

因此，本发明同时要求保护一种在目的蛋白中引入D型赖氨酸的方法，包括以下步骤：

(1) 在表达性质粒的特定酶切多克隆位点引入了目的蛋白的表达基因，并且将所述表达基因的目的位点突变成为TAG密码子；在该表达性质粒的另一个特定酶切多克隆位点引入ph氨酰tRNA合成酶的序列，得到重组质粒；将pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列，得到pAC-ph△-AK3质粒；由pAC-ph△-AK3质粒和重组质粒共转染到宿主中，得到表达系统；

(2) 在培养基中添加D型赖氨酸，诱导上述表达系统表达目的蛋白，纯化得到目的蛋白。

上述技术方案中，所述宿主选自但不局限于：细菌、酵母、植物细胞、动物细胞。

本发明所涉及的策略、方法和技术同时适用于其它D-型天然或非天然氨基酸，并且所引入的蛋白质在来源、大小、性质和结构等方面均无限制。其策略包括：（1）利用在培养本发明所述的大肠杆菌原核表达系统的培养基中添加一定浓度的D型赖氨酸，检测其生长情况，（2）监测在本发明所述的大肠杆菌原核表达系统的氯霉素抗性。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．本发明的方法适用于任意大小的蛋白质中引入D型赖氨酸；能在蛋白质的任意残基位置定点引入D型赖氨酸；D型赖氨酸引入效率接近100%；因此该方法具有普遍适用性，对D型氨基酸及所引入的蛋白质和多肽均无限制。

2. 该方法所需D型赖氨酸价格低廉，成本较低。

附图说明

图1是本发明实施例一中5mM D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化菌生长的影响；

图2是本发明实施例一中1.2、2.4、3.6mM D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化菌生长的影响；

图3是本发明实施例二中1.2、2.4、3.6、5mM D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化菌氯霉素耐受性的影响；

图4是本发明实施例三中含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的表达纯化SDS-PAGE图谱；

图5是本发明实施例五中含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的酸水解和衍生物手性高效液相分析。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：D型赖氨酸对含pAC-ph△-AK3转化菌生长的影响

首先制备一种大肠杆菌原核表达系统，所述大肠杆菌原核表达系统含有带有p15A复制子的pAC-ph△-AK3质粒和带有ColE1复制子的pETDuet-T2^DK-DKR质粒。

上述技术方案中，pAC-ph△-AK3质粒由pACYC184改造得到，，带有p15A复制子：pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列。pAC-ph△-AK3能编码来源于Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA（tRNA^Lys）分子对，其中赖氨酰tRNA合成酶由谷氨酰胺tRNA合成酶启动子和终止子调控表达，抑制型tRNA由lpp启动子和rrnC终止子调控表达；除此之外，氯霉素乙酰转移酶的112位天冬氨酸密码子突变成为琥珀密码子TAG以检测Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对的表达情况。具体地，pAC-ph△-AK3质粒具有SEQ ID No.1 所述核苷酸序列。

上述技术方案中，pETDuet-T2^DK-DKR由质粒pETDuet-1 改造得到：在第一个多克隆位点引入了双羰基还原酶突变体的序列，106位到143位替换成了双羰基还原酶突变体的序列，第二个多克隆位点引入了ph氨酰tRNA合成酶的序列，298位到354位序列替换成为ph氨酰tRNA合成酶的序列。pETDuet-T2^DK-DKR的第一个多克隆位点连接有第二位带琥珀突变的DKR基因；第二个多克隆位点连接有Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶(ph tRNARS) 的基因；两段基因都由T7promoter 启动并受乳糖操纵子调控表达。优选地，所述pETDuet-T2^DK-DKR质粒包含以下四个特点：(1) 编码的双羰基还原酶的基因第二个密码子由ACC突变成为琥珀密码子TAG，(2) 双羰基还原酶突变基因的N端添加了His6的标签，(3) 双羰基还原酶的突变基因构建到pETDuet-1的第一个多克隆位点，并在T7promoter启动下由乳糖操纵子调控表达。(4) pETDuet-1的第二个多克隆位点添加ph tRNARS的基因来增强ph tRNARS的表达以提高赖氨酰tRNA合成酶分子对的抑制效率。具体地， pETDuet-T2^DK-DKR质粒具有SEQ ID No.2 所述核苷酸序列。

pACYC184和pETDuet-1是商品化的载体，tRNA和tRNA合成酶的序列可参见公开号为US 2006/0177900的美国专利申请公开说明书，具体地，tRNA的序列请参见SEQ ID No.3所示；tRNA合成酶的序列请参见SEQ ID No.4所示。

上述技术方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述技术方案中，所述大肠杆菌原核表达系统由pAC-ph△-AK3质粒和pETDuet-T2^DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞得到。

将pAC-ph△-AK3和pETDuet-T2^DK-DKR两个质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含4μg/ml 四环素、20μg/ml的氯霉素的平板上，37℃培养约30小时，挑取共转化平板上的单菌落于带有四环素和氯霉素的LB液体培养基中培养20小时、取LB培养液稀释到带有四环素和氯霉素的M9培养基中使得其OD₆₀₀约为0.1，37℃培养约30小时，转接到含1.2、2.4、3.6、5mM的D型赖氨酸的、含有2种抗生素的M9培养基约40小时，期间每隔2小时取培养液测OD₆₀₀值。从生长曲线(图1，图2)可以看出3.6、5mM的D型赖氨酸能在对数生长期促进细胞的生长，而1.2mM和2.4mM的D型赖氨酸不会抑制菌体生长。图1中的球形折线代表5mM的D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化大肠杆菌，方形折线代表空白对照，图2中的方形折线代表代表3.6 mM的D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化大肠杆菌，球形折线图代表1.2M的D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化大肠杆菌，菱形折线图代表2.4M的D型赖氨酸对pAC-ph△-AK3转化大肠杆菌。

实施例二：D型赖氨酸对含pAC-ph△-AK3转化菌氯霉素耐受性的影响。

将pAC-ph△-AK质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含4μg/ml 四环素、20μg/ml的的平板上，37℃培养约30小时，挑取共转化平板上的单菌落于带有四环素、氯霉素的LB液体培养基中培养20小时、取LB培养液稀释到带有四环素、氯霉素的M9培养基中使得其OD₆₀₀约为0.2，37℃培养约30小时，含有不同浓度梯度（1.2、2.4、3.6、5mM）的D型赖氨酸下，转接到0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360 μg/ml的氯霉素浓度梯度的M9培养基中，其中不含氯霉素的为对照组。培养约30小时后测量其OD₆₀₀值，计算。从氯霉素抑制曲线可以看出（如图3所示），菌体的氯霉素耐受性随着培养基中的D型赖氨酸浓度增加而增强。由此，我们可以得出结论，赖氨酰tRNA合成酶和抑制性tRNA在M9培养基中对D型赖氨酸有很高的选择性。

实施例三：含D型赖氨酸双羰基还原酶突变体的表达与纯化

D型赖氨酸的定点引入系统是由包含有pAC-ph△-AK3和pETDuet-T2^DK-DKR两个质粒的共转化大肠杆菌BL21(DE3)构成的。两个质粒分别带有相容的复制子p15A和ColE1，其中pAC-ph△-AK3编码来源于Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶(ph tRNARS)和抑制性tRNA，pETDuet-T2^DK-DKR 含有双羰基还原酶的突变基因，其中pETDuet-T2^DK-DKR质粒包含以下四个特点：(1) 编码的双羰基还原酶的基因第二个密码子由ACC突变成为琥珀密码子TAG，(2) 双羰基还原酶突变基因的N端添加了His6的标签，(3) 双羰基还原酶的突变基因构建到pETDuet-1的第一个多克隆位点，并在T7promoter启动下由乳糖操纵子调控表达。(4) pETDuet-1的第二个多克隆位点添加ph tRNARS的基因来增强ph tRNARS的表达以提高赖氨酰tRNA合成酶分子对的抑制效率。将pAC-ph△-AK3 和pETDuet-T2^DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞，平板涂布于含4μg/ml 四环素、40μg/ml的氨苄青霉素、20μg/ml的氯霉素的LB平板上37度培养约20小时，挑取单菌落于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的LB液体培养基37度培养约20小时后转接于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的M9液体培养基使其最终OD约为0.1，37度培养30小时，转接于含四环素、氨苄青霉素、氯霉素的M9液体培养基使其最终OD约为0.3，37度培养6小时 (OD₆₀₀=0.6) 后加入D型赖氨酸和IPTG (100mM) 37度诱导30小时后，离心收集菌体。

将离心收集的菌体和0.05M的PH8.0的磷酸钠缓冲液按照质量体积比为1:5稀释，高压破碎，离心收集上清。将25ml上清和Ni-NTA柱材4度静态吸附过夜后，先用破碎缓冲液洗脱10个柱体积，随后采用含10、50、100、200、500mM 咪唑的0.05M PH8.0磷酸钠缓冲液分别洗脱5个柱体积，收集100、200mM咪唑洗脱组分、浓缩，取样测酶活，SDS-PAGE检测。将镍柱洗脱收集液上阴离子交换层析纯化，其洗脱液组成为：A泵：0.05M的PH8.0的磷酸钠缓冲液，B泵：0.05M的pH8.0的磷酸钠缓冲液含1M的NaCl。由紫外检测器监测洗脱液在280nm的紫外吸收。洗脱条件为：0 -30%的盐浓度线性梯度洗脱15个柱体积，在盐浓度为14.2%时目的蛋白被洗脱。收集目的蛋白洗脱液，浓缩，取样测酶活，SDS-PAGE检测。纯化结果如图4所示：泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为诱导后菌体破碎上清，泳道3为浓缩后的Ni-NTA纯化后的洗脱液，泳道4为浓缩后的阴离子交换层析纯化收洗脱液。

实施例四：含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的酸水解和衍生化

取3mg含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体蛋白在30ml 10N 盐酸中110度水解24小时，旋转蒸干，溶解于500μl PH 8.0的磷酸钠缓冲液（也可为0.1M的PH 8.0的硼酸钠缓冲液）。取50μl 溶解液和30μl 50mM NBD-F溶液混合，60度加热5分钟后加入1%的乙酸乙醇溶液920μl终止反应。

实施例五：含D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体水解产物的NBD-F衍生物的手性高效液相分析

高效液相仪为Shimadzu SCL-2010A，手性分析柱为OD-RH手性柱，流动相组成为：A泵为含1‰ TFA的蒸馏水，B泵为含1‰ TFA的乙腈。紫外检测器的检测波长为470nm。洗脱条件：35%-40%的B泵线性梯度洗脱150分钟后40%B泵维持10min。如图5所示，和D,L型赖氨酸衍生物相比，双羰基还原酶突变体蛋白水解衍生物图谱中113.3分钟出现D型赖氨酸的峰。而在野生型突变体蛋白的对照组没有出现D型赖氨酸的峰。证明D型赖氨酸仅在双羰基还原酶的第二位置定点插入。经过峰面积计算对比L型赖氨酸和D型赖氨酸的峰面积，D型赖氨酸在第二位的插入量为115±3%。

核苷酸和/或氨基酸序列表

 

<110> 中国药科大学

<120> 一种含有D型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

 

<210> 1

<211> 5447

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 1

gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt        60

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt       120

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga       180

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga       240

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt       300

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc       360

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat       420

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt       480

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg       540

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact       600

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa       660

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc       720

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc       780

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa       840

agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc       900

agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc       960

tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc      1020

gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac      1080

tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt      1140

gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt      1200

agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg      1260

tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt      1320

cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc      1380

aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttggtaa gatctcgaac      1440

gatcaaaaat aagtgccttc ccatcaaaaa aatattctca acataaaaaa ctttgtgtaa      1500

tacttgtaac gctacatgga gattaactca atctagctag aggaattcgg gcccgagcca      1560

gccggagagc ggcgggccaa acccgcaggc gcgggcaaac ccgccgggcc cgccactgca      1620

gcttcgtgtc atccttagcg aaagctaagg attttttttg catgcaaccg gtaagatctc      1680

gaacgatcaa aaataagtgc cttcccatca aaaaaatatt ctcaacataa aaaactttgt      1740

gtaatacttg taacgctaca tggagattaa ctcaatctag ctagaggaat tcgggcccga      1800

gccagccgga gagcggcggg ccaaacccgc aggcgcgggc aaacccgccg ggcccgccac      1860

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tctcgaacga tcaaaaataa gtgccttccc atcaaaaaaa tattctcaac ataaaaaact      1980

ttgtgtaata cttgtaacgc tacatggaga ttaactcaat ctagctagag gaattcgggc      2040

ccgagccagc cggagagcgg cgggccaaac ccgcaggcgc gggcaaaccc gccgggcccg      2100

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tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg tgtatgaaat      2220

ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta ggcataggct      2280

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gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg      3120

ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca      3180

tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc      3240

ttaccagcct aacttcgatc actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg      3300

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cacgcggcgc atgggcccta taagatcata cgccgttata cgttgtttac gctttgagga      3600

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gagaaggaga agtacgttgt tgagagtgga ataacgccaa gtggttacgt tcacgttggg      3720

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tatggaaagg aagctccgtt atctttaatg tatgagtttg ttggaattaa ggggcagaag      4440

gggaagatga gtggtagtaa gggaaatgtt attttactca gcgatctgta tgaggttctt      4500

gagccaggtc tcgttagatt tatctacgct cggcataggc caaacaagga gataaagata      4560

gatctaggtc ttggcattct aaacctctac gatgagttcg ataaagttga gagaatatac      4620

ttcggggttg agggtggtaa aggtgatgat gaagaattaa ggaggactta cgagctttca      4680

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gcgtgatcat atcgtcaatt attacctcca cggggagagc ctgagcaaac tggcctcagg      4800

catttgagaa gcacacggtc acactgcttc cggtagtcaa taaaccggta aaccagcaat      4860

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tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga      5100

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tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg      5340

tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg      5400

tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacg                    5447

 

<210> 2

<211> 7252

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 2

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag        60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccagatga ccggcatcac       120

gaatgtcacc gttctcggaa ccggcgtgct gggttcgcag atcgcgttcc agaccgcgtt       180

ccacggcttc gccgtcaccg cgtacgacat caacaccgac gcgctcgacg ccgccaagaa       240

gcgcttcgag ggcctcgcgg ccgtgtacga gaaggaggtc gcgggcgctg cagacggcgc       300

cgcgcagaag gcgctgggcg gcatccgcta ctccgacgac ctggcgcagg ccgtgaagga       360

cgccgacctc gtcatcgagg ccgtgccgga gagcctcgac ctcaagcgcg acatctacac       420

gaagctgggc gagctggcgc cggcgaagac gatcttcgcc accaactcct ccaccctgct       480

gccgagcgac ctggtcggct acaccggccg gggcgacaag ttcctcgccc tgcacttcgc       540

caaccacgtg tgggtgaaca acaccgccga ggtgatgggc acgacgaaga ccgaccccga       600

ggtgtaccag caggtcgtcg agttcgcctc cgcgatcggg atggtgccga tcgagctgaa       660

gaaggagaag gcgggctacg tgctcaactc cctcctcgtc ccgctgctgg atgcggcggc       720

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ctacatcgac aaaggcaagc tgggcctcgc gaccggcgag ggcttctacc ggtactgaag       960

cttgcggccg cataatgctt aagtcgaaca gaaagtaatc gtattgtaca cggccgcata      1020

atcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccccatctta      1080

gtatattagt taagtataag aaggagatat acatggttca ttgggccgat tatattgctg      1140

ataaaataat tagagagagg ggggagaagg agaagtacgt tgttgagagt ggaataacgc      1200

caagtggtta cgttcacgtt gggaacttta gggagctttt tacagcttat attgtgggcc      1260

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ttagtgaagt tcctgatccc tggggatgcc atgagagtta tgctgaacac ttcatgagaa      1440

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tctacaagag aggggaatat tctgaggaga taaggttagc ctttgagaaa agggataaga      1560

taatggagat actaaacaag tatagggaaa ttgcgaaaca acctcccctt ccagagaact      1620

ggtggcccgc aatggtttac tgccctgagc ataggaggga agcagagatc attgaatggg      1680

atgggggctg gaaggttaag tataagtgcc ccgaaggtca cgagggatgg gttgatataa      1740

ggagtgggaa cgtgaaactg aggtggcgtg ttgattggcc catgcgttgg tctcactttg      1800

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gaaaggagat tataaaggaa gtttatggaa aggaagctcc gttatcttta atgtatgagt      1920

ttgttggaat taaggggcag aaggggaaga tgagtggtag taagggaaat gttattttac      1980

tcagcgatct gtatgaggtt cttgagccag gtctcgttag atttatctac gctcggcata      2040

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tcgataaagt tgagagaata tacttcgggg ttgagggtgg taaaggtgat gatgaagaat      2160

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cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt      2340

gctgaaagga ggaactatat ccggattggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta      2400

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tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta      2820

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ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt      3000

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat      3060

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag      3120

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct      3180

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt      3240

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tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat      3480

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac      3540

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aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt      3660

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt      3720

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa      3780

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatcatga ttgaagcatt      3840

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa      3900

ataggtcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt      3960

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<210> 3

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工合成

 

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ctttttacag cttatattgt gggccatgcc ctaagggata aggggtatga ggttaggcac       240

atccacatgt gggatgatta tgatagattt aggaaggttc caaggaacgt tccccaggaa       300

tggaaagatt acctgggaat gcccattagt gaagttcctg atccctgggg atgccatgag       360

agttatgctg aacacttcat gagaaagttc gaggaggagg tagaaaaatt agggatcgaa       420

gttgactttc tttatgcgag tgaactctac aagagagggg aatattctga ggagataagg       480

ttagcctttg agaaaaggga taagataatg gagatactaa acaagtatag ggaaattgcg       540

aaacaacctc cccttccaga gaactggtgg cccgcaatgg tttactgccc tgagcatagg       600

agggaagcag agatcattga atgggatggg ggctggaagg ttaagtataa gtgccccgaa       660

ggtcacgagg gatgggttga tataaggagt gggaacgtga aactgaggtg gcgtgttgat       720

tggcccatgc gttggtctca ctttggcgtt gacttcgaac ctgctggaaa ggatcatctt       780

gtggctggtt caagctacga tacgggaaag gagattataa aggaagttta tggaaaggaa       840

gctccgttat ctttaatgta tgagtttgtt ggaattaagg ggcagaaggg gaagatgagt       900

ggtagtaagg gaaatgttat tttactcagc gatctgtatg aggttcttga gccaggtctc       960

gttagattta tctacgctcg gcataggcca aacaaggaga taaagataga tctaggtctt      1020

ggcattctaa acctctacga tgagttcgat aaagttgaga gaatatactt cggggttgag      1080

ggtggtaaag gtgatgatga agaattaagg aggacttacg agctttcata aagaaacagc      1140

aaacaatcca aaacgccgcg ttcagcggcg ttttttctgc ttttctacgc gt              1192

Claims (7)

1.一种大肠杆菌原核表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌原核表达系统含有带有p15A复制子的pAC-ph△-AK3质粒和带有ColE1复制子的pETDuet-T2^DK-DKR质粒；pAC-ph△-AK3质粒如SEQ ID No.1 所述核苷酸序列所示；pETDuet-T2^DK-DKR质粒如SEQ ID No.2 所述核苷酸序列所示。

2. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统，其特征在于，pAC-ph△-AK3质粒由pACYC184改造得到：pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列，赖氨酰tRNA合成酶由谷氨酰胺tRNA合成酶启动子和终止子调控表达，抑制型tRNA由lpp启动子和rrnC终止子调控表达。

3. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统，其特征在于pETDuet-T2^DK-DKR由质粒pETDuet-1 改造得到：在第一个多克隆位点引入了双羰基还原酶突变体的序列，106位到143位替换成了双羰基还原酶突变体的序列，编码的双羰基还原酶的基因第二个密码子由ACC突变成为琥珀密码子TAG，第二个多克隆位点引入了ph氨酰tRNA合成酶的序列，298位到354位序列替换成为ph氨酰tRNA合成酶的序列。

4. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

5. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌原核表达系统由pAC-ph△-AK3质粒和pETDuet-T2^DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞得到。

6. 利用权利要求1所述肠杆菌原核表达系统制备含有D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 在培养基中添加D型赖氨酸，异丙基硫代半乳糖苷诱导权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统表达，高压破碎，离心取上清；

(2) 采用亲和层析和阴离子交换层析结合的方法纯化上清液得到含D型氨基酸的双羰基还原酶。

7. 一种在双羰基还原酶中引入D型赖氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 在表达性质粒的特定酶切多克隆位点引入了目的蛋白的表达基因，并且将所述表达基因的目的位点突变成为TAG密码子；在该表达性质粒的另一个特定酶切多克隆位点引入ph氨酰tRNA合成酶的序列，得到重组质粒pETDuet-T2^DK-DKR；将pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列，得到pAC-ph△-AK3质粒；由pAC-ph△-AK3质粒和重组质粒共转染到宿主中，得到表达系统；pAC-ph△-AK3质粒如SEQ ID No.1 所述核苷酸序列所示；pETDuet-T2^DK-DKR质粒如SEQ ID No.2 所述核苷酸序列所示；

(2) 在培养基中添加D型赖氨酸，诱导上述表达系统表达目的蛋白，纯化得到目的蛋白。

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