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CN102415597A - 含有苹果提取物及胶原蛋白三肽的美容饮料 - Google Patents

含有苹果提取物及胶原蛋白三肽的美容饮料 Download PDF

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CN102415597A
CN102415597A CN2011102749711A CN201110274971A CN102415597A CN 102415597 A CN102415597 A CN 102415597A CN 2011102749711 A CN2011102749711 A CN 2011102749711A CN 201110274971 A CN201110274971 A CN 201110274971A CN 102415597 A CN102415597 A CN 102415597A
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beauty
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鱼津伸夫
川越大
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Abstract

本发明提供美容饮料。其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。

Description

含有苹果提取物及胶原蛋白三肽的美容饮料
技术领域
本发明涉及用于改善皮肤的美容饮料。
背景技术
近年来，作为真皮组织模型，含胶原蛋白的饮料受到注目。
本申请人在专利文献1(日本专利第4388289号公报)中提出了含有明胶分解物、来自大豆的皂苷、大豆异黄酮、神经酰胺、葡萄糖胺和酒精的饮料及含有大豆胚芽提取物的外用剂所形成的防止·改善皮肤老化及/或防止·改善皮肤粗糙的套装产品。
专利文献2(日本专利第4506880号)中公开了如下美容饮料，其特征在于，含有选自胶原蛋白肽、酵母提取物、来自植物的儿茶素、单宁及柚子多酚中的1种以上以及用乳酸菌使琼脂分解物发酵而所得到的发酵组合物。
专利文献3(日本专利第4505322号公报)中公开了如下果冻饮料，其具有掩蔽了鱼腥味的良好的风味和口感且高浓度含有作为美容健康食品的来自鱼类的胶原蛋白肽。
专利文献4(日本专利第4057163号公报)中公开了如下饮料，其特征在于，含有山白竹和胶原蛋白肽。
专利文献5(日本特开2002-27957号公报)中公开了如下液体组合物，其通过在含有来自茶、葡萄或苹果的植物多酚和胶原蛋白的液体中添加果胶，从而抑制由植物多酚和水溶性蛋白质所引起的白浊物质及/或沉淀物质的生成。
专利文献6(日本专利第3802721号公报)中，本申请人提出了含有具有Gly-Pro-Hyp的氨基酸序列的三肽的生物体胶原蛋白合成促进剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本专利第4388289号公报
专利文献2日本专利第4506880号
专利文献3日本专利第4505322号公报
专利文献4日本专利第4057163号公报
专利文献5日本特开2002-027957号公报
专利文献6日本专利第3802721号公报
发明内容
本发明的目的在于，开发具有胶原蛋白收缩能力、提高了美容性的胶原蛋白饮料。
本发明人以苹果提取物具有胶原蛋白收缩能力为知识依据，进一步发现通过与胶原蛋白三肽并用可增强胶原蛋白收缩能力，从而完成了本发明。而且，不断进行研究的结果，认识到了通过苹果提取物和胶原蛋白三肽并用，具有抑制皱纹形成的功能、抑制DNA损伤的功能、保持角质层水分量的功能、抑制表皮肥厚的功能。
1.一种美容饮料，其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，其特征在于，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。
2.根据1中所述的美容饮料，其特征在于，苹果提取物为来自苹果的多酚，胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的胶原蛋白三肽。
3.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制皱纹形成的美容饮料。
4.根据3中所述的用于抑制皱纹形成的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的皱纹形成。
5.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制DNA损伤的美容饮料。
6.根据5中所述的用于抑制DNA损伤的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的DNA损伤。
7.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于保持角质层水分量的美容饮料。
8.根据7中所述的用于保持角质层水分量的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的角质层水分量的减少。
9.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制表皮肥厚的美容饮料。
10.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于提高皮肤弹性的美容饮料。
可证明本发明的美容饮料通过并用苹果多酚和胶原蛋白三肽，在低浓度区域内显著提高使胶原蛋白凝胶收缩的功能。且可证明通过并用苹果提取物和胶原蛋白三肽，具有抑制皱纹形成、抑制DNA损伤、保持角质层水分量、抑制表皮肥厚的效果。这些功能特别是对于以被太阳光等中所包含的紫外线照射为起因的损伤具有有效的效果。
通过长期持续服用，可确实感到皮肤的光滑度、干燥得到改善，确认皮肤弹性得到改善，还可抑制痤疮的恶化、发病等的症状，确认化妆品涂布性得到改善，总体上适合美容用饮料。
附图说明
图1表示通过添加苹果多酚而产生的评价样品的胶原蛋白凝胶收缩率的结果。
图2表示通过添加胶原蛋白三肽而产生的评价样品胶原蛋白凝胶收缩率的结果。
图3表示通过并用苹果多酚和胶原蛋白三肽并用而产生的评价样品胶原蛋白凝胶收缩率的结果。
图4表示皱纹体积率。
图5表示经皮水分丧失量TEWL。
图6表示角质层水分量SC hydration。
图7表示表皮厚度。
图8表示DNA损伤(8-OH dG)。
图9表示PCNA(细胞增殖标记物)。
图10表示皮肤羟基脯氨酸(Hyp)。
图11表示通过服用而产生的感官试验结果。
图12(a)表示测定皮肤粘弹性的结果。
图12(b)表示测定皮肤弹性的结果。
具体实施方式
本发明人首先以苹果提取物具有胶原蛋白凝胶收缩作用为知识依据，进行了涉及以苹果提取物为有效成分的胶原蛋白凝胶收缩剂的专利申请(日本特愿2009-83818号)。本发明人进一步继续对苹果提取物的胶原蛋白凝胶收缩作用进行研究的结果，发现通过并用胶原蛋白三肽，可飞速增强胶原蛋白凝胶收缩作用。
本申请发明涉及可口服摄取的美容饮料。
本发明发挥使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩作用。且是以苹果提取物和胶原蛋白三肽并用的成分为有效成分的、用于抑制皱纹形成的美容饮料、用于抑制DNA损伤的美容饮料、用于保持角质层水分量的美容饮料、用于抑制表皮肥厚的美容饮料。
本发明使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩。胶原蛋白凝胶的收缩是指例如使凝胶的大小变小。作为胶原蛋白凝胶的大小的指标无特别限制，例如可例举胶原蛋白凝胶的直径、表面积、体积等。
此外，苹果提取物和胶原蛋白三肽并用的成分在抑制皱纹形成、抑制DNA损伤、保持角质层水分量、抑制表皮肥厚时也为有效成分。特别是作为针对被太阳光等中所包含的紫外线照射而引起的皱纹形成、DNA损伤、角质层水分量减少、表皮肥厚等损伤的抑制作用，发挥有效作用。
通过长期服用，可防止皮肤干燥，增加光滑度，抑制痤疮等的小疙瘩，是改善作为皮肤外用剂的化妆品的涂布性的美容用饮料。
<胶原蛋白凝胶>
本发明中，胶原蛋白凝胶只要是可收缩的形状即可，除了凝胶状以外，例如也可以为固状。
胶原蛋白凝胶中所包含的胶原蛋白的种类无特别限制，例如可例举I型、II型、III型、IV型、V型胶原蛋白等，优选为I型胶原蛋白。另外，胶原蛋白例如也可为将胶原蛋白加工处理后的产物。作为加工处理无特别限制，例如可例举热处理、酶处理等。作为热处理后的胶原蛋白，例如可例举明胶等，作为酶处理后的胶原蛋白，例如可例举去端肽胶原、胶原蛋白肽等。胶原蛋白凝胶中的所述胶原蛋白浓度无特别限制，例如可根据形状等适当设定。
在胶原蛋白凝胶中，纤维芽细胞的来源组织无特别限制，例如可例举皮肤、肺、心脏等，优选为皮肤。纤维芽细胞的来源种无特别限制，例如可例举人、猪、牛、兔、大鼠、小鼠等，优选为人。胶原蛋白凝胶中的纤维芽细胞的细胞密度无特别限制，可适当设定。
胶原蛋白凝胶例如也可包含胶原蛋白及纤维芽细胞以外的其他成分。作为其他成分无特别限制，例如可例举培养液、血清等。
<苹果提取物>
苹果提取物优选为苹果果实的提取物。特别优选为以苹果幼果提取物中所包含的多酚为主要成分。
已知苹果提取物中含有多酚、有机酸、氨基酸等。
已知苹果提取物可用于如下物质中，作为可提高改善血管功能的作用的BNP调节剂且含有提取物作为有效成分而形成的BNP调节剂、血流促进剂(日本特开2007-008837号公报、日本特开2006-265220号公报)、饮料(日本特开2004-305087号公报)、化妆品(日本特开2001-187724号公报)、消臭剂成分(日本特开平11-319051号公报)、香料成分(日本特开平08-023939号公报)等。
但是，还没有关于苹果提取物及来自苹果的多酚的胶原蛋白凝胶收缩效果的报道。
苹果提取物中，苹果(Malus pumIla)的品种例如可例举富士、国光、王林、红玉、乔纳金、蛇果、珊夏、千秋等，无特别限制。苹果的提取部位无特别限制，例如可例举果实、叶、干、花等，优选为果实。所述果实，例如可为未成熟果实(幼果)，也可为完全成熟果实，无特别限制。提取时所使用的所述果实的部位无特别限制，例如可例举全果、果肉、果皮、种子等。苹果提取物也可将这些部位单独或组合2种以上提取。
提取苹果提取物的方法无特别限制，可采用现有公知的方法。作为提取方法的具体例子，例如也可为以下方法。首先，将苹果的全果水洗后，用研磨机等粉碎。也可将该粉碎物进行果胶酶处理，离心分离后，用提取溶剂进行分配过滤来制备苹果提取物。作为所述果胶酶处理无特别限制，例如也可在20～60℃的温度条件下，添加10～50ppm果胶酶来进行。作为提取溶剂无特别限制，例如可例举己烷、氯仿等的有机溶剂。
苹果提取物例如可使用市售的苹果提取物，也可从苹果果实中提取制备，无特别限制。
胶原蛋白凝胶收缩剂中所包含的苹果提取物含量无特别限制，例如为0.001～99重量％，优选为0.001～5重量％。因为通过胶原蛋白和明胶并用，可飞速提高胶原蛋白凝胶收缩能力，所以在0.01以下即很充分。胶原蛋白凝胶收缩剂优选含有来自苹果的多酚的苹果提取物。
多酚的分离方法无特别限制，可采用现有公知的方法。多酚例如也可如下分离，将苹果提取物流入色谱柱后，洗脱色谱柱的吸附物，将该洗脱组分减压蒸馏、浓缩来进行分离。此外，还可以在该浓缩液中添加粉末助剂，进行冷冻干燥或喷雾干燥来制备多酚粉末。
多酚例如可使用市售的来自苹果的多酚含有物，也可以从苹果果实中提取及分离而制备，无特别限制。本发明的胶原蛋白凝胶收缩剂中所包含的所述多酚含量无特别限制，例如为0.01～99重量％，优选为0.1～50重量％。
<胶原蛋白三肽>
并用苹果提取物的胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的三肽，与通常称为普通胶原蛋白的胶原蛋白有所区别。进一步详细地说，优选氨基酸序列为Gly-X-Y(X，Y为氨基酸)的肽(peptide)，特别优选氨基酸序列为Gly-Pro-Hyp的肽。
本发明的胶原蛋白三肽使用来自猪等动物的胶原蛋白三肽、来自鱼的胶原蛋白三肽均可。
本发明的胶原蛋白三肽主要可水解胶原蛋白来制造。胶原蛋白水解物已有市售，这些酶性水解的胶原蛋白的多数的分子量分布范围为二千～八万。这些水解物以提高在水中的分散性为目的。
相对于此，本发明的胶原蛋白水解物的特征在于，作为特定的有效成分含有分子量为400以下的肽(peptide)。
添加量优选为0.01％以上。因本试验体系的试验中，胶原蛋白凝胶的收缩上限设想为80％左右，所以，胶原蛋白凝胶的收缩为70％左右以上时，即使增加添加浓度，增加效果也较小。因此，从不会减小的意义上来说虽没有上限，但实质上来说1.0％左右即为上限。
[试验例1]
<有关苹果提取物的胶原蛋白凝胶收缩作用试验>
该试验中，作为胶原蛋白凝胶收缩剂，使用苹果提取物(商品名：ApplephenonSH；ASAHI FOOD & HEALTHCARE CO.，LTD.制)，如下测定胶原蛋白凝胶收缩作用。
[材料]
(1)去端肽胶原(商品名：AteloCell、去端肽胶原(来自牛真皮)5mg/ml
(2)DMEM(粉末)(商品名：达尔伯克改良伊格尔培养基(2)、日水)
(3)DMEM(液体)(商品名；Gibco)
[评价样品]
(1)苹果提取物(苹果多酚)
商品名：Apple phenonSH(ASAHI FOOD & HEALTHCARE CO.，LTD.制)
规格；总多酚量98％以上(UV法)
[试验方法]
将预先继代培养的皮肤纤维芽细胞(来自新生儿)制备成细胞悬浮液(6×105cells/ml含有溶剂10％FBS的DMEM)。在冰冷中混合去端肽胶原(5mg/ml)4ml、3倍浓度DMEM(含有D-Glc1.2M及含有Apple phenonSH0.03％)2ml、FBS(牛血清)0.67ml、含有10％FBS的DMEM 3.34ml及细胞悬浮液2ml，在平底12孔板中各添加1ml。在37℃、5％CO2培养箱中培养，5小时后通过去端肽胶原再纤维化，证明已形成了凝胶。
从添加开始6小时后，使用灭菌刮刀的柄将凝胶从孔板上剥离后，添加含有10％FBS的DMEM溶液1ml(含0.5％、0.2％、0.1％HACP-01)，再次在37℃、5％CO2培养箱中培养7天。
培养液为隔1天用将评价药剂以任意浓度溶解的含有10％FBS的DMEM溶液1ml替换培养基。培养结束后，将培养液完全除去，用PBS洗涤后，用10％中性福尔马林溶液(Wako)浸润24小时以固定凝胶。
其后，置换为1％(w/v)Triton-X溶液，进行凝胶直径的计算测量。
进行在凝胶形成后添加苹果提取物(苹果多酚)时和凝胶包埋时添加苹果提取物(苹果多酚)时的试验。添加量如表1中记载。
表1中记载的添加浓度A1、A2、A3、A4的添加浓度表示在凝胶形成后添加的在含有10％FBS的DMEM溶液1ml中添加苹果提取物的数值。
此外，表1中记载的添加浓度B1、B2、B3表示凝胶包埋时添加了苹果提取物的凝胶容量1ml中的添加浓度。即组成凝胶1ml的各试样的容量由(1)去端肽胶原333.3μl、(2)含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度的DMEM 166.7μl、(3)FBS(牛血清)55.8μl、(4)含有10％FBS的DMEM 277.5μl、(5)细胞悬浮液166.7μl构成，评价样品的苹果提取物的添加浓度如下，在(2)3倍浓度DMEM的溶剂中，含有以0.3％浓度制备的苹果提取物的含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液在凝胶中的添加浓度为0.3％×(166.7μl/凝胶容量1ml)＝0.05％的B1所示的添加浓度。同样，B2及B3的添加浓度如下，通过分别制备分别含有0.1％及0.03％的苹果提取物的含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液，在凝胶包埋时添加，分别得到B2→0.0167％、B3→0.005％的添加浓度，求出胶原蛋白凝胶收缩率。
[凝胶直径的计算测量及凝胶面积的计算]
利用凝胶的形状与孔板同样为正圆形来计算凝胶面积。
将根据上述处理方法制备的凝胶从2个方向计算测量直径，计算出2直线的平均值。可由其凝胶直径的平均值计算出凝胶半径，凝胶面积可用下式计算。
凝胶面积＝(凝胶半径cm)×(凝胶半径cm)×圆周率
由进行药剂处理时的胶原蛋白凝胶的凝胶面积与未进行药剂处理的胶原蛋白凝胶的凝胶面积的面积比计算出胶原蛋白凝胶收缩率(％)。
胶原蛋白凝胶收缩率(％)＝100×{(未进行药剂处理的凝胶面积)-(进行药剂处理时的凝胶面积)}/(未进行药剂处理的凝胶面积)
对于一个数据用n＝3孔板评价，用平均±标准偏差(mean±S.D.)标记于图表中。
[试验结果]
表1及图1中表示单独添加苹果提取物的试验例的胶原蛋白凝胶收缩率(％)的结果。
证实在凝胶形成后添加苹果提取物时和在凝胶包埋时添加时的任一种情况下，胶原蛋白凝胶收缩能力均依赖于浓度。且显示在添加0.005％(w/v)时的凝胶收缩能力分别为15.2±6.9％、16.3±6.5％的非常接近的值。
表1
苹果提取物(苹果多酚)
Figure BDA0000091678150000101
〔试验例2〕
<有关胶原蛋白三肽的胶原蛋白凝胶收缩作用试验>
在该试验中，作为胶原蛋白凝胶收缩剂使用胶原蛋白三肽，如下测定胶原蛋白凝胶收缩作用。
[材料]
(1)去端肽胶原(商品名：AteloCell、去端肽胶原(来自牛真皮)5mg/ml
(2)DMEM(粉末)(商品名：达尔伯克改良伊格尔培养基(2)、日水)
(3)DMEM(液体)(商品名；Gibco)
[评价样品]
(2)胶原蛋白三肽
商品名：HACP-01(JELLICE株式会社制)
规格；含有三肽(G-X-Y；X、Y为任意的氨基酸)15％以上
[试验方法]
将预先继代培养的皮肤纤维芽细胞(来自新生儿)制备为细胞悬浮液(6×105cells/ml含有溶剂10％FBS的DMEM)。在冰冷中混合去端肽胶原(5mg/ml)4ml、3倍浓度DMEM(含有D-Glc1.2M及含有Apple phenonSH0.03％)2ml、FBS(牛血清)0.67ml、含有10％FBS的DMEM 3.33ml及细胞悬浮液2ml，在平底12孔板中各添加1ml。在37℃、5％CO2培养箱中培养，5小时后通过去端肽胶原再纤维化，证明形成了凝胶。
从添加开始6小时后，使用灭菌刮刀的柄将凝胶从孔板上剥离后，添加含有10％FBS的DMEM溶液1ml(含0.5％、0.2％、0.1％HACP-01)，再次在37℃、5％C02培养箱中培养7天。
培养液为隔1天用将评价药剂以任意浓度溶解的含有10％FBS的DMEM溶液1ml替换培养基。培养结束后，将培养液完全除去，用PBS洗涤后，用10％中性福尔马林溶液(Wako)浸润24小时以固定凝胶。
其后，置换为1％(w/v)Triton-X溶液，进行凝胶直径的计算测量。
进行在凝胶形成后添加胶原蛋白三肽时和凝胶包埋时添加胶原蛋白三肽时的试验。添加量如表2中记载。
表2中记载的添加浓度A1、A2、A3的添加浓度表示在凝胶形成后添加的含有10％FBS的DMEM溶液1ml中添加胶原蛋白三肽的数值。
此外，表2中记载的添加浓度B1、B2、B3表示凝胶包埋时添加了胶原蛋白三肽的凝胶容量1ml中的添加浓度。即组成凝胶1ml的各试样的容量由(1)去端肽胶原333.3μl、(2)含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM 166.7μl、(3)FBS(牛血清)55.8μl、(4)含有10％FBS的DMEM 277.5μl、(5)细胞悬浮液166.7μl构成，评价样品的胶原蛋白三肽的添加浓度如下，在(2)3倍浓度DMEM的溶剂中，含有以6.0％浓度制备的胶原蛋白三肽的含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液在凝胶中的添加浓度为0.3％×(166.7μl/凝胶容量1ml)＝1.0％的B1所示的添加浓度。同样，B2及B3的添加浓度如下，通过分别制备分别含有3.0％及0.6％的胶原蛋白三肽的含有1.2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液，在凝胶包埋时添加，分别得到B2→0.0167％、B3→0.005％的添加浓度，求出胶原蛋白凝胶收缩率。
[凝胶直径的计算测量及凝胶面积的计算]
利用凝胶的形状与孔板同样为正圆形从而计算出凝胶面积。参照图4所示的表示胶原蛋白凝胶收缩剂的胶原蛋白凝胶收缩状态的图。
将根据上述处理方法制备的凝胶从2个方向上计算测量直径，计算出2直线的平均值。可由其凝胶直径的平均值计算出凝胶半径，凝胶面积可用下式计算。
凝胶面积＝(凝胶半径cm)×(凝胶半径cm)×圆周率
由进行药剂处理时胶原蛋白凝胶的凝胶面积与未进行药剂处理的胶原蛋白凝胶的凝胶面积的面积比计算出胶原蛋白凝胶收缩率(％)。
胶原蛋白凝胶收缩率(％)＝100×{(未进行药剂处理的凝胶面积)-(进行药剂处理时的凝胶面积)}/(未进行药剂处理的凝胶面积)
对于一个数据用n＝3孔板评价，用平均±标准偏差(mean±S.D.)标记于图表中。
[试验结果]
表2及图2中表示单独添加胶原蛋白三肽的试验例中的胶原蛋白凝胶收缩率(％)的结果。
证实在凝胶形成后添加胶原蛋白三肽时和在凝胶包埋时添加胶原蛋白三肽时的任一种情况下，胶原蛋白凝胶收缩能力均依赖于浓度。且显示在添加0.1％(w/v)时的凝胶收缩能力分别为20.1±1.0％、24.2±15.5％的非常接近的值。
表2
Figure BDA0000091678150000131
实施例
实施例1
[苹果多酚、胶原蛋白三肽并用例]
与所述试验方法同样进行苹果多酚和胶原蛋白三肽并用试验。在凝胶包埋时添加苹果多酚，在凝胶形成后添加胶原蛋白三肽。其结果如表3、图3所示。
作为苹果多酚使用Apple phenonSH，作为胶原蛋白三肽使用分子量为约400的来自猪的胶原蛋白三肽(产品名：HACP-01 JELLICE株式会社制)。
表3
  实施例1   试验例1   试验例2   参考
  胶原蛋白三肽添加浓度％(w/v)   0.10％   0.10％
  苹果提取物添加浓度％(w/v)   0.005％   0.005％
  胶原蛋白凝胶收缩率(％)   45.6   16.3   20.1   36.4
  S.D.   6.7   6.9
试验例1为添加0.005％苹果提取物Apple phenonSH的例子。
试验例2为添加0.1％胶原蛋白三肽HACP-01的例子。
实施例1为并用试验例1和试验例2的例子。
可知实施例1与作为设想的相加作用的参考相比发挥了显著的作用。
该结果可确认出实施例1与所有的单独使用时相比，明显发挥出使胶原蛋白凝胶收缩的作用。此外，与作为单纯设想的相加数字的参考相比显示出显著的效果，这是始料未及的效果。
实施例2
[光老化抑制试验]
在所述试验中，使用使包含胶原蛋白及纤维芽细胞在内的胶原蛋白凝胶收缩的体外试验体系，可确认出通过并用苹果提取物及胶原蛋白三肽来协同促进胶原蛋白凝胶收缩。
已知长时间持续暴露在太阳光(紫外线)下时，会使面部、脖颈的深皱纹增加，还会引起皮肤干燥及皮肤粗糙、褐斑、雀斑等的色素沉着，作为应对该光老化引起的肌肤问题的对策，进行了新认识到的苹果提取物及胶原蛋白三肽并用所具有的胶原蛋白收缩能力的应用试验。即作为缓和、预防、抑制、改善皮肤老化、皮肤的光老化现象的成分，着眼于以多酚为主要成分的苹果提取物进行了试验。
<试验方法>
在将UVA波及UVB波照射无毛小鼠而形成皱纹的试验体系中，口服摄取作为被检物质的各种食品原料，研究对抑制皱纹及抑制皮肤老化的效果。
试验开始时使用6周龄的无毛小鼠(Hos：HR-1雌)，用以下1)～11)的条件·方法进行试验。
1)试验对象物的制备及投给
无毛小鼠的分组在开始投给日时，将普通状态良好的动物根据体重以组间无差异的方式分成每组6只。此外，对试验组5的(2者并用混合饲料)的组用n＝5评价，各组的个体以1笼/组进行饲养。
在小鼠用飼料MF(Oriental BioService制)中，进行混合处理使表4中所示的各个被检物质均匀混合，用混合饲料使其自由摄取。表示投给组的一览表。混合饲料在动物刚刚搬入之后到解剖18小时前实施。
(1)作为苹果提取物，使用pomactiv HFV(法国的Val de Vire Bioactives公司(VVB公司)制(日本代理店unitecfoods))。pomactiv HFV是以法国产苹果酒用苹果为原料的苹果多酚产品。成分规格为总多酚90％以上(用UV法计算)。以原花青素、槲皮素(糖苷)、根皮苷、儿茶素类为主要成分。
(2)作为胶原蛋白三肽原料使用HACP-01。
HACP-01(胶原蛋白三肽原料)是以来自猪的胶原蛋白为原料，由JELLICE公司制造销售的胶原蛋白三肽。
该胶原蛋白三肽是含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的三肽，通常与普通的被称为胶原蛋白的物质有区别。进一步详细地说，优选氨基酸序列为Gly-X-Y(X，Y为氨基酸)的肽(peptide)，特别优选氨基酸序列为Gly-Pro-Hyp的肽。
胶原蛋白肽使用来自猪等动物的胶原蛋白肽、来自鱼的胶原蛋白肽均可。胶原蛋白三肽主要可水解胶原蛋白来制造。胶原蛋白水解物已有市售，但这些酶性水解的胶原蛋白的大多数的分子量分布范围为2千～8万。这些水解物以提高在水中的分散性为目的。
相对于此，JELLICE制的胶原蛋白水解物HACP-01的特征在于，含有作为特定有效成分的分子量为约400以下的肽(peptide)。
表4
各组的饲料投给·UV照射条件
Figure BDA0000091678150000161
(注)：“pomactiv HFV”：以unitecfoods制多酚为主要成分的苹果提取物
2)UV照射(表4；试验概要)
UV照射时，将动物转入专用的笼中，每组照射UVB20mJ/cm2及UVAl0J/cm2。照射为每周三次，星期一、星期三、星期五进行，实施10星期。
3)经皮水分丧失量(TEWL)的测定
经皮水分丧失量的测定使用Vapometer(keystone-scientific制)，将末端贴紧从背部的尾根开始向脖颈方向2cm、从腰椎开始右侧0.5cm的部位进行测定。测定日在试验开始日实施，确认各组的TEWL值无偏差，其后直到马上进行解剖之前进行测定。
4)角质层水分量的测定
角质层水分量的测定使用MoistureCheckerMY-808S(SCALAR制)，将末端贴紧从背部的尾根开始向脖颈方向2cm、从腰椎开始右侧0.5cm的部位进行测定。
5)解剖
各组在本饲养期间结束后第二天开始18小时断食后，通过将冰冷的Avertin(2，2，2-三溴乙醇)以0.5mg/kg体重进行腹腔内投给来导入麻醉。其后在皮肤从背部的尾根开始向脖颈方向2cm、从腰椎开始右侧0.5cm的部位范围内采集反射型复制品((有)ASAHIBIOMED制)。其后进行开腹解剖。皮肤组织进行10％中性福尔马林浸润，在石蜡包埋后进行苏木素-伊红染色。
6)皮肤形态观察及皱纹体积率的计算测量
进行皮肤表面部的照片撮影和采集的复制品的判定。将皱纹形成程度作为指标使用ASA-03RXD((有)ASAHIBIOMED制)计算出皱纹体积率％(μm3/mm2/100)。
7)表皮肥厚
通过在“5)解剖”项中实施的皮肤组织的苏木素-伊红染色，计算测量表皮的厚度。从同一染色图像500μm中任意选择6处，计算测量各处表皮的厚度，将其6个的平均值作为其个体表皮的厚度。
8)8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OH dG)测定
通过免疫组织染色，着眼于表皮细胞实施了DNA损伤的生物标记物8-OHdG的测定。
将“5)解剖”项中准备的石蜡包埋后的皮肤组织适当制作成5μm厚的切片，根据公知的方法实施脱石蜡、亲水化。抗原赋活化在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)沸腾中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，常温下用含有0.3％过氧化氢甲醇反应30分钟以抑制内源性过氧化物酶。水洗、10mmPBS(-)洗涤后，用兔子血清75倍(稀释溶液为PBS(-))室温放置30分钟进行封闭反应。将血清从载玻片上除去，将1次抗体(N45.1：nikkenseil株式会社制)以5μg/mL在4℃放置过夜以使1次抗体反应。用PBS(-)洗涤2次，将生物素化二次抗体(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍后在室温下使2次抗体反应30分钟。用PBS(-)洗涤2次，使ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)在室温下反应30分钟。作为显色试剂使用DAB(3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)在常温下反应3分30秒。水洗后，按照公知的方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况，根据以下标准进行评分。评分判断困难时用其中间值0.5，计算出各组的分数。
分数
×；分数3；从表皮细胞开始上层细胞核有数层染色
△；分数2；从表皮细胞开始上层细胞核染色
○；分数1；表皮细胞的细胞核染色
◎；分数0；表皮细胞的细胞核为分散程度的染色
9)Proliferation Cell Nuclear Antigen(PCNA；增殖细胞核抗原)测定
PCNA是从细胞周期的细胞生长期后期到DNA合成期初期进行表达的核蛋白质，DNA损伤时与DNA聚合酶、RFC(复制因子C；滑动夹装载因子)形成复合物，重新合成·修复DNA。但是，认为在所谓微弱的紫外线连续照射的PCNA持续表达的环境下，会导致细胞周期异常、进而细胞增殖过量、表皮细胞的更新亢进、角化不全、表皮肥厚，最终引起光老化现象。
通过免疫组织染色，着眼于表皮细胞实施细胞增殖的生物标记物PCNA的测定。
将“5)解剖”项中准备的石蜡包埋后的皮肤组织适当制作成5μm厚的切片，根据公知的方法实施脱石蜡、亲水化。抗原赋活化在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)沸腾中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，常温下用含有0.3％过氧化氢的甲醇反应30分钟以抑制内源性过氧化物酶。水洗、PBS(-)洗涤后，用兔子血清75倍(稀释溶液为PBS(-))室温放置30分钟进行封闭反应。将血清从载玻片上除去，将1次抗体(PC-10：Santa Cruz制)以1μg/mL在4℃放置过夜以使1次抗体反应。用PBS(-)洗涤2次，将生物素化二次抗体(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍后在室温下使2次抗体反应30分钟。用PBS(-)洗涤2次，使ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)在室温下反应30分钟。作为显色试剂使用DAB(3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)在常温下反应3分30秒。水洗后，按照公知的方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况，根据以下标准进行评分。评分判断困难时用其中间值0.5，计算出各组的分数。
分数
×；分数3；从表皮细胞开始上层细胞核有数层染色
△；分数2；从表皮细胞开始上层细胞核染色
○；分数1；表皮细胞的细胞核染色
◎；分数0；表皮细胞的细胞核为分散程度的染色
10)皮肤羟基脯氨酸(Hyp)
将皮肤蛋白质进行盐酸水解，用LC/MS/MS测定羟基脯氨酸量。
从“5)解剖”项中冷冻保存的小鼠皮肤上切取胶原蛋白测定用10mg。将其皮肤片用剪子切细放入带旋盖的试管后，加入6N盐酸1ml，110℃下酸水解24小时。将反应溶液用MilliQ水稀释成50倍后，用过滤器过滤再用MilliQ水稀释100倍，作为羟基脯氨酸测定用的样品。
羟基脯氨酸使用LC/MS/MS系统的ACQUITY(R)TQD(Waters)测定。
LC条件
·色谱柱HSS T32.1X100mm(Waters制)
·流速        0.4mL/mIn
·柱温        50℃
·流动相 A：0.1％甲酸
         B：0.1％甲酸、80％乙腈
·梯度
表5
  时间(分钟)   A液(％)   B液(％)
  0.0   99.9   0.1
  1.0   99.9   0.1
  1.5   50.0   50.0
  2.5   0.1   99.0
  4.0   0.1   99.0
  4.1   99.9   0.1
  6.0   99.9   0.1
MS/MS条件
·离子化           ESI+(Positive)
·毛细管电压       0.5kV
·脱溶剂气         1,000L/Hr
·锥孔反吹气       50L/Hr
·离子源加热器     150℃
·监测器           MRM
·前体离子(m/z)    132.16
·产物离子(m/z)    86.1
·Dwell时间(秒)    0.05
·锥孔电压(V)      28
·碰撞能量(eV)     12
与标准品的羟基脯氨酸(Wako制)的峰区相比较计算出皮肤胶原蛋白中的羟基脯氨酸量(Hyp)。
11)统计处理
试验结果用平均值±标准偏差(mean±S.D.)表示，多重比较(Steel’s test)用Excel统计2008的分析软件进行显著性差异检验。设定为
Figure BDA0000091678150000211
Figure BDA0000091678150000212
Figure BDA0000091678150000213
p＜0.1时，在接近显著水平上而很留意地记录。
<试验结果>
以下将本实施例2的各试验例的结果顺序表示。
1.普通状态观察及皱纹体积率的计算测量
从紫外线照射第4星期左右开始，UV照射动物中，头部皮肤的轻度褐色化、颈部皱纹的深度以及后肢背部的皱纹与UV非照射动物相比变得突出了。
在解剖时的外观观察中，可确认出UV照射动物中面部、颈部及后肢背部的皱纹非常清晰，但即使在UV照射下，2者并用混合饲料(pomactiv HFV 0.006％及HACP-01 0.5％混合饲料)的小鼠中其症状也为轻度，2者并用混合饲料组中的皱纹深度较浅，为肉眼观察不到皱纹的程度。此外，高浓度摄取动物与对照组相比，皮肤具有湿润感。
如表6、图4的皱纹体积率的图表所示，可看出通过紫外线照射由明确的皱纹形成，在同一紫外线照射条件下，在混合饲料组中，可证实皱纹抑制效果呈显著的浓度依赖性。另一方面，苹果混合饲料组及胶原蛋白三肽混合饲料组中皱纹的抑制效果极其微小，通过显著性差异检验，未能证实与UV+组相比有显著的皱纹体积率的抑制。另一方面，仅有2者并用混合饲料组显著地抑制了皱纹体积率。
2.体重变化
如表6所示，体重变化各组未发现有大的差异。
3.摄饵量
如表6所示，摄饵量与体重变化同样未发现有大的差异。摄食量由体重增加变得缓慢的紫外线照射6星期～10星期之间的平均值计算。认为该摄取量为可使人不需勉强即可摄取的量，并可抑制光老化现象所产生的皱纹。
4.肝脏重量
对于肝脏重量也未发现有大的差异，未观察到异常症状。此外，其他脏器也未发现异常。
5.经皮水分丧失量(TEWL)
结果如表6所示。
认为经皮水分丧失量的数值越高，越会使水分从角质层蒸发而引起皮肤的干燥状态。通常已知由于UV照射会使经皮水分丧失量上升，在本试验中也证实了与UV-组相比，UV+组中的解剖日的经皮水分丧失量增高而引起干燥状态。此时，UV+照射及pomactiv HFV混合饲料组显示出低的TEWL值。与UV+照射组相比，UV-组、苹果混合饲料组及2者并用组显示出显著低的TEWL值。在胶原蛋白三肽混合饲料组中在接近显著水平(p＝0.0987)上显示出低的TEWL值。
表6
Figure BDA0000091678150000231
6.角质层水分量
结果如表7所示。
认为角质层水分量其数值越低，与角质层的水分或保持水分有关的天然保湿因子(Natural Moisturizing Factor；NMF)越减少，而引起皮肤的干燥状态。通常已知由于UV照射，会使角质层水分量减少，且本试验也证实了与[UV-/对照食]组相比，[UV+/对照食]组的解剖日的角质层水分量变低而引起干燥状态。此时，苹果混合饲料组显示出角质层水分量的恢复。与UV+照射组相比，苹果混合饲料组及2者并用组显示出显著高的角质水分量。
7.表皮肥厚
结果如表7所示。
相对于[UV+/对照食]组，[UV-/对照食]组、胶原蛋白三肽混合饲料组及2者并用组均证明显著抑制了表皮肥厚(棘层肥厚)。此外，0.006％混合饲料组中在接近显著水平(p＝0.0831)上表皮肥厚得到了抑制。
8.8-OHdG
结果如表7所示。
相对于[UV+/对照食]组，[UV-/对照食]组、2者并用组显著抑制了8-OHdG。另一方面，苹果混合饲料组中未抑制8-OHdG。此外，胶原蛋白三肽混合饲料组中在接近显著水平(p＝0.0596)上抑制了8-OHdG。
8-OHdG是细胞的DNA损伤的指标之一，由于暴露于紫外线、放射线、化学污染物质、香烟的烟等氧化应激下使DNA的鸟嘌呤发生氧化而形成。可证明在本试验中，因紫外线照射而使小鼠皮肤的基底细胞层中的8-OHdG增加，因而引起了DNA损伤及在苹果和胶原蛋白三肽的2者并用混合饲料组中抑制了其DNA损伤。
9.PCNA
结果如表7所示。
相对于[UV+/对照食]组，[UV-/对照食]组、苹果混合饲料组及2者并用组显著抑制了PCNA。胶原蛋白三肽混合饲料组中在接近显著水平(p＝0.0645)上抑制了PCNA的表达。
PCNA是细胞增殖、细胞周期的指标之一，在细胞生长期后期到DNA合成期初期表达增强，与DNA聚合酶、复制因子C(RFC)等形成复合物后，进行DNA损伤部位的切除和新的DNA合成及修复的核蛋白。本试验中，认为为了将因紫外线照射而过量增加的DNA伤害修复到正常状态，会导致PCNA过表达、DNA过量合成、表皮基底细胞的细胞周期异常，继而基底细胞的过量增殖会使表皮的更新异常，最终引起表皮的肥厚和皮肤外观的皱纹。苹果和胶原蛋白三肽2者并用混合饲料组显著抑制了该PCNA的过表达，表明通过苹果和胶原蛋白三肽2者并用，可引领达到提前缓和紫外线损伤，抑制皱纹形成、抑制表皮肥厚的结果。
10.皮肤羟基脯氨酸(Hyp)
结果如表7所示。
相对于[UV+/对照食]组，可证实2者并用组在接近显著水平(p＝0.0938)上Hyp上升。Hyp上升表明了皮肤组织中胶原蛋白量的增加。
表7
概括上述各动物实验，可确认出各试验中苹果提取物和胶原蛋白三肽2者并用均发挥了效果。
特别是确认出皱纹体积率、8-OHdG这2项在紫外线照射条件下也仅有2者并用组显著抑制，发挥了苹果提取物和胶原蛋白三肽的2者并用的效果。
其他，在TEWL、角质层水分量、表皮厚中，2者并用组显著缓和·抑制了紫外线损伤的影响，皮肤组织中的Hyp也仅有2者并用组在接近显著水平上显示出上升，这些均证明2者并用的有用性。
本申请人另外进行了改变添加量，与本试验内容相同地进行仅混合pomactivHFV的饲料的试验。添加量为0.006重量％、0.012重量％、0.060重量％这3种。可确认出该试验结果发挥浓度依赖性的作用效果。例如，以皱纹体积率作为参考表示时，根据添加量，分别为31.1％、13.4％、9.0％。对照食的UV有无的结果与本试验例相同。本试验例中，苹果提取物0.006重量％和胶原蛋白三肽0.5重量％的2者并用显示出12.0％的皱纹体积率，可确认出在低浓度添加中显著发挥了抑制皱纹形成的功能。如此，苹果提取物和胶原蛋白三肽的2者并用即使在低浓度下也发挥了显著的协同作用。
实施例3
进行了如下试验，确认通过连日口服摄取混合有苹果提取物(与实施例2同样)和胶原蛋白三肽(与实施例2同样)的饮料对健康者的肌肤状态的有效性。
1.试验方法
试验设计：平行组间双盲测试
被检人数：20名(各组10名)、30岁以上的健康女性
摄取时间：30天
摄取量：饮品1天1瓶50ml    推荐就寝前摄取
调查时期：摄取前、10天后、30天后
调查方法：马上要饮用之前、试验开始后10天、30天
2.试验品
(a)胶原蛋白三肽配合饮料    50ml/1瓶
含有三肽的胶原蛋白肽                 ：2600mg、
神经酰胺                             ：600μg、
维生素C                              ：250mg、
蓝锭果提取物                         ：15mg、
辅酶Q10                              ：1mg、
维生素E(作为α-生育酚)               ：2mg、
透明质酸                             ：1mg
(b)胶原蛋白三肽和苹果多酚的配合饮料  50ml/1瓶
代替作为抗老化材料而已知的蓝锭果提取物而配合苹果多酚。
大量含有三肽的胶原蛋白肽    ：2600mg、
苹果多酚                    ：83mg、
※苹果多酚原料为热水提取干燥物
神经酰胺                    ：600μg、
维生素C                     ：250mg、
辅酶Q10                     ：1mg、
维生素E(作为α-生育酚)      ：2mg、
透明质酸                    ：1mg
3.试验期间的注意事项
1)试验期间避免暴饮暴食。
2)试验期间中不改变生活习惯。
3)控制胶原蛋白肽、大豆异黄酮、维生素C等特别以美容为目的的健康食品的摄取、美容等的手术，慎用新型化妆品。
4.调查项目
1)病历单：干燥、化妆涂布性、紧绷度、光亮度、柔软度、其他
2)机器测定：弹性
弹性：皮肤弹力Cutometer MPA580    2次
测定部位：面部右颊部
5.试验结果
(1)根据病历单的试验结果如图11所示。图11所示的数据是针对试验前的状态和经过试验期30天后的状态所进行的问卷调查的回答的归纳。回答种类对于各个项目，为从“1.有改善2.无变化3.变差了4.原本就不在意”等的4个项目中选择。
自觉症状问卷调查中，有改善为+1，无变化为0，变差了为-1。
该结果为，并用了胶原蛋白三肽和苹果多酚的(b)与配合了胶原蛋白三肽的(a)相比，在皮肤的光滑度、干燥、化妆涂布性等中均自觉有优异的改善效果。而且对于痤疮，在容易生痤疮、难治愈、易恶化上，均自觉有抑制效果。
因此，通过持续服用，在期待肌肤的湿润度、化妆涂布性变得良好的同时，还可期待可抑制痤疮的发生、症状。
(2)皮肤弹性的评价
使用Cutometer MPA580(Courage+Khazaka Electronic Gmbh公司制)计算测量的皮肤的粘弹性和计算测量弹性的结果如图12(a)(b)所示。对于皮肤粘弹性，使用Cutometer MPA580的计算测量参数R0，对于皮肤弹性，使用参数R2进行评价。计算测量在试验开始前、试验开始后第10天、试验开始30天后(试验期结束后)测定3次。表中a表示配合了胶原蛋白三肽的试饮饮料，b表示配合了苹果多酚和胶原蛋白三肽的试饮饮料。
如图12(a)所示，对于粘弹性，中间的摄取10天时，未发现苹果多酚的有无所造成的差异，但在摄取30天时，并用苹果多酚和胶原蛋白三肽的样品(b)的改善效果增大了。
对于如图12(b)所示的弹性，中间的摄取10天时、摄取30天时，并用苹果多酚和胶原蛋白三肽的样品(b)的改善效果均增大了。
因此，通过长期持续摄取，可通过机器计算测量来确认样品(b)的皮肤弹性、绷紧性得到了改善。

Claims (10)

1.一种美容饮料，其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，其特征在于，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。
2.根据权利要求1中所述的美容饮料，其特征在于，苹果提取物为来自苹果的多酚，胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的胶原蛋白三肽。
3.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制皱纹形成的美容饮料。
4.根据权利要求3中所述的用于抑制皱纹形成的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的皱纹形成。
5.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制DNA损伤的美容饮料。
6.根据权利要求5中所述的用于抑制DNA损伤的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的DNA损伤。
7.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于保持角质层水分量的美容饮料。
8.根据权利要求7中所述的用于保持角质层水分量的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的角质层水分量的减少。
9.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制表皮肥厚的美容饮料。
10.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于提高皮肤弹性的美容。
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