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CN102333447B - 用于治疗和预防晶状体纤维化疾病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗和预防晶状体纤维化疾病的组合物和方法 Download PDF

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CN102333447B CN200980156374.XA CN200980156374A CN102333447B CN 102333447 B CN102333447 B CN 102333447B CN 200980156374 A CN200980156374 A CN 200980156374A CN 102333447 B CN102333447 B CN 102333447B
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Abstract

本发明提供了用于治疗纤维化疾病的组合物和方法。

Description

用于治疗和预防晶状体纤维化疾病的组合物和方法
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2008年12月4日申请的第61/119,750号美国临时专利申请的优先权。上述申请通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及晶状体纤维化疾病领域，具体地说，本发明公开了用于抑制、治疗和/或预防纤维化、特别是晶状体纤维化疾病的组合物和方法。
发明背景
为了描述本发明所属技术领域的现有状态，在本说明书中引述了一些公开出版物和专利文件。这些引用文献中的每一篇都通过引用结合到本文中，如同全文公开的一样。
成肌纤维细胞很可能是导致视力减退的晶状体纤维化疾病(例如后囊混浊(PCO)和前囊下白内障(ASC))的病因。PCO是白内障手术的一种常见并发症。ASC和PCO中成肌纤维细胞的起源尚不清楚。目前，还没有可以用来有效地阻断晶状体纤维化疾病(例如PCO)发展的方法。
发明概述
根据本发明，提供抑制纤维化疾病、特别是晶状体纤维化疾病的方法。在一个具体的实施方案中，这些方法包括给予需要这种治疗的患者的晶状体治疗有效量的组合物，该组合物包含与至少一种细胞毒性分子缀合的至少一种骨骼肌干细胞靶向分子和至少一种药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，该晶状体纤维化疾病是后囊混浊或前囊下白内障。在又一个实施方案中，本发明的组合物是直接给予到晶状体或周围组织。
根据本发明的另一方面，提供用于治疗晶状体纤维化疾病的组合物。在一个具体的实施方案中，这些组合物包含与至少一种细胞毒性分子缀合的至少一种骨骼肌干细胞靶向分子和至少一种药学上可接受的载体。
附图简述
图1A和图1B提供在鸡晶状体囊袋上的模拟白内障手术以诱导后囊混浊之后，分别在第0天和第2天晶状体中骨骼肌干细胞的影像图。
图2A是来自在单独的补体或补体加上G8抗体中培养(1天)的后囊混浊诱导的晶状体的α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白的蛋白质印迹图。图2B是图2A中蛋白质印迹的信号强度比的图。
图3是G8和MyoD mRNA标记的小鼠晶状体细胞的影像图。
图4提供位于晶状体上皮里面小境(niches)中的G8pos细胞亚群的影像图。在制备上皮外植体之前将晶状体固定在E15，保留了原位定位G8pos细胞。外植体用抗G8抗原的mAb(用罗丹明缀合的第二抗体标记过)标记，再对F-肌动蛋白(Alexa Fluor-488鬼笔毒环肽)和核(TO-PRO-3，蓝色)共染色。在以x-y面(x-y tile)数字地获取的单一光学平面中共焦成像(图4A)显示在图4B中，在较高的放大倍数下定位到晶状体上皮细胞之中归巢的小境的G8pos细胞(箭头)，尺寸条20μm。图4A中的插入图显示在培养物中在T0时固定的外植体中，晶状体上皮相关的G8pos细胞也表达MyoD mRNA，能用与MyoD反义寡核苷酸序列缀合的用Cy3标记的DNA树状聚体(dendrimer)进行检测；细胞核用Hoechst染料复染。为了进一步定位G8pos细胞小境，通过扫描共焦成像，创建了从顶部到基底获取的连续1微米光切面Z-垛叠(Z-stack)的正交切割(顶图，图4B)。在代表性光切面中沿着水平线制作正交切割(底图，图4B)。G8pos小境与晶状体上皮细胞的顶表面缔合(箭头，图4B)。
图5显示在对上皮损伤应答时扩大并迁移到创伤边缘的G8pos前体细胞。进行模拟白内障手术以制备离体(ex vivo)受创伤上皮外植体，见图5A中的模型。从晶状体囊(一种基底膜，BM)中去除纤维细胞团块，在晶状体上皮(LE)中产生了受创伤前沿，在此处它已毗连纤维细胞。在前囊中制造的切口使外植体变扁平，产生了受创伤切口边缘。在图5B-5F中，通过用G8 mAb免疫标记，测定培养1小时时G8pos细胞对损伤的初始应答。用Alexa Fluor488-鬼笔毒环肽对F-肌动蛋白的染色勾画出晶状体上皮细胞的轮廓。通过模拟白内障手术造成的损伤诱导了G8pos细胞群的出现和扩大(图5B，图5C)及其向创伤边缘即前沿(图5D-5E)和切口边缘(图5F)两者的迁移。在水平线(图5E，下图)的位置通过共焦Z-垛叠的正交切割(图5E，上图)显示沿着晶状体上皮细胞顶表面迁移到前沿的G8pos细胞(箭头)。图5G-5I显示G8pos细胞的间充质表型通过G8和波形蛋白的双重标记予以证明，见图5I中的叠加图。尺寸条20μm。
图6提供示踪研究，显示对晶状体上皮损伤应答中的G8pos细胞是创伤时存在的G8pos细胞的子代。晶状体上皮离体外植体中的G8pos细胞在T0时用G8 mAb和罗丹明缀合的第二抗体标记。将具有标记的G8细胞的外植体孵育并在损伤后追踪G8细胞24小时(图6A-6F)或72小时(图6G-6I)，此时将其固定并再次用G8 mAb标记，这次用Alexa-Fluor 488缀合的第二抗体标记。图6A-6C和图6G-6I是扩大后的小境，图6D-6F是位于前沿的细胞。用带Alexa-Fluor 488标签的G8标记的所有细胞(图6B，图6E，图6H)也用示踪的带罗丹明标签的G8标记(图6A，图6D，图6G)，如在叠加图(图6C，图6F，图6I)中所看见的一样。这些结果证明了参与晶状体上皮愈合的G8pos细胞来源于在损伤时就存在的G8pos前体细胞并且不包括后来募集至G8谱系的细胞。尺寸条20μm。
图7显示G8pos细胞是成肌纤维细胞前体。培养6天的受创伤晶状体上皮(图7A-7C)对G8抗原(图7A)和α-SMA(图7B)进行双重标记，见图7C的叠加图。在G8pos细胞的集落内存在有从G8pos细胞到成肌纤维细胞的进程(progression)：几乎不表达到不表达α-SMA的G8pos细胞(白色箭头)，表达α-SMA但尚未组构成应激纤维的G8pos细胞(箭头)，含有应激纤维的带α-SMA的G8pos细胞(空心箭头)，和丢失了G8抗原的成肌纤维细胞(虚箭头)。在上述的同一进程中，让外植体也在允许G8pos细胞迁移到坚硬培养皿上的条件下生长，这促进了G8细胞在3天之内向成肌纤维细胞的分化(图7D-7F)。尺寸条20μm。图7G、图7H显示G8pos细胞在培养第1天在上皮外植体中被清除，即通过用G8 mAb标记它们并用补体C溶解它们。图7G提供在G8+C(与C相比)中的溶解细胞的锥虫蓝摄取标记区域(闭环区域)，这被在消除后第1天的细胞损失所证实。图7H显示在培养第1天、再培养5天和对α-SMA和β-肌动蛋白免疫转印的暴露于G8+C、单独的G8、单独的C或未处理(U)的上皮外植体。G8细胞的消除阻断了α-SMA的表达。
图8A是在石蜡中包埋、切片和用苏木精和伊红染色的成年小鼠眼的影像图。图8B和图8C中的箭头表示在荧光显微照片中在较高的放大倍数下显示的区域。在图8B和图8C中，用G8抗体标记的细胞用箭头显示。细胞核也被染色。
图9A-9D是分别针对G8抗原、α平滑肌肌动蛋白(SMA)、肌球蛋白和MyoD蛋白的存在染色的横纹肌肉瘤细胞的影像图。
发明详述
据推测晶状体由单一细胞类型——上皮细胞组成。因此，可以假设在晶状体中的成肌纤维细胞是由晶状体上皮细胞经历上皮-间充质转换过程发育而来。这种转分化可以通过α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达来鉴定。
本文提供一种针对晶状体纤维化疾病的模型，该模型中，培养的鸡胚晶状体重演了囊混浊后晶状体纤维化病变的主要特征，即增殖、跨后囊迁移和间充质标记的表达。这个模型用来鉴定负责引起纤维化的细胞。具体地说，骨骼肌干细胞(skm干细胞)，一种新鉴定出的在晶状体中的表达MyoD mRNA和G8抗原的细胞群，已确认在晶状体纤维化疾病的发展中起主要作用。
正如下文所证明的，晶状体含有独特的表达骨骼肌谱系标记的干细胞亚群。这些skm干细胞存在于中纬线上皮里面的小境中。损伤后，skm干细胞被激活以从上皮中出来并且表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。skm干细胞负责α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)即一种成肌纤维细胞标记的表达。这些结果表明，skm干细胞亚群是晶状体的纤维化疾病的病因。
后囊混浊(PCO)是在白内障手术后20-40％的患者中所发生的一种疾病。白内障手术后所留下来的晶状体上皮细胞迁移到晶状体的透明后囊上。在PCO的发展过程中，从上皮中出现的细胞亚群负责引起视力下降的纤维化变化。正如本文所证明的，具有成肌纤维细胞样特性的细胞起源于埋在晶状体上皮中的骨骼肌干细胞。晶状体中的骨骼肌干细胞可以基于其表达骨骼肌特异性转录因子MyoD(例如MyoD mRNA)和G8抗原进行鉴定。骨骼肌干细胞也可以表达成头蛋白(Noggin)。
根据本发明，提供抑制、预防、降低纤维化疾病/纤维化、特别是眼纤维化疾病的风险和/或治疗纤维化疾病/纤维化、特别是眼纤维化疾病的方法。在一个具体的实施方案中，本发明的方法抑制器官或组织(例如心脏、皮肤、肠、肺、肝和/或肾)的纤维化。在一个具体的实施方案中，该方法包括减少和/或消除眼、特别是晶状体中的骨骼肌干细胞。在一个优选的实施方案中，眼纤维化疾病是一种晶状体纤维化疾病。眼纤维化疾病包括但不限于先天性眼纤维化综合征、眼变应性疾病(例如眼变应性炎症)、角膜的纤维化、小梁网的纤维化、视网膜的纤维化和晶状体纤维化疾病。晶状体纤维化疾病包括但不限于后囊混浊和白内障(例如前囊下白内障)。
骨骼肌干细胞的切除可以通过各种方法来实现。在一个具体的实施方案中，本发明的方法利用了骨骼肌干细胞具有不同于其它细胞、特别是晶状体上皮细胞的分子(例如在质膜上)的事实。在本发明一个具体的实施方案中，抑制、预防、降低晶状体纤维化疾病的风险和/或治疗晶状体纤维化疾病的方法包括给予至少一种分子，该分子包含任选具有至少一种细胞毒性分子(例如与其缀合)的至少一种骨骼肌干细胞靶向部分。本发明的分子可含在至少一种药学上可接受的载体中。在一个具体的实施方案中，靶向部分与细胞毒性分子共价连接，任选通过连接域(linking domain)。在另一个实施方案中，细胞毒性分子与对靶向部分(例如识别G8抗体的抗体)具有特定亲和力的分子相连。在又一个实施方案中，靶向部分和细胞毒性分子不是共价连接的。举例来说，本发明的方法可包括给予在一种药物组合物或者在序贯或同时给予的单独的药物组合物中的G8抗体(一种skm干细胞靶向分子)和补体。
特异性地靶向骨骼肌干细胞可以通过特异性地结合细胞表面分子，例如与配体和/或抗体特异性地结合来实现，其中与晶状体上皮细胞相比较，所述细胞表面分子对于骨骼肌干细胞来说是独特的。对于骨骼肌干细胞，细胞表面靶包括但不限于G8抗原、多配体蛋白聚糖(syndecan)(多配体蛋白聚糖1-4)、c-Met(间充质-上皮过渡因子；肝细胞生长因子受体(HGFR))、CD34和M-钙黏着蛋白。在一个具体的实施方案中，细胞表面靶是G8抗原。因此，本发明的靶向部分特异性地结合骨骼肌干细胞的细胞表面靶以把其它晶状体细胞(例如晶状体上皮细胞)全部排除在外。
可通过使靶向部分与诱导细胞死亡的试剂(例如细胞毒性分子)偶联来消除/减少骨骼肌干细胞。细胞毒性分子包括但不限于补体(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、牛、马和人的补体；例如含有补体的血液/血清级分；例如补体成分/蛋白质；例如补体的激活物)、纳米颗粒和纳米管(例如热敏性碳纳米晶体；参见例如Chakravarty等(2008)PNAS 105：8697-8702)和Cho等(2008)Clin.Cancer Res.，14：1310-1316)、细胞毒性(cytoxic)抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin))、阳离子两亲性裂解肽(例如KLA(氨基酸序列：KLAKLAKKLAKLAK(SEQID NO：2))和PTP(前列腺特异性膜抗原-靶向肽：CQKHHNYLC(SEQ ID NO：3)))、放射性核素和毒素。毒素可得自各种各样的来源，例如植物、细菌、动物和人类，或者可以是合成毒素(药物)，并且包括但不限于腐尸碱、蓖麻毒蛋白(例如蓖麻毒蛋白A)、相思豆毒蛋白、溴化乙锭、白喉毒素、假单胞菌外毒素、PE40、PE38、皂草苷(saporin)、多花白树毒蛋白(gelonin)、RNA酶、肽核酸(PNAs)、1型或2型核糖体失活蛋白(RIP)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、异株泻根毒蛋白(bryodin)、苦瓜蛋白、化疗剂和三角梅毒蛋白(bouganin)。本发明的放射性核素包括但不限于正电子发射同位素和α-发射体、β-发射体、γ-发射体、俄歇(Auger)-发射体和低能电子-发射体。在一个具体的实施方案中，放射性核素是α-发射体或俄歇-发射体。放射性同位素包括但不限于13N、18F、32P、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、67Cu、77Br、80mBr、82Rb、86Y、90Y、95Ru、97Ru、99mTc、103Ru、105Ru、111In、113mIn、113Sn、121mTe、122mTe、125mTe、123I、124I、125I、126I、131I、133I、165Tm、167Tm、168Tm、177Lu、186Re、188Re、195mHg、211At、212Bi、213Bi和225Ac。在又一个实施方案中，含有放射性核素的分子可以与放射性增敏剂一起给予。
本发明包括组合物，该组合物包含1)任选具有至少一种细胞毒素(例如与其缀合)的至少一种靶向部分，和2)至少一种药学上可接受的载体。这样的组合物可以按治疗有效量给予到有需要的患者用于治疗纤维化疾病、特别是晶状体纤维化疾病。可以把本发明的组合物装在试剂盒内。
本发明的组合物可以通过任何合适的途径，例如可以通过注射(例如对于局部(直接，包括眼内透镜)或系统给药)、口服、经肺、局部、经鼻或其它给药方式给予。该组合物可以通过任何合适的方式给予，包括胃肠外、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、局部、吸入、经皮、眼内、肺内、动脉内(intraareterial)、直肠内、肌内和鼻内给药。在一个优选的实施方案中，将该组合物直接给予到眼、特别是晶状体。一般而言，该组合物中的药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。该组合物可以包括各种缓冲剂内容(例如Tris HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；和添加剂例如去污剂和增溶剂(例如吐温80(Tween 80)、聚山梨酯80(Polysorbate 80))、抗氧剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增量(bulking)物质(例如乳糖、甘露醇)。该组合物也可以掺入到高分子化合物例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚丙交酯/聚乙交酯共聚物、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中，或者掺入到脂质体中。这样的组合物可以影响本发明药物组合物各组分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990，MackPublishing Co.，Easton，PA 18042)，第1435-1712页，所述文献通过引用结合到本文中。本发明的药物组合物可以制成例如液体形式，或者可以制成干粉形式(例如冻干的粉末，供后来的重配用)。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物包含滴眼剂、可注射溶液或眼膏。可利用很细的针把可注射溶液直接注射到晶状体或邻近组织中。也可以通过接触透镜或更优选眼内透镜(例如白内障手术中使用的眼内透镜)将这种组合物给予到眼。所述透镜可以用该组合物涂覆和/或包埋，或者可以将其浸泡在该组合物中。
在又一个实施方案中，本发明的组合物可以在白内障手术时、白内障手术后或白内障手术前给予以防止纤维化(例如引起PCO的纤维化)。在再另一个实施方案中，本发明的组合物可以在去除纤维细胞团块后直接注射到晶状体囊的囊袋内。由于晶状体是无血管的，因此预期本发明的分子(例如偶联抗体)不会进入体循环。
本文描述的操作用来特异性地靶向和消除/减少晶状体上皮中的骨骼肌干细胞。然而，本发明的方法可用来清除其它组织中的骨骼肌干细胞以治疗、抑制和/或预防与异常行为和/或骨骼肌干细胞数量和/或异常纤维化相关的其它疾病和病变。这样的疾病和病变包括例如瘢痕组织形成(例如皮肤、心脏或肝脏的瘢痕组织形成)。
定义
提供下面的定义便于对本发明的理解：
术语“纤维化”是指胞外基质蛋白的任何过度产生或沉积。纤维化包括纤维性组织的任何异常加工或纤维样变性或纤维变性。纤维化可以由各种损伤或疾病所引起。术语“眼纤维化”是指影响眼或其某一部位的纤维化。
“抗体”或“抗体分子”是与特定抗原结合的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单域抗体(Dab)和双特异性抗体。本文所用的抗体或抗体分子涵盖了重组产生的完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、F(v)、scFv、scFv2、scFv-Fc、小抗体(minibody)、双抗体(diabody)、四抗体(tetrabody)、单可变域(例如重链可变区(variable heavydomain)、轻链可变区(variable light domain))和双特异性的。单域抗体(Dabs)可以由单一轻链或重链可变区组成。本发明还包括Affibody分子(Affibody，Bromma，Sweden)和肽抗体(peptabody)(Terskikh等(1997)PNAS 94：1663-1668)。在本发明的某个实施方案中，将对骨骼肌干细胞上的靶分子有特异性的轻链可变区和/或重链可变区插入到上述抗体构建体(construct)的骨架(backbone)中。用于重组法制备抗体的方法是本领域众所周知的。“Fv”是含有抗原识别和结合位点的抗体片段。这个区域由一条重链可变区和一条轻链可变区以紧密、非共价缔合的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变区的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体来说，这六个CDR赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，甚至单可变区(或仅包含对抗原有特异性的三个CDR的Fv一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲和性常常低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH区和VL区，其中这些结构域存在于一条多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH区和VL区之间还包含多肽接头(linker)，使得scFv能够形成抗原结合所需要的结构。术语“双抗体(diabody)”是指具有两个抗原结合位点的抗体小片段，这些片段包含连在同一多肽链上的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)(VH-VL)。通过利用短到不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448。在又一个实施方案中，抗体是人源化的。
就抗体而论，术语“免疫特异性的”是指在含有抗原生物分子的混合群体的样品中，能与目标蛋白质或化合物的一个或多个表位结合但基本上不识别和结合其它分子的抗体。术语“特异性地结合”是指在含有生物分子的混合群体的样品中，目标多肽或化合物与靶多肽或化合物的结合，同时基本上不识别和结合其它分子。举例来说，“特异性结合对”包含彼此具有特殊特异性的并且在正常条件下彼此结合优于与其它分子结合的特异性结合成员和结合配偶体(binding partner)。
术语“缀合的”是指通过本发明的两个分子或化合物的共价或非共价方式相连接。这些分子可以通过接头域相连接。
术语“接头域(linker domain)”是指包含靶向部分与细胞毒素共价连接的共价键或原子链的化学部分。在一个具体的实施方案中，接头可含有0(即化学键)～约500个原子、约1～约100个原子或约1～约50个原子。示例性接头可包含至少一个任选取代的、饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷基、烯基或芳基。接头也可以是多肽(例如约1～约20个氨基酸)。
本文所用的术语“放射性增敏剂”定义为按治疗有效量给予动物以增加细胞对辐射的敏感性的分子。放射性增敏剂能增加细胞对辐射毒性效应的敏感性是已知的。放射性增敏剂包括但不限于2-硝基咪唑化合物和苯并三嗪二氧化物化合物、卤代嘧啶、甲硝唑、米索硝唑、去甲米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。
“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府管理局批准的或在美国药典或其它公认的药典中列举的用于动物、更特别是人类的。
“载体”是指例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)、抗氧剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如吐温80、聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如Tris HCl、醋酸盐、磷酸盐)、抗微生物剂、增量物质(例如乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或溶媒，其与本发明的活性剂一起给予。药学上可接受的载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水或盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液优选用作载体，特别是对于可注射溶液。合适的药用载体描述于“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，PA)；Gennaro，A.R.，Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第20版，(Lippincott，Williams和Wilkins)，2000；Liberman等(编著)，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；及Kibbe等(编著)，Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版)，American PharmaceuticalAssociation，Washington，1999。
下面的实施例提供了实施本发明的说明性方法，但并不意味以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
在模拟白内障手术之后，按先前所述方法用针把鸡晶状体囊袋固定在培养皿上(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。通过G8抗原的免疫荧光定位(图1)、MyoD mRNA的原位杂交(图3)及共焦和落射荧光显微镜术对骨骼肌干细胞(skm干细胞)进行了鉴定。G8抗体识别鸡胚和胎(Gerhart等(2001)J.Cell Biol.，155：381-391；Gerhart等(2004)J.Cell Biol.，164：739-746；Strony等(2005)Gene Expr.Patterns，5：387-395)和成体小鼠组织(图3)中表达MyoD mRNA的细胞中特异性表达的表面抗原。使用与Cy3缀合的DNA树状聚体(dendrimer)(参见例如Gerhart等(2004)Biol.Proced.Online，6：149-156)和下列反义寡核苷酸序列：鸡MyoD，5′-TTCTCAAGAGCAAATACTCACCATTTGGTGATTCCGTGTAGTA-3′(L34006；Dechesne等(1994)Mol.Cell.Biol.，14：5474-5486)来检测MyoD的信使RNA。荧光树状聚体得自Genisphere，Inc.(Hatfield，PA)。用树状聚体和抗体按先前所述方法进行双重标记(Gerhart等(2001)J.Cell Biol.，155：381-391；Gerhart等(2004)J.Cell Biol.，164：739-746；Strony等(2005)Gene Expr.Patterns，5：387-395；Gerhart等(2004)Biol.Proced.Online，6：149-156)。
在第1天切除skm干细胞，通过裂解用G8抗体标记的细胞(参见例如Gerhart等(2001)J.Cell Biol.，155：381-391；Gerhart等(2004)J.Cell Biol.，164：739-746；Strony等(2005)Gene Exp.Patterns，5：387-395；Gerhart等(2007)J.Cell Biol.，178：649-660；Gerhart等(2006)J.Cell Biol.，175：283-292；Gerhart等(2008)Biol.Proc.Online，10：74-82)并通过在补体中孵育获得PCO培养物(图2)。更准确地讲，将晶状体与按1∶20在Hanks氏缓冲盐水(含有0.1％牛血清白蛋白(BSA))中稀释的G8抗体一起于37℃孵育1小时，洗涤后在按1∶40在Hanks氏缓冲盐水(含有0.1％BSA)中稀释的幼兔补体(CedarlaneLaboratories，Burlington，NC)中在室温下孵育30分钟。用蛋白质印迹分析法测定α-SMA的表达(图2)。
在晶状体上皮细胞中归巢的晶状体的中纬线区带(EQ)中定位的小境里面检测到G8/MyoD mRNA阳性skm干细胞亚群。这一发现首次证明了在晶状体上皮中存在具有干细胞特性并且其表型不同于晶状体上皮细胞的细胞群。在用模拟白内障手术诱导的损伤后，skm细胞从其小境中快速出现并具有间充质形态。这些skm干细胞在骰状晶状体上皮细胞单层的顶部之上慢慢移动并迁移到共同迁移上皮细胞片层的前沿。skm干细胞的切除抑制了后囊混浊培养物中α-SMA表达的表达。
也通过G8抗原的免疫荧光定位、MyoD mRNA的原位杂交和落射荧光显微镜术对骨骼肌干细胞进行了鉴定(图3)。因此，显然在晶状体中存在骨骼肌干细胞并不局限鸡，因为skm干细胞也存在于其它动物(包括哺乳动物)。
实施例2
间充质细胞在上皮创伤愈合、纤维化和癌症中起重要的作用(Radisky等(2007)J.Cell Biochem.，101：830-9；Eyden，B.(2008)J.Cell Mol.Med.，12：22-37；Polyak等(2009)Nat.Rev.Cancer 9：265-73)。在上皮片层内具有间充质表型的细胞的出现被认为是主要由内源上皮细胞的转化(通常称为上皮-间充质转换(EMT))所引起(Baum等(2008)Semin.Cell Dev.Biol.，19：294-308；Lee等(2006)J.Cell Biol.，172：973-81)。在本研究中，研究了上皮含有在上皮创伤愈合中起作用并可接收信号以分化成为成肌纤维细胞的间充质前体细胞亚群的可能性。这些研究的模型是一种离体培养系统，最初开发出来是为了研究称为后囊混浊(PCO)的晶状体纤维化疾病(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。采用这种培养物模型有可能跟踪完整上皮对天然微环境内的临床相关创伤的应答。上皮的创伤是在胚胎第15天鸡晶状体中模拟白内障手术的结果。这种显微外科操作包括去除来自晶状体囊内的晶状体纤维细胞团块即一种围绕整个晶状体的厚基底膜，这使得晶状体囊后面剥除了细胞(见图5A中的示意图)。晶状体上皮保持完整并粘连在具有主创伤边缘的囊上，主创伤边缘为曾连有纤维细胞的区域的边界(前沿，图5A)。通过在其前区切几个切口，产生了另外的创伤边缘(切口边缘，图5A)，再使组织变扁平，用针固定在培养皿上使细胞一侧朝上并培养成为离体外植体(见图5A中的模型)。采用高分辨率共焦显微术，该方法使得有可能跟踪受创伤上皮对损伤的应答。这种创伤模型中的上皮细胞快速开始共同迁移横过裸露的基底膜囊进入受创伤区，在培养物中几天之内伤口就被上皮细胞填满了(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。只有在创伤愈合过程完成之后才表达与生化检测的成肌纤维细胞出现相关的分子标记(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)，证明了在这个离体模型中，纤维化疾病的发展主要是迁移后和创伤后闭合事件。
在本研究中检验的假设是：1)在成熟晶状体的上皮细胞中存在间充质前体亚群，2)这些细胞可以在损伤后被激活以调节创伤愈合过程，和3)这些细胞的子代具有变成成肌纤维细胞(一种与纤维化疾病发展相关的表型)的潜力。在晶状体损伤模型中作为间充质前体细胞候选者研究的细胞类型根据其细胞表面抗原G8的表达进行了鉴定。用G8单克隆抗体(mAb)标记的细胞是上胚层的一个亚群，上胚层是产生胚胎所有三个胚层的组织(Bellairs，R.(1986)Anat Embryol (Berl)174：1-14)。这些G8pos细胞也表达生肌转录因子myoD的mRNA(George-Weinstein等(1996)Dev.Biol.，173：279-91；Gerhart等(2000)J.Cell.Biol.，149：825-34)。在发育过程中，大多数G8pos/MyoDpos上胚层细胞都被整合到体节中，在此其功能是调节肌肉分化(Gerhart等(2006)J.Cell.Biol.，175：283-92)；然而，G8pos/MyoDpos上胚层细胞当在培养皿中分离和生长时本身就有生肌潜力(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92；Strony等(2005)Gene Expr.Patterns，5：387-95；Gerhart等(2004)J.Cell.Biol.，164：739-46)。有趣的是，在非肌肉组织的细胞中还检测到表达G8抗原和MyoD两者的细胞亚群(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92；Asakura等(1995)Dev.Biol.，171：386-98；Chen等(2005)Genesis 41：116-21；Grounds等(1992)Exp.Cell.Res.，198：357-61)，所述非肌肉组织包括胚胎晶状体(E5，Gerhart等(2009)Developmental Biology 336：30-41)，但是这些细胞亚群在这些组织中的功能是未知的。
材料与方法
离体上皮外植体制备
为了制备离体上皮外植体，从胚胎第15天(E15)鸡胚(Truslow Farms，Chestertown，MD)中通过解剖眼摘出晶状体(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。然后，在前晶状体囊即围绕晶状体的厚基底膜内切一个切口，通过该切口水洗脱去除晶状体纤维细胞团块。这个过程(其中晶状体上皮仍然紧紧粘连在囊上)模拟了白内障手术。上皮的主创伤边缘(前沿)接在曾连有纤维细胞的区域的边界(模型，图5A)。在该组织的前区进行切割，产生了另外的创伤边缘，使外植体变扁平并用针固定在培养皿上使细胞一侧朝上(图5A)。通过显微镜成像跟踪晶状体上皮对其天然微环境内创伤的应答。将离体上皮外植体在含有1％青霉素-链霉素(Mediatech-Cellgro，Manassas，VA)、1％L-谷氨酰胺(Mediatech-Cellgro，Manassas，VA)及按照说明加或不加10％胎牛血清(Invitrogen)的培养基199(Invitrogen)中进行培养。在设计为保持G8pos细胞的位置如其在体内(in vivo)存在时一样的实验中，在制备上皮外植体之前，将晶状体在3.7％甲醛中固定10分钟。
免疫荧光和原位杂交
对于免疫荧光研究，上皮外植体按先前所述方法进行免疫染色(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。简而言之，在免疫染色之前，将外植体在含3.7％甲醛的PBS中固定后在含0.25％Triton X-100的PBS中透化处理。将细胞与原代抗血清一起孵育后再与罗丹明-(Jackson Laboratories，West Chester，PA and MilliporeCorp.，Bedford，MA)、荧光素-(Jackson Laboratories，West Chester，PA)或Alexa Fluor488-(Invitrogen-Molecular Probes；Eugene，OR)缀合的第二抗体一起孵育。对于免疫荧光研究使用了下列第一抗体：G8 mAb(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92)波形蛋白(多克隆)抗体(由Paul FitzGerald慷概赠送的礼物)(University of California，Davis，CA)和荧光素(FITC)-缀合的α-SMA mAb(Sigma，St.Louis，MO)。有些外植体用结合丝状肌动蛋白的Alexa Fluor 488-缀合的鬼笔毒环肽和TO-PRO3(一种核染料)(Invitrogen-Molecular Probes；Eugene，OR)进行了复染。所有经免疫染色的样品都用共焦显微镜(LSM 510；Carl Zeiss，Oberkochen，德国)进行了检查，只是还要进行原位杂交的样品除外。将单图像或Z-垛叠(stack)收集起来并进行分析；得出的数据表示从顶部到基底方向成像的单光学平面或正交切面。
对于原位杂交研究，MyoD的多种mRNA用与Cy3缀合的DNA树状聚体和下列反义寡核苷酸序列进行了检测：鸡MyoD，5′-TTCTCAAGAGCAAATACTCACCATTTGGTGATTCCGTGTAGTA-3′(SEQ ID NO：1)(Genisphere，Inc.，Hatfield，PA)(Gerhart等(2006)J.Cell.Biol.，175：283-92；Gerhart等(2004)Biol.Proced.Online，6：149-156)。对外植体的G8抗原和MyoDmRNA进行双重标记，按先前所述方法(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92)用Hoechst进行复染，并用落射荧光显微镜(Eclipse E800，Nikon)进行检查。图像用摄像机(Evolution QE；Media Cybernetics)和Image-Pro Plus软件(Phase 3 Imaging Systems)捕获。
细胞示踪
G8细胞按先前所述方法标记用于示踪(Gerhart等(2006)J.Cell.Biol.，175：283-92)。简而言之，将晶状体离体上皮外植体在T0时在含有G8 mAb(1∶40)的培养基199中在室温下孵育45分钟，在培养基199中漂洗，然后在罗丹明缀合的IgM抗体(Millipore Corp.，Bedford，MA)中在室温下孵育30分钟。标记的外植体在培养基199中漂洗，置于无血清培养基(SFM：含有1％青霉素链霉素和L-谷氨酰胺的培养基199)中，于37℃孵育。在培养物中24小时或72小时后，将上皮外植体在3.7％甲醛中固定。为了确定损伤后24或72小时对上皮创伤愈合应答的G8pos细胞是否的确是在T0时存在的G8pos细胞的子代，将固定后的外植体此时再次用G8 mAb(1∶40)标记，然后用与Alexa Fluor 488缀合的IgM第二抗体(Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR)标记。先前的命运作图研究(其中追踪G8pos细胞从上胚层到胚胎组织)证明，标记上胚层中的G8pos细胞的G8 mAb在整个研究当中保持与这些细胞缔合并且不向周围细胞转移(Gerhart等(2006)J.Cell.Biol.，175：283-92)。
上皮细胞外植体中的G8pos细胞切除
上皮外植体中的G8pos细胞切除按照先前对鸡胚上胚层内G8pos细胞的切除法所描述的程序进行(Gerhart等(2006)J.Cell.Biol.，175：283-92)。对于这些研究，在SFM中制备了离体晶状体上皮外植体。在第1天培养时，将上皮外植体与在Hanks氏缓冲盐水中稀释的G8抗原(1∶20)一起于37℃孵育1小时，然后在含有0.1％BSA的Hanks氏缓冲盐水中稀释的幼兔补体(1∶40；Cedar Lane，Inc，Burlington，Ontario，Canada)中在室温下孵育30分钟。幼兔补体按照制造商的方案(Cedar Lane，Inc，Burlington，Ontario，Canada)来制备。对照外植体保持不处理或者单独与G8 mAb或补体一起孵育。处理后，漂洗外植体，再与SFM一起孵育。处理后立即测定溶解的G8细胞的存在，即将离体上皮外植体在含0.2％锥虫蓝的PBS中于37℃孵育15分钟，再用解剖显微镜(SMZ800；Nikon，Tokyo，Japan)和Nikon DigitalSight DS-Fil相机显现，图像用Nikon NIS-Elements成像软件捕获。
蛋白质印迹分析
在第6天，上皮外植体在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO)的OGT缓冲液(44.4mM正辛基β-D-吡喃葡糖苷，1％Triton X-100，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mMEDTA，10mM咪唑)中提取和裂解。用BCA试验(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。蛋白质在Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上进行分离，用电泳法转移到膜(Immobilon-P；Millipore Corp.，Bedford，MA)上并进行免疫印迹。为了检测，使用了ECL试剂(AmershamLife Sciences，Arlington Heights，IL)。所有凝胶都在还原条件下跑电泳。蛋白质印迹法所用的抗体包括β-肌动蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(Sigma，St Louis，MO)。
结果
已鉴定出成熟晶状体(E15)中存在G8pos细胞并测定了G8pos细胞的定位、原位，集中在G8pos细胞与晶状体上皮的缔合关系。为了保持G8pos细胞的位置如其在体内存在时一样，在制备晶状体上皮外植体之前将晶状体进行固定。外植体中的G8pos细胞依次用抗G8抗原的mAb和罗丹明缀合的第二抗体进行了标记。培养物用荧光素缀合的鬼笔毒环肽进行共染色以标出丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)并揭示外植体中细胞的细胞构造。标记的外植体用高分辨率共焦显微术进行了检查(图4)。发现G8pos细胞定位在晶状体上皮细胞中归巢的小境内(图4A)。G8pos细胞的典型小境(图4B中较高的放大倍数下显示，下图)平均含有7个细胞(7.57+/-.66；平均值+/-SEM)。在上皮外植体中检测到多达14个这样的小境。在晶状体上皮内G8pos细胞小境的定位对应于完整晶状体的中纬线区。以前的研究表明，G8pos细胞常常共表达生肌转录因子MyoD的mRNA。用G8 mAb和用DNA树状聚体双重标记上皮外植体检查到E15晶状体上皮内MyoD mRNA由G8pos细胞表达，其中G8 mAb用荧光素标记，DNA树状聚体与MyoDmRNA的反义寡核苷酸序列和荧光染料Cy3两者缀合(Gerhart等(2000)J.Cell.Biol.，149：825-34；Gerhart等(2004)Biol.Proced.Online 6：149-156)。荧光成像显示，晶状体上皮中存在的G8pos细胞也表达MyoD mRNA(插图，图4A)。
创建了通过激光扫描共焦显微术采集的Z-垛叠的正交切面以研究晶状体上皮内G8pos细胞小境的微环境。在小境的区域中按顶部到基底方向以一个微米厚的光切面获取Z-垛叠。正交切面的分析揭示出G8pos细胞的小境沿晶状体上皮细胞顶表面定位，其中与晶状体基底膜缔合的G8pos细胞证据很少(图4B，参见箭头，顶图)。G8pos细胞小境的独特位置把这些细胞定位，使得它们能够作为快速应答者对上皮的损伤发挥作用。
本研究的一个重要方面是检查G8pos前体细胞对晶状体上皮损伤的应答。对于这些研究，晶状体上皮通过模拟白内障手术造成创伤并置于培养物中培养成离体外植体(图5A)。在含血清培养基中培养1小时后测定了G8pos前体细胞对上皮损伤的应答。此时，将培养物固定，用抗G8抗原的抗体免疫染色，对F-肌动蛋白共染色，用共焦显微术检查(图5B-F)。图像分析揭示出在损伤后的这一短时间内，G8pos前体细胞就已经从其小境中出来并且其群体大小已扩大(图5B，C)。另外，G8pos细胞已快速地迁移到伤口边缘(图5D-F)，既是邻接已去除了纤维细胞的前沿(图5D，E)也是已使上皮变扁平的切口边缘(图5F)。通过用共焦成像采集的Z-垛叠的正交切面揭示出G8pos细胞通过沿上皮顶表面迁移游到伤口边缘(图5E，箭头，顶图)。迁移中的G8pos细胞表现出间充质形态，一种由其表达间充质标记波形蛋白证实的表型(图5G-I)。这些结果证明了晶状体上皮内的G8pos间充质前体细胞亚群通过从其小境中出来、扩大并迁移到伤口边缘而对上皮的损伤作出快速反应。
在需时三天左右的整个创伤愈合过程中，发现G8pos细胞沿着晶状体上皮顶表面以及在伤口边缘处成簇。为了研究对上皮创伤应答的G8pos细胞是否的确是在时间0(T0，紧接在显微手术之后)时存在的G8pos细胞的子代，将G8pos细胞在T0时用G8抗体和罗丹明缀合的第二抗体标记并在创伤闭合时期中进行跟踪。在培养物中培养24小时(图6A-F)和72小时(图6G-I)时，将外植体固定，在这些时间中存在的G8pos细胞用G8 mAb免疫染色，其中G8 mAb用Alexa Fluor 488缀合的第二抗体标记过。共焦分析显示，在活动性创伤愈合(24小时)期间，所有G8pos/Alexa Fluor 488标记的细胞也都用G8-罗丹明标签标记，不论G8pos细胞是沿着上皮成簇定位(图6A-C)还是已迁移到创伤前沿(图6D-F)。甚至当创伤愈合完成时(72小时)，所有G8pos/Alexa Fluor 488标记的细胞都用G8-罗丹明标签共标记(图6G-I)。这些结果证明参与晶状体上皮创伤愈合应答的G8pos细胞来源于在T0时就存在的G8pos细胞群。
受创伤晶状体上皮的愈合(创伤闭合)过程在用生化方法检测到与纤维化相关的分子(例如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白)之前就出现了(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。然而，在完成创伤愈合后的几天以内，这些分子的表达均被诱导。此时，具有新出现的成肌纤维细胞典型间充质形态的α-SMA阳性细胞出现在晶状体上皮细胞中(Walker等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48：2214-23)。现在，利用高分辨率共焦成像研究了在对晶状体上皮损伤应答中被激活的G8pos细胞是否是离体损伤模型中稍后时间出现的成肌纤维细胞的前体。成肌纤维细胞定义为已把α-SMA组构成应激纤维的间充质细胞(Tomasek等(2002)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，3：349-63；Hinz等(2007)Am.J.Pathol.，170：1807-16)，一种给这些细胞提供收缩功能的特征，该功能将它们与PCO等纤维化疾病相联系。为了检查G8pos细胞是否是培养物模型中出现的成肌纤维细胞的前体，对在无血清条件下培养的离体外植体进行了图像分析，培养第6天固定，用G8 mAb和罗丹明缀合的第二抗体免疫标记，再用与荧光素直接缀合的αSMA抗体共标记(图7A-C)。共焦显微术成像揭示出含有α-SMA阳性应激纤维的G8pos细胞的存在，证明了G8pos细胞的确是该创伤模型中成肌纤维细胞的来源。另外，发现了与上皮缔合的G8pos细胞小簇内有G8pos前体细胞到成肌纤维细胞的进程。过渡细胞类型包括几乎不表达到不表达αSMA的G8pos细胞(白色箭头)，表达αSMA但αSMA尚未组构成应激纤维的G8pos细胞(箭头)，和含有αSMA阳性应激纤维的G8pos细胞(空心箭头)，表达G8的成肌纤维细胞。本研究还证明G8细胞向成肌纤维细胞分化中的最后一步是前体细胞抗原G8的丢失(虚箭头)。分化时前体细胞标记的丢失是这些细胞与许多前体细胞群的分化子代共享的一个特征(Cattaneo等(1990)Nature 347：762-5；Bai等(2009)Neuroreport.，20：918-22)。
接下来检查了是否有可能促使G8pos细胞分化成成肌纤维细胞。对于这些研究，利用了成肌纤维细胞发育已知在坚硬(rigid)环境下被增强的事实(Hinz，B.(2007)J.Invest.Dermatol.，127：526-37)，并让离体培养物在含血清培养基中生长，使得切口边缘处的G8pos细胞从晶状体囊迁移到坚硬培养皿上。在培养第3天，即在α-SMA阳性成肌纤维细胞已出现在其晶状体上皮的天然微环境内之前的时间点，对这种G8pos细胞群体检查了αSMA在G8pos细胞中的表达。结果证明当G8pos细胞接触到坚硬基底时促进从G8pos前体细胞向α-SMA阳性成肌纤维细胞的转换(图7D-F)。从G8pos细胞向成肌纤维细胞的转换过程与上述关于晶状体囊上成肌纤维细胞的出现情况相同。这些数据证明G8pos细胞能产生成肌纤维细胞。
最后，检查了当G8pos细胞在培养物中在第一天被消除时，α-SMA表达是否在离体培养物中被抑制，即通过用G8抗体标记它们并用补体溶解它们。处理的培养物中的细胞溶解用锥虫蓝摄取法予以证实，因为这种染料被活细胞排斥。用细胞小集落检测了锥虫蓝染色(图7G，G8+C，切除，参见前沿处的环绕的大集落)。锥虫蓝标记的集落分布类似于培养第1天典型存在的G8pos细胞的扩大集落分布。切除后24小时，通过来自锥虫蓝染色区域的细胞的后续损失证实了溶解(图7G，G8+C，切除后1天)。类似的细胞损失在单独用补体孵育的对照培养物中未观测到(图7G，C)。G8细胞切除后，将离体外植体(切除的和对照)培养6天，即未处理的对照培养物通常表达αSMA的时间点，如此处通过免疫印迹分析所显示(图7H，U)。αSMA的表达当在培养第1天切除G8pos细胞时被抑制(图7H，G8+C)，而在单独暴露于G8抗体(G8)或补体(C)的培养物时几乎对αSMA表达没有影响。这些结果证实G8pos细胞是成肌纤维细胞的前体。
在本研究中，报告了在晶状体上皮细胞中定位的小境中存在间充质前体细胞独特亚群的发现。这种细胞类型对上皮的损伤作出快速反应并具有分化成成肌纤维细胞的潜力。这些细胞的独特特征包括细胞表面抗原G8和MyoD mRNA的表达，这是它们与先前鉴定的上胚层亚群共享的特征，所述上胚层亚群变成掺入至各种胚胎组织(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92)，包括缺乏生肌潜力的那些，例如晶状体。在晶状体上皮创伤之后，G8pos亚群从其小境中出来，群体大小扩大，表现出间充质表型并迁移到伤口边缘。伤口边缘处间充质细胞的存在是许多上皮创伤愈合模型的特征，但是它们的出现通常归因于EMT。对受创伤晶状体上皮的本发明研究提示，G8pos/MyoDpos前体细胞是对损伤应答并定位到伤口边缘的间充质细胞的祖细胞的备选范例(alternate paradigm)。这种相同的前体群可以分化成成肌纤维细胞，其在创伤后的出现与纤维化疾病的发展相关。这一发现对晶状体纤维化疾病PCO发展具有特别的重要性，PCO是在白内障手术期间晶状体上皮创伤的后果。然而，在其它组织中表达G8抗原和/或MyoD的细胞小亚群的存在倾向于例如肺、肝和肾等的纤维化(Gerhart等(2001)J.Cell.Biol.，155：381-92；Mayer等(1997)J.Cell.Biol.，139：1477-84)，表明活化G8pos/MyoDpos分化成成肌纤维细胞的能力对许多组织中纤维化发展有贡献。
实施例3
将成年小鼠的眼在石蜡中包埋，切片后用苏木精和伊红染色(图8A)。在图8B和图8C中，箭头表示荧光显微照片中较高的放大倍数下显示的区域。晶状体中纬线附近的细胞用G8抗体标记(图8B和图8C中的箭头)。细胞核用染料染色。这些结果证明成年小鼠的晶状体中存在骨骼肌干细胞。
横纹肌肉瘤是含有类似于骨骼肌细胞的细胞的肿瘤(图9A-9D)。在人横纹肌肉瘤细胞的培养物中G8抗体也识别其抗原。横纹肌肉瘤细胞能合成也存在于成肌纤维细胞中的分子，包括G8抗原、α平滑肌肌动蛋白(SMA)、肌球蛋白和MyoD蛋白。这些结果表明G8抗体可用来检测人晶状体中的成肌纤维细胞。
尽管已经对本发明的某些优选实施方案作了描述并在上文进行了具体的举例说明，但是预期，本发明并不局限于所述的实施方案。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改，如同所附权利要求书中公开的一样。

Claims (5)

1.至少一种骨骼肌干细胞靶向分子在生产用于治疗或预防晶状体纤维化疾病的药物中的用途，其中所述骨骼肌干细胞靶向分子是G8抗体，其中所述骨骼肌干细胞靶向分子缀合至至少一种细胞毒性分子。
2.权利要求1的用途，其中所述骨骼肌干细胞靶向分子和细胞毒性分子包含在还包含至少一种药学上可接受的载体的组合物中。
3.权利要求1的用途，其中所述晶状体纤维化疾病是后囊混浊或前囊下白内障。
4.权利要求1的用途，其中所述细胞毒性分子选自补体、热敏性碳纳米晶体、细胞毒性抗生素、阳离子两亲性裂解肽、放射性核素和毒素。
5.权利要求1的用途，其中所述细胞毒性分子是补体。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2676946A1 (en) * 2009-08-28 2011-02-28 Lucie Peduto Adam12 inhibitors and their use against inflammation-induced fibrosis
JP2015511960A (ja) * 2012-03-09 2015-04-23 ランケナー インスティテュート フォー メディカル リサーチ がんを治療するための組成物及び方法
CN105188764B (zh) * 2013-03-21 2020-03-20 詹尼斯费尔公司 Dna嵌入剂的细胞递送
GB201312010D0 (en) * 2013-07-04 2013-08-21 Univ Birmingham Receptor Agonists
US11400099B2 (en) 2016-09-23 2022-08-02 Thomas Jefferson University Drug-induced epigenetic remodeling to prevent fibrosis
HU231426B1 (hu) * 2018-12-05 2023-08-28 Pharmacoidea Kft. Syndecan-3 45-384 aminosav közti régiójára specifikus ligandok alkalmazása neurodegenerativ kórképek kezelésére

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006128152A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Thomas Jefferson University Method to treat and prevent posterior capsule opacification

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2165851T3 (es) 1991-11-25 2002-04-01 Enzon Inc Proteinas multivalentes que se unen a antigenos.
US6180357B1 (en) * 1999-10-08 2001-01-30 Arius Research, Inc. Individualized patient-specific anti-cancer antibodies
WO2004072117A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Pharmacia Corporation Antibodies to c-met for the treatment of cancers
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006128152A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Thomas Jefferson University Method to treat and prevent posterior capsule opacification

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lens-specific Expression of TGFβ1 in Transgenic Mice Causes Anterior Subcapsular Cataracts;Y.Srinivasan et al;《J.Clin.Invest》;19980228;第101卷(第3期);第633页 *
MyoD-positive epiblast are present in mature fetal organs lacking skeletal muscle;Jacquelyn Gerhart et al;《JCB article》;20011029;第175卷(第2期);第382、385页 *

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