CN102335213A - 一种低毒的三七总皂苷注射剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低毒的三七总皂苷注射剂及其制备方法，该注射剂中含有以下重量百分比的活性成分：三七皂苷R₁ 9.5-15.0％、人参皂苷Rg₁ 37.0-56.0％、人参皂苷Re 5.0-8.0％、人参皂苷Rb₁ 21.0-32.0％、人参皂苷Rd不低于1.0％。本发明提供的三七总皂苷毒性低，不良反应少。

Description

一种低毒的三七总皂苷注射剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种具有治疗心脑血管等疾病的低毒三七总皂苷注射剂及其制备方法。

背景技术

三七总皂苷是临床上用于治疗心脑血管疾病的一种常用药。目前用于治疗心脑血管疾病的三七总皂苷注射制剂有：血栓通注射液、注射用血栓通、血塞通注射液、注射用血塞通。

2011年6月13日在《关于中药基本药物标准草案的公示(第五批)》中对三七总皂苷质量标准进行公示，公示稿对各注射剂中[异常毒性]及[溶血与凝聚]的规定分别如下：

由上表可见：

三七总皂苷注射剂的[异常毒性]指标可耐受供试品浓度为8mg/ml，原料三七总皂苷的[异常毒性]指标可耐受供试品浓度为15mg/ml。

三七总皂苷注射剂的[溶血与凝聚]指标可耐受供试品浓度为37.5mg/ml，公示标准中[溶血与凝聚]的检查法是按中国药典2010版附录规定，肉眼观察溶血与凝聚反应，若溶液中棕红色或红棕色絮状沉淀，轻轻倒转3次仍不分散，表明可能有红细胞凝聚发生，应进一步置显微镜下观察，如可见红细胞聚集为凝聚。

中国专利200610066204.0，专利名称为“一种治疗心脑血管疾病的三七药物组合物”，该专利控制毒性成分的方法是：因为三七总皂苷注射制剂中人参皂苷Rd的含量与不良反应发生率成正比例关系，故控制三七总皂苷活性成份组合物中人参皂苷Rd含量小于2.5％。按该专利的制备方法，注射剂的异常毒性可耐受供试品浓度为30mg/ml；含以人参皂苷Rd为代表的乙醇洗脱液急性毒性LD50最高为115mg/kg、异常毒性最高可耐受供试品浓度为4.5mg/ml。

据文献检索，人参皂苷Rd目前已明确的功效有以下方面：

1、能减轻NA所致小鼠耳廓毛细血管痉挛收缩的程度及相对增加毛细血管的开放数量，亦能相对增加小鼠耳廓毛细血管血流的速度。能显著改善微循环并适度延长凝血时间。

2、可以提高天然杀伤细胞(NK)活性和干扰素γ的产生水平，增强免疫机能，增强小鼠抑瘤率，减轻瘤重。

3、能促进T细胞增殖，提高天然杀伤细胞(NK)的活性，从而提高机体免疫力，并具有促进副肾皮质荷尔蒙分泌作用。

4、有效抑制H/R后人脐静脉内皮细胞的TPP水平的提高，从而抑制H/R导致的GJIC损伤；还可有效保护因I/R引起的肾损伤及近球细胞损伤。

5、能易化学习记忆过程，加强胆碱系统功能，提高神经可塑性，从而改善学习记忆功能。对东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍和环己米特引起的小鼠记忆巩固障碍均有不同程度的改善作用；但对乙醇引起的小鼠记忆再现障碍，由于个体差异较大而未见统计学显著意义的改善作用。

6、具有抑制Phe收缩主动脉环的作用。

7、人参皂苷Rd是一种具有抗肿瘤作用的中药提取物，能抑制癌细胞生长，为国家二类新药。

由以上可知，人参皂苷Rd具有自己独特的治疗功效，是三七总皂苷的重要组分之一，发明专利200610066204.0将人参皂苷Rd与杂质成分一并除去，可能会使三七总皂苷注射剂的药效受到影响。

在国家食品药品监督管理局2007年发布《关于开展注射剂类药品生产工艺和处方核查工作的通知》(国食药监办[2007]504号)，在其《通知》的附件2“部分中药注射剂高风险品种名单”中，四个不同批准文号的血塞通注射液分别排名17、28、19、30；附件3“部分有严重不良反应报告的注射剂品种名单”中，血塞通注射剂及血栓通注射剂分别排名10、22。可见三七总皂苷注射剂的风险及不良反应是注射剂品种中是很高的。

而且，尽管对杂质的去除方法也不断的跟进，提取物的纯度也越来越高，但是三七总皂苷注射剂的不良反应仍然无法避免。

中药作为一个复杂的成分，即使杂质含量少，仍然无法避免出现不良反应，究其原因，是该注射剂中还存在其他不能用现在手段检测到的物质，该物质导致了不良反应的发生。

针对现有注射剂中存在的问题，发明人经过大量的研究，最终提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种毒性低的三七总皂苷注射剂。

本发明的另一目的还提供了该注射剂的制备方法。

本发明提供的一种三七总皂苷注射剂，含有以下重量百分比的活性成分：三七皂苷R₁ 9.5-15.0％、人参皂苷Rg₁ 37.0-56.0％、人参皂苷Re 5.0-8.0％、人参皂苷Rb₁ 21.0-32.0％、人参皂苷Rd不低于1.0％。

优选地，对本发明提供的注射剂进行检测，[异常毒性项目]检测，用0.9％氯化钠注射液溶解的可耐受供试品(即三七总皂苷注射剂)的浓度达到20mg/ml以上，[溶血与凝聚]显微镜下检测，用0.9％氯化钠注射液溶解的可耐受供试品(即三七总皂苷注射剂)的浓度达到20mg/ml以上。

所述注射剂为注射液、冻干粉针或无菌粉末。

本发明还提供了一种制备三七总皂苷注射剂的方法，工艺关键在于，在三七总皂苷注射剂的制备过程中使用大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱吸附三七总皂苷中的毒性成分。

具体的，本发明提供的三七总皂苷注射剂的制备方法(简称为第一种方法)，包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，用2-20倍50-80％乙醇加热提取2-5次，每次1-5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水，搅匀，静置12-36小时，滤过；

2)滤液调pH值至7.0-8.0，以流速为0.5-15BV/h过大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，流出液再通过大孔树脂柱，用水洗涤后，用不同浓度乙醇液洗脱，收集、合并、吸附，回收乙醇至无醇味，备用；

或回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至相对密度为1.06-1.10，干燥，即得三七总皂苷；

3)将上述三七总皂苷按照注射剂的常规制备方法，制成三七总皂苷注射剂。

上述方法进一步优选为包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，粒径控制在10-40目，用2-20倍50-80％乙醇加热提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含生药约0.5-1g，搅匀，静置12-36小时，滤过；

2)滤液调pH值至7.0-7.5，以流速为0.5-15BV/h通过0.1-10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，以流速为0.5-15BV/h通过0.5-10倍三七重量的大孔树脂柱，用2-5BV、浓度为10-80％的乙醇溶液依次洗脱，收集合格部分、合并、吸附脱色、回收乙醇至无醇味，备用；

或回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至60℃相对密度为1.06-1.10，干燥，即得三七总皂苷；

3)将上述三七总皂苷按照注射剂的常规制备方法，制成三七总皂苷注射剂。

上述方法中：

所述三七为三七主根和/或三七芦头。

所述步骤2)中：所述合格部分为在线监测，符合本发明要求的部分即为合格部分；所述脱色为常规使用的活性炭、氧化铝、离子交换树脂法等脱色方法。

所述大孔吸附树脂的类型可选用D101、D201、AB-8或NKA-9等常用的类型。

本发明还提供了三七总皂苷注射剂的另一种制备方法(简称为第二种方法)，包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，加2-20倍50-95％的乙醇提取2-5次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.5-1g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.05-0.5％，搅匀，静置，滤过；

2)取滤液加0.1-1.0％的枸橼酸钠，过0.1-10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为0.5-15BV/h，收集流出液；流出液过0.5-10倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用0.5-3BV、浓度为0.1％的氢氧化钠溶液以0.5-15BV/h的流速洗脱，洗液弃去，再分别用纯化水及10％乙醇液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂并浓缩至在40-80℃时相对密度为1.10-1.20的清膏，减压干燥，得三七总皂苷；

3)按照注射剂的常规制备方法，将三七总皂苷制成三七总皂苷注射剂。

优选地，本发明提供的制备方法包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，粒径控制在10-40目，加8-12倍60-80％的乙醇提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.5-1.0g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.1-0.2％，搅匀，静置，滤过；

2)取滤液加0.3-0.6％的枸橼酸钠，过0.5-2.0倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为2-5BV/h，收集流出液；流出液过1-3倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV、浓度为0.1％氢氧化钠溶液，以2-5BV/h的流速洗脱，洗液弃去，用纯化水洗柱，至流出液为中性，再用3BV的10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为40、45、50、55、80)的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在60℃时相对密度为1.10-1.20的清膏，减压干燥，得三七总皂苷；

3)按照注射剂的常规制备方法，将三七总皂苷制成三七总皂苷注射剂。

上述方法中：

所述三七为三七主根和/或三七芦头。

所述步骤1)中，氯化钠浓度为0.05-0.5g的氯化钠溶于100ml三七总皂苷浓缩液中，其浓度为0.05-0.5％。

所述步骤2)中：所述合格部分为在线监测，符合本发明要求的部分即为合格部分；所述脱色为常规使用的活性炭、氧化铝、离子交换树脂法等脱色方法；BV为柱体积。

所述大孔吸附树脂的类型可选用D101、D201、AB-8或NKA-9等常用的类型。

本发明还提供了上述三七总皂苷注射剂在制备心血管疾病的药物中的应用。

本发明提供的注射剂具有以下优点：

1、[异常毒性]高

国家标准公示的指标中：三七总皂苷注射剂[异常毒性]指标中可耐受供试品浓度8mg/ml，三七总皂苷原料的[异常毒性]指标中可耐受供试品浓度为15mg/ml。

而本发明提供的注射剂中[异常毒性]中可耐受供试品浓度在20mg/ml以上。

异常毒性是药品安全性的一个重要指标，也是导致出现不良反应因素之一，异常毒性试验的供试品浓度越高，说明药品的毒性相对较低。

2、[溶血与凝聚]要求高

国家公布的标准中：三七总皂苷注射剂的[溶血与凝聚]指标中可耐受供试品浓度为37.5mg/ml。

本发明专利[溶血与凝聚]显微镜下观察可耐受供试品浓度达到20mg/ml以上。

三七总皂苷注射剂溶血与凝聚检查项，按《中国药典》2010版附录规定，用肉眼观察不溶血为符合规定。

本发明专利在显微镜下观察溶血和凝聚反应，供试品浓度达到20mg/ml，仍符合标准要求。肉眼观察与显微镜观察相差极大，肉眼观察100mg/ml的不溶血的样品，在显微镜下观察10mg/ml已经出现溶血和凝聚反应。

“溶血与凝聚”与临床的不良反应有密切关系，导致出现“溶血与凝聚”的供试品浓度越高，说明药物的安全性也越高。本发明专利使用显微镜检查“溶血与凝聚”，可耐受供试品浓度达到20mg/ml以上，大大高于三七总皂苷注射剂现行标准。

本发明提供的三七总皂苷注射剂[异常毒性]及[溶血与凝聚]的指标远远高出三七总皂苷注射剂国家标准规定，由于毒性降低，溶血与凝聚指标提高，可以合理推测药品临床使用的安全性将远远优于现有三七总皂苷注射剂，可以大幅度降低三七总皂苷注射剂的临床不良反应率。

3、提取方法：与现有技术(200610066204.0)相比，本发明的主要区别在于：在三七总皂苷制备过程中使用大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱吸附三七总皂苷中的毒性成分。根据异常毒性实验结果，大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱吸附了毒性极大的成分，对已知的有效成分吸附极少。

另外，在采用第二种方法制备时：用盐析技术还可巧妙的除去植物树脂类成份。

4、经过动物实验显示，与其他三七总皂苷注射制剂相比，本发明提供的三七总皂苷注射剂，治疗瘀血阻络，中风偏瘫，胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症等心脑血管疾病时，毒性成分含量少、临床不良反应率低，与现有技术提供的三七总皂苷注射剂等效。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

BV为多少倍的柱体积，如1BV为1倍柱体积。

浓度为g/ml，如1％的枸橼酸钠溶液为1g枸橼酸钠溶于100ml的水中，制得1％的枸橼酸钠溶液。

以下实施例中大孔吸附树脂的类型可选用D101、D201、AB-8或NKA-9等常用的类型。

实施例1：三七总皂苷冻干粉针剂(第一种方法)

1、提取方法：

取三七主根，制成10目粗粉，用乙醇提取5次，每次加2倍50％的乙醇，每次提取5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含生药约1g，搅匀，静置36小时，滤过；

滤液调pH值至7.0，以流速为15BV/h通过10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液；流出液以流速为15BV/h通过10倍三七重量的大孔树脂柱，用浓度为10-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为10、45、50、55、80)的乙醇溶液依次洗脱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)、合并、吸附脱色，回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至60℃时相对密度为1.06，干燥，即得三七总皂苷(收率是6％)。

2、粉针剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节至每1ml含三七总皂苷150mg，冷冻干燥，分装，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：

照高效液相色谱法(附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相A：乙腈，流动相B：水，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于6000，人参皂苷Rg₁与Re的分离度应不低于1.5。

对照品溶液(或对照提取物溶液)的制备：分别取减压干燥12小时的三七皂苷R₁对照品、人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品和人参皂苷Rb₁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R₁ 0.3mg、人参皂苷Rg₁ 1.2mg、人参皂苷Re 0.2mg、人参皂苷Rb₁ 1.0mg、人参皂苷Rd 0.1mg的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液；或取减压干燥12小时的三七总皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2.5mg的溶液，摇匀，即得对照提取物溶液。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含4mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液(或对照提取物溶液)与供试品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为11.1％，人参皂苷Rg₁为37.0％，人参皂苷Re为6.2％，人参皂苷Rb₁为32.0％，人参皂苷Rd为4.0％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为90.3％。

4、异常毒性检测：

按2010年版《中国药典》异常毒性检查法对样品进行检测，浓度从10mg/ml(称样按总皂苷冻干粉质量计)起逐渐提高剂量，测试各样品的异常毒性安全浓度上限及超安全上限后的死亡率。

精密称取各样品，用0.9％氯化钠注射液配制成对应浓度的溶液，即得供试品溶液。取17-20g小鼠5只，性别不限，每只尾静脉注射0.5ml，4-5秒匀速注射完毕，48小时内不出现死亡，判为“合格”。如有死亡，为证实死因是该药物作用而不是其他非药物因素导致死亡，另取18-19g小鼠10只复检，48小时不出现死亡判为“合格”，出现死亡判为“不合格”。本样品浓度20mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到23mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

按2010年版《中国药典》溶血与凝聚检查法对样品进行检测，精密称取各样品，用0.9％氯化钠注射液将其对应浓度的溶液，即得供试品溶液。家兔取血5ml，放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000-1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的混悬液，按下表所示在每瓶依次加入2％红细胞混悬液、0.9％氯化钠溶液或蒸馏水、供试液(每个供试品按下表分别配0.9％氯化钠注射液或蒸馏水得1、2、3号反应物，4号与5号分别为不含供试品的溶血反应阴性对照液与阳性对照液)，混匀后立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，3小时后开始观察溶血和凝聚反应，记录肉眼观察结果后摇匀各样品、对照品，用玻璃棒点取血样在玻片上，镜检(40×)。

试管编号	1	2	3	4(阴性对照)	5(阳性对照)
						2％红细胞混悬液(ml)	2.5	2.5	/	2.5	2.5
0.9％氯化钠溶液(ml)	2.2	2.2	4.7	2.5	/
						蒸馏水(ml)	/	/	/	/	2.5
供试品溶液(ml)	0.3	0.3	0.3	/	/

肉眼观察溶血与凝聚反应发生情况。若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生，记为“肉眼溶血”；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生，记为“肉眼不溶血”。若溶液中有红色或絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生，记为“肉眼凝聚”。显微镜下(物镜40×)观察红细胞状态。红细胞密集程度适中，圆整完好为镜检不溶血，判为“合格”。局部大面积出现以下情况判定为镜检溶血，判为“不合格”：红细胞内部或边缘有深色颗粒状突起或聚集；形状不圆；边缘溶胀模糊；花状溶胀；细胞完全溶胀；上述情况兼有2-3项。如有红细胞凝聚的现象，应按下法进一步判定是真凝聚或假凝聚：若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9％氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，记为“假凝聚”；若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚，记为“真凝聚”。)

在显微镜下观察，本样品浓度达到20mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到23mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例2：三七总皂苷冻干粉针剂(第二种方法)

1、提取方法：

取三七主根，制成40目粗粉，用乙醇提取2次，每次加12倍60％的乙醇，每次提取2小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.5g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.05％，搅匀，静置，滤过；

取滤液加0.1％的枸橼酸钠，过0.1倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为0.5BV/h，收集流出液；流出液过0.5倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV、浓度为0.1％氢氧化钠溶液以0.5BV/h的流速洗脱，洗脱液弃去；用纯化水洗柱至流出液为中性，洗脱液弃去；再用3BV的10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为40、45、50、55、80)的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在60℃时相对密度为1.10的清膏，低温干燥，得三七总皂苷(收率是5％)。

2、粉针剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含三七总皂苷150mg，冷冻干燥，分装，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为15.0％，人参皂苷Rg₁为50.3％，人参皂苷Re为5.2％，人参皂苷Rb₁为26.1％，人参皂苷Rd为1.0％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为97.6％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度23mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到25mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到23mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到25mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例3：三七总皂苷的提取方法(第一种方法)

1、提取方法：

取三七主根，制成20目粗粉，用乙醇提取2次，每次加20倍80％的乙醇，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含生药约0.5g，搅匀，静置12小时，滤过；

滤液调pH值至7.5，以流速为0.5BV/h通过0.1倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，以流速为0.5BV/h通过0.5倍三七重量的大孔树脂柱，用浓度为10-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为10、45、50、55、80)的乙醇溶液依次洗脱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)、合并、吸附脱色，回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至60℃相对密度为1.06，干燥，即得三七总皂苷(收率是8％)。

2、粉针剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含三七总皂苷150mg，冷冻干燥，分装，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为9.5％，人参皂苷Rg₁为43.9％，人参皂苷Re为5.4％，人参皂苷Rb₁为26.5％，人参皂苷Rd为1.3％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为86.6％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度20mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到23mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到20mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到23mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例4：三七总皂苷的提取方法(第二种方法)

1、提取方法：

取三七芦头，制成30目粗粉，用乙醇提取5次，每次加8倍95％的乙醇，每次3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约1g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.5％，搅匀，静置，滤过；

取滤液加1.0％的枸橼酸钠，过10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为15BV/h，收集流出液；流出液过10倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV、浓度为0.1％氢氧化钠溶液以15BV/h流速洗脱，洗脱液弃去；用纯化水洗柱，至流出液为中性，洗脱液弃去；再用3BV量10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为40、45、50、55、80)的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在60℃时相对密度为1.10的清膏，低温干燥，得三七总皂苷(收率是10％)。

2、粉针剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含固形物150mg，冷冻干燥，分装，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：方法及结果

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为12.3％，人参皂苷Rg₁为46.4％，人参皂苷Re为8.0％，人参皂苷Rb₁为21.0％，人参皂苷Rd为2.3％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为90.0％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度23mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到25mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到23mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到25mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例5：三七总皂苷的提取方法(第二种方法)

1、提取方法：

取三七主根，制成20目粗粉，用乙醇提取4次，每次加10倍70％的乙醇，每次1小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.6g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.2％，搅匀，静置，滤过；

取滤液加1.0％的枸橼酸钠，过2倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为5BV/h，收集流出液；流出液过3倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV浓度为0.1％氢氧化钠溶液以5BV/h流速洗脱，洗脱液弃去；然后用纯化水洗柱，至流出液为中性，再用3BV量10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为40、45、50、55、80)的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在60℃时相对密度为1.10的清膏，低温干燥，得三七总皂苷(收率是7％)。

2、粉针剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含三七总皂苷150mg，冷冻干燥，分装，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为10.2％，人参皂苷Rg₁为56％，人参皂苷Re为5.0％，人参皂苷Rb₁为25.2％，人参皂苷Rd为1.8％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为98.2％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度23mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到25mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到23mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到25mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例6：三七总皂苷的提取方法(第一种方法)

1、提取方法：

取三七主根，制成25目粗粉，用乙醇加热提取3次，每次加15倍65％乙醇，每次提取3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含生药约0.8g，搅匀，静置20小时，滤过；

滤液调pH值至8.0，以流速为8BV/h通过3倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，以流速为2BV/h通过7倍三七重量的大孔树脂柱，用3BV浓度为10-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为10、45、50、55、80)的乙醇溶液依次洗脱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)、合并、吸附脱色、回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至60℃相对密度为1.06，干燥，即得三七总皂苷(收率是9％)。

2、注射液的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含三七总皂苷55mg，另加氯化钠1mg，过滤，灌装，制成注射液。

3、含量检测：

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为13.2％，人参皂苷Rg₁为47.6％，人参皂苷Re为7.1％，人参皂苷Rb₁为22.8％，人参皂苷Rd为2.6％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为93.3％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度20mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到23mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到20mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到23mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实施例7：三七总皂苷冻干粉针剂(第二种方法)

1、提取方法：

取三七芦头，制成35目粗粉，加乙醇提取2次，每次加9倍75％的乙醇，每次提取2小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.7g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.15％，搅匀，静置，滤过；

取滤液加0.4％的枸橼酸钠，过1.5倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为3BV/h，收集流出液；流出液过2.5倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV浓度为0.1％氢氧化钠溶液以4BV/h的流速洗脱，洗脱液弃去；用纯化水洗柱至流出液为中性，再用3BV的10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％(依次洗脱的乙醇浓度分别为40、45、50、55、80)的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分(在线监测，符合本发明要求的部分为合格部分)，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在65℃时相对密度为1.15的清膏，低温干燥，得三七总皂苷(收率是7.5％)。

2、无菌粉末的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含三七总皂苷150mg，除菌滤过，冻干，无菌分装，制成无菌粉末。

3、含量检测：

方法同实施例1，本品按干燥品计算，三七皂苷R₁为12.8％，人参皂苷Rg₁为44.5％，人参皂苷Re为5.9％，人参皂苷Rb₁为23.6％，人参皂苷Rd为3.1％。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd总量为89.9％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度23mg/ml小鼠未出现死亡，浓度达到25mg/ml小鼠出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度达到23mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度达到25mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

对比例：三七总皂苷的提取方法(参考专利200610066204.0的实施例1)

1、提取方法：

取三七主根，粉碎成20目粗粉，加8倍量60％乙醇提取7小时，收集提取液，过滤，取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含0.5g生药的溶液，用3倍三七重量的大孔树脂柱及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5％调整至95％，流速4.5BV/h，弃去含乙醇浓度在30％至70％以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30％以上至70％以下的洗脱液，65℃以下减压回收溶剂并浓缩至相对密度为1.13(60℃)的清膏，得三七总皂苷

2、注射剂的制备方法：

取上述三七总皂苷加注射用水调节每1ml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成注射用粉针剂。

3、含量检测：方法同实施例1，结果为：三七皂苷R₁为12.2％、人参皂苷Rg₁为41.3％、人参皂苷Re为4.7％、人参皂苷Rb₁为27.5％、人参皂苷Rd为0.6％，以上总量为86.3％。

4、异常毒性检测：

方法同实施例1，本样品浓度25mg/ml小鼠未出现死亡。

5、溶血与凝聚检测：

方法同实施例1，在显微镜下观察，本样品浓度12mg/ml未出现溶血与凝聚反应，浓度15mg/ml时出现溶血与凝聚反应。

实验例1：含量、异常毒性检测及溶血与凝聚检测

对实施例1-7、黑龙江省珍宝岛制药有限公司生产的注射用血塞通、昆明制药有限公司生产的注射用血塞通、广西梧州制药(集团)股份有限公司生产的注射用血栓通以及对比例的注射剂的含量、异常毒性检测及溶血与凝集检测，检测方法同实施例1，结果见表1：

1、三七总皂苷注射制剂毒性与溶血比较

受试药物：对比例制成的粉针剂、黑龙江省珍宝岛制药有限公司生产的注射用血塞通、昆明制药有限公司生产的注射用血塞通、广西梧州制药(集团)股份有限公司生产的注射用血栓通、实施例1-5制成的粉针剂、实施例6的注射液、实施例7的无菌粉末共11个受试药物。

按2010年版《中国药典》异常毒性检查法对本发明实施例1-7、对比例及相关三七总皂苷注射剂进行毒性比较，检测方法同实施例1，结果见表1：

表1：异常毒性试验结果

注：异常毒性试验按《中国药典》2010年版方法试验，“合格”是指试验药液在该浓度下，异常毒性试验的检查(或复查)结果符合规定要求；不符合规定要求者的数据为对应供试品的检查与复查死亡率。

从表1结果显示：

异常毒性检查结果，对比例制成的受试药物毒性最低，其次为本发明实施例2、实施例4、实施例5、实施例7制成的受试药物，再次之为本发明实施例1、实施例3、实施例6制成的受试药物。除对比例制成的受试药物外，本发明实施例制成的受试药物与其他三七总皂苷注射剂相比，可耐受供试品浓度相差达7mg/ml以上，具有显著性差异。

按2010年版《中国药典》溶血与凝聚检查法对本发明的实施例1-7、对比例及相关三七总皂苷注射剂进行毒性比较，检测方法同实施例1，结果见表2：

表2：溶血与凝聚试验结果(镜检)

注：溶血与凝聚试验按《中国药典》2010年版方法试验，全部受试药品肉眼观察溶血与凝聚均符合规定(浓度均20mg/ml)。试验药液在对应浓度下，整个盖玻片表面均分为九个区域，检查每个区域。镜检(物镜40×)观察，红细胞密集程度适中，形状圆整完好，判为“合格”。镜检观察全部或部分区域大面积出现以下情况之一者判定为“不合格”：红细胞内部或边缘有深色颗粒状突起或聚集；形状不圆；边缘溶胀模糊；溶胀呈花状；细胞完全溶胀；兼有上述“不合格”情况2-3项。

从表2结果显示：溶血与凝聚肉眼检查结果，所有样品均不发生凝聚。对比例和广西梧州制药(集团)股份有限公司生产的注射用血栓通在15mg/ml镜检出现溶血反应，本发明实施例1-7制成的受试药物可耐受供试品浓度(20mg/ml)最高。

本发明实施例制成的受试药物与其他三七总皂苷注射剂相比，可耐受供试品浓度相差达8mg/ml以上，具有显著性差异。

3、三七总皂苷注射制剂含量比较：见表3

对本发明的实施例1-7、对比例及相关三七总皂苷注射剂进行含量检测，检测方法同实施例1，结果见表2：

表3：三七总皂苷注射制剂含量比较(％)

	三七皂苷R1	人参皂苷Rg1	人参皂苷Re	人参皂苷Rb1	人参皂苷Rd	总量
							对比例	12.2	41.3	4.7	27.5	0.6	86.3
注射用血塞通(珍宝岛)	9.6	32.8	4.0	328	9.1	88.3
							注射用血塞通(昆明制药)	8.3	28.3	3.4	37.8	10.1	87.9
注射用血栓通(梧州制药)	9.6	37.7	5.8	38.4	5.8	97.3
							实施例1粉针剂	11.1	37.0	6.2	32.0	4.0	90.3
实施例2粉针剂	15.0	50.3	5.2	26.1	1.0	97.6
							实施例3粉针剂	9.5	43.9	5.4	26.5	1.3	86.6
实施例4粉针剂	12.3	46.4	8.0	21.0	2.3	90.0
							实施例5粉针剂	10.2	56.0	5.0	25.2	1.8	98.2
实施例6注射液	13.2	47.6	7.1	22.8	2.6	93.3
							实施例7无菌粉末	12./8	44.5	5.9	23.6	3.1	89.9

表3结果显示：本发明实施例1-7制成的药物中，人参皂苷总量高于对比例、注射用血塞通(珍宝岛)、注射用血塞通(昆明制药)的含量，Rd含量高于对比例。

实验例2：毒性及溶血实验

主要是检测大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂吸附物洗脱液的毒性与溶血：

1、实施例洗脱液样品制法：分别收集实施例1、实施例2制备过程中的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂吸附的三七成分，65℃以下减压回收溶剂并浓缩至相对密度为1.05-1.15(60℃)的清膏，加注射用水调节每1ml含固形物100mg-150mg，加针用活性炭适量(0.30％，重量比)，80℃以下保温搅拌30分钟，滤过，冷冻干燥，压塞，压盖，制成样品。大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂吸附物质总重量占吸附前三七总皂苷总重量的1-3％。

2、实验方法：

健康小鼠(体重18-20g)，雌雄各半，试验前检疫5天，根据预试验结果，随机分组，每组各10只，雌雄各半。采用尾静脉注射给药，一次性等容量注射，试液浓度间距为0.5mg/ml。注射容量为每鼠0.50ml。

表4：大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂洗脱液成分检验结果

	实施例1洗脱液	实施例2洗脱液
			三七皂苷R1	0.00％	0.00％
人参皂苷Rg1	0.25％	0.00％
			人参皂苷Re	0.02％	0.00％
人参皂苷Rb1	47.39％	49.65％
			人参皂苷Rd	12.81％	12.50％
未知成份	39.53％	37.85％

表5：大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂洗脱液异常毒性试验

供试品	2mg/ml	5mg/ml	8mg/ml
				实施例1洗脱液	合格	1/5，复检2/10	3/5
实施例2洗脱液	合格	2/5	5/5

注：异常毒性试验按《中国药典》2010年版方法试验，“合格”是指供试品在对应浓度下，异常毒性试验的检查(或复查)结果符合规定要求；不符合规定要求者的数据为对应供试品的检查与复查死亡率。

表6：大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂洗脱液溶血与凝聚试验

供试品	5mg/ml	8mg/ml
			实施例1洗脱液	不合格	不合格
实施例2洗脱液	不合格	不合格

注：溶血与凝聚试验按《中国药典》2010年版方法试验，全部供试品肉眼观察溶血与凝聚均符合规定。供试品在对应浓度下，整个盖玻片表面均分为九个区域，检查每个区域。镜检(物镜40×)观察，红细胞密集程度适中，形状圆整完好，判为“合格”。镜检观察全部或部分区域大面积出现以下情况之一者判定为“不合格”：红细胞内部或边缘有深色颗粒状突起或聚集；形状不圆；边缘溶胀模糊；溶胀呈花状；细胞完全溶胀；兼有上述“不合格”情况2-3项。

从表4-6结果可以看出：大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂吸附的已知三七总皂苷有效成分极少，异常毒性可耐受供试品浓度仅为2mg/ml，溶血与凝聚可耐受供试品浓度低于5mg/ml，吸附物质毒性极大。

说明：上述实验证明大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂能吸附三七总皂苷中毒性较大的杂质成分。本发明专利注射剂毒性低于其他三七总皂苷注射剂的原因是大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂吸附了三七总皂苷中的毒性成分。

实验例3：药效实验

1、实验药物：

对比例方法制备的三七总皂苷注射剂；

注射用血塞通，购自昆明制药有限公司；

注射用血栓通，购自广西梧州制药(集团)股份有限公司；

0.9％氯化钠注射液，购自北京双鹤药业股份有限公司；

2、实验动物：SD大鼠，雄性，280-320g。

3 实验方法：

3.1对大鼠局灶性脑缺血的影响

3.1.1实验分组：雄性大鼠随机分为12组：假手术组；模型组；实施例1-7；对比例组；注射用血栓通(梧州)组；注射用血塞通(昆明)组，每组8只；除了假手术组、模型组每天静脉注射生理盐水1.5ml/kg外，其余各组(冻干粉针用注射用水溶解)按照45.0mg/kg静脉注射。

3.1.2实验方法：按Tamura氏方法，动物用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉(35mg/100g体重)，经颞下入路，打开颅窗，剥开软脑膜，暴露右侧大脑中动脉，电凝嗅束与大脑下静脉之间的一段大脑中动脉(电凝输出功率为4W)，假手术组只开颅窗，不电凝大脑中动脉。

手术后即刻尾静脉注射受试药物(3ml/kg体重，假手术组及模型组静脉给予等量生理盐水)，伤口缝合后回笼饲养。试验及饲养室温均为22.0±1.0℃。

术后4小时，采用单盲法按下列标准观测各组动物神经症状，进行行为综合评分，评分标准为：

(1)提起鼠尾离开地面，观察两前肢活动情况，左前肢屈曲、左肩内收者按程度评为0-4分，(正常大鼠)两前肢对称伸向前方者评为0分；

(2)轻提鼠尾，推动左肩向右移动10cm，再推动右肩向左移动10cm，以左侧阻力下降程度，评为0-3分；

(3)牵拉两前肢，视左侧肌力下降程度评为0-3分。三项分数相加，并以分数之和进行分级，I级：0分；II：1-3分；III：4-6分；IV：7-10分。级别越高则动物行为障碍越严重。

术后24小时，按上述标准再对各组动物进行行为综合评分。结果按等级序值法进行统计学处理。

末次评分后，动物麻醉，腹主动脉取血，断头取出大脑，手术显微镜下确认中动脉已阻断后冠状切4刀，平均切成5个脑片，TTC染色，10％福尔马林避光保存。用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)(固定取像的放大倍数)计算大鼠脑梗塞范围。结果进行统计学处理，模型组与正常组比较，给药组与模型组比较。

3.1.3实验结果

3.1.3.1对大鼠神经症状的影响：见表7

表7：对大鼠脑中动脉阻断后神经症状的影响(等级序值法)

由表7可见：

手术后4小时、24小时假手术组动物神经行为未发现异常；

模型组动物可见明显的行为障碍，主要表现为左肩内收、屈曲，前肢无力等，与假手术组比较差异显著(P＜0.01)。

给药4小时后，本发明实施例1-7、对比例制备的制剂以及注射用血栓通神经行为障碍比模型组的减轻不明显；24小时后，本发明实施例1-7、对比例制备的受试药物以及注射用血栓通的给药动物行为障碍明显改善，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)，对比例及注射用血塞通组给药后4小时神经行为障碍明显改善，与模型组比较有显著差异(P＜0.01)，但给药后24小时神经行为障碍有所加重，与模型组比较无显著差异。

结论：本发明提供的药品略好于其余三七总皂苷注射制剂，但是组间比较无显著差异。

3.1.3.2对脑梗塞范围的影响：见表8。

表8：三七总皂苷注射制剂对大鼠脑梗塞范围的影响

注：与假手术组相比，^**P＜0.01；与模型组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01。

由表8可见，手术后24小时，模型组大鼠术侧局部缺血严重(P＜0.01)，形成明显的梗塞灶；与模型组比较，本发明实施例1-7组、对比例组、注射用血栓通(梧州)组的梗塞范围显著减少(P＜0.01)，注射用血塞通(昆明)的梗塞面积明显减少(P＜0.05)。实施例组与对比例组相比，无显著性差异。

结论：本发明提供的药品对脑梗塞面积的减少效果略好于其余三七总皂苷注射制剂，尤其是注射用血塞通(昆明)组，各三七总皂苷注射制剂组之间比较无显著差异。

3.2对心肌缺血的影响

3.2.1实验动物：SD种雄性大鼠，体重240-260g。

3.2.2实验分组：

SD种雄性大鼠，随机分为11组：模型组；本发明实施例1-7组；对比例组；注射用血栓通(梧州)组；注射用血塞通(昆明)组，给药途径为左股静脉注射，模型组给1.5ml/kg体重的0.9％氯化钠注射液，其余各组给予45mg/kg体重的冻干粉针(注射前预先用注射用水溶解)。

3.2.3实验方法：

动物以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45mg/kg)，仰位固定，切开气管，插入气管插管，接呼吸机(SC-3型，上海医疗设备厂)行人工呼吸(32次/分，呼吸比值1∶3)；开胸，断3-4肋，打开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支根部穿线(0号缝合线)，备结扎用；分离左股静脉准备给药；穿线后稳定10分钟，结扎，给入受试药物后缝合胸壁，恢复自主呼吸。150min后，腹主动脉取血，测定血清CK、LDH含量；

心脏结扎线以下横切5片，N-BT染色，采用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)，以固定象距测量总心肌面积及梗塞心肌面积，观察心肌梗塞程度；

3.2.4：结果进行统计学处理(t检验)。

3.2.5试验结果

三七总皂苷注射制剂对心肌梗塞程度的影响：见表9

表9：各给药组对心肌梗塞范围的影响

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表9可见：模型组梗塞区占心室及心脏百分比分别为28.7及24.4％；本发明实施例1-7制备的制剂、注射用血栓通及对比例组制备的受试药物、注射用血塞通各三个剂量组作用相似，心肌梗塞程度均有明显减轻，梗塞面积减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。

结论：本试验以大鼠心肌缺血所致心肌梗塞模型观察药物作用，发现：心肌缺血导致心肌梗塞发生，N-BT染色后心梗斑块明显，占心室总面积的28.7％。各种三七总皂苷注射制剂均可明显减轻心肌梗塞程度，梗塞面积减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种三七总皂苷注射剂，其特征在于该注射剂中含有以下重量百分比的活性成分：三七皂苷R₁ 9.5-15.0％、人参皂苷Rg₁ 37.0-56.0％、人参皂苷Re 5.0-8.0％、人参皂苷Rb₁ 21.0-32.0％、人参皂苷Rd不低于1.0％。

2.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于，该注射剂的异常毒性项目检测，用0.9％氯化钠注射液溶解的三七总皂苷注射剂的浓度达到20mg/ml以上；溶血与凝聚显微镜下检测，用0.9％氯化钠注射液溶解的三七总皂苷注射剂的浓度达到20mg/ml以上。

3.根据权利要求1或2所述的三七总皂苷注射剂，其特征在于，所述注射剂为注射液、冻干粉针或无菌粉末。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述的注射剂的方法，其特征在于，该注射剂的制备过程中使用大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱吸附三七总皂苷中的毒性成分。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)三七制成粗粉，用2-20倍50-80％乙醇加热提取2-5次，每次1-5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加适量水，搅匀，静置12-36小时，滤过；

2)滤液调pH值至7.0-8.0，以流速为0.5-15BV/h过大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，流出液再通过大孔树脂柱，用水洗涤后，用不同浓度乙醇液洗脱，收集、合并、吸附，回收乙醇至无醇味，备用；

或回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至相对密度为1.06-1.10(60℃)，干燥，即得三七总皂苷；

3)将上述三七总皂苷按照注射剂的常规制备方法，制成三七总皂苷注射剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，粒径控制在10-40目，用2-20倍50-80％乙醇加热提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含生药0.5-1g，搅匀，静置12-36小时，滤过；

2)滤液调pH值至7.0-7.5，以流速为0.5-15BV/h通过0.1-10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，收集流出液，以流速为0.5-15BV/h通过0.5-10倍三七重量的大孔树脂柱，用2-5BV、浓度为10-80％的乙醇溶液依次洗脱，收集合格部分，合并、吸附脱色、回收乙醇至无醇味，备用；

或回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至60℃相对密度为1.06-1.10，干燥，即得三七总皂苷；

3)将上述三七总皂苷按照注射剂的常规制备方法，制成三七总皂苷注射剂。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，加2-20倍50-95％的乙醇锅体旋转提取2-5次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药0.5-1g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.05-0.5％，搅匀，静置，滤过；

2)取滤液加0.1-1.0％的枸橼酸钠，过0.1-10倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为0.5-15BV/h，收集流出液；流出液过0.5-10倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用0.5-3BV、浓度为0.1％的氢氧化钠溶液，以0.5-15BV/h的流速洗脱，洗液弃去，再分别用纯化水及10％乙醇液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂并浓缩至在40-80℃时相对密度为1.10-1.20的清膏，减压干燥，得三七总皂苷；

3)按照注射剂的常规制备方法，将三七总皂苷制成三七总皂苷注射剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)取三七，制成粗粉，粒径控制在10-40目，加8-12倍60-80％的乙醇锅体旋转提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，减压浓缩成每1ml含生药约0.5-1.0g，加氯化钠使其含氯化钠的浓度达到0.1-0.2％，搅匀，静置，滤过；

2)取滤液加0.3-0.6％的枸橼酸钠，过0.5-2.0倍三七重量的大孔弱酸性松香基阳离子交换树脂柱，流速为2-5BV/h，收集流出液；流出液过1-3倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附；用1BV、浓度为0.1％氢氧化钠溶液，以2-5BV/h的流速洗脱，洗液弃去；用纯化水洗柱，至流出液为中性，再用3BV的10％乙醇溶液洗柱，洗脱液弃去；用40-80％的乙醇梯度洗脱大孔吸附树脂柱，收集合格部分，吸附脱色，65℃以下减压回收溶剂，并浓缩至在60℃时相对密度为1.10-1.20的清膏，减压干燥，得三七总皂苷；

3)按照注射剂的常规制备方法，将三七总皂苷制成三七总皂苷注射剂。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述三七为三七主根和/或三七芦头；所述合格部分为在线监测，符合权利要求1所述的部分即为合格部分；所述脱色为常规使用的活性炭、氧化铝或离子交换树脂法的脱色方法。

10.权利要求1或2所述的三七总皂苷注射剂在制备心血管疾病的药物中的应用。