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CN102250911A - 一种可溶性b7-h1定量检测试剂盒 - Google Patents

一种可溶性b7-h1定量检测试剂盒 Download PDF

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CN102250911A
CN102250911A CN 201110144895 CN201110144895A CN102250911A CN 102250911 A CN102250911 A CN 102250911A CN 201110144895 CN201110144895 CN 201110144895 CN 201110144895 A CN201110144895 A CN 201110144895A CN 102250911 A CN102250911 A CN 102250911A
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CN
China
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seq
nucleotide sequence
monoclonal antibody
cell
antibody
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Pending
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CN 201110144895
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Inventor
陈永井
王勤
张学光
施敏骅
胡振华
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Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
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Abstract

本发明公开了一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，包括：本辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、洗液和终止液，所述试剂盒还包括：包被抗体、标准品蛋白和检测抗体，其中，所述包被抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体，其重链具有如序列表中SEQIDNO：1所示核苷酸序列，其轻链具有如序列表中SEQIDNO：2所示核苷酸序列；所述检测抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体，其重链具有如序列表中SEQIDNO：3所示核苷酸序列，其轻链具有如序列表中SEQIDNO：4所示核苷酸序列。本发明所述可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒具有良好的特异性，可以精确地定量分析人细胞培养上清、血清、血浆和胸水等液体中的可溶性B7-H1蛋白因子的浓度。

Description

一种可溶性B7-H1定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，具体涉及利用两株特异性抗人B7-H1单克隆抗体ZH11、10D7以及B7-H1Ig融合蛋白研制用于定量检测分析可溶性B7-H1因子的酶联免疫检测试剂盒的方法，该定量检测体系可应用在肺癌鉴别诊断和预后判断领域。
背景技术
已知有许多受体/配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行。
近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族，如B7/CD28、LAF1/ICAM-1、ICOS-GL50、PD-1/B7-H1、BTLA/HVEM和CD2/LFA-3等。这些协同刺激分子以受体/配体相互作用的方式传导信号。受体/配体一般表达在不同的免疫细胞表面，通常一个为持续性表达，一个呈诱导性表达的特征。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫反应有效启动、适度应答和适时终止。
PD-1（CD279）是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）。研究发现，PD-1分子主要在T、B、NK细胞表面呈诱导性上调表达，未成熟的T、B细胞在胸腺和骨髓内发育的特定阶段也有弱表达，PD-1分子C末端的酪氨酸残基可与下游的SHP-1、SHP-2等信号转导分子作用而抑制免疫细胞的进一步活化。B7-H1（B7-H1，CD274）是PD-1的两个配体之一，与B7家族其它成员一样，在蛋白结构上B7-H1分子包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区尾部。B7-H1胞外区有4个保守的半胱氨酸残基，参与Ig样结构中二硫键的形成，保持正确的空间结构。B7-H1的mRNA不仅表达在实质器官组织，如：心脏、肺、肝和胎盘等，部分抗原递呈细胞上也有适度表达，如：活化的B细胞和树突状细胞；在胸腺上皮细胞和多种上皮性来源的肿瘤细胞株上B7-H1 mRNA呈高表达。蛋白水平上，B7-H1在活化的T、B、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞（如：肺癌、肝癌、乳腺癌和鳞状细胞癌等）上诱导性表达。大量的研究表明，B7-H1与活化的T细胞上PD-1相互作用可显著抑制效应性T细胞的生物学功能，PD-1或B7-H1的表达改变导致PD-1/PD-L抑制途径发生异常，进而引发机体产生免疫功能亢进/低下性疾病。
Dong H等研究发现，低剂量的激发型抗CD3单抗与B7-H1Ig联合应用可有效刺激T细胞的增殖，促进IL-10的分泌，这种正性刺激作用呈IL-2依赖性，对小鼠B7-H1的研究也获得了类似的结果。但后来更多的研究表明，B7-H1能与其负性受体PD-1相互作用抑制T细胞的增殖和活化，尤其能显著降低IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。B7-H1对T细胞功能的影响主要依赖于TCR和CD28信号的强度，在亚适量TCR信号刺激下，B7-H1对T细胞增殖的抑制作用明显，而在最适量TCR信号时，仅在没有CD28协同刺激信号的条件下才对T细胞增殖发挥促进作用，PD-1/B7-H1抑制途径所介导的效应可被CD28信号或IL-2逆转。因此，PD-1/B7-H1负性信号可显著抑制T细胞的活化增殖和细胞因子的产生。
PD-1/PD-L相互作用后抑制Bcl-xL的表达，对效应性T细胞多种转录因子的表达产生抑制，如：GATA-3、Tbet和Eomes。体外应用转染PD-1或FcγRⅡ-PD-1融合蛋白基因的B淋巴瘤细胞系的研究表明，PD-1可抑制B细胞受体的刺激性信号，从而降低B细胞活化。BCR与PD-1交联后可抑制Ca2+内流及下游信号激活分子如syk、PI3K、磷脂酶-3和vav的酪氨酸残基的磷酸化。有趣的是，这种抑制效应并不需要PD-1胞浆区N端位于ITIM活化抑制基序内的酪氨酸残基参与，而是由C端的酪氨酸残基与SHP-2酪氨酸磷酸酶结合的结果。此外，PD-1也可抑制更下游的信号激活分子—丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的酪氨酸残基磷酸化而抑制B淋巴瘤细胞系的增殖。另外，以Jurkat细胞株为模型的研究结果也表明TCR与PD-1的交联可引起SHP-2的磷酸化并向PD-1的胞浆区募集。
PD-1/B7-H1抑制途径与肿瘤的发生、发展密切相关。研究发现，多种肿瘤细胞和肿瘤组织组成性高表达B7-H1，如：肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌。PD-1/B7-H1抑制途径对CD8+ T细胞的活化增殖有明显的抑制作用，肿瘤细胞可通过此途径逃避CTL杀伤作用，减弱机体抗肿瘤免疫应答。用阻断型抗B7-H1单抗阻断PD-1/B7-H1信号可以通过上调IFN-γ、IL-2、IL-10的分泌有效逆转CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖受抑，同时T细胞的活化程度和杀伤能力增强。这提示PD-1/B7-H1途径可能是肿瘤细胞逃避免疫识别和免疫清除的原因之一。另外，肿瘤微环境因子可促进肿瘤细胞表达B7-H1，该分子的出现和上调有利于肿瘤细胞的进一步生长和转移，诱导浸润的肿瘤抗原特异性T细胞凋亡。Dong H等动物模型研究发现，转染了B7-H1基因的P815肿瘤细胞系在体外可抵制特异性CTL的裂解，将其接种小鼠体内后具有更强的致瘤性和侵袭性。然而，这些生物学特性均可通过阻断B7-H1而逆转。因此，可制备特异性抗B7-H1单抗或PD-1可溶性抑制因子，通过阻断PD-1/B7-H1信号对该抑制途径的作用进行封闭，增强CTL杀伤肿瘤细胞的功能，有效抑制肿瘤的形成和生长。这为肿瘤免疫治疗开辟了新途径。更为重要的是，最新研究表明B7-H1的表达强度可以作为肿瘤患者预后的临床判断指标。PD-1/PD-L途径作为重要的细胞周期检查点，发挥着特异性的抗原依赖性负性调控作用，是药物干涉机体以及抗肿瘤免疫治疗的靶分子之一，具有潜在的应用价值。  
作为负性协同刺激信号，B7-H1在机体免疫应答过程中无论广度还是深度均扮演着重要的角色，参与淋巴细胞活化，在免疫耐受和免疫损伤方面发挥着无可替代的作用。PD-1/B7-H1的相互作用，有效降低了IFN-γ和TNF-α的表达，为移植排斥、自身免疫病和过敏症等的治疗提供了一些新的思路。一方面，通过增强PD-1抑制信号以降低机体免疫细胞的过度活化、增殖，减轻淋巴细胞对自身组织的损伤和自身抗原的持续应答，也可以通过增强该负性信号以减轻宿主免疫系统对移植物的排斥反应，提高移植物的存活率；另一方面，通过特异性阻断PD-1/B7-H1抑制信号使机体中失能的效应性细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+ T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力及时清除肿瘤细胞和病毒。PD-1/PD-L有望成为肿瘤免疫治疗的有效靶分子，也为HIV和HBV等慢性病毒性感染的治疗提供一个新的策略。2006年，美国FDA已批准了一株人源化抗人PD-1单抗，用于肿瘤和传染病等方面的临床治疗研究。随着研究的不断深入，PD-1/PD-L在机体免疫调节和各类临床疾病的研究、预防、诊断与治疗中的作用将得以彻底阐明。
肺癌的发病率和病死率在西方国家和我国大城市中均已居各类恶性肿瘤的首位。2008年中国卫生部颁布的第三次全国死因调查情况表明：恶性肿瘤位列城市人口死亡原因的首位，肺癌上升幅度最大，达465%。肺癌局部和远处转移相对隐匿、导致早期诊断和预防困难。因此，临床治疗主要是面对中晚期肺癌人群，长期以来5年生存率仅在10-15%左右。随着肿瘤分子生物学及遗传学的快速发展，人们认识到肺癌的发生、发展和转移是一个多阶段、多步骤、多基因参与调控的复杂生物学过程，且与患者机体的免疫功能密切相关。当今研究除了需研发有效的分子检测技术对肺癌患者做出临床早期诊断外，还需对在肺癌发生、发展和免疫逃逸中起重要作用的信号途径及靶分子进行深入研究。在恶性肿瘤患者体内，进入淋巴管或血管的瘤细胞只有某些瘤细胞亚群得以优势生长，获得转移表型。这些具有高转移潜能的瘤细胞如何逃避机体的免疫监视、抵御抗原特异性T细胞杀伤作用的机制尚未完全阐明。近年来，分子诊断和靶向治疗已成为肺癌治疗领域的研究热点，其中，针对表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子（VEGF）的靶向治疗药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）和抗VEGF抗体等在肺癌临床得到广泛应用，在有选择性的肺癌人群中取得了明显生存获益。随着对机体免疫功能调节机制和肿瘤发病机制的认识逐步深入，我们发现负性协同刺激分子B7-H1在肺癌等多种上皮肿瘤异常高表达，在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用，有望成为临床肺癌个体化防治的重要靶点之一，并有可能成为肺癌危险度、疗效及预后评估的实验室基础。  
研究发现，许多协同刺激分子能分别以细胞膜型和可溶性两种形式存在，包括CD40、OX40L、4-1BBL、CD86、CD30和CTLA-4等。可溶性分子可以通过蛋白水解酶裂解细胞上的膜型分子而形成，例如：B7-H3和s4-1BBL；也可以由专一的mRNA编码产生，例如：sCD86和sCTLA-4。许多可溶性协同刺激分子的表达水平具有临床诊断价值，例如，可溶性CD40L（sCD40L）是活化的CD4+ T细胞和血小板表面膜型CD40L分子裂解而来，sCD40L水平在某些自身免疫疾病的血清中异常升高，原发性血小板增多症和动脉硬化患者的血清中sCD40L水平也较高。可溶性CD30分子在某些肿瘤和艾滋病（AIDS）患者的血清中也呈现高水平表达。业已表明，机体中可溶性分子和膜表面的分子一样具有相应的生物学功能，一方面，细胞膜上的分子能够通过直接的受体/配体相互作用介导协同刺激信号；另一方面，可溶性蛋白因子能够像细胞因子一样参与血液循环在免疫应答中发挥重要的调节作用，它们既能够影响邻近细胞又能够和远端细胞表面的受体相互结合，从而参与疾病的发生、发展，其发挥作用的广度和深度远远超过细胞膜表面的分子。迄今为止，因缺乏有效的检测方法，国内外尚未有对可溶性B7-H1（sB7-H1）的研究报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，包括：辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、标准品蛋白、洗液和终止液，所述试剂盒还包括：包被抗体和检测抗体，其中，所述包被抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体，其重链具有如序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO：5所示氨基酸序列，其轻链具有如序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO：6所示氨基酸序列；所述检测抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体，其重链具有如序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，其轻链具有如序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
优选的技术方案中，所述包被抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11，由保藏号为的CGMCC No. 1637的杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1）制备的单克隆抗体；所述检测抗体为鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D7，由保藏号为CGMCC No. 4802的分泌小鼠抗人PD-L1分子单克隆抗体杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7）制备的单克隆抗体。
上述技术方案中，杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 1637，建议的分类命名：杂交瘤细胞，保藏日期：2006年03月08日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 4802，建议的分类命名：分泌小鼠抗人PD-L1分子单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2011年4月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
上述技术方案中，所述标准品蛋白为标准品蛋白B7-H1Ig蛋白，即为普通的现有技术中的B7-H1Ig蛋白。
上述技术方案中，所述洗液选自：含体积分数0.02%~0.2%的吐温20（Tween-20）的0.002M咪唑盐溶液或者PH7.4的PBS溶液，优选为含体积分数0.02%吐温20（Tween-20）的PH7.4的PBS溶液。
上述技术方案中，所述终止液选自：2M的硫酸或者1%HCl溶液；优选为2M的硫酸。
所描述的试剂盒除包括本发明的抗细胞表面B7-H1分子的单克隆抗体外，还可包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液和标准品等。
本发明同时要求保护一种核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明同时要求保护一种核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明同时要求保护一种核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明同时要求保护一种核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明同时要求保护一种鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11，所述单克隆抗体的重链如序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链如序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
本发明同时要求保护一种鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D7，所述单克隆抗体的重链如序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链如序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
本发明同时要求保护一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11的杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1），其保藏号为CGMCC No. 1637。
本发明同时要求保护一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D7的杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7），其保藏号为CGMCC No. 4802。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．本发明所述可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒具有良好的特异性，可以精确地定量分析人细胞培养上清、血清、血浆和胸水等液体中的可溶性B7-H1蛋白因子的浓度。
2．本发明所述可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒具有良好的灵敏度，可在0.195~12.5ng/ml的sB7-H1浓度范围内保持良好的线性关系。
附图说明
杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 1637，建议的分类命名：杂交瘤细胞，保藏日期：2006年03月08日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 4802，建议的分类命名：分泌小鼠抗人PD-L1分子单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2011年4月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
图1为实施例一中抗体鉴定图；
图2、3为实施例一中抗体的特异性分析；
图4为实施例一中抗原表位竞争实验结果图；
图5为实施例二中人可溶性B7-H1 ELISA试剂盒的特异性分析的结果图；
图6A～6B为实施例二中人可溶性B7-H1 ELISA试剂盒线性检测范围的分析图及试剂盒定量分析时所得浓度和OD值的标准曲线；
图7为实施例二中人可溶性B7-H1 ELISA试剂盒可用于测定基因转染细胞培养上清中的sB7-H1的结果图；
图8为实施例三中应用试剂盒定量分析时所得浓度和OD值的标准曲线；
图9为实施例三中定量分析不同肿瘤细胞株培养上清中sB7-H1的表达水平的结果图；
图10为实施例四中定量分析不同病理类型和分期的肺癌患者外周血sB7-H1的表达水平的结果图；
图11为实施例四中定量分析不同肿瘤大小和淋巴结转移级别肺癌患者外周sB7-H1表达水平的结果图；
图12为实施例四中定量分析肺癌患者外周血中sB7-H1动态变化与临床疗效的关系的结果图；
图13为实施例四中定量分析 sB7-H1与各肿瘤标志物之间关系的ROC曲线；
图14为实施例五中分析可溶性B7-H1 检测体系分析该因子在不同年龄段健康志愿者外周血中的表达特性的结果图；
图15为实施例五中应用实施例三所述试剂盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者外周血清中的表达水平的结果图；   
图16为实施例五中应用实施例三所述试剂盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者胸水中的表达水平的结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
（1）试剂和材料：小牛血清Hyclone公司（美国）；每升RPMI1640或DMEM培养基（Gibco，美国）中添加小牛血清100ml、L-谷氨酰胺0.15g、NaHCO3 2.0g、丙酮酸钠0.11g、葡萄糖3.6g、HEPES 4.766g、2-巯基乙醇10.0ml；HAT、HT选择培养基将50倍浓度的HAT、HT选择培养基（Sigma，美国），用RPMI1640或DMEM完全培养基稀释为工作浓度；福氏佐剂（Freund’adjuvant，Sigma，美国)；细胞融合剂聚乙二醇（PEG1500）；Protein G亲和层吸柱（Pharmacia，瑞典）；Pristane（Sigma，美国）。细胞培养瓶、板（Nunc，丹麦）；CO2培养箱、离心机（Jouan，法国），倒置显微镜（O1ympus，日本），流式细胞仪（Coulter，美国）；转人B7-H1基因细胞株L929/B7-H1（本人构建）。所有细胞株经检测，均无支原体污染；6~8周龄的雌性Balb/c小鼠（上海实验动物中心）。
（2）细胞株的培养：采用含10% FCS的RPMI1640培养基，基因转染细胞株定期用抗性筛选药物Zeocin（500μg/ml）加压培养，以保持目的基因产物的稳定高表达。L929/B7-H1和L929/mock细胞为贴壁性生长，传代时用0.25%的胰酶消化；其它细胞为悬浮性生长，间隔2~3天换液。
（3）动物免疫：收集生长良好的L929/B7-H1细胞，用PBS洗涤二遍后，加入丝裂霉素溶液（50μg/100μl/1×107），混匀，置于37℃，45min，PBS洗涤三遍后，再用0.3~0.4ml的生理盐水重新悬浮，与等量的IFA充分乳化，分别于颈部皮下多点及腹腔注射（1×107/只）；并于初次免疫后第三周、第五周再行免疫，将细胞数量改为8×106/只，细胞的预处理及注射的部位同上，于融合前4~5天，再次腹腔注射5×106/只以加强免疫。
（4）骨髓瘤细胞的准备：融合前10~14天，复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用含10% FCS的DMEM培养基传代培养，待细胞生长旺盛、形态良好，且细胞活力大于95%方可用于融合。融合前24~36h用新鲜培养基将细胞浓度调整为3×105/ml。
（5）饲养细胞的准备：于融合前1天，取Balb/c小鼠，摘除眼球致死，自来水冲洗后置于75%酒精中10min，然后固定于解剖架上，沿胸骨打开小鼠胸腔，剪下胸腺，置于200目的钢丝网中，将筛网移入盛有10ml基础培养基的平皿中，研磨胸腺，使其成为单个细胞而悬于培养基中；吸取少许细胞悬液计数，1000rpm，离心8min，用完全培养基调整细胞浓度为3~4×105/ml，于96孔培养板中，每孔加入0.1ml细胞悬液（相当于3~4×104/孔），CO2培养箱中培养。
（6）免疫小鼠脾脏细胞的制备：取加强免疫后的小鼠按上述方法处死，处理小鼠，打开腹腔，在左后腹部取出脾脏，经研磨获取单个脾脏细胞。用苔盼蓝液作活细胞有核计数，离心（1000rpm×8min），洗涤两遍后将沉淀细胞悬于20ml RPMI1640中，置于培养箱中备用。
（7）细胞的融合及选择性培养：将RPMI1640或DMEM基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温。收集2×107个生长良好的SP2/0细胞，与1×108个脾脏细胞混合于50ml透明塑料离心管中，用RPMI1640洗涤两遍，1000rpm 离心8min后弃尽上清，用手指弹击管底，使两种沉淀细胞充分混匀成糊状。将塑料管置于37℃保温杯中，吸取PEG溶液1ml，将尖头吸管轻轻插入细胞悬液底部，在1min内匀速加完，且边加边轻轻搅拌，然后在水浴中静置90s。再加入40ml 37℃预温的无血清DMEM，室温静止5min，离心（800rpm×10min），弃上清。将沉淀细胞轻轻重悬置于40ml含2%HAT、15%FCS的DMEM培养中。混匀后滴加在含有饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5%CO2培养，3~4天半量换液，10天后改用 HT培养基，2周后转用含15%FCS的DMEM培养基。
（8）杂交瘤细胞的筛选：待细胞克隆布满1/3~1/4培养孔时，即可吸取上清用间接免疫荧光标记法进行筛选。将生长良好的L929/B7-H1细胞用PBS洗涤后，分加于流式管中（5×105/管），加入杂交瘤细胞的培养上清(50μl/管)。于4℃反应30min，用含1%小牛血清的PBS 洗涤两遍，加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗，再于4℃反应30min，洗涤后用FACS分析，同时以L929/mock、L929/B7.1、L929/PD-L2细胞作为阴性对照细胞株。
稳定表达人B7-H1的L929/B7-H1基因转染细胞进行鉴定，将复测为阳性的克隆连续3次克隆化培养，最终获得2株能持续分泌特异性抗人B7-H1分子的杂交瘤细胞株，命名为ZH11和10D7，流式细胞仪检测结果显示，该单抗能特异性识别人B7-H1，而不与mock、B7.1和PD-L2等基因转染细胞结合（图1）。
（9）杂交瘤细胞的克隆化培养：采用有限稀释法，将抗体反应阳性孔细胞准确计数后，用HAT选择培养基梯度稀释为50个/ml和10个/ml细胞，加100μl/孔于含有饲养细胞的96孔培养板中。使每孔平均含有5个和1个细胞，37℃、5%CO2培养。适时换液并根据细胞的生长状态及时按已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞继续克隆，直至抗体分泌阳性率大于95%；扩大培养并及时液氮冻存。
（10）单克隆抗体的制备：采用腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6~8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注入Pristane 0.5ml/只。一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×107/只，同时另一侧腹腔再次注入Pristane和福氏半佐的等体积混合物0.2ml/只，轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。5~10天后收获腹水，离心取上清分装后-80℃保存。
（11）抗体纯化：将腹水解冻，离心去除凝块，取上清液按50%饱和度加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后置4℃ 4~6小时，离心弃上清。取沉淀加PH7.4的PBS复溶。透析去除(NH4)2SO4，样品经Protein G亲和层吸柱再用PH2.8甘氨酸-盐酸洗脱。收集蛋白洗脱峰用PH9.0的Tris-Base调节PH至7.0，PBS透析后用紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白含量（mg/ml）=OD280×1.55-OD260×0.76。结果：单克隆抗体ZH11和10D7浓度分别为2.16mg/ml和1.93mg/ml。
（12）单克隆抗体效价测定：将生长良好的L929/B7-H1细胞分于流式管中，5×105/管。分别加入杂交瘤细胞的培养上清、腹水和纯化的抗体蛋白梯度稀释液（20μl/管），于4℃反应30min，PBS洗涤后加入羊抗鼠IgG-PE，再于4℃反应30min。洗涤后用流式细胞仪分析，以出现同样阳性率及荧光强度时的最大稀释倍数为抗体的效价。结果显示：两株抗体的效价均达1:10000以上。
（13）单抗隆抗体的类型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清1:50、腹水1:20000稀释。取0.2ml稀释液加于含有亚类定性试剂的小试管中，室温放置1min，待其自然溶解后轻轻混匀，将亚类定性试纸条轻轻插入管中，5~10min后，试纸的一面出现与mAb重链名称相对应的兰色蛋白显色条带，此即该抗体所属的小鼠Ig亚类；而另一面出现与mAb轻链名称相对应的兰色蛋白条带，此即该mAb的轻链类型。对上述两单克隆抗体进行测序，测序结果见核苷酸/氨基酸序列表的SEQ ID No: 1~8，其中，鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11的重链具有如序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；其轻链具有如序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列；鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D的重链具有如序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；其轻链具有如序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
（14）单克隆抗体的特异性鉴定：将L929/mock、L929/B7-H1、L929/PD-L2、L929/B7.1和L929/B7.2等细胞裂解液或人IgG、B7-H1Ig、PD-L2Ig、B7.1Ig和CD28Ig蛋白用碳酸盐缓冲液（0.01M，PH9.3）调整为0.2μg/ml包被ELISA检测板，4℃过夜。洗涤2次后用2% BSA 37℃封闭1h，洗涤2次后加入研制获得的鼠抗人B7-H1单抗，37℃反应1h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG二抗（1:1000，100μl/孔），37℃继续反应1h，PBS洗涤6次，再加入新鲜配制的底物TMB（100μl，Sigma，美国），37℃反应15min，用2mol/L H2SO4（50μl/孔）终止酶与底物的反应，用酶标仪测定OD450。
将L929/mock、L929/B7-H1、L929/PD-L2、L929/B7.1和L929/B7.2等细胞裂解液包被ELISA板，检测结果显示，研制获得的ZH11和10D7单抗可特异性识别细胞裂解液中B7-H1蛋白（图2）；同样，这两株单抗也可特异性识别商品化B7-H1Ig重组蛋白（图3）。
（15）生物素标记单抗：取待标记的抗人B7-H1单抗（10D7）200μg，加入含有1ml的0.01M PH=9.3碳酸缓冲液透析袋中，于4℃下透析平衡过夜后，加入浓度为1mg/ml的BNHS-DMSO溶液40μl，室温避光反应4小时，再于4℃下在PH7.2 PBS中透析72小时，分装后-20℃保存。
（16）抗体竞争实验：将L929/B7-H1细胞（5×105/管）用PBS洗涤后分别加入不同浓度的单克隆抗体（每管0.016~10μg），4℃孵育30min，洗涤后加入Biotin标记的单抗（每管1μg），再4℃孵育30min，洗涤后加入streptavidine-PE，4℃孵育30min并洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照组。
以L929/B7-H1为竞争靶细胞对获得的单抗ZH11和10D7所识别的抗原位点进行分析，经免疫荧光标记的竞争抑制实验，结果显示，不同浓度的10D7均不能有效阻断Biotin标记的ZH11与L929/B7-H1的结合。因此，10D7识别的抗原表位不同于ZH11（图4）。
将上述两杂交瘤细胞株进行保藏，杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 1637，建议的分类命名：杂交瘤细胞，保藏日期：2006年03月08日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7）的保藏信息为：保藏号：CGMCC No. 4802，建议的分类命名：分泌小鼠抗人PD-L1分子单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2011年4月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
实施例二：
一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，包括以下组分：
(1) 包被抗体：实施例一所述鼠抗人B7-H1单抗（ZH11），30μg/管，1管； 
(2) 标准品蛋白：B7-H1Ig蛋白（R&D），25ng/管，1管；
(3) 检测抗体：实施例一所述鼠抗人B7-H1单抗（Biotin-10D7），10μg/管，1管；
(4) 本辣根过氧化物酶标记Streptavidin-HRP (Sigma-Aldrich)，1μl//管，1管；
(5) 反应底物：四甲基联苯胺TMB(Sigma-Aldrich)，10ml； 
(6) 牛血清白蛋白Bovine Serum Albumin BSA(上海生工)，2g/100ml，30ml； 
(7). 酶标板ELISA板（Costar），1块；
(8). 洗液：10×PBS，100 ml；Tween-20，0.5 ml；
(9). 终止液：2M H2SO4，5 ml；
贮存条件： 
Figure 321560DEST_PATH_IMAGE001
上述试剂盒的特异性分析：
1. 包被抗体ZH11用0.01M CBS (pH9.6)缓冲液配制成3μg/ml浓度的包被抗体工作液，按100μl/孔加入ELISA板，于4℃静置过夜；
2. 弃包被液，用0.01M PB洗板3次；加入2%BSA 200μl/孔，室温封闭1h；以PBS（含0.5%BSA）为样品稀释液，配制一系列已知浓度的sB7-H1、sB7.1、sPD-L2、sB7-H3蛋白的溶液，同时准备测定样品； 
3. 弃掉封闭液，0.01M PB洗板3次，加入一系列已知浓度的sB7-H1、sB7.1、sPD-L2、sB7-H3蛋白的溶液100μl/孔，室温反应2h；细胞培养上清、血清/血浆样品按100μl/孔加入ELISA板； 
4. 弃掉反应液，0.01M PB洗板2次，检测抗体Biotin-10D7用抗体稀释液调整至终浓度为1μg/ml，按100μl/孔加入ELISA板，室温反应2h；
5. 弃尽样品后用0.01M PB洗板3次；加入Streptavidin-HRP（1:5000），100μl/孔，室温反应1h；   
6. 弃尽反应液用0.01M PB（含0.2% Tween20）洗板8-10次；
7. 加入反应底物TMB，100μl/孔，室温避光反应10-15min；2M H2SO4终止；
8. 应用酶标仪选择OD450 nm波长测定ELISA板各检测孔的OD读数；
得到OD读数和各蛋白浓度的关系曲线图，如图5所示。
然后，分析上述试剂盒的线性检测范围，配置一系列已知浓度的sB7-H1蛋白的溶液，然后进行检测，得到OD读数和sB7-H1蛋白浓度的关系曲线图，如图6A~6B所示。
应用上述试剂盒测定基因转染细胞培养上清中的sB7-H1，具体包括以下步骤：将L929/mock、L929/PD-L2和L929/B7-H1细胞（5×104/孔）于24孔培养板中连续培养，每间隔12h收集培养上清。将anti-B7-H1单抗（ZH11）用碳酸盐缓冲液（0.01M CBS，pH9.3）调整为3μg/ml包被ELISA检测板，4℃过夜。PBS（含0.1% Tween 20）洗涤3次，2% BSA 室温封闭1h。PBS洗涤3次后加入商品化标准品B7-H1蛋白，室温反应2h，PBS洗涤3次。然后，加入生物素标记的单抗biotin-10D7（1μg/ml，100μl/孔），室温继续反应1h，PBS洗涤3次后，加入Streptavidin-HRP（1:3000，100μl/孔），室温反应1h，PBS洗涤6-8次，再加入HRP反应底物TMB（100μl/孔），室温反应10-15min，用2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450，每个样品设置3个复孔。最终得到图7。
综上所述，该试剂盒的特异性良好，并且在195-12500pg之间存在良好的线性关系。
实施例三：实施例二所述试剂盒可应用于定量分析人细胞培养上清、血清、血浆和胸水等液体中的可溶性B7-H1蛋白因子的浓度。
样品处理的方法分别为：
1. 细胞培养上清：2500 rpm×10 min，-20℃ 保存，避免反复冻融。
2. 血清样本：2500 rpm×10 min，-20℃ 保存，避免反复冻融。
3. 血浆样本：2500 rpm×10 min，-20℃ 保存，避免反复冻融。
定量检测操作步骤：
1. 包被抗体ZH11用0.01M CBS (pH9.6)缓冲液配制成3μg/ml浓度的包被抗体工作液，按100μl/孔加入ELISA板，于4℃静置过夜；     
2. 弃包被液，用0.01M PB洗板3次；加入1%BSA 200μl/孔，室温封闭1h；
3. 弃掉封闭液，0.01M PB洗板3次；以PBS（含0.5%BSA）为样品稀释液，准备测定样品。标准蛋白：
Figure 114067DEST_PATH_IMAGE002
取7个EP管，每管加入100μl稀释液并置于EP管架上；
Figure 267705DEST_PATH_IMAGE003
将100μl 50ng/ml B7-H1Ig纯品蛋白加到第一个EP管，混匀后再取100μl到第二个EP管进行倍比稀释，依此类推至第7管。细胞培养上清、血清/血浆样品按100μl/孔加入ELISA板；
Figure 272702DEST_PATH_IMAGE004
检测抗体Biotin-10D7用抗体稀释液调整至终浓度为1μg/ml；
4. 加入标准品和待测样品100μl/孔，室温反应2h；
5. 弃尽样品后用0.01M PB洗板3次；加入Streptavidin-HRP（1:5000），100μl/孔，室温反应1h； 
6. 弃尽反应液用0.01M PB（含0.2% Tween20）洗板8-10次；
7. 加入反应底物TMB，100μl/孔，室温避光反应10-15min；2M H2SO4终止；
8. 应用酶标仪选择OD450 nm波长测定ELISA板各检测孔的OD读数。  
结果分析：
1. 标准品OD值采用GraphPad Software软件利用最佳的拟合曲线列出最合适的函数方程；
2. 样品/对照孔的OD值代入方程，并乘以相应的稀释倍数，计算出样品和对照孔的相应浓度；
3. 样品孔取复孔的平均值。
实验应用举例：
1. 原始数据：
Figure 466834DEST_PATH_IMAGE005
2. 曲线方程：
y= 0.0447x + 0.0938，
R2 = 0.9922；其中，y代表OD值，x代表sB7-H1浓度，单位为ng/ml；
3. 绘制的标准曲线如图8所示。
准确性分析：
方法：
1．板内准确性分析：在同一次实验中，将三个已知浓度的样本（12.5, 6.25, 3.125 ng/ml）分别设20个复孔，进行sB7-H1检测，分析该试剂盒的准确性；
2．板间准确性分析：在24此不同实验室中，将三个已知浓度的样本（12.5, 6.25, 3.125 ng/ml）分别进行B7-H3检测，分析该试剂盒的准确性；
结果：
Figure 210668DEST_PATH_IMAGE006
结论：变异系数CV<10%，证实检测方法均具有良好的准确性。
实际应用举例：
1、定量分析不同肿瘤细胞株培养上清中sB7-H1的表达水平，得图9；
2、定量分析不同病理类型和分期的肺癌患者外周血sB7-H1的表达水平，得图10；
3、定量分析不同肿瘤大小和淋巴结转移级别肺癌患者外周sB7-H1表达水平，得图11；
4、定量分析肺癌患者外周血中sB7-H1动态变化与临床疗效的关系，得图12；
5、定量分析 sB7-H1与各肿瘤标志物之间关系的ROC曲线，得图13；
综上所述，可以使用本发明特异性测定可溶性B7-H1的ELISA试剂盒对肺癌进行鉴别诊断，对肺癌患者在临床治疗过程中的进展进行评价。肺癌患者血清中存在sB7-H1高表达，且这种高表达和肺癌的肿瘤负荷和病变范围有关，且肿瘤局灶如恶性胸水中sB7-H1水平高于血清含量。临床随访研究发现，肺癌患者血清中该可溶性因子的表达水平和临床疗效呈负相关。所描述的试剂盒除包括本发明的抗细胞表面B7-H1分子的单克隆抗体外，还可包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液和标准品等。
实施例五：
应用实施例二所述试剂盒，分析可溶性B7-H1 检测体系分析该因子在不同年龄段健康志愿者外周血中的表达特性，得图14，图14显示，在健康人血清中存在sB7-H1的表达，且sB7-H1在人血清中的表达水平随着年龄的增加而增加。人群中，3-10岁儿童的表达水平最低，51-70岁的老年人则具有较高表达水平。两中间年龄段成人的表达水平则居中。
应用实施例二所述试剂盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者外周血清中的表达水平，得图15，图15显示应用特异性检测人sB7-H1的ELISA对肺癌患者的外周血清中该因子的表达水平进行定量，结果显示，与健康志愿者相比，肺癌患者血清中sB7-H1的含量显著升高，该因子的平均含量是健康人对照的两倍以上。
应用实施例二所述试剂盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者胸水中的表达水平，得图16，图16显示应用建立的特异性检测人sB7-H1的ELISA对10例肺癌患者胸水和外周血清进行分析，结果表明，肺癌患者胸水中sB7-H1的表达量显著高于外周血中的水平。
核苷酸和/或氨基酸序列表
 
<110>  苏州大学
<120>  一种可溶性B7-H1定量检测试剂盒
<160>  8    
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  420
<212>  DNA
<213>  未知
 
<400>  1
gtcaagctgc agcagtcagg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc        60
tgcaagactt ctggcttcac cttcaacagt agctatataa gttggttgag gcaaaagcct       120
ggacagagtc ttgagtgtat tgcatggatt tatgctggaa ctggcggtac taactataat       180
cagaagttca cagacaaggc ccaactgact gtagatacat cctccagcac agcctacatg       240
caattcagca gcctgacaac tgaggactct gccatctatt actgtgcaag acacccccgg       300
agttttttct atggtatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc       360
aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc       420
 
<210>  2
<211>  380
<212>  DNA
<213>  未知
 
<400>  2
cacattgtga tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc        60
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gcatgcaagc ttggcgtaat                                                   380
 
<210>  3
<211>  396
<212>  DNA
<213>  未知
 
<400>  3
gagcagtcag ggggagactt agtgaagcct ggagggtccc tgaaactctc ctgtgcagcc        60
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ttggattatt ggggtcaagg aacctcattc accatctcct cagccaaaac gacaccccca       360
tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaa                                 396
 
<210>  4
<211>  353
<212>  DNA
<213>  未知
 
<400>  4
tcgacgattc agattgggat gacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag        60
aaggtcacca tgacctgcag tgtcagctca agtattactt tcatgtactg gttccagcag       120
aagccaggat cctcccccag actcctgatt tatgacacat ccaagctggc ttctggagtc       180
cctgttcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagccgaatg       240
gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga gtggttaccc gtacacgttc       300
ggagggggga ccaagctgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atc              353
 
<210>  5
<211>  140
<212>  PRT
<213>  未知
 
<400>  5
VKLQQSGAEL VKPGASVKLS CKTSGFTFNS SYISWLRQKP GQSLECIAWI YAGTGGTNYN        60
QKFTDKAQLT VDTSSSTAYM QFSSLTTEDS AIYYCARHPR SFFYGMDYWG QGTSVTVSSA       120
KTTPPSVYPL APGSAAQTNS                                                   140
 
<210>  6
<211>  127
<212>  PRT
<213>  未知
 
<400>  6
HIVMTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVT SMHWYQQKSG TSPKGWIYDT SKLASGVPAR        60
FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SNNPLTFGAG TKLELKRADA APTVSIVDLQ       120
ACKLGVX                                                                 127
 
<210>  7
<211>  132
<212>  PRT
<213>  未知
 
<400>  7
EQSGGDLVKP GGSLKLSCAA SGFTFSYYAM SWVRQTPEKR LEWVASISSR GDTYYPDIVK        60
GRFTISRDNA RNILYLQMRS LRSEDTALYY CARGGGNYEG LDYWGQGTSF TISSAKTTPP       120
SVYPLAPGSA AQ                                                           132
 
<210>  8
<211>  118
<212>  PRT
<213>  未知
 
<400>  8
STIQIGMTQS PAIMSASPGE KVTMTCSVSS SITFMYWFQQ KPGSSPRLLI YDTSKLASGV        60
PVRFSGSGSG TSYSLTISRM EAEDAATYYC QQWSGYPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVS         118

Claims (9)

1. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5. 一种鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11，其特征在于，所述单克隆抗体的重链如序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列所示；所述单克隆抗体的轻链如序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列所示。
6. 一种鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D7，其特征在于，所述单克隆抗体的重链如序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列所示；所述单克隆抗体的轻链如序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列所示。
7. 一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-H1单克隆抗体ZH11的杂交瘤细胞株ZH11（抗PD-L1），其保藏号为CGMCC No. 1637。
8. 一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-H1单克隆抗体10D7的杂交瘤细胞株SIPD-L1（10D7），其保藏号为CGMCC No. 4802。
9.一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，包括：辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、标准品蛋白、洗液和终止液，所述试剂盒还包括：包被抗体和检测抗体，其特征在于，所述包被抗体为权利要求5所述鼠抗人B7-H1单克隆抗体；所述检测抗体为权利要求6所述鼠抗人B7-H1单克隆抗体。
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