CN102216459A - 调节细胞摩尔渗透压浓度的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供组合物和方法，其用于调节细胞，例如培养的细胞，包括生物反应器中的培养细胞中的细胞内摩尔渗透压浓度。本发明提供包含至少一个渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的核酸，和含有渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的细胞、载体、制备产物、人造器官或植入物等。

Description

调节细胞摩尔渗透压浓度的组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年9月15日提交的美国临时申请号61/097,149的权益，其内容以其整体引入作为参考。

技术领域

本发明一般涉及分子和细胞生物学、细胞培养系统和生物反应器，并涉及细胞培养中产物，如多肽的重组产生。具体而言，本发明提供用于调节细胞，例如培养细胞，包括生物反应器中的培养细胞中细胞内摩尔渗透压浓度的组合物和方法。

相关领域的背景

生物反应器培养的哺乳动物细胞用于制备重组蛋白质药物，如生长因子、血栓溶解剂、干扰素、白细胞介素、促红细胞生成素、集落刺激因子和多种其它细胞因子和抗体。然而，在生物反应器中，因为加入碱来控制pH以及加入营养物和补充物为培养物提供必需的能量，培养物的摩尔渗透压浓度会提高。通常，在补料分批生物反应器运行的整个过程中，摩尔渗透压浓度有时从大约300毫渗摩尔/kg(mOsm)升高至600mOsm的值。已经显示相比于300mOsm的细胞培养物，在(高于340mOsm并低于包括400到450mOsm的阈值)摩尔渗透压浓度范围内，哺乳动物细胞的比生产力增加，而细胞的生长速率降低，但细胞的死亡速率不受影响。对于大多数细胞系，看起来存在摩尔渗透压浓度阈值，在所述阈值细胞以上死亡速率随摩尔渗透压浓度升高而显著升高(阈值经常看起来在400到450mOsm之间)。

在生物反应器中，提高的摩尔渗透压浓度与提高的张力(增加的NaCl)相关。高NaCl激活转录因子张力应答增强子/渗透应答元件结合蛋白质(TonEBP/OREBP，其中TonE也称为“张力增强子”或“渗透应答元件”)，其激活TonE，导致几种保护基因的增强转录，所述保护基因的启动子受其同源结合位点：增强子ORE/TonE的控制。

TonEBP/OREBP转录活性的调控是复杂的。在高渗性的30分钟内，TonEBP/OREBP变得磷酸化并易位到细胞核中。数小时后，TonEBP/OREBP mRNA和蛋白质丰度提高。同样，高渗性提高TonEBP/OREBP的反式激活活性，所述活性与其反式激活结构域的磷酸化相关联。更迟缓地，高渗性通过诱导其mRNA和蛋白质合成提高TonEBP/OREBP的丰度。

发明概述

本发明提供分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含(a)至少一个渗透应答转录调节元件(ORTRE)，其包含有效连接转录调节序列的至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子；(b)(a)的核酸分子，其中所述转录调节序列在真核细胞中是有转录活性的，或者所述转录调节序列来自真核细胞；(c)(a)或(b)的核酸分子，其中所述转录调节序列在脊椎动物、哺乳动物、人、昆虫、植物、酵母或真菌细胞，或病毒中是有转录活性的，或者所述转录调节序列来自脊椎动物、哺乳动物、人、昆虫、植物、酵母或真菌细胞，或病毒，或者所述转录调节序列是合成序列；或，(d)(a)的核酸分子，其中所述转录调节序列包含启动子和/或增强子。

在备选实施方案中，所述至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子分子(序列)以有义或反义方向定位在启动子的5’；或，所述至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列以有义或反义方向定位在启动子的3’；或，所述至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列以有义或反义方向定位在启动子的5’，并且第二个、第三个和/或额外的TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列以有义或反义方向定位在启动子的3’。

在备选实施方案中，OR-TRE还包含有效连接所述TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列的至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子。所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子可以有义或反义方向定位在OR-TRE的5’；或，所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子可以有义或反义方向定位在OR-TRE的3’；或，激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子可以有义或反义方向定位在OR-TRE的5’，并且第二个、第三个和/或额外的激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子以有义或反义方向定位在OR-TRE的3’。

在备选方面，所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子以有义或反义方向定位在启动子的5’；或，所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子以有义或反义方向定位在启动子的3’；或，激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子以有义或反义方向定位在启动子的5’，并且第二个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子以有义或反义方向定位在启动子的3’。

在一个实施方案中，至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子和/或至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子具有(包含)，或进一步包含真核(例如脊椎动物、哺乳动物、人、昆虫、酵母或真菌)、原核、植物、病毒和/或合成的核酸分子序列。

在备选实施方案中，所述至少一个TonEBP应答转录增强子包含5’-T/A/C)GGAA(A/T)NN(T/A/C)N(T/A/C)-3’(SEQ ID NO：1)的核酸序列，其中N可以是任何核酸残基；和/或所述至少一个NFATc应答转录增强子包含5’-(T/A/C)GGAA(C/G)(A/G)-3’(SEQ ID NO：2)或5’-(T/A/C)GGAAANN(T/A/C)N(T/A/C)-3’(SEQ ID NO：4)的核酸序列，其中N可以是任何核酸残基；和/或所述至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子包含5’-TGA(C/G)TCA-3’(SEQ ID NO：3)的核酸序列。

在备选实施方案中，所述至少一个TonEBP应答转录增强子包含5’-(T/A/C)GGAAANN(T/A/C)N(T/A/C)-3’(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列；和/或所述至少一个NFATc应答转录增强子包含5’-TGGAAATTTGT-3’(SEQ ID NO：5)的核酸序列；和/或所述至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子包含5’-TGACTCA-3’(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述OR-TRE包含5’-TT

AATGGGATTTAGAGAGGTGGGGTTC

T-3’的核苷酸序列，或(SEQ ID NO：7)的2到12位残基(其对应于5’-T

-3’)(SEQ ID NO：9)，或5’-TTGACTAGTT

AATGGGATTTAGAGAGGTGGGGTTCTTGCTAGCTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGA

3’(SEQ ID NO：8)，其中(SEQ ID NO：7)和(SEQ ID NO：8)中的TonE和AP1结合位点为粗体。

在一个实施方案中，用于本发明渗透应答构建体的TonEBP应答转录增强子元件(序列)包含特异结合蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸残基基序RAHYETEG(SEQ ID NO：9)。

在一个实施方案中，所述至少一个TonEBP应答转录增强子定位在至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子的5’，或，至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子序列定位在至少一个TonEBP应答转录增强子的5’。

在备选实施方案中，至少一个TonEBP应答转录增强子序列定位在至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400或500或更多核苷酸残基内。

在备选实施方案中，至少一个TonEBP应答转录增强子定位在启动子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400或500或更多核苷酸残基内。

在备选实施方案中，至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子序列定位在启动子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400或500或更多核苷酸内。

在备选实施方案中，所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子、哺乳动物启动子、细菌启动子、植物启动子、酵母启动子、真菌启动子、病毒启动子、或巨细胞病毒(CMV)启动子。

在备选实施方案中，所述OR-TRE包含1到10个(1到10)或更多TonEBP应答转录增强子，和/或，所述OR-TRE包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子。

在备选实施方案中，核酸分子还包含有效连接在细胞中，例如真核细胞中有转录活性的启动子的一个或更多额外核酸分子(序列)。所述一个或多个额外的核酸分子(序列)可包含一个或更多蛋白质编码核酸分子，或一个或更多调节核酸(具有抑制、稳定或上调功能或效果的核酸)。例如，调节核酸可以是一个或更多有义或反义核酸分子(序列)。在备选实施方案中，所述额外的核酸分子包含：(a)蛋白质编码核酸分子；(b)调节核酸分子；或(c)(b)的核酸分子，其中所述调节核酸分子是抑制性的，稳定或上调核酸分子，或可以是有义或反义序列。

在备选实施方案中，所述额外的核酸分子包含编码渗透保护蛋白质或肽的核酸分子(序列)；或，所述额外的核酸分子包含这样的核酸分子(序列)，其编码抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶，或其任何组合。

在备选实施方案中，所述调节核酸，例如抑制性的核酸分子包含有义序列、反义序列、核酶、短的干扰RNA(siRNA)，或微小RNA(miRNA)。所述额外的核酸分子可包含编码NFATc或TonEBP多肽的核酸分子。

本发明提供分离的、合成的或重组的渗透应答核酸分子，其包含：(a)有效连接核酸的本发明的至少一个OR-TRE，其中所述OR-TRE调节或驱动该核酸的转录；(b)(a)的核酸分子，其中所转录的核酸编码(包含)多肽编码核酸分子；(c)(b)的核酸分子，其中所转录的核酸编码：(i)渗透保护蛋白质或肽，或在摩尔渗透压浓度升高的环境中保护细胞，或在高渗性或高渗性提高的条件下保护细胞的蛋白质；(ii)抗细胞凋亡蛋白质；(iii)赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；(iv)参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；(v)参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；(vi)糖酵解酶；(vii)细胞周期调节蛋白；(viii)糖基化酶；或(ix)(i)到(viii)的任何组合；(d)(a)的核酸分子，其中所转录的核酸包含调节核酸，例如抑制性的，稳定化或上调核酸分子，或包含有义或反义序列的核酸分子；(e)(d)的核酸分子，其中所述调节核酸，例如抑制性的，稳定化或上调核酸分子包含有义、反义序列、核酶、短的干扰RNA(siRNA)，或微小RNA(miRNA)；(f)编码(b)的多肽的核酸分子，其中所转录的核酸编码NFATc多肽、AP-1多肽、TonEBP多肽、钙依赖磷酸酶多肽或其组合。

在备选实施方案中，所述渗透保护蛋白质或肽是脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白，或醛糖还原酶。所述抗细胞凋亡蛋白质可以是Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BHRF1、X-IAP、IAP1、IAP2IEX-1L、Bfl-1或Bcl-w。赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质可以是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、sulfiredoxin、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、硫醇转移酶、谷氧还蛋白或谷胱甘肽还原酶。

在备选实施方案中，参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质是结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)、钙联接蛋白、钙网蛋白、ERp57或蛋白质二硫键异构酶(PDI)。

所述糖酵解酶可以是丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶。所述细胞周期调节蛋白可以是细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶，或细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。

本发明提供分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少一个渗透应答转录调节元件，所述渗透应答转录调节元件有效连接包含靶核酸分子的至少一个核酸分子。所述靶核酸分子可包含靶定生乳基因或生乳信使或生乳蛋白质以降低生乳基因或生乳信使或生乳蛋白质表达的核酸分子。所述生乳基因可以是乳酸脱氢酶。包含靶定生乳基因或生乳基因信使的核酸分子的核酸可包含短的干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA和/或具有核酶活性的RNA。在一个实施方案中，所述至少一个渗透应答转录调节元件包含本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)。

一方面，所述渗透应答核酸分子还包含编码转录物(信使)的核酸分子，所述转录物(信使)包含5’非翻译区、3’非翻译区或5’非翻译区和3’非翻译区。一方面，所述渗透应答核酸分子还包含至少一个转录或翻译调节序列，其在一个实施方案中可以定位在5’非翻译区，或定位在3’非翻译区，或定位在5’非翻译区和3’非翻译区。

本发明提供这样的载体，其包含(a)本发明的核酸分子，(b)本发明的核酸；和/或(c)本发明的渗透应答核酸。在备选实施方案中，所述载体是表达盒、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体或克隆载体；或，所述载体是噬菌体P1来源的载体、细菌人工染色体、酵母人工染色体，或哺乳动物人工染色体；或所述载体是染色体外游离基因。一方面，所述载体是整合型载体。

本发明提供这样的细胞，其包含：(a)本发明的核酸，(b)本发明的核酸；和/或(c)本发明的渗透应答核酸；或(b)本发明的载体。在备选实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞、人细胞、小鼠细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、植物细胞、永生细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。细胞中的载体可以是染色体外游离基因，或，所述载体可以稳定整合到细胞的基因组内。本发明的核酸可以是附加型的瞬时表达构建体，或是基因组整合的表达构建体，其或者可以是稳定的基因组插入片段。

本发明提供生物反应器、培养碟、培养皿、试管、滚瓶等，其包含本发明的细胞。

本发明提供用于在摩尔渗透压浓度升高的环境中，或在高渗性或高渗性提高的条件下保护细胞，或维持摩尔渗透压浓度或细胞中的摩尔渗透压浓度的方法，其包括表达渗透保护蛋白质或肽或渗透保护调节核酸分子，其中所述方法包括：(a)向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：本发明的核酸分子和/或本发明的渗透应答核酸分子，或本发明的载体；其中所述多核苷酸编码渗透保护蛋白质或肽，或其本身就是渗透保护核酸分子；和(b)培养所述细胞，从而表达渗透保护蛋白质或肽，或渗透保护调节核酸，由此在摩尔渗透压浓度升高的环境中，或在高渗性或高渗性提高的条件下保护细胞。

在这些方法的备选方面，所述渗透保护蛋白质或肽包含：(i)在摩尔渗透压浓度升高的环境中保护细胞(例如在高渗性或高渗性提高的条件下保护细胞)的蛋白质；(ii)抗细胞凋亡蛋白质；(iii)赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；(iv)参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；(v)参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；(vi)糖酵解酶；(vii)细胞周期调节蛋白；(viii)糖基化酶；或(ix)(i)到(viii)的任何组合。

本发明提供在高渗性条件下提高或调节细胞(包括培养的细胞，例如生物反应器中的细胞)中重组蛋白质的产生，或提高细胞(包括培养的细胞，例如生物反应器中的细胞)中正确折叠蛋白质或正确糖基化蛋白质产生的方法，所述方法包括：(a)提供编码重组蛋白质的异源或重组核酸分子；和(b)将多核苷酸稳定或瞬时插入到细胞中，所述多核苷酸包含：本发明的核酸和/或本发明的渗透应答核酸，其中所述核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽，或渗透保护调节核酸；和(c)一定条件下培养细胞，在所述条件下表达(b)的渗透保护蛋白质或肽或渗透保护调节核酸和(a)的重组蛋白质，由此在高渗性条件下，提高或调节细胞中重组蛋白质的产生，或提高细胞中正确折叠蛋白质或正确糖基化蛋白质的产生或调节正确折叠蛋白质或正确糖基化蛋白质的产生。

本发明提供用于在高渗性条件下提高或调节生物反应器、外植体或人造器官中的细胞中重组蛋白质的产生，或提高或调节其中正确折叠蛋白质或正确糖基化蛋白质的产生的方法，所述方法包括：(a)提供包含本发明细胞的生物反应器、外植体或人造器官，其中所述细胞包含本发明的核酸和/或本发明的渗透应答核酸分子，或本发明的载体；并且所述核酸分子或载体编码渗透保护蛋白质或肽；和(b)在这样的条件下培养所述细胞，在所述条件下表达渗透保护蛋白质或肽或渗透保护调节核酸，和重组蛋白质，或将所述生物反应器、外植体或人造器官置于这样的条件下，其允许细胞表达渗透保护蛋白质或肽或渗透保护调节核酸，和重组蛋白质。

本发明提供用于增加或增强细胞对渗透胁迫或渗透休克的适应性或抗性的方法，所述方法包括：向细胞中引入多核苷酸，其包括本发明核酸和/或本发明渗透应答核酸分子，或本发明载体；其中所述核酸分子或载体编码渗透保护蛋白质或肽或渗透保护调节核酸。在备选方面，如此处所用，渗透胁迫不同于渗透休克，因为与渗透休克相比，渗透胁迫包括培养系统、细胞等中摩尔渗透压浓度(胁迫)的逐渐改变，而所述渗透休克包括培养系统、细胞等中摩尔渗透压浓度(胁迫)的急剧改变(休克)。

在这些方法的备选方面，所述方法增加或增强细胞对高渗透胁迫或高渗透休克的适应性或抗性，或，所述方法增加或增强细胞对低渗透胁迫或低渗透休克的适应性或抗性。

本发明提供在细胞中高渗性条件下，提高或调节细胞中重组蛋白质产生，或提高或调节细胞中正确折叠的蛋白质或正确糖基化蛋白质的产生的方法，其包括：(a)提供编码重组蛋白质的异源或重组核酸分子；和(b)将多核苷酸稳定或瞬时插入到细胞中，所述多核苷酸包含：本发明的核酸和/或本发明的渗透应答核酸分子，或本发明的载体；其中所述核酸分子或载体编码渗透保护蛋白质或肽；和(c)在表达(b)的渗透保护蛋白质或肽或核酸和(a)的重组蛋白质的条件下培养所述细胞。

本发明提供在高渗性条件下，提高或调节外植体或人造器官中重组蛋白质的产生，或提高外植体或人造器官中正确折叠蛋白质或正确糖基化蛋白质产生的方法，所述方法包括：(a)提供包含编码重组蛋白质的异源或重组核酸分子的细胞；和(b)将多核苷酸稳定或瞬时插入到细胞中，所述多核苷酸包含：本发明的核酸和/或本发明的渗透应答核酸分子，或本发明的载体，其中所述核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽或渗透保护核酸分子；和(c)在所述外植体或人造器官中插入细胞，并在允许渗透保护蛋白质或肽或渗透保护核酸分子，和重组蛋白质在细胞中表达的条件下维持所述外植体或人造器官，由此在所述外植体或人造器官中提高或调节重组蛋白质的产生。

本发明提供在密集或晚期细胞生产系统中有效产生生物分子，或允许在密集或晚期细胞生产系统中总生物分子产量更高或翻译后加工蛋白质产量更高的方法，其包括：(a)将多核苷酸稳定或瞬时插入到能够产生生物分子的细胞中，所述多核苷酸包含：本发明的核酸和/或本发明的渗透应答核酸分子，或本发明的载体，其中所述核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽，或渗透保护核酸分子；(b)(a)的方法，其中所述生物分子是小分子、多肽和/或核酸；或(c)(a)或(b)的方法，其中所述方法产生更高产量的正确折叠的或优选折叠的(例如野生型折叠，野生型模式折叠)或糖基化的多肽。

本发明提供包含本发明细胞、本发明载体，和/或本发明渗透应答核酸分子的人造器官或外植体。本发明提供制备方法产物，其包含本发明的细胞、本发明的载体，和/或本发明的渗透应答核酸分子。本发明提供包含本发明细胞、本发明核酸分子、本发明载体，和/或本发明渗透应答核酸分子的试剂盒。一方面，所述试剂盒还包含用于实施本发明方法的说明书。

因此，在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的分离的核酸分子，所述渗透应答转录调节元件包含有效连接转录调节子的至少一个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子和有效连接所述TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子的至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子。所述转录调节子例如可以是启动子、增强子或其组合。在一些实施方案中，第一个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子定位在启动子的5’，第二个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子定位在启动子的3’。在一些实施方案中，第一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在OR-TRE的5’，第二个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在OR-TRE的3’。在一些实施方案中，激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在转录调节子的5’，并且所述转录调节子是启动子。在其它实施方案中，激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在转录调节子的3’，所述转录调节子是启动子。在其它实施方案中，第一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在转录调节子的5’，第二个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在转录调节子的3’，其中所述第一个转录调节子和所述第二个转录调节子均是启动子。在一些实施方案中，核酸分子含有(a)包含SEQID NO：1的核酸序列的至少一个TonEBP应答转录增强子；或(b)包含SEQID NO：2或SEQ ID NO：4的核酸序列的至少一个NFATc应答转录增强子；或(c)包含SEQ ID NO：3的核酸序列的至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子(其中N可以是任何核苷酸)。

在某些实施方案中，本发明的OR-TRE包含SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9的核苷酸序列。

本发明的核酸分子还可以包含有效连接转录调节子的额外的核酸分子，其中所述转录调节子是在真核细胞中有转录活性的启动子。所述额外的核酸分子可以是蛋白质编码核酸分子(例如编码目的蛋白质)或调节核酸分子(例如，抑制分子、稳定分子、上调核酸分子，或产生反义分子的分子)。在一些实施方案中，所述抑制核酸分子包含反义序列、核酶、短的干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一些实施方案中，所述额外的核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽，例如，脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE)。在其它实施方案中，所述额外的核酸分子编码在细胞中赋予所表达蛋白质有益性质的蛋白质或肽。赋予益处的蛋白质可以是例如抗细胞凋亡蛋白质(例如，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BHRF1、X-IAP、IAP1、IAP2IEX-1L、Bfl-1或Bcl-w)；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质(例如，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、sulfiredoxin、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、硫醇转移酶、谷氧还蛋白或谷胱甘肽还原酶)；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质(例如，结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)、钙联接蛋白、钙网蛋白、ERp57或蛋白质二硫键异构酶(PDI))；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶(例如，丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶)；细胞周期调节蛋白(例如，细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶，或细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂)；糖基化酶，或其任何组合。在其它实施方案中，所述额外的核酸分子编码NFATc或TonEBP多肽。

在一些实施方案中，OR-TRE有效连接至少一个靶核酸分子，例如，靶定生乳基因、生乳信使或生乳蛋白质以降低所述生乳基因(例如，乳酸脱氢酶)、生乳信使或生乳蛋白质表达的核酸分子。在一些实施方案中，靶定生乳基因或生乳信使的这些核酸分子包含短的干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA和/或具有核酶活性的RNA。

本发明包括包含本发明核酸的载体和包含此类载体的宿主细胞。

在某些实施方案中，本发明的核酸分子还包含(i)编码赋予在细胞中表达的蛋白质有益性质的多肽的额外的核酸分子，其有效连接转录调节子，其中所述转录调节子是在真核细胞中有转录活性的启动子和(ii)编码待在细胞中表达的目的蛋白质的核酸分子，其中(i)的核酸分子的表达向(ii)的核酸分子编码的多肽传递所述有益性质。

在此类实施方案中，(i)的分子编码选自抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶，或其任何组合的多肽。

本发明还提供用于在高渗性条件下保护细胞的方法，其包括：

(a)向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：

(i)编码渗透保护蛋白质或肽的核酸分子或调节核酸分子和

(ii)编码有效连接启动子的第二种目的蛋白质的多核苷酸；和

(b)培养所述细胞，从而表达所述渗透保护蛋白质或肽，或渗透保护调节核酸和目的蛋白质，由此在高渗性条件下保护细胞，并允许所述第二种目的蛋白质表达。

在这些实施方案中，所述渗透保护蛋白质或肽可以是，例如，脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE)。

本发明还提供用于在细胞中高渗性条件下表达目的蛋白质的方法，其包括：

(a)向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：

(i)编码赋予表达蛋白质有益性质的蛋白质的核酸分子和

(ii)编码有效连接启动子的第二种目的蛋白质的多核苷酸；和

(b)培养所述细胞，从而当所述细胞在高渗性条件下生长时(i)的核酸分子的表达向(ii)的多核苷酸表达的多肽传递所述有益性质。

在这些实施方案中，赋予细胞中表达的蛋白质有益性质的蛋白质或肽可以是，例如，抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶；或其任何组合。

在本发明的方法中，细胞最初可在正常培养条件(即具有标准张力条件)下培养，随后可改变培养条件，以将摩尔渗透压浓度升高至足以增加所述第二种目的蛋白质表达的量。这可通过用增加所述摩尔渗透压浓度的化合物掺加培养物来完成。

在一些实施方案中，蛋白质在培养晚期(当培养条件具有升高的摩尔渗透压浓度时)的表达有益于产生这样的蛋白质，如对细胞有毒的蛋白质、不稳定的蛋白质，或在正常培养条件下难以表达的蛋白质。

在其它实施方案中，初始培养条件是标准培养条件，并且允许所述培养物在细胞培养过程中变成高渗的，由此增强在OR-TRE控制下的所述第二种目的蛋白质的表达。这些蛋白质可以是对细胞有毒的蛋白质、不稳定的蛋白质、或在正常培养条件下难以表达的蛋白质。

本发明还提供用于添加或增强细胞对渗透胁迫或渗透休克的适应性或抗性的方法，所述方法包括向细胞中引入包含本发明的核酸分子的多核苷酸，其中额外的核酸分子是(a)渗透保护蛋白质或肽；或(b)渗透保护调节核酸。

本发明还提供用于在细胞中高渗性条件下表达目的蛋白质的方法，所述方法包括向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：

(a)编码TonEBP的蛋白质编码核酸分子；和

(b)编码有效连接第二种OR-TRE的第二种目的蛋白质的多核苷酸；其中在摩尔渗透压浓度升高的条件下，表达(a)的核酸分子，由此表达TonEBP蛋白质，并且其中所述TonEBP蛋白质正调节TonEBP和所述第二种目的蛋白质的表达。这产生正反馈环系统。在这些实施方案中，第二种目的蛋白质可以是例如，渗透保护蛋白质(例如，脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE))；向所述细胞表达的多肽传递有益性质的蛋白质(例如，抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶；或其任何组合)。在一些实施方案中，所述方法可包括有效连接启动子的第三种目的蛋白质的表达，其中传递有益性质的蛋白质作用于所述第三种目的蛋白质。

在附图及下文描述中阐明了本发明的一个或更多实施方案的详细内容。本发明的其它特征、目标和优势将从附图和权利要求的描述中变得显而易见。

所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物此处为所有目的明确引入作为参考。

附图简述

图1a和图1b简要说明了本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TREs)怎样提高渗透耐受性，如下文详细讨论。

图2简要说明了通过测定转染细胞上清液中的标记物来证明本发明构建体的转录上调活性的实验，如下文实施例1中详细描述。

图3简要说明了本发明的示例性渗透应答转录调节元件(OR-TREs)，如下文实施例1中详细描述。

图4简要说明了图3说明的本发明示例性渗透应答转录调节元件(OR-TREs)的体内渗透保护功效，如下文实施例1中详细描述。

图5简要说明了将POR3和POR7驱动表达水平对其组成型表达水平进行归一化，如下文实施例1中详细描述。多种图中的相似参考符号指示相似元件。

图6显示了一个、三个或七个ORE对高渗培养基中蛋白质生产的影响。

发明详述

本发明提供用于调节细胞，例如培养细胞，如生物反应器中使用的细胞中胞内摩尔渗透压浓度的组合物和方法。一方面，本发明提供用于调节培养的哺乳动物细胞中胞内摩尔渗透压浓度的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供人造(重组)渗透感应或“渗透应答”基因表达系统，和用于制备和使用它们的方法。在另一实施方案中，通过将这些渗透感应或“渗透应答”基因表达系统掺入到细胞中，本发明还提供具有增强的渗透应答，或增强的渗透感应机制的改造细胞。因此，一方面，当这些细胞用于培养系统，例如生物反应器中时，它们增强的渗透应答性(例如对高渗或低渗胁迫的增强抗性)导致更好的细胞健康和存活，并导致在培养系统或生物反应器中提高的或增加的产物生产。

在一个实施方案中，本发明的构建体用作诱导型核酸和/或多肽表达系统，其中诱导或降低本发明构建体转录的信号(例如本发明构建体中的核酸)是细胞的胞内和/或胞外环境，例如生物反应器、培养碟、培养皿、试管、滚瓶、外植体、人造器官等中培养液的摩尔渗透压浓度、重量摩尔渗透压浓度和/或张力的改变(例如引起高渗性或增加高渗性程度的改变)。

在备选实施方案中，因为本发明的组合物和方法赋予细胞渗透保护表型，这些组合物和方法可用于提高或增加“难以表达”分子、多肽和/或核酸(例如对细胞有毒，例如具有内在宿主细胞毒性的分子、多肽和/或核酸)的产生(制备)。此处提供的组合物和方法也用于提高或增加“难以表达”多肽(其在难以正确表达或如优选的/期望的(例如野生型折叠模式)的背景中“难以表达”)的表达(制备)，例如来提高或增加正确的翻译后加工，例如，在具有对渗透胁迫条件(例如高渗性条件)敏感的翻译后机制的细胞中(例如在渗透胁迫培养或在生物反应器条件中，例如在晚期或细胞密集培养环境中)提高或增加多肽正确的折叠和/或优选的/期望的糖基化(例如野生型糖基化模式)。在另一实施方案中，此处提供的组合物和方法也用于提高或增加“难以表达”多肽的表达，所述“难以表达”多肽在不能正确进行翻译后加工或在渗透胁迫条件(例如高渗性条件)例如在渗透胁迫培养或生物反应器条件中，例如在晚期或细胞密集培养环境中没有足够产量的蛋白质，例如在渗透胁迫条件中不能正常折叠或变得糖基化或没有足够产量的蛋白质的上下文中“难以表达”。在备选实施方案中，因为通过实施此处提供的组合物和方法产生了正确进行翻译后修饰，例如糖基化或折叠的多肽，在晚期或细胞密集培养环境中，如生物反应器中维持产物质量。例如，一方面，实施此处提供的组合物和方法导致在制备过程中维持重组蛋白质的质量，例如在制备过程维持FDA认可的重组蛋白质质量，特别是当在晚期或细胞密集培养环境中，如生物反应器中产物质量降低时。

在其它实施方案中，也因为本发明的组合物和方法向细胞中传递渗透保护表型，这些组合物和方法可用于提高或增加密集或晚期细胞生产系统，包括例如细胞培养物，或生物反应器、培养碟、培养皿、试管、滚瓶、外植体、人造器官等中密集或晚期生长细胞的产生(制备)。因此，此处提供的组合物和方法的使用允许在密集或晚期细胞生产系统中有效产生生物分子，包括允许产生更高产量的总生物分子(例如，小分子、多肽和/或核酸)，或更高产量的翻译后加工蛋白质，例如更高产量的正确折叠的或优选折叠(例如野生型折叠)的或糖基化的多肽。

同样，本发明的组合物和方法可用于诱导重组蛋白质表达，或在培养条件中提高细胞中正确的蛋白质折叠和/或糖基化的程度，所述培养条件包括已经达到最佳细胞密度的培养条件中；诱导-例如本发明OR-TRE转录的提高由细胞内和/或细胞外环境中的摩尔渗透压浓度、重量摩尔渗透压浓度和/或张力的改变(例如升高)(例如引起高渗性条件或增加高渗性程度的改变)触发。本发明的组合物和方法可用于降低细胞表达系统，例如外植体、人造器官、生物反应器、培养基等中的细胞生长和重组蛋白质表达。本发明的组合物和方法可用作高渗性，或高渗性、高摩尔渗透压浓度、重量摩尔渗透压浓度和/或张力条件下的诱导型转录或启动子系统。

培养细胞产生的产物包括重组多肽、多糖、小分子如聚酮化合物(例如，抗生素)、核酸、病毒体和包装的病毒颗粒(例如，“生产者细胞”是所述培养细胞)等，通过实施本发明的方法和/或组合物来提高培养细胞的产物生产。

本发明的经改造细胞可以更好地抵抗渗透胁迫(例如高渗性条件，包括高渗或低渗胁迫的增强抗性)，它们面对提高的摩尔渗透压浓度(例如，高渗性条件)时受到保护，在备选实施方案中可在比正常(生理)重量摩尔渗透压浓度高或低的情况下维持生长和高成活力。在一个实施方案中，本发明的渗透感应或“渗透应答”或“高渗性应答”基因表达系统和细胞的使用，例如通过降低渗透胁迫条件中的细胞毒性并保证培养细胞产物的充足量和恒定质量而允许“难以表达”蛋白质的更好培养或生物反应器产量，所述培养细胞产物可以是重组蛋白质产物和/或正确折叠的或优选折叠的(例如，野生型折叠)或糖基化的蛋白质。

在一个实施方案中，本发明通过提供高渗性敏感、渗透感应或渗透应答基因表达系统，为在渗透胁迫培养条件下细胞降低的产物产量提供解决方案；并且本发明提供包含本发明的这些高渗性敏感、渗透感应或渗透应答系统的细胞，其中本发明的细胞对高渗性、低渗性或任何渗透胁迫条件，包括高渗或低渗胁迫的负面影响具有增强的存活和抗性。本发明提供用于防止或改善这样问题的组合物、细胞和方法，所述问题由高渗性或升高的重量摩尔渗透压浓度，例如与培养系统如生物反应器中增加的张力条件(例如，升高的盐，如升高的钠盐或钾盐，例如NaCl)相关联(相关)的高渗性引起。本发明提供用于防止或改善这样问题的组合物、细胞和方法，所述问题由低渗性或降低的摩尔渗透压浓度，例如与培养系统如生物反应器中降低的张力(例如，降低的盐，如降低的钠盐或钾盐，例如NaCl)相关联(相关)的降低的摩尔渗透压浓度引起。

在备选方面，本发明提供用于防止或改善高渗性或升高的摩尔渗透压浓度引起的问题，或低渗性或降低的摩尔渗透压浓度引起的问题的组合物、细胞和方法，其中所述高渗性或低渗性分别由任何培养或缓冲液系统中组分、成分或元素的提高或降低水平(量)引起，所述培养或缓冲液系统包括例如：无机盐和矿物质，例如氯化钠、氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、氯化钾、硫酸镁、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和/或硫酸锌；或微量元素，例如：仲钼酸铵、氧化铵钒、硫酸锰、氯化镍、亚硒酸、偏硅酸钠和/或氯化亚锡；或缓冲液或缓冲液成分，例如：磷酸盐(包括例如，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)、碳酸盐和/或碳酸氢盐(例如，碳酸钠和/或碳酸氢钠)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和/或丁酸钠；或可提高和/或降低摩尔渗透压浓度的任何培养成分或组分，例如：糖类，如葡萄糖和/或半乳糖，任何天然的或合成的氨基酸、核苷酸和/或辅因子，代谢中间产物，例如：次黄嘌呤、亚麻酸、硫辛酸、腐胺二盐酸盐、丙酮酸钠和/或胸腺嘧啶，或维生素或以低浓度需要的任何其它有机化合物如：生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、维生素B12、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、激素和/或辅因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子，或肽、蛋白质和/或组织水解产物(例如蛋白胨)，或抗生素，例如，硫酸庆大霉素，或脂肪酸如亚油酸、α生育酚、脂类/EtOH，或嵌段共聚物，例如基于氧化乙烯和氧化丙烯的聚合物，例如PLURONIC^TM(BASF，Florham Park，N.J.)，其可作为消泡剂、湿润剂、分散剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、渗透保护剂起作用，例如脯氨酸、谷氨酸、山梨醇、甜菜碱、肌醇、牛磺酸和/或甘油-磷酸胆碱。

在一个实施方案中，当实施本发明的组合物和/或方法来放大实施本发明的渗透保护效应时，使用一种或更多渗透保护剂化合物；例如本发明的组合物和/或方法包括(包含)使用一种或更多渗透保护剂化合物，如脯氨酸、谷氨酸、山梨醇、甜菜碱、肌醇、牛磺酸和/或甘油-磷酸胆碱。

本发明的组合物，例如本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TREs)包含至少一个张力增强子结合蛋白质(TonEBP)(也称为“渗透应答元件结合蛋白质(OREBP)”或“NFAT5”)应答转录增强子序列(ORE/TonE增强子序列)和/或本发明的OR-TRE可包含NFATc张力应答转录因子。渗透胁迫(包括例如高盐(高钠盐或高钾盐，例如NaCl)条件引起的高渗性的条件)通过磷酸化(尽管本发明不受任何特定作用机制限制)激活转录因子张力应答增强子/渗透应答元件结合蛋白质(NFATc或TonEBP/OREBP)，并且磷酸化的TonEBP/OREBP从细胞质易位到细胞核中，导致本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TREs)和内源渗透应答转录调节元件的转录增强。

内源渗透应答转录调节元件的激活增强几种保护性核酸，例如基因的表达(转录)，所述保护性核酸的启动子受增强子ORE/TonE的控制，所述保护性核酸包括牛磺酸转运蛋白(Tau T)、甜菜碱-γ-氨基酸丁酸转运蛋白(BGT1)、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白70(HSP70)、水通道蛋白2(AQP2)和醛糖还原酶基因(AR)；在备选实施方案中，本发明的渗透应答核酸包含这些渗透应答内源核酸，例如基因的编码序列。因此，一方面，本发明的组合物和方法通过渗透应答表达掺入(改造)到本发明的组合物中的渗透应答内源核酸，例如基因而向细胞传递渗透抗性；所述基因例如包括牛磺酸转运蛋白(Tau T)、甜菜碱-γ-氨基酸丁酸转运蛋白(BGT1)、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白70(HSP70)、水通道蛋白2(AQP2)和/或醛糖还原酶基因(AR)。

然而，在备选方面，本发明的组合物和方法通过渗透应答表达核酸，例如基因(和蛋白质)向细胞传递渗透抗性，所述核酸对已经插入它们的细胞而言是异源的。例如，牛磺酸转运蛋白(Tau T)、甜菜碱-γ-氨基酸丁酸转运蛋白(BGT1)、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白70(HSP70)、水通道蛋白2(AQP2)和/或醛糖还原酶基因(AR)对细胞而言可以是异源的。本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达内源或异源渗透保护蛋白质或肽向细胞传递渗透抗性，所述保护蛋白质或肽如脯氨酸或甜菜碱、或牛磺酸转运蛋白、或甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、或钠-肌醇-协同转运蛋白、或热激蛋白、或热激蛋白70、或水通道蛋白(作为水通道起作用的膜孔蛋白质)、或水通道蛋白2、或醛糖还原酶。

本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达内源或异源渗透保护性抗细胞凋亡蛋白质，如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BHRF1、X-IAP、IAP1、IAP2IEX-1L、Bfl-1或Bcl-w向细胞传递渗透抗性。

本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达赋予细胞氧化胁迫抗性的内源或异源蛋白质向细胞传递渗透抗性，所述蛋白质如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、sulfiredoxin、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、硫醇转移酶、谷氧还蛋白或谷胱甘肽还原酶。

本发明的组合物和方法保护细胞免于渗透胁迫，例如保护细胞免于高渗性条件，以改善或防止不利结果，例如但不限于未折叠的或错误折叠的蛋白质等。因此，在备选实施方案中，本发明的组合物和方法使得细胞，包括培养的细胞能够产生并分泌更多的内源产物，包括蛋白质或正确折叠状态和/或具有更好(正常的，野生型)糖基化模式等的蛋白质。一方面，本发明的组合物和方法可通过渗透应答表达参与促进蛋白质折叠的内源或异源分子伴侣蛋白质向细胞传递渗透抗性，包括所谓的解折叠蛋白质应答(或“UPR”，其响应解折叠或错误折叠的蛋白质积累而被激活，从而防止由解折叠或错误折叠的蛋白质积累触发的程序性细胞死亡或细胞凋亡)，所述分子伴侣蛋白质如结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)(也称为葡萄糖调节蛋白78，或Grp78)、钙联接蛋白、钙网蛋白、ERp57或蛋白质二硫键异构酶(PDI)。

本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达参与蛋白质胞外分泌的内源或异源蛋白质向细胞传递渗透抗性。

本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达内源或异源糖酵解酶，例如丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶向细胞传递渗透抗性。

本发明的组合物和方法还可通过渗透应答表达内源或异源细胞周期调节蛋白，例如细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)，或细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂向细胞传递渗透抗性。

一方面，本发明的渗透应答核酸序列可用于通过例如改善细胞胁迫，随后是渗透胁迫来增强/提高哺乳动物细胞培养物中重组蛋白质的产生。本发明还提供使用本发明的这些渗透应答核酸序列的方法。

本发明还提供核酸，其中目的基因的表达处于渗透应答元件的控制下，从而目的蛋白质可在升高的摩尔渗透压浓度条件下表达。在这些情况下，OR-TRE有效连接编码目的基因的核酸。在这些实施方案中，所述核酸还可包含OR-TRE控制的渗透抗性基因或核酸，和/或编码蛋白质或肽的核酸，所述蛋白质或肽赋予表达的蛋白质有益影响，其例如可以是对细胞代谢、分泌、成活力或生长的影响，或有时候可以是对表达的蛋白质的质量具有有益影响的某些影响，如正确折叠的翻译后修饰等。

本发明还提供正反馈机制，其中OR-TRE指导TonEBP的表达，从而所述蛋白质然后可以驱动TonEBP的进一步表达。当与OR-TRE控制下的其它基因结合使用时，所述正反馈也具有驱动这些基因表达的效果。所述正反馈可提供给细胞对高渗性增强的适应性。

可人工提高培养物的摩尔渗透压浓度，以受调节的预测方式驱动OR-TRE’s控制下的基因表达，以安排蛋白质产生的时间，以优化某些性质。或者，通过将基因的表达置于OR-TRE的控制下，基因可在培养阶段晚期随摩尔渗透压浓度自然升高而表达。这些方法可用于表达对细胞有毒的蛋白质、不稳定的蛋白质，和在标准培养条件下难以简单地表达的蛋白质。

本发明还提供多种新的人造启动子，其使得能够进行张力应答基因表达并且其可能应用于重组蛋白质的制备。一方面，本发明的核酸包含渗透应答哺乳动物启动子；或者，一方面，本发明的核酸包含TonEBP mRNA的渗透应答非翻译区用于目的核酸序列的渗透敏感表达。

在一个实施方案中，本发明的核酸包含TonEBP/OREBP应答启动子，其包含最小真核启动子上游克隆的TonEBP/OREBP增强体的一个或多个特异操纵基因模块。一方面，使用小鼠醛糖还原酶的-1053到-1007位核苷酸序列(参阅例如，Daoudal(1997)J.Biol.Chem.Jan 31；272(5)：2615-2619)，其在-1053位置上含有TonE，并在-1014位置上含有激活子蛋白质1(AP-1)。

在备选方面，本发明的核酸通过在驱动转基因表达的启动子序列上游或启动子序列内插入一个或更多渗透应答元件，因此随重量摩尔渗透压浓度升高增强其转录活性来对抗升高的重量摩尔渗透压浓度对重组蛋白质生产的影响。例如，在自然界系统中，绝大多数张力应答基因在TonE的35bp内具有一个或更多激活子蛋白质1(AP-1)应答位点；并且在备选方面，本发明的核酸在TonE位点的相似距离(更远、更近或相同)内包含一个或多个AP-1位点(AP-1结合序列)。本发明核酸中一个或更多AP-1应答基序的存在促进高NaCl诱导的应答性，例如在该方面，包含AP-1应答基序的本发明渗透应答转录调节元件(ORTRE)对渗透胁迫条件更敏感或更应答(更张力应答)，例如对高盐(例如，钠盐或钾盐，例如NaCl)培养条件更敏感或更应答。本发明使用多种转基因表达备选，或窗口，通过改变有效连接启动子序列的渗透应答元件，例如TonE和/或AP-1的数量，以可能在渗透胁迫(例如低渗或高渗)条件下精确调控转基因(“目的基因”)表达水平达到期望的水平，例如从基础表达达到更高水平，或最高水平的表达。

在一个实施方案中，通过本发明的核酸介导细胞高渗性应答性(例如张力应答性)的提高，这通过提高核酸分子，例如转录单元的启动子介导/控制的转基因或“目的基因”的转录速率来实现。例如，一方面，通过本发明渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的启动子介导高渗性应答(例如张力应答)NFATc/OREBP或TonEBP/OREBP基因反式激活活性的提高。在备选实施方案中，在真核细胞中具有转录活性的任何启动子均可用于本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)中，例如包含或由组成型启动子或诱导型启动子，或合成启动子，或哺乳动物、植物、昆虫、细菌、酵母、真菌或病毒启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子，例如由人CMV启动子片段组成的最小启动子组成。一方面，使用最小转录单元，例如此处描述的最小或拆开形式的表达载体来最有效地表达核酸分子(例如转基因或目的基因)。

尽管本发明不受任何特定作用机制限制，一方面，因为细胞对TonEBP表达具有TonEBP驱动正反馈环，本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TREs)提高渗透耐受性，如图1a和图1b中简要说明。

本发明的组合物和方法改善与提高的张力(增加的盐，如钠盐或钾盐，例如或NaCl)相关的升高的重量摩尔渗透压浓度。一方面，培养环境中的高盐(钠盐或钾盐)刺激本发明的转录因子张力应答增强子/渗透应答元件结合蛋白(TonEBP/OREBP)，导致掺入本发明构建体中的渗透保护基因的转录增强。在这些构建体中，启动子受例如渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，或增强子ORE/TonE(一方面，其包括一个或更多AP-1蛋白质结合序列)的控制。

尽管本发明不受任何特定作用机制限制，一方面，在图1a中图示了TonEBP/OREBP转录活性的调节；该方案包括核质运输、反式激活和磷酸化。一方面，在高渗性的30分钟内，TonEBP/OREBP变得磷酸化，并且其细胞核分布，即细胞核部分中的量与细胞质部分中的量的比值增加。一方面，TonEBP的反式激活依赖于张力：TonEBP转录活性在等渗条件下为正，在低渗性中降低，在高渗性中提高。

图1a简要表示了TonEBP怎样被高渗性刺激并诱导含有一个或多个TonEBP同源结合位点：ORE/TonE的启动子的转录。在一个实施方案中，包含启动子的任何内源TonE(张力增强子，也称为渗透应答元件)可用于驱动重组蛋白质的表达，用于提高的生物药物产生。

图1b图示了应用TonEBP的渗透依赖性活性的实例：渗透应答正反馈环。然而，应该注意的是本发明不受任何特定作用机制限制，图1b描绘了许多可能示例性作用机制之一：TonEBP应答正反馈环，其中TonEBP反式激活其自身的表达，从而当张力增加时，TonEBP综合地扩大其自身的刺激：TonEBP的渗透应答激活越强，则产生更多的TonEBP，导致更大的反馈。

在设计本发明的构建体时，本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)可反式激活多种渗透保护基因，因此使得细胞能够适应高渗性。在一个示例性机制中，此类渗透应答正反馈环可加速并扩大哺乳动物细胞对渗透胁迫的适应性。其将提高它们对高重量摩尔渗透压浓度的耐受性，而没有组成型过表达的缺点。

一方面，TonEBP的组成型过表达可代表等渗条件中细胞的多余能量排出；然而，因为本发明包括渗透应答转录调节元件(OR-TREs)，其能够对表达任何重组蛋白质的任何细胞产生渗透抗性表型，所以在一些环境中，想象可以本发明的构建体或细胞以组成型表达赋予细胞一定程度的渗透抗性的基因。在备选实施方案中，本发明的构建体是渗透应答的，因为它们可应答胞内和/或胞外的重量摩尔渗透压浓度、摩尔渗透压浓度和/或张力的提高或降低。在备选实施方案中，渗透应答表示重量摩尔渗透压浓度或摩尔渗透压浓度的任何改变，例如重量摩尔渗透压浓度或摩尔渗透压浓度的任何降低或提高，例如重量摩尔浓度的任何改变，包括高渗性或低渗性(例如升高或降低条件)中的任何改变。一方面，“重量摩尔渗透压浓度”是水溶液中溶解的溶质颗粒的渗透压的量度。所述溶质颗粒包括离子和非离子分子。

重量摩尔渗透压浓度表示为溶解在1kg水中渗压活性颗粒的浓度(即渗透压摩尔)(1mOsm/kg H₂O在38℃下等同于19mm Hg的渗透压)。“摩尔渗透压浓度”指溶解在1升溶液中溶质颗粒的数量。可向培养基中加入以提高其重量摩尔渗透压浓度的溶质包括蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、盐(例如钠盐或钾盐)、糖、代谢物、有机酸、脂类等。在一个实施方案中，提高培养基中氨基酸和盐，例如钠盐和钾盐(例如NaCl)的浓度，以实现此处阐明的期望重量摩尔渗透压浓度范围。当用于此处时，缩写“mOsm”表示“毫渗摩尔/kg H₂O”。

例如，在一个实施方案中，此处提供的组合物和方法用于维持细胞培养基，例如生物反应器中的细胞培养基，以具有约210到359毫渗摩尔(mOsm)范围，或约260到320毫渗摩尔(mOsm)范围内的重量摩尔渗透压浓度，或在备选实施方案中靶定约280、290、300或310mOsm/kg的细胞培养重量摩尔渗透压浓度。

在备选实施方案中，此处提供的组合物和方法用于维持相对低摩尔渗透压浓度的细胞培养基，例如用于维持具有约248mOsm到约280mOsm的摩尔渗透压浓度的细胞培养基，参阅例如美国专利号(USPN)5,747,341。在备选实施方案中，此处提供的组合物和方法用于维持约280mOsm到约330mOsm，或约400到600mOsm的细胞培养基，例如美国专利申请出版号20050272124中所述。在备选实施方案中，此处提供的组合物和方法用于维持约250mOsm到约600mOsm的细胞培养基，如USPN 5,705,364中所述。

环境或胁迫抗性蛋白质

本发明提供包含本发明至少一个渗透应答转录调节元件的渗透应答核酸，所述渗透应答转录调节元件有效连接这样的核酸，其编码渗透保护蛋白质或肽；抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；或其任何组合。

渗透保护基因

本发明提供渗透应答核酸，其编码有利影响哺乳动物细胞水含量和/或渗透潜力的蛋白质。例如，本发明的核酸可以应答渗透表达编码影响哺乳动物细胞水含量和/或渗透潜力的任何蛋白质的生物合成的核酸，所述蛋白质如脯氨酸和甜菜碱，和/或影响其它渗透活性溶质如糖的水平的蛋白质。

本发明的核酸可应答渗透表达多个基因，其提高渗透抗性并具有互补的作用模式。本发明核酸表达的这些基因的组合在提高细胞，例如哺乳动物细胞中的渗透抗性方面可具有累加和/或协同效应。在备选实施方案中，通过组成型表达这些基因中的一个或更多个，和/或还以渗透应答方式，例如使用本发明的渗透应答转录和/或转录后表达系统表达一个或更多个基因赋予益处。通过提供蛋白质表达的组成型和渗透诱导提高的多种组合(所述蛋白质提供给改造的细胞增强的渗透应答或增强的渗透感应机制)，可设计或调整本发明以具有适合于表达任何重组蛋白质的任何细胞，例如任何哺乳动物细胞的渗透敏感表达模式，以更好地抵抗高渗性或低渗性的胁迫。例如，本发明的组合物和方法可用于改善或防止乳酸盐的产生，其酸化例如培养系统或生物反应器中的培养条件。在大多数培养系统和生物反应器中，为了维持培养基的pH，泵入碱，因此重量摩尔渗透压浓度升高。

补料分批式生物反应器中乳酸盐的积累与降低的细胞生长和成活力之间具有相关性。因此，糖酵解酶，如丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶和其它酶通过本发明组合物和方法的渗透应答过表达使得转化细胞，例如哺乳动物细胞能够从乳酸盐产生转换到乳酸盐消耗。糖酵解酶的这种过表达的结果是维持细胞的成活力和细胞，例如哺乳动物细胞的提高的重组蛋白质产生。

产生并操作核酸和载体

本发明提供包含渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的核酸、渗透应答核酸和表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和包含它们的克隆载体。可与科学和专利文献中详细描述的本领域已知的任何方法或方案或装置结合实施本发明。

本发明提供包含渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的“核酸”或“核酸序列”，或渗透应答核酸，并还包括RNAi如siRNA或miRNA、寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或这些的任何片段，包括基因组或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链或双链的，并可代表天然或合成来源的肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质，例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNPs)的有义链或反义链。本发明的核酸可编码如此处所述的多肽，并可不仅包含编码序列，还可包含前导序列或前蛋白序列和非编码序列，如内含子或编码序列的5’和/或3’非编码序列。因此，用于实施本发明的多核苷酸可包括多肽的编码序列以及包括额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。

一般技术

可从遗传改造的、扩增的和/或重组表达的/产生的多种来源中分离用于实施本发明的核酸，无论是本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)、渗透应答核酸，还是用于实施本发明的RNA、iRNA、调节核酸(具有抑制性、稳定或上调功能或效果的核酸)、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体。

可单独分离或克隆重组核酸和/或多肽，并检测其期望活性。可使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。

或者，可通过如在Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；USPN 4,458,066中描述的众所周知的化学合成技术在体外合成用于实施本发明的核酸。

在科学和专利文献中详细描述了用于操作核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow聚合酶的随机引物标记、缺口翻译、扩增)、测序、杂交等，参阅例如Sambrook，编辑，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(第2版)，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Ausubel，编辑John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACIDPROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，编辑Elsevier，N.Y.(1993)。

获得并操作用于实施本发明的核酸的另一有用手段是从基因组样品中克隆，需要时筛选并再克隆从例如基因组克隆或cDNA克隆中分离或扩增的插入片段。用于实施本发明的核酸来源包括例如在哺乳动物人工染色体(MACs)(参阅例如美国专利号5,721,118；6,025,155)；人类人工染色体(参阅例如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335)；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体(参阅例如Woon(1998)Genomics50：306-316)；P1来源载体(PACs)(参阅例如Kern(1997)Biotechniques23：120-124)；黏粒、重组病毒、噬菌体或噬菌粒中包含的基因组或cDNA文库。

转录和翻译控制序列

本发明的核酸序列包含有效连接蛋白质编码序列或调节核酸，例如抑制性、稳定化或上调核酸分子的启动子和增强子，以指导或调节RNA的合成/表达。例如，一方面本发明提供至少一个张力增强子结合蛋白(TonEBP)应答转录增强子序列，其位于在真核细胞中有转录活性的启动子序列的上游(5’)并且有效连接所述启动子序列。额外的增强子序列也可有效连接本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TREs)。

可在真核细胞，例如哺乳动物细胞中操作的任何转录调节序列，例如启动子或增强子序列均可用于实施本发明，例如用于本发明的核酸构建体中。例如，在备选实施方案中，用于实施本发明的启动子是最小启动子(也称为“核心启动子”)、诱导型启动子或组成型启动子。当在启动子处起始转录的RNA聚合酶将编码序列转录成RNA，例如mRNA时，转录调节序列，例如启动子、增强子序列“有效连接”待转录的序列，例如蛋白质编码序列。在一个实施方案中，如此处所用的启动子是核酸，例如DNA或基因的调节区，其可定位在待转录核酸或基因的上游(即，有义链的5’区)，因此，所述启动子起始(允许)核酸或基因的转录。

在备选实施方案中，转录调节序列，例如启动子或增强子序列可“有效连接”待转录的序列，例如蛋白质编码序列，或调节核酸，如抑制性、稳定化或上调核酸分子，或反义或其它抑制性序列(如miRNA或siRNA)，即使所述启动子或增强子不靠近(邻近)待转录的序列；换言之，转录调节序列(例如增强子如AP-1或TonEBP应答转录增强子)与待转录的序列(位置上相关)的距离没有限制(例如20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400或500或更多残基)，并且其在构建体上的位置(构建体中或构建体内)没有限制；注意在一些实施方案中，所述转录调节序列与待转录的序列成顺式，而在其它方面其与待转录的序列成反式。

在备选实施方案中，转录调节序列，例如启动子或增强子序列(例如AP-1或TonEBP应答转录增强子)可在待转录的序列的有义方向或反义方向，或与待转录的序列在同一条链或相反的链上。

可使用任何最小启动子，例如核心启动子或最小启动子，其为正确起始转录需要的启动子序列或基序的最小部分。一方面，用于实施本发明的最小或核心启动子是或包含人CMV启动子的片段；最小启动子(核心启动子)和鉴定并制备它们的方法为本领域所熟知，例如参阅Baliga(2001)Biol.Proceed.Online 3：64-69；Hettiarachchi(2003)Nucleic Acids Res.31(18)：5256-5265。例如，含有TATA盒并从-90位置延伸到转录起始位点+1处的CaMV 35S启动子的结构域A部分可用作“最小启动子”。除了TATA盒(其为RNA聚合酶II的结合位点)，该最小启动子含有最少三个CAAT样盒；这些序列加强上游序列的活性并影响启动子活性的效率。一方面，这些CAAT样盒单独使用或附着到异源启动子区，以驱动本发明构建体的表达。可用于实施本发明的其它示例性“最小启动子”包括包含例如Bassel-Duby(1992)Mol.Cell Biol.12(11)：5024-5032描述的CCCACCCCC(CCAC盒)序列的启动子；或例如Juven-Gershon(2008)Curr.Opin.Cell Biol.20(3)：253-9.Epub 2008 Apr 22；Juven-Gershon(2006)Biochem.Soc.Trans.34(Pt 6)：1047-50描述的RNA聚合酶II核心启动子；或来自肌球蛋白重链基因(-164到+16)的最小启动子；参阅例如Smith(1998)Am.J.Physiol.274(5Pt 1)：C1188-95。

可用于实施本发明的示例性真核启动子包括CMV立即早期HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTRs、小鼠金属硫蛋白I、热激启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs，和小鼠金属硫蛋白I启动子。也可使用已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的任何启动子。可用于实施本发明的启动子也包括大肠杆菌(E.coli)lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、lambda PR启动子、lambda PL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的操纵子的启动子和酸性磷酸酶启动子；真菌启动子等。

可用于实施本发明的示例性植物启动子包括诱导型和组成型启动子，例如组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′-或2′-启动子；和/或例如暴露在植物激素，如生长素后可诱导的启动子；和来自已知植物基因的其它转录起始区。

也可使用已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的任何启增强子和/或启动子。在备选实施方案中，如此处所用，增强子是短的核酸区域，例如可特异性结合蛋白质的DNA(其可称为激活子)或特异性结合增强子结合蛋白的DNA。一方面，激活子结合到该增强子区域可起始蛋白质编码序列，例如基因的转录，或影响(起始、终止、提高或降低)启动子的活性。受增强子影响或“有效连接”增强子的启动子和/或基因可与增强子具有相当远的距离，或可以甚至在不同载体或染色体上。在备选实施方案中，启动子上的增强子引起的转录的增强或降低可能是因为激活子直接或间接结合到增强子上，导致额外的“转录因子”募集到启动子上的增强子，其可增强转录所需的其它蛋白质，如RNA或DNA聚合酶的结合。

一方面，在真核细胞中表达的本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体也可含有额外的增强子以提高表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件，一般长度为约10到约300bp，其作用于启动子以增强其转录。实例包括在复制起点100到270bp late侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点late侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。

SV40病毒的早期和晚期启动子便利地获得为SV40限制性片段，其也包含SV40病毒的复制起点。Fiers等，Nature，273：113(1978)；Mulligan和Berg，Science，209：1422-1427(1980)；Pavlakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：7398-7402(1981)。人巨细胞病毒的立即早期启动子便利地获得为HindIII E限制性片段。Greenaway等，Gene，18：355-360(1982)。在美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了该系统的改进。还参阅Gray等，Nature，295：503-508(1982)关于在猴细胞中表达编码免疫干扰素的cDNA；Reyes等，Nature，297：598-601(1982)关于小鼠细胞中人β-干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下的表达；Canaani(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5166-5170，关于在培养小鼠和兔细胞中人干扰素β1基因的表达；和Gorman(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6777-6781关于CV-1猴肾细胞、鸡胚胎成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和小鼠NIH-3T3细胞中细菌CAT序列使用劳斯肉瘤病毒长末端重复作为启动子的表达。

在Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；Levinson等；EP 117,060；和EP 117,058中描述了适合用于在重组脊椎动物细胞培养中合成目的多肽的其它方法、载体和宿主细胞。在一个实施方案中，用于实施本发明的质粒(其用于本发明组合物的哺乳动物细胞培养表达，包括任何核酸或多肽)是pRK5(EP公开号307,247)或pSVI6B(PCT公开号WO 91/08291，1991年6月13日发表)。

表达载体和克隆载体

本发明提供包含本发明核酸(包含本发明渗透应答转录调节元件(OR-TRE))和/或本发明的渗透应答核酸(包括本发明的渗透调节核酸)的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体。病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、黏粒、f黏粒、细菌人工染色体、病毒DNA(例如牛痘苗、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病和SV40的衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体、和对特定目的宿主(如哺乳动物细胞)特异的任何其它载体均可用于实施本发明。一方面，用于实施本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体可包括染色体、非染色体和合成的DNA序列。大量合适的载体为本领域技术人员所知，并可通过商业途径获得。

示例性载体包括真核载体，如pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可使用任何其它质粒或其它载体，只要它们在宿主中可以复制并具有活力。本发明可使用低拷贝数或高拷贝数的载体。

用于实施本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体可包含启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子；并还可以包括用于扩大表达的适当序列。哺乳动物表达载体可包含复制起点、任何必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、和5′侧翼非转录序列。在一些方面，来自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点可用于提供需要的非转录遗传元件。

一方面，表达载体可具有两个复制系统，以允许其维持在两种生物中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中进行表达，在原核宿主中进行克隆和扩增。此外，对于整合表达载体，表达载体可含有与宿主细胞基因组同源的至少一个序列。其可含有位于表达构建体侧翼的两个同源序列。通过选择适当的同源序列用于包括在载体中，整合载体可被导向宿主细胞中的特定位点。

用于整合载体的构建体为本领域所熟知。示例性真核启动子包括CMV立即早期HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白I。选择适当载体和启动子为本领域普通技术人员所熟知。表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包括用于扩大表达的适当序列。使用氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标记的其它载体从任何期望基因中选择启动子区域。此外，所述表达载体优选含有一个或更多选择标记基因，以提供表型性状用于选择转化的宿主细胞，所述选择标记如二氢叶酸还原酶或对真核细胞培养物的新霉素抗性，或如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

哺乳动物表达载体还可包含复制起点、任何必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。在一些方面，来自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点可用于提供需要的非转录遗传元件。

在备选方面，本发明的核酸，例如包含本发明渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，和/或渗透应答核酸的那些核酸是附加型核酸或稳定整合到细胞，例如待培养的细胞的基因组中。

对于本发明核酸构建体的稳定整合，可使用任何合适的载体或媒介物，例如慢病毒载体和/或包装系统，例如在USPNs 7,311,907；7,262,049描述了假型慢病毒载体；USPNs 7,250,299；7,226,780；7,220,578；7,211,247；7,160,721描述了用于提高细胞生长和提高含有慢病毒感染的宿主细胞的细胞培养物密度的方法；USPNs 7,078,031；7,070,993；7,056,699；6,955,919描述了(仅仅提及一些)可用于实施本发明的载体和包装系统。

对于本发明核酸构建体的附加型转移，可使用任何合适的载体或媒介物，例如，在USPN 7,294,505中描述的稳定的细胞核附加型载体；在USPN6,808,923中描述的用于附加型复制想要基因的慢病毒载体系统；在USPN6,797,494中描述的用于组织特异性基因表达的附加型表达载体；在USPN6,605,281中描述了用于附加型转导的人乳头瘤病毒载体；在USPN6,479,279或6,410,314中描述的附加型载体；仅仅提及一些可用于实施本发明的载体和包装系统。

可用于实施本发明的其它表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体或克隆载体和系统包括例如在USPN 7,371,570中描述的复制感受态腺病毒载体；USPN 7,348,178中描述的基于腺病毒(Ad)的反式包装系统；USPN 7,323,177；7,319,033；7,318,919；或7,306,793中描述的腺病毒；仅仅提及一些可用于实施本发明的载体和包装系统。

标记基因

一方面，用于实施本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体含有一个或更多选择标记基因，以允许选择含有本发明核酸的宿主细胞，例如哺乳动物细胞。

示例性选择标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或赋予真核细胞培养物新霉素抗性的基因、赋予四环素或氨苄青霉素抗性的基因。用于实施本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体和克隆载体还可包括选择标记基因，以允许选择这样的细胞，其已经转化有例如致使细菌抵抗药物(如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环素)的基因。选择标记还可包括生物合成基因，如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些基因。

一方面，为了提高鉴定转染细胞的能力，一个或更多选择或可筛选标记核酸用作目的表达基因或除目的表达基因之外使用。“标记基因”或“标记核酸”是向表达标记基因/核酸的细胞传递不同表型，因此允许所转染的细胞与没有标记的细胞区分开的核酸。

“标记基因”或“标记核酸”可编码选择或可筛选标记，根据所述标记是否赋予可以通过化学手段，即通过使用选择性试剂(例如抗生素等)进行“选择”的性状，或根据其是否是可以通过观察或检测，例如通过“筛选”鉴定的简单性状。例如，绿色荧光蛋白或任何其它荧光蛋白、萤光素酶类型的生物发光蛋白等。合适的标记基因的许多实例为本领域所知并可用于实施本发明。

“标记基因”或“标记核酸”还可编码“可分泌标记”，可通过鉴定或选择转染细胞的手段检测其分泌。实例包括这样的标记，其编码可通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原，或编码甚至通过其催化活性检测的可分泌酶。可分泌蛋白质属于许多种类，包括例如可通过ELISA检测的小的可扩散蛋白质；在胞外溶液中可检测的小的活性酶(例如分泌的碱性磷酸酶、分泌的萤光素酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)-来源的分泌的a-淀粉酶(SAMY)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的木聚糖酶A衍生物)和膜结合或瞬时膜结合蛋白质。任何选择标记可用于实施本发明，并且适合于细胞转染，包括哺乳动物细胞转染的选择标记为本领域所知。此类标记可包括但不限于：腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶(与新霉素组合)、博来霉素抗性基因(腐草霉素或博来霉素或zeocin组合)、胞嘧啶脱氨酶(与N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸、肌苷和胞嘧啶组合)、二氢叶酸还原酶(DHFR)(与氨甲喋呤组合)、组氨醇脱氢酶(与组氨醇组合)、潮霉素-B-磷酸转移酶(与潮霉素组合)、胸苷激酶和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。当使用腺苷脱氨酶标记时，通过在低浓度ADA抑制剂2′-脱氧考福霉素和细胞毒性浓度的腺苷或其类似物9-β-D-呋喃木糖基腺嘌呤存在下选择掺入基因的细胞。

宿主细胞和转化细胞

本发明还提供转化或转染细胞，其包含本发明的核酸构建体，例如本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，或本发明的渗透应答或渗透调节核酸。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性细菌细胞包括埃希氏菌属属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的任何种，包括例如大肠杆菌、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。示例性真菌细胞包括曲霉属(Aspergillus)的任何种。示例性酵母细胞包括毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)的任何种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。示例性昆虫细胞包括斜纹夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)的任何种类，包括果蝇S2和果蝇Sf9。示例性动物细胞包括CHO、COS或Bowes黑素瘤或任何小鼠或人细胞系。适当宿主的选择在本领域技术人员能力范围内。用于转化多种高等植物物种的技术是众所周知的并描述于技术和科技文献中。参阅例如，Weising(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；USPN 5,750,870。

可使用任何多种技术，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移将本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体或克隆载体引入宿主细胞中。特定方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂质转染、或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。

一方面，本发明的构建体引入细胞中用于筛选，因此核酸以适合核酸随后表达的方式进入所述细胞。引入方法很大程度上受靶定细胞类型的指导。示例性方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、脂质转染(例如，LIPOFECTIN^TM)、电穿孔、病毒感染等。本发明的构建体可稳定整合到宿主细胞的基因组内(例如利用逆转录病毒引入)或可暂时或稳定存在于细胞质中；例如，通过使用常规的质粒，利用标准的调节序列、选择标记等。

适当时，可在改进的常规营养培养基中培养本发明的改造宿主细胞，适当时用于激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因。转化合适宿主菌株并且宿主菌株生长至适当的细胞密度后，可通过适当手段(例如温度变动或化学诱导)诱导所选的启动子，并且可将所述细胞培养额外一段时期，以允许它们产生想要的重组多肽。

可在改进的常规营养培养基中培养含有本发明构建体的宿主细胞，适当时用于激活启动子、选择转化体或扩增基因。培养条件，如温度、pH等可以是之前所选宿主细胞用于表达使用的那些条件，并将对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

转染的方法为本领域普通技术人员所知，例如CaPO₄和电穿孔。根据所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等，1989，上文中描述的使用氯化钙的钙处理或电穿孔一般用于原核生物或含有坚实细胞壁屏障的其它细胞。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可使用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀方法。已经在美国专利号4,399,216中描述了哺乳动物细胞宿主系统的一般方面。通过根据Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法进行向酵母的转化。然而，也可使用其它方法，例如通过细胞核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合、或多聚阳离子，例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物或polyomithine向细胞中引入DNA。对于转化哺乳动物细胞的多种技术，参阅Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。

调节核酸序列

在一个实施方案中，本发明提供渗透应答和渗透调节核酸，其包含至少一个调节核酸，例如抑制性、稳定化或上调核酸分子。在一个实施方案中，使用靶定基因信使的序列，例如生乳基因或生乳基因信使。在一个实施方案中，序列是抑制性的，例如包含短的干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA和/或具有核酶活性的RNA。因此，在备选实施方案中，本发明提供调节(抑制、稳定或上调)核酸，包括可“靶定”基因、信使(mRNA)或蛋白质的核酸来提高、增强、降低或废除所述基因、信使(mRNA)或蛋白质表达和/或活性的用途。

在一个实施方案中，这些调节(例如抑制性)核酸是寡核苷酸，例如包含天然核苷酸、天然发生的核酸、合成核酸和/或重组核酸的已知类似物。本发明包括具有合成骨架的核酸样结构的用途，参阅例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid DrugDev 6：153-156。本发明提供单链或双链形式的调节核酸(抑制性、稳定或上调)脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)的用途。本发明提供核酸的用途，所述核酸含有天然核苷酸的已知类似物。本发明提供调节(例如抑制性)混和寡核苷酸的用途，所述混和寡核苷酸包含携带2′-O-烷基取代基(其通过磷酸二酯键缀合到DNA部分上)的RNA部分，参阅例如USPN5,013,830。本发明提供具有合成骨架的核酸样结构的用途。本发明提供的DNA骨架类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3′-硫代乙缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3′-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNAs)；参阅Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，F.Eckstein编辑，IRL Press at Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies，Annalsof the New York Academy of Sciences，第600卷，编辑Baserga和Denhardt(NYAS 1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993，CRC Press)。本发明提供含有非离子骨架，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位的PNAs的用途。例如USPNs6,031,092；6,001,982；5,684,148描述了硫代磷酸酯键；也参阅WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197。用于本发明核酸的其它合成骨架包括甲基膦酸酯键或交替的甲基膦酸酯和磷酸二酯键(参阅例如，USPN 5,962,674；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36：8692-8698)，和苄基膦酸酯键(参阅例如，USPN 5,532,226；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156)。本发明提供调节(例如，抑制性)核酸的用途，所述调节核酸包括基因、多核苷酸、DAN、RNA、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探针和扩增产物。

为了表达RNA转录物的目的，本发明的核酸可引入真核(例如哺乳动物)细胞中，所述RNA转录物可发挥功能而影响还未翻译成蛋白质的基因表达模式。用于实施本发明的示例性调节(例如抑制性)核酸包括短的干扰RNAs(siRNAs)和microRNAs(miRNAs)、反义RNA和具有核酶活性的RNA；这些可发挥降低或消除天然(内源)或引入(异源)细胞基因，例如哺乳动物基因的表达的功能。

可构建或分离用于实施本发明的基因和核酸，当其转录时产生调节(例如反义或有义)RNA或双链RNA，其与全部或部分靶定的信使RNA(s)互补。调节(例如反义或有义)或双链RNA或siRNA或miRNA降低信使RNA的多肽产物的产生。所述多肽产物可以是哺乳动物细胞的基因组编码的任何蛋白质。

也可构建或分离用于实施本发明的基因和核酸，当其转录时产生RNA酶，或核酶，其可作为内切核糖核酸酶起作用并催化具有选定序列的RNA分子的剪切。

所选信使RNA’s的剪切可导致它们编码的多肽产物的产生降低。这些调节(例如抑制性)核酸可用于制备新的哺乳动物细胞系；这些哺乳动物细胞系可表达降低水平的多肽，包括但不限于可受反义或干扰RNA影响的此处引用的多肽。

可使用常规方法和筛选系统确定用于任何特定实施方案，例如生物反应器、外植体、细胞培养物等中表达为重组蛋白质的调节(例如抑制性或上调)核酸的最佳长度和浓度。在科学和专利文献中全面描述了用于设计最佳长度和浓度的策略，并且技术人员可使用常规方法和筛选系统，使用本发明的新试剂设计调节(例如抑制性或上调)核酸，例如寡核苷酸。

反义寡核苷酸

本发明提供反义寡核苷酸，其包含靶定基因信使的至少一个序列，例如靶定生乳基因或生乳基因信使的序列。在科学和专利文献中全面描述了用于设计反义寡核苷酸的策略，并且技术人员可使用本发明的新试剂设计蛋白质编码(例如生乳蛋白质编码)寡核苷酸。例如，筛选有效的反义寡核苷酸的基因巡查法/RNA作图方案为本领域所熟知，参阅例如Ho(2000)Methods Enzymol.314：168-183，其描述了RNA作图测定，是基于标准分子技术，为有效的反义序列选择提供简单且可靠的方法。还参阅Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci.11：191-198。

在一个实施方案中，天然发生的核酸用作调节(例如抑制性或上调)核酸寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何长度；例如，在备选方面，所述反义寡核苷酸在约5到100，约10到80，约15到60，约18到40之间。可通过常规筛选确定最佳长度。所述反义寡核苷酸可以任何浓度存在。可通过常规筛选确定最佳浓度。多种合成的、非天然发生的核苷酸和核酸类似物是已知的，其可解决该潜在问题。例如，可使用含有非离子骨架，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元的肽核酸(PNAs)。也可使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸，如WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol ApplPharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，编辑Agrawal(HumanaPress，Totowa，N.J.，1996)中所述。本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义寡核苷酸还可包括二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3′-硫代乙缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、′-N-氨基甲酸酯和吗啉代氨基甲酸酯核酸，如上所述。

组合化学方法可用于产生大量寡核苷酸，可快速筛选对任何靶标，如本发明的有义和反义木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列具有适当的结合亲和力和特异性的特定寡核苷酸(参阅例如，Gold(1995)J.of Biol.Chem.270：13581-13584)。

调节核酶

本发明提供能够调节转录物(信使)，例如可结合生乳蛋白质编码信使的核酶。在一个实施方案中，这些核酶例如通过靶定mRNA而调节(例如抑制)蛋白质活性，例如生乳蛋白质活性。在科学和专利文献中详细描述了用于设计核酶并选择生乳蛋白质特异性反义序列用于靶定的策略，并且技术人员可使用本发明的新试剂设计此类核酶。核酶通过核酶靶RNA结合部分结合靶RNA而起作用，所述靶RNA结合部分靠近剪切靶RNA的RNA的酶部分。因此，所述核酶通过互补碱基配对识别并结合靶RNA，并且一旦结合到正确位点上，则酶促剪切并失活所述靶RNA。如果剪切发生在编码序列中，以该方式剪切靶RNA将破坏其指导编码蛋白质合成的能力。核酶结合并剪切其RNA靶标后，其可以从该RNA释放并重复结合并剪切新的靶标。

在一些环境中，核酶的酶促性质可以优于其它技术，如反义技术(其中核酸分子简单地结合核酸靶标，以阻断其转录、翻译或与另一分子的结合)，因为实现治疗性治疗的核酶的有效浓度可以低于反义寡核苷酸的有效浓度。该潜在优势反映了核酶酶促作用的能力。因此，单个核酶分子能够剪切许多靶RNA分子。此外，核酶通常是高特异的抑制剂，抑制的特异性不仅依赖于结合的碱基配对机制，还依赖于分子借以抑制其结合的RNA表达的机制。即，所述抑制由RNA靶标的剪切引起，因此特异性定义为靶RNA剪切速率与非靶RNA剪切速率的比值。该剪切机制依赖于参与碱基配对的那些因素以外的因素。因此，核酶作用的特异性可比结合相同RNA位点的反义寡核苷酸作用的特异性更高。

用于实施本发明的核酶可以是酶促核酶RNA分子，其可在锤头基序、发夹基序中形成为肝炎δ病毒甚序、组I内含子基序和/或与RNA指导序列结合的RNaseP-样RNA。例如Rossi(1992)Aids Research and HumanRetroviruses 8：183描述了锤头基序的实例；Hampel(1989)Biochemistry28：4929和Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18：299描述了发夹基序的实例；Perrotta(1992)Biochemistry 31：16描述了肝炎δ病毒基序的实例；Guerrier-Takada(1983)Cell 35：849描述了RNaseP基序的实例；和Cech美国专利号4,987,071描述了组I内含子。这些特异基序的详述不旨在限制。

RNA干扰(RNAi)

一方面，本发明提供RNA调节(例如，抑制性、稳定或上调)分子，例如“RNAi”分子，用于靶定蛋白质编码序列，如生乳蛋白质编码序列。所述RNAi分子可包含双链RNA(dsRNA)分子，例如siRNA、miRNA和/或短的发夹RNA(shRNA)分子。所述RNAi分子，例如siRNA(例如小的抑制性RNA)可抑制蛋白质编码基因(例如生乳蛋白质编码基因)，和/或miRNA(microRNA)的表达，以抑制蛋白质信使(例如生乳蛋白质信使)的翻译。一方面，所述RNAi分子，例如siRNA和/或miRNA长度为约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或更多双链体核苷酸。

尽管本发明不受任何特定作用机制限制，RNAi可进入细胞并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNAs的降解。当细胞暴露于双链RNA(dsRNA)时，来自同源基因的mRNA被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi背后可能的基本机制是匹配特定基因序列的双链RNA(dsRNA)降解成短的片段，其称为短干扰RNA，触发与其序列匹配的mRNA的降解。一方面，本发明的RNAi用于基因沉默治疗，参阅例如，Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。一方面，本发明提供使用本发明的RNAi’s分子，例如siRNA和/或miRNA选择性降解RNA的方法。可在体外、离体或体内进行该过程。一方面，本发明的RNAi分子可用于在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。

用于制备和使用调节核酸，例如RNAi分子、siRNA和/或miRNA调节RNA表达，例如选择性降解RNA的方法为本领域所熟知，参阅例如，USPNs 6,506,559；6,511,824；6,515,109；6,489,127。

转基因非人动物

本发明提供包含本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的转基因非人动物，例如用来研究非人动物中的渗透调节。可使用本领域已知的任何方法设计并产生转基因非人动物；参阅例如，USPNs 6,211,428；6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，其描述了制备并使用转化的细胞和卵和转基因小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、鸡、山羊、鱼和奶牛。还参阅例如，Pollock(1999)J.Immunol.Methods231：147-157，其描述了转基因奶品场动物奶中重组蛋白质的产生；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，其阐明了转基因山羊的产生。

细胞培养、外植体和生物反应器

在备选实施方案中，本发明的组合物和方法可用于维持任何外植体、人造器官或培养系统，例如生物反应器、外植体、人造器官或简单的细胞培养板、瓶、盘、管或烧瓶中的细胞的健康和成活力。组合物和方法用于维持培养条件中的细胞的健康和成活力，例如当设计那些细胞来产生产物，例如重组蛋白质或多糖产物，或在“生产细胞系”的情况下是病毒(病毒体颗粒)产物(参阅例如USPNs 5,837,484；6,566,118)，或有机分子如聚酮化合物时，那么因为所述细胞因掺入了本发明的组合物(例如本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体或克隆载体，或包含本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的任何嵌合核酸)变得更健康并且更具成活力，所以产生了更多的这种想要的产物。

此处提供的组合物和方法也可用于加强培养系统，例如生物反应器、外植体等中的细胞产生分子，例如重组蛋白质。一方面，此处提供的组合物和方法用于在次于最佳渗透条件(次于特定细胞或培养系统的最佳渗透条件)下，例如高渗性和/或低渗性的条件下，如在晚期阶段或密集细胞培养条件中见到的那些条件下维持或提高正确折叠或更好折叠(例如野生型折叠)和/或糖基化的蛋白质的产生。因此，在一个实施方案中，此处提供的组合物和方法用于尤其在渗透胁迫条件如在晚期阶段或密集细胞培养条件下维持或提高细胞，例如细胞培养系统中产生的产物(例如重组蛋白质)的质量。

可利用本领域已知的任何培养系统实施此处提供的组合物和方法，参阅例如，USPNs 5,705,364；5,721,121；5,976,833；6,180,401；6,410,270；6,716,602；7,294,484；7,294,481；和美国专利申请公开号20030096414；20050272124(描述补料分批式细胞培养)；20060160180；20070254358；20070231901(描述微流体细胞培养系统)；20070184529(描述操作细胞培养环境用于糖基化)；20070161106。

例如，在一个实施方案中使用“补料分批式细胞培养”，例如分批式培养，其中开始时向培养瓶中供应细胞和培养基，然后在培养过程中向培养物连续输送或以离散增量输送额外的培养营养物，在终止培养之前周期性地收获细胞和/或产物。用于实施本发明的补料分批式培养系统可以是“半连续补料分批式培养”，例如其中周期性地去除全部培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜的培养基进行替换。简单的“分批式培养”也可用于实施本发明，例如其中用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)在培养过程开始时供给培养容器。灌注培养也可用于实施本发明，例如其中在制备培养物生长过程中不从培养容器中将上清液去除；通过例如过滤、包囊化、锚定到微载体上等将细胞限制在培养物中，并且连续或间歇地引入培养基并从培养容器中去除所述培养基。

本发明的细胞(包括包含本发明的表达盒、载体、重组病毒、质粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体或克隆载体，或包含本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)的任何嵌合核酸的任何细胞)可用于任何细胞培养系统，包括任何生物反应器、细胞培养板、管或烧瓶。本发明还提供包含本发明细胞的生物反应器系统、细胞培养系统、平板、管和烧瓶。

例如，在实施本发明中，细胞生长期之后可以是与所述生长期不同的多肽生产期。在一个实施方案中，在不同培养瓶中从细胞生长期开始进行生产期。

或者，同一容器可用于各步骤中。例如，可用含高重量摩尔渗透压浓度，低葡萄糖的培养基供应生长期的培养基用于生产。或者，使用本领域可得的细胞流体分离设备(例如，交叉流过滤、旋转筛或流化床微载体)的培养基交换使得能够使用同一容器。

在一个实施方案中，生产期包括以至少约1.0x10⁶细胞/mL，或至少约3.0x10⁶细胞/mL，或约1到10x10⁶细胞/mL的细胞种子密度接种生长期的培养动物细胞。在一个实施方案中，在例如示例用于生长期的培养容器中约400到600mOsm，或约400到500mOsm的起始重量摩尔渗透压浓度下培养动物细胞。

在一个实施方案中，为了获得具有特定重量摩尔渗透压浓度的培养基，可使用PS-04^TM、DIESEL^TM或SUPER CELL^TM培养基，或类似培养基，并且可通过添加基底浓度的葡萄糖和盐(如NaCl)提高所述培养基的重量摩尔渗透压浓度。该类型的培养基含有过量的氨基酸，以提供额外的细胞营养物并实现高的起始重量摩尔渗透压浓度。然而，如对普通技术人员显而易见的是，可调整培养基中其它组分的浓度，以达到想要的重量摩尔渗透压浓度。

在一个实施方案中，重量摩尔渗透压浓度在整个培养过程中维持在基本想要的范围内。控制葡萄糖向细胞培养基中的供应帮助防止重量摩尔渗透压浓度过度升高，基本高于想要的最佳值。

在一个实施方案中，在整个培养过程中葡萄糖浓度控制在约0.01到1g/L，优选0.02-0.5g/L，并更优选0.05-0.2g/L范围内来进行生产期。为了监测并控制培养基中的葡萄糖浓度在特定范围内，FIA或其它自动在线控制系统是有用的。

在一个实施方案中，在整个培养过程中也将谷氨酰胺浓度控制在0.2到2mM，更优选0.5到1mM范围内。可使用例如与上文讨论的类似的FIA系统完成对谷氨酰胺浓度的控制。

在一个实施方案中，培养条件，如温度、pH、dO₂等是之前所选宿主细胞用于蛋白质产生的那些条件，并对普通技术人员而言是显而易见的。例如，pH可调整到6.5到7.5的范围内，并且用于生产的温度可以在30℃到38C之间。

在一个实施方案中，对重组蛋白质而言，生产周期可从约10到15天或更长的正常时间缩短到约9天或更少，或7天或更少。在某些实施方案中(例如其中目的多肽是DNA酶)，生产期在获得最大多肽滴定度之前终止。因为获得的DNA酶组合物与更长运行中产生的DNA酶相比具有降低百分比的脱酰胺作用，所以这是有利的。多肽生产期后，可使用本领域中良好建立的技术从培养基中回收目的多肽。

生物反应器、植入物和人造器官

本发明还提供包含本发明细胞的植入物和人造器官、生物反应器系统、细胞培养系统、平板、盘、管、瓶子和烧瓶。任何植入物、人造器官、生物反应器系统、细胞培养系统、细胞培养板、盘(例如培养皿)、细胞培养管和/或细胞培养烧瓶(例如滚瓶)可用于实施本发明。

例如，本发明的生物反应器，或用于实施本发明方法的生物反应器可以是如在美国专利申请公开号20080112995中描述的可移植生物反应器装置；或例如在美国专利申请公开号20080057571；20080044890；20080044850；20080038816；20080032396；20080032389；20080032380；20080014629；20080014215；和/或20080003669，和/或美国专利号(USPNs)7,378,023；7,371,567(其描述用于生物人造器官的生物反应器)；7,351,584(描述用于哺乳动物肝细胞的生物反应器)；7,348,175(描述微处理器控制并操作的生物反应器)；7,300,584(描述用于在生物反应器中生物处理悬浮液的设备)；7,290,669(描述上流生物反应器)；7,264,962(描述三阶段酶反应器)；7,229,808(描述使用活性固定化生物材料的生物反应器)；7,198,941(描述多孔容器生物反应器装置)；7,198,940(描述生物反应器装置和细胞培养系统用于活细胞自动化培养和加工)；7,156,985(描述具有改善的温度控制的生物反应器系统)中描述的生物反应器设备；仅描述可用于实施本发明的少量示例性生物反应器和细胞培养系统。

在备选实施方案中，本发明提供植入物，例如包含本发明细胞的医学植入物(例如细胞分泌型胰岛素或细胞因子或激素)、或支架、矫形的、眼睛或牙科植入物。例如，植入物和人造器官(例如人造或植入物皮肤、肝、胰腺或牙齿)、生物反应器系统、细胞培养系统、平板、盘、管和烧瓶可包含干细胞、多能细胞、未分化细胞、脉络丛细胞、神经膜细胞、视网膜细胞、神经细胞、骨细胞、肝细胞、肝实质细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、肝巨噬细胞、肾细胞、血管细胞、皮肤细胞、牙周细胞、成牙本质细胞、成牙质细胞、成牙骨质细胞、成釉细胞、生牙外胚层间充质组织、成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞和参与牙生成或骨形成的其它细胞和组织，和/或干细胞，和其它人或动物器官细胞，或细胞是胚胎或成人干细胞，或其组合。

任何生物反应器、植入物、支架、人造器官或包含本发明细胞的类似设备可用于制备或使用本发明的组合物或方法；例如，如USPNs 7,388,042；7,381,418；7,379,765；7,361,332；7,351,423；6,886,568；5,965,125；5,270,192；和美国专利申请公开号20040127987；20080119909(描述耳植入物)；20080118549(描述眼睛植入物)；20080020015(描述生物活性的创伤敷剂)；20070254005(描述心瓣膜生物假体、血管植入物、关节盘植入物)；20070059335；20060128015(描述肝植入物)中描述的植入物。

渗透应答转录增强子及其结合蛋白质

本发明提供包含至少一个TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列的至少一个渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，所述TonEBP应答或NFATc应答转录增强子序列有效连接转录调节序列，例如有效连接启动子，如最小启动子、组成型启动子或诱导型启动子等。TonEBP应答和NFATc应答转录增强子序列，和结合它们的TonEBP和NFATc蛋白为本领域所熟知。

例如，TonEBP应答转录增强子序列可包含序列：5’-(T/A/C)GGAA(A/T)NN(T/A/C)N(T/A/C)-3’(SEQ ID NO：1)；并且描述了TonEBP应答转录增强子序列，例如参阅Daoudal(1997)J.Biol.Chem.272(5)：2615-2619；Ferraris(1999)Am.J.Physiol.276(3Pt 1)和下文描述的其它文献。可用于实施本发明的示例性活性TonEBP结合位点包括在表1中发现的那些位点：

表1

1.Daoudal S，Tournaire C，Halere A，Veyssière G，Jean C.Isolation ofthe mouse aldose reductase promoter and identification of atonicity-responsive element.J.Biol Chem.1997Jan 31；272(5)：2615-9.

2.Ferraris JD，Williams CK，Ohtaka A，García-Pérez A.Functionalconsensus for mammalian osmotic response elements.Am J Physiol.1999Mar；276(3 Pt 1).

3.Ferraris JD，Williams CK，Jung KY，Bedford JJ，Burg MB，García-Pérez A.ORE，a eukaryotic minimal essential osmotic responseelement.The aldose reductase gene in hyperosmotic stress.J Biol Chem.1996 Aug 2；271(31)：18318-21.

4.Fenton RA，Cottingham CA，Stewart GS，Howorth A，Hewitt JA，Smith CP.Structure and characterization of the mouse UT-A gene(Slc14a2).Am J Physiol.Renal Physiol.2002 Apr；282(4)：F630.

5.Ko BC，Ruepp B，Bohren KM，Gabbay KH，Chung SS. Identification and characterization of multiple osmotic response sequencesin the human aldose reduct

6.Lopez-Rodriguez C，Aramburu J，Rakeman AS，Rao A：NFAT5，aconstitutively nuclear NFAT protein that does not cooperate with Fos andJun.Proc Natl Acad Sci USA 1999，96：7214-7219.

7.Lopez-Rodriguez C，Aramburu J，Jin L，Rakeman AS，Michino M，Rao A：Bridging the NFAT and NF-kappaB families：NFAT5 dimerizationregulates cytokine gene transcription in response to osmotic stress.Immunity 2001，15：47-58.

8.Miyakawa H，Woo SK，Chen CP，Dahl SC，Handler JS，Kwon HM.Cis-and trans-acting factors regulating transcription of the BGT1 gene inresponse to hypertonicity.Am J Physiol.1998 Apr；274(4Pt 2)：F753-61.

9.Rim JS，Atta MG，Dahl SC，Berry GT，Handler JS，Kwon HM.Transcription of the sodium/myo-inositol cotransporter gene is regulatedby multiple responsive enhancers spread over 50 kilobase pairs in the5′flanking region.J.Biol Chem.1998 Aug 7；273(32)：20615-21.

10.Stroud JC，Lopez-Rodriguez C，Rao A，Chen L：Structure of aTonEBP-DNA complex reveals DNA encircled by a transcription factor.Nat Struct Biol 2002，9：90-94.

11.Woo SK，Lee SD，Na KY，Park WK，Kwon HM.TonEBP/NFAT5stimulates transcription of HSP70 in response to hypertonicity.Mol CellBiol.2002 Aug；22(16)：5753-60.

增强渗透保护表型

一方面，本发明的组合物和/或方法也表达结合渗透应答转录增强子的蛋白质，例如本发明的组合物(构建体)包含编码至少一个蛋白质的核酸序列，其结合用于本发明构建体的渗透应答转录增强子。该备选实施方案特别可用于本发明的这些方面，其中本发明的构建体和/或方法用作诱导型核酸和/或多肽表达系统；其中本发明的构建体本身可供应(制备)组成型或诱导型(例如，渗透应答的)的额外的或新的蛋白质，其结合渗透应答转录增强子以“增强”本发明构建体中存在的渗透应答转录增强子序列的转录激活。

在另一实施方案中，结合渗透应答转录增强子以“增强”渗透应答转录增强子序列转录激活的额外的或新的蛋白质存在于分离的构建体上，而不是存在于本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)上。

例如，本发明的示例性方法包括使用包含本发明构建体和另一表达构建体(例如表达载体)的OR TRE用于产生新的或额外的渗透应答转录增强子结合序列。

例如，本发明的构建体可编码张力应答增强子结合蛋白质，或“TonE结合蛋白质”或“TonEBP”，其具有以下序列：

MPSDFISLLS ADLDLESPKS LYSRESVYDL LPKELQLPPS RETSVASMSQ TSGGEAGSPP

61   PAVVAADASS APSSSSMGGA CSSFTTSSSP TIYSTSVTDS KAMQVESCSS AVGVSNRGVS

121  EKQLTSNTVQ QHPSTPKRHT VLYISPPPED LLDNSRMSCQ DEGCGLESEQ SCSMWMEDSP

181  SNFSNMSTSS YNDNTEVPRK SRKRNPKQRP GVKRRDCEES NMDIFDADSA KAPHYVLSQL

241  TTDNKGNSKA GNGTLENQKG TGVKKSPMLC GQYPVKSEGK ELKIVVQPET QHRARYLTEG

301  SRGSVKDRTQ QGFPTVKLEG HNEPVVLQVF VGNDSGRVKP HGFYQACRVT GRNTTPCKEV

361  DIEGTTVIEV GLDPSNNMTL AVDCVGILKL RNADVEARIG IAGSKKKSTR ARLVFRVNIM

421  RKDGSTLTLQ TPSSPILCTQ PAGVPEILKK SLHSCSVKGE EEVFLIGKNF LKGTKVIFQE

481  NVSDENSWKS EAEIDMELFH QNHLIVKVPP YHDQHITLPV SVGIYVVTNA GRSHDVQPFT

541  YTPDPAAAGA LNVNVKKEIS SPARPCSFEE AMKAMKTTGC NLDKVNIIPN ALMTPLIPSS

601  MIKSEDVTPM EVTAEKRSST IFKTTKSVGS TQQTLENISN IAGNGSFSSP SSSHLPSENE

661  KQQQIQPKAY NPETLTTIQT QDISQPGTFP AVSASSQLPN SDALLQQATQ FQTRETQSRE

721  ILQSDGTVVN LSQLTEASQQ QQQSPLQEQA QTLQQQISSN IFPSPNSVSQ LQNTIQQLQA

781  GSFTGSTASG SSGSVDLVQQ VLEAQQQLSS VLFSAPDGNE NVQEQLSADI FQQVSQIQSG

841  VSPGMFSSTE PTVHTRPDNL LPGRAESVHP QSENTLSNQQ QQQQQQQQVM ESSAAMVMEM

901  QQSICQAAAQ IQSELFPSTA SANGNLQQSP VYQQTSHMMS ALSTNEDMQM QCELFSSPPA

961  VSGNETSTTT TQQVATPGTT MFQTSSSGDG EETGTQAKQI QNSVFQTMVQ MQHSGDNQPQ

1021 VNLFSSTKSM MSVQNSGTQQ QGNGLFQQGN EMMSLQSGNF LQQSSHSQAQ LFHPQNPIAD

1081 AQNLSQETQG SLFHSPNPIV HSQTSTTSSE QMQPPMFHSQ STIAVLQGSS VPQDQQSTNI

1141 FLSQSPMNNL QTNTVAQEAF FAAPNSISPL QSTSNSEQQA AFQQQAPISH IQTPMLSQEQ

1201 AQPPQQGLFQ PQVALGSLPP NPMPQSQQGT MFQSQHSIVA MQSNSPSQEQ QQQQQQQQQQ

1261 QQQQQQSILF SNQNTMATMA SPKQPPPNMI FNPNQNPMAN QEQQNQSIFH QQSNMAPMNQ

1321 EQQPMQFQSQ STVSSLQNPG PTQSESSQTP LFHSSPQIQL VQGSPSSQEQ QVTLFLSPAS

1381 MSALQTSINQ QDMQQSPLYS PQNNMPGIQG ATSSPQPQAT LFHNTAGGTM NQLQNSPGSS

1441 QQTSGMFLFG IQNNCSQLLT SGPATLPDQL MAISQPGQPQ NEGQPPVTTL LSQQMPENSP

1501 LASSINTNQN IEKIDLLVSL QNQGNNLTGS F

NFATc张力应答转录激活序列也可用于本发明的构建体中；例如在Li(2007)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.292(5)：C1606-16中描述了所述NFATc信号途径。例如Miyakawa(1999)“Tonicity-responsive enhancerbinding protein，arel-like protein that stimulates transcription in responseto hypertonicity”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5)：2538-2542(还参阅，例如Lopez-Rodriguez(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(13)：7214-7219)描述的应答张力应答增强子结合蛋白质的序列也可用于实施本发明。该蛋白质调节哺乳动物细胞中渗透胁迫诱导的基因表达。不像该蛋白质家族的单体成员，该蛋白质以同二聚体存在并与DNA元件形成稳定的二聚体。已经发现了该基因的多个转录物变体，其编码不同同种型。可用于实施本发明的一个同种型是：

1    MPSDFISLLS ADLDLESPKS LYSRDSLKLH PSQNFHRAGL LEESVYDLLP KELQLPPSRE

61   TSVASMSQTS GGEAGSPPPA VVAADASSAP SSSSMGGACS SFTTSSSPTI YSTSVTDSKA

121  MQVESCSSAV GVSNRGVSEK QLTSNTVQQH PSTPKRHTVL YISPPPEDLL DNSRMSCQDE

181  GCGLESEQSC SMWMEDSPSN FSNMSTSSYN DNTEVPRKSR KRNPKQRPGV KRRDCEESNM

241  DIFDADSAKA PHYVLSQLTT DNKGNSKAGN GTLENQKGTG VKKSPMLCGQ YPVKSEGKEL

301  KIVVQPETQH RARYLTEGSR GSVKDRTQQG FPTVKLEGHN EPVVLQVFVG NDSGRVKPHG

361  FYQACRVTGR NTTPCKEVDI EGTTVIEVGL DPSNNMTLAV DCVGILKLRN ADVEARIGIA

421  GSKKKSTRAR LVFRVNIMRK DGSTLTLQTP SSPILCTQPA GVPEILKKSL HSCSVKGEEE

481  VFLIGKNFLK GTKVIFQENV SDENSWKSEA EIDMELFHQN HLIVKVPPYH DQHITLPVSV

541  GIYVVTNAGR SHDVQPFTYT PDPAAGALNV NVKKEISSPA RPCSFEEAMK AMKTTGCNLD

601  KVNIIPNALM TPLIPSSMIK SEDVTPMEVT AEKRSSTIFK TTKSVGSTQQ TLENISNIAG

661  NGSFSSPSSS HLPSENEKQQ QIQPKAYNPE TLTTIQTQDI SQPGTFPAVS ASSQLPNSDA

721  LLQQATQFQT RETQSREILQ SDGTVVNLSQ LTEASQQQQQ SPLQEQAQTL QQQISSNIFP

781  SPNSVSQLQN TIQQLQAGSF TGSTASGSSG SVDLVQQVLE AQQQLSSVLF SAPDGNENVQ

841  EQLSADIFQQ VSQIQSGVSP GMFSSTEPTV HTRPDNLLPG RAESVHPQSE NTLSNQQQQQ

901  QQQQQVMESS AAMVMEMQQS ICQAAAQIQS ELFPSTASAN GNLQQSPVYQ QTSHMMSALS

961  TNEDMQMQCE LFSSPPAVSG NETSTTTTQQ VATPGTTMFQ TSSSGDGEET GTQAKQIQNS

1021 VFQTMVQMQH SGDNQPQVNL FSSTKSMMSV QNSGTQQQGN GLFQQGNEMM SLQSGNFLQQ

1081 SSHSQAQLFH PQNPIADAQN LSQETQGSLF HSPNPIVHSQ TSTTSSEQMQ PPMFHSQSTI

1141 AVLQGSSVPQ DQQSTNIFLS QSPMNNLQTN TVAQEAFFAA PNSISPLQST SNSEQQAAFQ

1201 QQAPISHIQT PMLSQEQAQP PQQGLFQPQV ALGSLPPNPM PQSQQGTMFQ SQHSIVAMQS

1261 NSPSQEQQQQ QQQQQQQQQQ QQQSILFSNQ NTMATMASPK QPPPNMIFNP NQNPMANQEQ

1321 QNQSIFHQQS NMAPMNQEQQ PMQFQSQSTV SSLQNPGPTQ SESSQTPLFH SSPQIQLVQG

1381 SPSSQEQQVT LFLSPASMSA LQTSINQQDM QQSPLYSPQN NMPGIQGATS SPQPQATLFH

1441 NTAGGTMNQL QNSPGSSQQT SGMFLFGIQN NCSQLLTSGP ATLPDQLMAI SQPGQPQNEG

1501 QPPVTTLLSQ QMPENSPLAS SINTNQNIEK IDLLVSLQNQ GNNLTGSF

参阅例如Nagase(1998)DNA Res.5(6)：355-364；Lopez-Rodriguez(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(13)：7214-7219；Miyakawa(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5)：2538-2542。

如上描述，本发明提供核酸构建体，当其插入细胞并在细胞(包括生物反应器、细胞培养物、植入物等中的细胞)中表达时向该细胞提供渗透保护表型。在备选实施方案中，本发明提供例如通过也编码NFATc多肽、AP-1多肽、TonEBP多肽、钙依赖磷酸酶多肽、或其组合而具有提高能力的渗透保护构建体。因为例如NFATc多肽结合张力应答增强子，导致细胞中渗透保护蛋白质的更多(更大，更高)表达，所以当本发明的构建体也表达NFATc多肽时会获得增强的渗透保护能力。因为例如AP-1多肽可以是NFATc多肽结合张力应答增强子必需的辅因子，所以当本发明的构建体也表达AP-1多肽时会获得增强的渗透保护能力。因为例如TonEBP蛋白结合本发明的TonEBP应答转录增强子序列，所以当本发明的构建体也表达TonEBP多肽时会获得增强的渗透保护能力。也可通过本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，或通过另一增强子或启动子来调节NFATc、AP-1、TonEBP和/或钙依赖磷酸酶多肽编码核酸。

在备选实施方案中，除了在同一构建体上表达为本发明的ORE-TRE渗透应答核酸分子外，NFATc、AP-1、TonEBP和/或钙依赖磷酸酶多肽在分离的构建体上，例如分离的载体上进行表达，所述构建体可以是附加型的、瞬时表达构建体或基因组整合的表达构建体。

试剂盒和文库

本发明提供包含本发明的组合物和方法的试剂盒，其包括本发明的细胞、靶序列、转染试剂、转导试剂、说明书(关于本发明的方法)，或其任何组合。如此，此处提供试剂盒、细胞、载体等。

参考以下实施例进一步描述本发明，然而应该理解本发明不限制于这些实施例。

实施例

实施例1：设计渗透敏感的杂合转录调节元件

本发明提供了渗透应答转录调节元件(ORTREs)。

该实施例描述了TonE结合位点用于设计本发明的示例性渗透应答合成杂合转录调节元件，及其在提高的重量摩尔渗透压浓度下的表达特性。这些结果证实本发明的渗透应答转录调节元件可以渗透依赖性方式被反式激活。

方法：

构建渗透应答启动子POR1

利用寡聚物OLM1555’-TTGACTAGTT

AATGGGATTTAGAGAGGTGGGGTTC

TTGCTAGCTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGA

-3’(SEQ ID NO：8)和退火序列OLM1655’-3’(SEQ ID NO：10)通过PCR扩增人CMV启动子来克隆渗透应答启动子POR1，其中TonE和AP1结合位点为粗体，认为这些结合位点以及它们之间的序列是渗透应答元件(OR)，退火序列为斜体；SpeI和NheI克隆位点分别引入渗透应答元件(OR)的5’和3’，并且使用下划线标出所述克隆位点。Topo克隆PCR产物，因此产生pLM216。利用(SpeI/ClaI)从pLM216上切下具有其直接3’内含子的杂合启动子，并将其克隆到STIgMA-FC Stalkless表达质粒(SpeI ClaI)中，产生pOsmo1(POR1-Intron-STIgMA-Fc-pA；POR1，OR-Pfragment CMV)。

细胞培养，转染

中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1 DUX-B11(dhfr-)在无血清低蛋白(重组人胰岛素)培养基中悬浮生长。优化的LIPOFECTAMINE^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染方案用于细胞的高效瞬时转染。转染后6小时收获瞬时转染的细胞，并接种在6孔平板中重量摩尔渗透压浓度升高的含血清培养基中。在各孔中通过加入盐浓度升高的固定体积的磷酸缓冲盐水调节培养基的重量摩尔渗透压浓度。48小时后通过ELISA常规分析瞬时转染的细胞的Fc融合基因表达。

结果

为了分析渗透应答元件用于设计哺乳动物基因调节系统用于生物药剂生产和胁迫应答遗传改造的潜能，我们融合了小鼠醛糖还原酶启动子(序列-1053到-1007)的渗透应答元件，所述小鼠醛糖还原酶启动子含有人巨细胞病毒立即早期启动子部分的5’TonE位点和AP-1位点(激活蛋白质-1)(参阅例如Daoudal等1997，上文)，因此构建了渗透应答启动子1POR1。

我们构建了质粒，其中示例性POR1启动子驱动Fc融合蛋白pOsmo1(POR1-Intron-STIgMA-Fc-pA；POR1，OR Pfragment CMV)的表达。将组成型启动子-(人巨细胞病毒启动子)或POR1-驱动的Fc融合表达质粒转染到CHOK1DUX-B11(dhfr-)细胞后，将转染的细胞接种在重量摩尔渗透压浓度升高的培养基中并在其中生长48小时。然后测定细胞上清液的Fc融合物表达，如图2中简要说明，其中重量摩尔渗透压浓度表示为mOsm，并且来自本发明组成型启动子和POR1-转录调节元件的蛋白质浓度表示为mg/L。

所述组成型启动子驱动的表达质粒的表达水平在300到400mOsm保持稳定，然后随着重量摩尔渗透压浓度进一步升高而降低。这可能反映了高重量摩尔渗透压浓度下详细描述的细胞行为：随着重量摩尔渗透压浓度升高，细胞生长速率降低，并且细胞成活力下降。

因此，报告基因的组成型表达说明了高重量摩尔渗透压浓度对重组蛋白质表达的影响。

所述人巨细胞病毒启动子和渗透应答启动子1在300mOsm时驱动等同的重组蛋白质表达水平。随着重量摩尔渗透压浓度升高至400mOsm，POR1-驱动的表达水平升高，然后随重量摩尔渗透压浓度升高而降低。然而，POR1-驱动的表达水平以比其组成型启动子驱动的副本慢得多的速率降低。

结论

组成型驱动的和示例性POR1-驱动的Fc融合物表达水平的比较说明，尽管细胞的生理状态受高重量摩尔渗透压浓度的影响，并因此总的蛋白质产生减少，但本发明的示例性POR1在高渗培养基中比CMV启动子驱动更高的蛋白质表达水平。这些结果证明当本发明的渗透应答调节元件被转染到CHO-K1DUX-B11(dhfr-)细胞后，可以渗透依赖性方式被反式激活。因此，如该POR1-驱动的转基因表达所示例，这些结果证明本发明转录调节元件可用作实时重量摩尔渗透压浓度感应器。

实施例2：设计一组渗透应答转录调节元件

该实施例描述了本发明的一组渗透应答转录调节元件的设计与检测。我们检测了增加本发明构建体中渗透应答元件的数量在升高的重量摩尔渗透压浓度下对重组蛋白质表达窗的影响。图3简要说明了本发明的三个示例性合成渗透应答转录调节元件是怎样构建的。

方法：

构建渗透应答启动子

从pOsmo1(SpeI/ClaI)上切下POR1并将其克隆到pOsmo1(NheI/ClaI)中，因此产生含有2个渗透应答元件的渗透应答杂合启动子：pLM217(POR2-Intron)。同样，通过从pLM217(SpeI/ClaI)上切下POR2-Intron并插入到pOsmo1(NheI/ClaI)中构建POR3，因此产生pOsmo2(POR3-Intron-STIgMA-Fc-pA；POR3，OR-OR-OR-PfragmentCMV)。从pLM217(SpeI/ClaI)上切下POR2-Intron并将其克隆到pLM217(NheI/ClaI)，因此产生pLM218：POR4-Intron(POR4，OR-OR-OR-OR-Pfragment CMV)。从pLM218(SpeI/ClaI)上切下POR4-Intron并连接到pOsmo2(NheI/ClaI)，因此产生pOsmo3(POR7-Intron-STIgMA-Fc-pA；POR7，OR-OR-OR-OR-OR-OR-OR-Pfragment CMV)。

细胞培养，转染

中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1 DUX-B11(dhfr-)在无血清低蛋白(重组人胰岛素)培养基中悬浮生长。优化的LIPOFECTAMINE^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染方案用于细胞的高效瞬时转染。转染6小时后收获瞬时转染的细胞，并接种在6个孔板中重量摩尔渗透压浓度升高的含血清培养基中。在各孔中通过加入盐浓度升高的固定体积的磷酸缓冲盐水调节培养基的重量摩尔渗透压浓度。48小时后通过ELISA常规分析瞬时转染的细胞Fc融合基因表达。

结果

为了评估增加数量的人巨细胞病毒启动子片段的5’渗透应答元件的影响，我们构建了两个其它渗透应答启动子，其携带并排克隆的3或7个渗透应答元件：POR3和POR7，如图3所示。用人巨细胞病毒组成型启动子或渗透应答启动子3，POR3或渗透应答启动子7，POR7驱动的Fc融合表达质粒转染CHO-K1 DUX-B11(dhfr-)细胞。转染后6小时，收获细胞并将其接种在重量摩尔渗透压浓度升高的培养基中。报告基因的组成型表达不受300mOsm到400mOsm之间的重量摩尔渗透压浓度的显著影响，Fc融合物表达水平然后随重量摩尔渗透压浓度升高而降低，如图4所示，其简要说明了图3中说明的本发明示例性渗透应答转录调节元件(OR-TREs)的体内渗透保护功效；还参阅图5中的归一化数据。

POR3驱动的Fc融合表达水平是等渗培养基中其副本组成型表达水平的一半，如图4所示。随着培养基重量摩尔渗透压浓度从300mOsm升高至500mOsm，POR3驱动的表达提高至1.5倍等渗表达水平的峰值，然后随着重量摩尔渗透压浓度从500mOsm升高至700mOsm，表达降低。

POR7驱动的Fc融合物表达水平低于等渗培养基中其组成型表达副本的15倍，如图4中所示。随着摩尔渗透压浓度从300mOsm升高至550mOsm，POR7驱动的Fc融合表达水平升高至4倍等渗表达水平的峰值，然后随重量摩尔渗透压浓度降低而降低。数据在图5中进行归一化。

结论

在本发明渗透应答转录调节元件(OR-TREs)(也称为“杂合渗透应答启动子”)内编码(插入)的渗透应答元件越多(数量越多)，等渗培养基中转基因表达水平越低-但其诱导因子(其最高表达水平与等渗表达水平的比值)越高。因此，我们已经构建了一组渗透应答启动子，其产生多种转基因表达窗和诱导因子；并且本发明提供多种渗透应答转录调节元件(OR-TREs)，其具有工程化到构建体中的一个或多个渗透应答元件；例如，具有一个或多个张力增强子结合蛋白质(TonEBP)应答转录增强子序列(TonEBP结合基序)，并且作为备选实施方案，还任选地具有一个或多个AP-1蛋白质结合位点(AP-1结合基序)。

归一化的表达水平

数据分析

因为被抑制的细胞生长和成活力，组成型表达水平从等渗到高渗表达的相对下降表示蛋白质产生的渗透相关下降。因此，我们将POR3和POR7驱动的表达水平针对其组成型表达水平进行归一化；参阅图4。

结论

该实施例给出了这样的数据，其证明增加本发明构建体中编码的渗透应答元件(本发明的渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，或“渗透应答启动子”)的数量怎样以渗透应答元件数量依赖性方式降低等渗表达水平。该实施例还给出了这样的数据，其证明通过本发明示例性构建体对这些启动子的实际反式激活水平随重量摩尔渗透压浓度从350mOsm到700mOsm以线性方式升高。

实施例3：渗透敏感的转录和转录后基因调节

该实施例描述了本发明示例性构建体，其具有组合的渗透敏感的转录和转录后基因调节；例如本发明的示例性构建体能够在渗透胁迫(例如高盐)条件下正上调信使和多肽的转录和转录后表达水平。

备选实施方案组合了渗透调节与转录控制和/或转录后(例如翻译)水平控制：(1)(在转录水平上)内源哺乳动物渗透应答启动子和/或本发明的合成的真核渗透应答启动子；和(2)(在转录后水平上)通过掺入一个或更多转录或翻译调节序列或基序。这些控制可掺入(工程化)到本发明的构建体中，从而从该构建体产生的任何信使(转录物)具有渗透敏感5’和/或3’非翻译区；和一个实施方案中，额外的转录和/或转录后(例如翻译)水平控制。

例如，转录和/或转录后(例如翻译)水平控制序列或基序的存在产生mRNA(信使)，其更稳定和/或更长效，例如在高渗性(例如高渗环境)中更稳定和/或更长效；因此在高渗性条件下，例如高重量摩尔渗透压浓度下导致提高的重组蛋白质表达。该实施方案增强了等渗培养基中的基础表达与高渗性条件中，例如高渗培养基中最大基因诱导之间的调节因子。

实施例4：

组成型启动子驱动的重组蛋白质产生的产量随重量摩尔渗透压浓度升高而稳定降低。我们论述了在组成型启动子中引入渗透应答元件可进一步反式激活组成型启动子，并抗衡高渗性对重组蛋白质产生的负面影响。为了检验该假设，我们在人CMV启动子和P_{fragment CMV}之间引入一个、三个或七个渗透应答元件。

方法：

构建渗透应答启动子

利用寡聚物OLM401：5’-C

CAATCA

3’(SEQ ID NO：38)和OLM400：5’-A

A

3’(SEQ ID NO：39)(限制性位点为粗体，退火序列为斜体)PCR扩增人CMV启动子的增强子。用HindIII和NheI消化PCR产物，从中间质粒(SpeI/EcoRI)上切下P_OR1-Intron，将两个DNA片段克隆到另一中间质粒(HindIII/EcoRI)中，因此产生：PconstOR1-Intron：E_hCMVOR1P_{fragment CMV}-Intron。相同的策略用于构建PconstOR3-Intron：E_hCMVOR3P_{fragment CMV}-Intron和PconstOR7-Intron：E_hCMVOR7P_{fragment CMV}-Intron。

从中间质粒(SpeI/ClaI)上切下PconstOR1，并将其克隆到pOsmoI(SpeI/ClaI)中，因此产生：pconstOsmo1(PconstOR1-Intron-STIgMA-Fc-pA；PconstOR1：E_hCMV-P_OR1)。相同的策略用于构建pconstOsmo3(PconstOR3-Intron-STIgMA-Fc-pA；PconstOR3：E_hCMV-P_OR3)和pconstOsmo7(PconstOR7-Intron-STIgMA-Fc-pA；PconstOR7：E_hCMV-P_OR7)。

细胞培养，转染

中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1DUX-B11(dhfr-)在无血清低蛋白(重组人胰岛素)培养基中悬浮生长。优化的lipofectamin转染方案用于细胞的高效瞬时转染。转染6小时后收获瞬时转染的细胞，并接种在6孔板中重量摩尔渗透压浓度升高的含血清培养基中。在各孔中通过加入盐浓度升高的固定体积的磷酸缓冲盐水调节培养基的重量摩尔渗透压浓度。通过ELISA用Fc融合基因表达测定常规分析瞬时转染的细胞。

结果

为了评估引入增加数量的人巨细胞病毒启动子的增强子的3’和人巨细胞病毒启动子片段的5’的渗透应答元件的影响，我们构建了三个启动子，其携带并排克隆的1、3或7个渗透应答元件：PconstOR1、PconstOR3、PconstOR7。用人巨细胞病毒组成型启动子或这些工程化启动子之一驱动的Fc融合表达质粒转染CHO-K1DUX-B11(dhfr-)细胞。转染后6小时，收获细胞并将其接种在重量摩尔渗透压浓度升高的培养基中。

报告基因的组成型表达随重量摩尔渗透压浓度升高而稳定降低(图6)。

令人惊奇的是，在增强子和CMV启动子的片段之间引入一个渗透应答元件导致等渗培养基中重组蛋白质的表达加倍。在300mOsm/Kg到450mOsm/Kg之间，PconstOR1驱动的目的重组蛋白质的表达水平维持在该高水平，然后随重量摩尔渗透压浓度从500mOsm/Kg升高至700mOsm/Kg而降低。

在组成型人CMV启动子内引入三个渗透应答元件导致在300mOsm/Kg处与野生型CMV启动子相比，重组蛋白质表达轻微上升。相反，引入七个渗透应答元件导致等渗培养基中的重组蛋白质表达轻微下降。经修饰而含有三个或七个渗透应答元件的CMV驱动的Fc融合表达水平在300mSom/Kg到400mOsm/Kg时升高，随后稳定降低直到700mOsm/Kg。

结论

在人CMV启动子内引入一个渗透应答元件导致300mOsm/Kg处的重组蛋白质表达水平加倍。这是没有预计到的结果。

渗透应答元件的存在使得能够抗衡升高的重量摩尔渗透压浓度对重组蛋白质表达的影响，并且当引入三个或七个渗透应答元件时，重组表达水平随重量摩尔渗透压浓度升高而上调，在400mOsm/Kg达到最大值，然后稳定降低。

已经描述了许多本发明的许多实施方案。然而，应该理解可进行多种修改而不背离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (54)

1.分离的核酸分子，其包含至少一个渗透应答转录调节元件(OR-TRE)，所述渗透应答转录调节元件包含有效连接转录调节子的至少一个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子和有效连接所述TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子的至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述转录调节子包含启动子、增强子或其组合。

3.权利要求2的核酸分子，其包含定位在启动子5’的第一个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子，和定位在所述启动子3’的第二个TonEBP应答转录增强子或NFATc应答转录增强子。

4.权利要求1的核酸分子，其包含定位在所述OR-TRE 5’的第一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子和定位在所述OR-TRE 3’的第二个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子。

5.权利要求1的核酸分子，其中所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在所述转录调节子的5’，其中所述转录调节子是启动子。

6.权利要求1的核酸分子，其中所述激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子定位在所述转录调节子的3’，其中所述转录调节子是启动子。

7.权利要求1的核酸分子，其包含定位在所述转录调节子5’的第一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子和定位在所述转录调节子3’的第二个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子，其中所述第一个转录调节子和所述第二个转录调节子均是启动子。

8.权利要求1的核酸分子，其中

(a)至少一个TonEBP应答转录增强子包含SEQ ID NO：1的核酸序列；或

(b)至少一个NFATc应答转录增强子包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的核酸序列；或

(c)至少一个激活子蛋白-1(AP-1)应答转录增强子包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中N可以是任何核苷酸。

9.权利要求1的核酸分子，其中所述OR-TRE包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的核苷酸序列。

10.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子还包含有效连接转录调节子的额外核酸分子，其中所述转录调节子是在真核细胞中有转录活性的启动子。

11.权利要求10的核酸分子，其中所述额外的核酸分子包含(a)编码目的蛋白质的蛋白质编码核酸分子；或(b)调节核酸分子。

12.权利要求10的核酸分子，其中所述调节核酸分子是抑制性分子、稳定分子和上调核酸分子，或产生反义分子。

13.权利要求11的核酸分子，其中所述额外的核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽。

14.权利要求11的核酸分子，其中所述额外的核酸分子编码赋予在细胞中表达的蛋白质有益性质的蛋白质或肽。

15.权利要求14的核酸分子，其中所述额外核酸分子编码多肽，所述多肽选自抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶，或其任何组合。

16.权利要求12的核酸分子，其中所述抑制核酸分子包含反义序列、核酶、短的干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。

17.权利要求10的核酸分子，其中所述额外的核酸分子编码NFATc或TonEBP多肽。

18.权利要求13的渗透应答核酸分子，其中所述渗透保护蛋白质或肽是脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE)。

19.权利要求15的渗透应答核酸分子，其中所述抗细胞凋亡蛋白质是Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BHRF1、X-IAP、IAP1、IAP2 IEX-1L、Bfl-1或Bcl-w。

20.权利要求15的渗透应答核酸分子，其中赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、sulfiredoxin、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、硫醇转移酶、谷氧还蛋白或谷胱甘肽还原酶。

21.权利要求15的渗透应答核酸分子，其中参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质是结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)、钙联接蛋白、钙网蛋白、ERp57或蛋白质二硫键异构酶(PDI)。

22.权利要求15的渗透应答核酸分子，其中所述糖酵解酶是丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶。

23.权利要求15的渗透应答核酸分子，其中所述细胞周期调节蛋白是细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶，或细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。

24.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述OR-TRE有效连接至少一个靶定核酸分子。

25.权利要求24的核酸分子，其中所述靶定核酸分子包含靶定生乳基因、生乳信使或生乳蛋白质以降低所述生乳基因、生乳信使或生乳蛋白质表达的核酸分子。

26.权利要求25的核酸分子，其中所述生乳基因是乳酸脱氢酶。

27.权利要求24的核酸分子，其中所述包含靶定生乳基因或生乳基因信使的核酸分子的核酸包含短的干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA和/或具有核酶活性的RNA。

28.载体，其包含权利要求1的核酸分子。

29.细胞，其包含权利要求29的载体。

30.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子还包含(i)有效连接转录调节子的额外的核酸分子，其编码赋予细胞中表达的蛋白质有益性质的多肽，其中所述转录调节子是在真核细胞中有转录活性的启动子和(ii)核酸分子，其编码待在细胞中表达的目的蛋白质，其中(i)的核酸分子的表达向(ii)的核酸分子编码的多肽传递所述有益性质。

31.权利要求30的核酸分子，其中所述(i)的额外核酸分子编码这样的多肽，其选自抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶，或其任何组合。

32.用于在高渗性条件下保护细胞的方法，其包括：

(a)向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：(i)权利要求13的核酸分子，和/或权利要求12的渗透应答核酸分子和(ii)编码有效连接启动子的第二种目的蛋白质的多核苷酸；和

(b)培养所述细胞，从而表达所述渗透保护蛋白质或肽，或渗透保护调节核酸和所述目的蛋白质，由此在高渗性条件下保护细胞，并允许所述第二种目的蛋白质表达。

33.权利要求32的方法，其中所述渗透保护蛋白质或肽是脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE)。

34.用于在高渗性条件下在细胞中表达目的蛋白质的方法，其包括：

(a)向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：(i)权利要求14的核酸分子和(ii)编码有效连接启动子的第二种目的蛋白质的多核苷酸；和

(b)培养所述细胞，从而当所述细胞在高渗性条件下生长时，(i)的核酸分子的表达向(ii)的多核苷酸编码的多肽传递所述有益性质。

35.权利要求34的方法，其中赋予在细胞中表达的蛋白质有益性质的蛋白质或肽是抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶；或其任何组合。

36.权利要求32或34的方法，其中在步骤(b)中所述细胞是最初在正常培养条件下培养的细胞，随后提高重量摩尔渗透压浓度至足以提高所述第二种目的蛋白质表达的量。

37.权利要求36的方法，其中通过用增加所述重量摩尔渗透压浓度的化合物掺加所述培养物来提高所述重量摩尔渗透压浓度。

38.权利要求36的方法，其中所述第二种目的蛋白质对所述细胞有毒。

39.权利要求36的方法，其中所述第二种目的蛋白质是不稳定的。

40.权利要求36的方法，其中所述第二种目的蛋白质难以在正常培养条件下表达。

41.权利要求32或34的方法，其中在步骤(b)中所述细胞是最初在正常培养条件下培养的细胞，并允许培养物变成高渗的，由此提高所述第二种目的蛋白质的表达。

42.权利要求41的方法，其中所述第二种目的蛋白质对所述细胞有毒。

43.权利要求41的方法，其中所述第二种目的蛋白质是不稳定的。

44.权利要求41的方法，其中所述第二种目的蛋白质难以在正常培养条件下表达。

45.用于添加或增强细胞对渗透胁迫或渗透休克的适应性或抗性的方法，所述方法包括向细胞中引入包含权利要求11的核酸分子的多核苷酸，其中所述额外的核酸分子编码渗透保护蛋白质或肽；或渗透保护调节核酸。

46.用于在细胞中高渗性条件下表达目的蛋白质的方法，所述方法包括向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：

(a)权利要求11的核酸分子和

(b)编码有效连接第二种OR-TRE的第二种目的蛋白质的多核苷酸；

其中(a)的所述核酸分子编码TonEBP；并且其中在摩尔渗透压浓度升高的条件下，表达(a)的所述核酸分子，由此表达TonEBP蛋白质，并且其中所述TonEBP蛋白质正调节TonEBP和所述第二种目的蛋白质的表达。

47.权利要求46的方法，其中所述第二种目的蛋白质是渗透保护蛋白质。

48.权利要求47的方法，其中所述渗透保护蛋白质是脯氨酸或甜菜碱、牛磺酸转运蛋白、甜菜碱-γ-氨基丁酸转运蛋白、钠-肌醇-协同转运蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、醛糖还原酶，或神经病靶酯酶(NTE)。

49.权利要求46的方法，其中所述第二种目的蛋白质是向所述细胞表达的多肽传递有益性质的蛋白质。

50.权利要求49的方法，其中传递有益性质的所述蛋白质是抗细胞凋亡蛋白质；赋予细胞氧化胁迫抗性的蛋白质；参与促进蛋白质折叠的分子伴侣蛋白质；参与蛋白质胞外分泌的蛋白质；糖酵解酶；细胞周期调节蛋白；糖基化酶；或其任何组合。

51.权利要求49的方法，其还包括编码有效连接启动子的第三种目的蛋白质的第三种核酸，其中传递有益性质的所述蛋白质作用于所述第三种目的蛋白质。

52.权利要求11的核酸分子，其中所述额外的核酸分子编码TonEBP。

53.权利要求11的核酸分子，其还包含编码有效连接第二种OR-TRE的第二种目的蛋白质的多核苷酸。

54.试剂盒，其包含权利要求1的核酸分子。

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