CN102181516A - 一种PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种优化的PheRS酶活测定体系，以及利用该体系筛选结核分枝杆菌PheRS抑制剂的方法，建立了PheRS蛋白抑制剂的蛋白水平筛选模型。本发明的方法简单、可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。运用该筛选方法从化合物库的2000个样品中筛选得到可抑制结核分枝杆菌PheRS酶的活性阳性化合物4个(以抑制率大于50％为筛选阳性标准)。从2560个微生物代谢粗提物中得到25个阳性样品(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。4560个样品中筛选阳性率为0.6％。

Description

一种PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种结核分枝杆菌PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法。

背景技术

近年来，曾经被有效控制的结核病大有卷土重来之势，已成为与艾滋病、疟疾并称的传染病三大杀手。结核病死灰复燃的原因中很重要的一个方面就是多重耐药菌的增加。因此，寻找新的有效的抗结核药物已成为我国乃至世界结核病防治重要任务。目前世界各国的新药筛选部门都普遍采用靶向筛选来筛选新药：即从病原微生物生长繁殖所必需的某一组分或是从其耐药机理入手，将其作为候选新药的作用靶位，设计特定的筛选模型，并利用模型有针对性地从微生物代谢产物或化合物库中进行筛选，以期得到对有效的新型抗细菌药物。

在蛋白质的生物合成过程中，氨酰-tRNA合成酶起了至关重要的作用，它催化氨基酸与相应的tRNA合成氨酰-tRNA，是遗传信息通过蛋白质形式得以表达所必需的一个组分，是各类生物体生存所必不可少的一类酶。对于病原菌而言，一旦它的某种氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能，就会导致其蛋白质的生物合成中断以及许多重要的生理过程受影响，病原菌的生长繁殖也就随之终止。因此，氨酰-tRNA合成酶适于作为新型抗菌药物的作用靶点。由此可见，目前迫切需要一种特异性强的筛选方法，建立崭新、低毒、高效的筛选模型。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种优化的PheRS酶活测 定体系。

本发明的PheRS酶活测定体系以ddH₂O为溶剂，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 90～110mM

MgCl₂                 9～11mM

Phe                   2.3～2.7mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   1.8～2.2mM

PEP                   0.9～1.1mM

NADH                  1.3～1.7mM

PheRS                 3.5～4.5μg/100μl

肌激酶                1.6～2.0U/100μl

丙酮酸激酶            1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶            1.6～2.0U/100μl。

优选地，本发明的PheRS酶活测定体系含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 100mM

MgCl₂                 10mM

Phe                   2.5mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   2.0mM

PEP                   1.0mM

NADH                  1.5mM

PheRS                 4μg/100μl

肌激酶                1.8U/100μl

丙酮酸激酶            1.8U/100μl

乳酸脱氢酶            1.8U/100μl。

本发明的另一个目的是提供筛选结核分枝杆菌PheRS抑制剂的方法，该方法包括如下步骤：

1)配制上述PheRS酶活测定体系，作为反应体系：

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向步骤1)配制好的反应体系中加入化合物的样品溶液或者菌株发酵液的样品溶液；

ii)阳性对照组：配制不含PheRS的步骤1)所述的反应体系；

iii)阴性对照组：向步骤1)所述反应体系中加入等量的i)中溶解化合物样品所用的溶剂DMSO或者等量的用于菌株发酵的发酵培养基；

3)将步骤2)各反应组分别混合均匀，置于酶标仪内反应，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

上述步骤2)中，当样品为化合物时，加入溶剂制成样品溶液，向反应体系中加入该样品溶液，使样品的终浓度为18-22μM，作为样品反应组；优选地，向100μl反应体系中加入样品溶液，使样品终浓度为20μM，作为样品反应组。

当样品为菌株发酵液时，取10μl发酵液挥干后加入DMSO制成样品溶液，加入到100μl反应体系中，作为样品反应组。所述菌株发酵液的生产方式为：从斜面上挑取约0.5cm²菌株培养物种入盛有50ml发酵培养基的瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。

所述发酵培养基的组成为：

葡萄糖5g；麦芽膏10g；棉子饼粉10g；淀粉20g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 0.5g；(NH₄)₂SO₄ 5g；CaCO₃ 3g；NaCl 1g加水至终体积1L，调pH至7.2。

可选地，所述发酵培养基的组成为：

葡萄糖5g；酵母膏5g；牛肉膏5g；大豆蛋白胨5g；黄豆饼粉10g；淀粉20g；玉米浆4g；CaCO₃ 4g；0.002％的CoCl₂溶液1ml，加水至终体积1L，调pH至7.2。

上述步骤3)从各组反应体系分别混合均匀后开始测定OD₃₄₀吸光值。具体地：将步骤2)各反应组分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37℃进行反应。以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min(25次)。根据结果，计算反应抑制率IR。

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

然后抑制率公式 计算各孔的抑制率。

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

当抑制率为100％时，则表征PheRS的活性被完全抑制。

当样品为化合物时，抑制率大于50％的样品为阳性样品；当样品为菌株发酵液时，抑制率大于30％的样品为阳性样品。

在本发明一个优选的实施方案中，通过体外表达结核分枝杆菌PheRS蛋白，分离纯化得到PheRS蛋白，按照上述方法从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选4560个样品，其中2000个化合物，2560个菌株发酵液样品。初筛阳性率80/4560＝1.7％，复筛阳性率29/4560＝0.6％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。

其中，复筛中筛出活性化合物四个，分别为SC100107-6-D4、SC100107-20-A7、SC100107-20-A11和SC100107-23-A5，抑制率分别为61.3％、68.7％、53.2％和60.6％；复筛中筛出阳性菌株发酵液25个。

本发明选择的苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)作为药物筛选的靶点具有其独特的优点。PheRS与其它氨酰-tRNA合成酶在结构以 及催化特性方面的差异将有利于避免交叉耐药的问题。另外，PheRS在不同细菌中的序列比较保守，而且与真核生物的同种功能的蛋白之间不具有相关性，有利于筛选到对多种病原菌都有效的广谱抗生素，而且所筛选到的化合物对人体的毒性也会很小。因此将PheRS筛选抗结核的药物的靶点，建立崭新、低毒、高效的筛选模型。

因此，本发明筛选PheRS抑制剂的方法所选择的靶点特异性高，并通过分子生物学技术和细胞生物学技术建立体外高通量筛选模型。本发明的PheRS酶活测定体系与传统的用放射性同位素标记氨基酸的方法相比，简单可靠，方便易行。该方法效率高，成本低，是一种理想的抗菌药物的筛选方法。

附图说明

图1为pET30a/pheST的质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用的生物材料大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET30a/pheST，已于2010年11月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.4321。

实施例1样品筛选

本实施例中以结核分枝杆菌PheRS酶为例，说明抗菌药物的筛选方法。

一、重组PheRS蛋白的制备

1、pET30a/pheST质粒的构建

以目前网络数据库中已公开的结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增pheRS基因(包括pheS和pheT基因)(SEQ ID No.1和2)。引物序列如下：

pheS：上游引物5’CCG 

TTGTCGCCGGAG 3’；下游引物5’CCG 

TCAGGCACCCACC 3’。斜体部分分别是Nde I和Xba I酶切位点。

pheT：上游引物5’GTGTGTGC 

CGGCTACCCTA 3’；下游引物5’CTTA 

CCAGCCACGCAGCAC 3’。斜体部分分别是Nde I和HindIII酶切位点。

PCR反应体系包括：

模板(H37Rv基因组

DNA)                  1μl

上游引物(20pM)        1μl

下游引物(20pM)        1μl

2×Pfu混合物          25μl

无核酸酶ddH2O         22μl

总体积                50μl

PCR反应的条件为：

以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板，通过PCR方法分别扩增出目的基因片段，将回收纯化的pheT基因片段的和质粒载体pET30a均经过Nde I和HindIII双酶切后，用T4DNA连接酶于16℃连接16h。

连接反应体系如下：

pET30a载体            2.8μl

PCR产物(pheT)         10μl

10×T4缓冲液          1.5μl

T4连接酶        0.7μl

总体积          15μl

PCR产物与pET20b载体的摩尔比为3∶1。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h筛选重组子，提取质粒，双酶切鉴定插入片段后，由上海生工生物工程有限公司测序。

从已构建的pheT/pET-30a质粒中用Xba I和HindIII酶切获得核糖体结合位点(RBS)+pheT片段。用Nde I和HindIII酶切pET-30a载体，再将回收纯化的pheS基因片段与pheT、pET-30a三个片段连接，获得重组pET30a/pheST质粒，质粒图谱见图1。

2、目的蛋白的诱导表达以及分离纯化

将测序无误的重组质粒pET30a/pheST转化大肠杆菌B121(λDE3)。挑取转化子在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)中，37℃200rpm振荡培养至培养液变浑浊后，按1∶50的比例将上述培养物转接于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至OD₆₆₀＝0.8左右，加入终浓度1.0mM IPTG，20℃诱导表达过夜。

离心收集菌体，超声裂解菌体后，将裂解液在4℃，15000g离心30min，上清用0.45μm滤膜过滤。通过 

explorer系统，使用1ml HisTrap^TM HP镍离子亲和层析柱纯化重组PheRS蛋白。

二、PheRS酶活测定体系的配制：

反应物                终浓度

Hepes                 100mM

MgCl₂                 10mM

Phe                   2.5mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   2.0mM

PEP               1.0mM

NADH              1.5mM

PheRS             4μg/100μl

肌激酶            1.8U/100μl

丙酮酸激酶        1.8U/100μl

乳酸脱氢酶        1.8U/100μl。

三、样品制备

化合物样品：将化合物溶解在DMSO中，浓度为2mM，作为混合物的样品溶液。

发酵液样品：先将菌株发酵，方法为从斜面上挑取0.5cm²培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解，作为菌株发酵液的样品溶液。

其中，发酵培养基的组成为：

葡萄糖5g；麦芽膏10g；棉子饼粉10g；淀粉20g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 0.5g；(NH₄)₂SO₄ 5g；CaCO₃ 3g；NaCl 1g加水至终体积1L，调pH至7.2。

四、样品活性检测

按以下分组分别向反应体系中添加各组分：

A.阴性对照组(化合物)：向PheRS酶活测定体系中加入1μlDMSO溶剂，反应体系的总体积为100μl。

A’.阴性对照组(菌株发酵液)：向PheRS酶活测定体系中加入1μl抽提后的发酵培养基(取50ml发酵培养基，置于250ml三角瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天；取10ml发酵培养基液用10ml的丙酮抽提，挥干)，反应体系的总体积为100μl。

B.阳性对照组：按照上述“二、PheRS酶活测定体系的配制”项下的方法，配制不含PheRS的PheRS酶活测定体系，反应体系的总体积为100μl。

C.样品实验组(化合物)：取1μl化合物样品溶液加入到PheRS酶活测定体系中，使化合物的终浓度为20μM，反应体系的总体积为100μl；

C’.样品实验组(菌株发酵液)：取1μl菌株发酵液的样品溶液，加入到PheRS酶活测定体系中，使反应体系的总体积为100μl。

将上述各反应组的反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中(每孔反应体系总体积为100μl)，置于PerkinElmer公司的EnVision酶标仪内，开启温控为37℃进行反应。以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min(25次)。

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

再依公式抑制率 

计算各孔的抑制率。

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量；

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量；

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

筛选结果为：从化合物库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选4560个样品，其中2000个化合物，2560个菌株发酵液样品，初筛阳性率80/4560＝1.7％，复筛阳性率29/4560＝0.6％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。

其中，复筛中筛出活性化合物四个，分别为SC100107-6-D4、SC100107-20-A7、SC100107-20-A11和SC100107-23-A5，抑制率分别为61.3％、68.7％、53.2％和60.6％；复筛中筛出阳性菌株发酵液25个(其中链霉菌属菌株发酵液21个，小单孢菌属菌株发酵液3个，诺卡氏菌属菌株发酵液1个)。

实施例2

与实施例1同法操作，不同之处在于以下三个方面：

第二项、PheRS酶活测定体系的配制：

反应物                终浓度

Hepes                 90mM

MgCl₂                 9mM

Phe                   2.3mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   1.8mM

PEP                   0.9mM

NADH                  1.3mM

PheRS                 3.5μg/100μl

肌激酶                1.6U/100μl

丙酮酸激酶            1.6U/100μl

乳酸脱氢酶            1.6U/100μl。

第三项、样品制备

所用的发酵培养基为：

葡萄糖5g；酵母膏5g；牛肉膏5g；大豆蛋白胨5g；黄豆饼粉10g；淀粉20g；米浆4g；CaCO₃ 4g；0.002％的CoCl₂溶液1ml，加水至终体积1L，调pH至7.2。

第四项、样品活性检测

C.样品实验组(化合物)：取1μl化合物样品溶液加入到PheRS酶活测定体系中，使化合物的终浓度为18μM，反应体系的总体积为100μl。

筛选结果同实施例1。

实施例3

与实施例1同法操作，不同之处在于以下两个方面：

第二项、PheRS酶活测定体系的配制：

反应物                终浓度

Hepes                 110mM

MgCl₂                11mM

Phe                  2.7mM

tRNA                 50μg/100μl

ATP                  2.2mM

PEP                  1.1mM

NADH                 1.7mM

PheRS                4.5μg/100μl

肌激酶               2.0U/100μl

丙酮酸激酶           2.0U/100μl

乳酸脱氢酶           2.0U/100μl。

第四项、样品活性检测

C.样品实验组(化合物)：取1μl化合物样品溶液加入到PheRS酶活测定体系中，使化合物的终浓度为22μM，反应体系的总体积为100μl。

筛选结果同实施例1。

运用本发明的筛选方法从化合物库的2000个样品中筛选得到可抑制结核分枝杆菌PheRS酶的活性阳性化合物4个(以抑制率大于50％为筛选阳性标准)。从2560个微生物代谢粗提物(菌株发酵液)中得到25个阳性样品(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。4560个样品中筛选阳性率为0.6％。

Claims (10)

1.一种PheRS酶活测定体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 90～110mM

MgCl₂                 9～11mM

Phe                   2.3～2.7mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   1.8～2.2mM

PEP                   0.9～1.1mM

NADH                  1.3～1.7mM

PheRS                 3.5～4.5μg/100μl

肌激酶                1.6～2.0U/100μl

丙酮酸激酶            1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶            1.6～2.0U/100μl。

2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 100mM

MgCl₂                 10mM

Phe                   2.5mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   2.0mM

PEP                   1.0mM

NADH                  1.5mM

PheRS                 4μg/100μl

肌激酶                1.8U/100μl

丙酮酸激酶            1.8U/100μl

乳酸脱氢酶            1.8U/100μl。

3.一种筛选结核分枝杆菌PheRS抑制剂的方法，包括如下步骤：

1)配制权利要求1或2所述的体系；

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向步骤1)配制好的反应体系中加入化合物的样品溶液或者菌株发酵液的样品溶液；

ii)阳性实验组：配制不含PheRS的步骤1)所述的反应体系；

iii)阴性对照组：向步骤1)所述反应体系中加入等量的i)中溶解化合物样品所用的溶剂DMSO或者等量的用于菌株发酵的发酵培养基；

3)将步骤2)各反应组分别混合均匀，置于酶标仪内反应，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当步骤2)i)中的样品为化合物时，加入溶剂制成样品溶液，向反应体系中加入该样品溶液，使样品的终浓度为18-22μM，作为样品反应组。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当步骤2)i)中的样品为菌株发酵液时，取发酵液挥干后加入溶剂制成样品溶液，加入到反应体系中，作为样品反应组。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌株发酵液的生产方式为：从斜面上挑取0.5cm²菌株培养物种入盛有50ml发酵培养基的瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5g；麦芽膏10g；棉子饼粉10g；淀粉20g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 0.5g；(NH4)₂SO₄ 5g；CaCO₃ 3g；NaCl 1g加水至终体积1L，调pH至7.2。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5g；酵母膏5g；牛肉膏5g；大豆蛋白胨5g；黄豆饼粉10g；淀粉20g；玉米浆4g；CaCO₃ 4g；0.002％的CoCl₂溶液1ml，加水至终体积1L，调pH至7.2。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)为将步骤2)各反应组分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，在37℃下反应，以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min，根据结果，计算反应抑制率IR。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，按如下方式计算反应抑制率：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min；

然后按照抑制率公式

计算各孔的抑制率；

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量；

当样品为化合物时，抑制率大于50％的样品为阳性样品；当样品为菌株发酵液时，抑制率大于30％的样品为阳性样品。

Images