KR101239757B1

KR101239757B1 - 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 ｇｄ－ａ2와 알긴산 분해용 생촉매 및 이를 이용한 알긴산 올리고당의 제조 방법

Info

Publication number: KR101239757B1
Application number: KR1020120129173A
Authority: KR
Inventors: 이상헌; 서국화
Original assignee: 주식회사 지디
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2013-03-06

Abstract

본 발명은 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해하여 알긴산 저분자화물을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신규 미생물에 관한 것으로, 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)와, 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2 또는 그의 배양물 또는 상기 배양물의 농축물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 알긴산 분해용 생촉매, 및 이를 이용한 알긴산 올리고당의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)는 기존에 보고된 알긴산 분해능을 갖는 여타 미생물에 비하여 현저히 우수한 알긴산 분해능이 인정될 뿐만 아니라, 알긴산 올리고당을 경제적으로 대량 생산할 수 있으며, 알긴산을 저분자화하여 건강식품이나 의약품 등의 제조에 보다 효율적으로 이용할 수 있어 인류의 건강 및 질병 치료와 관련된 다양한 기능성을 갖는 고부가가치의 알긴산 올리고당을 제조할 수 있음은 물론, 해조류의 세포벽을 분해하여 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산 효율을 증대시킬 수 있어 다양한 산업분야에 응용될 수 있는 효과가 있다.

Description

알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 ＧＤ－Ａ2와 알긴산 분해용 생촉매 및 이를 이용한 알긴산 올리고당의 제조 방법{NOVEL PAENIBACILLUS LAUTUS GD-A2 PRODUCING BREAKING DOWN ALGINATE LYASE, BIOCATALYST FOR ALGINIC ACID AND METHOD FOR MANUFACTURING ALGINIC ACID OLIGOSACCARIDE BY USING THE SAME}

본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 및 알긴산 올리고당의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해하여 알긴산 저분자화물을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다.

일반적으로 알긴산(alginic acid)은 해초산이라고도 하고, 해조류의 세포벽을 구성하는 다당류로서, 2종의 우론산(uronic acid)의 중합체이며, 중합도 80, 분자량 1500 정도로서 묽은 황산으로 씻은 갈조를 묽은 알칼리성의 따뜻한 물에서 추출하여 그 추출액을 산성으로 만들면 생기는 침전물이다.

이러한 알긴산은 그 분자 속에 우론산의 카르복실기가 있으므로 산의 성질을 나타내고, 보통은 나트륨염으로 다룬다. 또한, 알긴산의 칼슘염은 물에 녹지 않으므로 혈액 속의 칼슘 이온과 반응하여 불용성 염을 만들고, 이것이 혈관을 막기 때문에 경구투여로는 독성이 없으나 혈액 속에 주사하면 해가 되는 물질로 알려져 있다.

알긴산은 1957년까지는 만뉴론산(mannuronic acid)만으로 되어 있다고 생각하였으나, 최근에 와서 글루론산(guluronic acid)도 알긴산의 구성성분인 것이 밝혀졌는데, 도 1에 도시된 바와 같이 그 구조는 만뉴론산과 글루론산이 β-1, 4 결합으로 수백개가 연결된 것이 있고, 또한 알긴산의 분자 중에는 만뉴론산만 또는 글루론산만이 길게 결합된 곳이 있으며, 만뉴론산과 글루론산의 존재량 비율은 해조의 종류에 따라 다르다.

그리고, 알긴산은 불용성이지만 나트륨염은 물에 잘 녹으며 점성도가 매우 높기 때문에 그 용도가 다양하고, 이러한 나트륨염은 잘게 부순 갈조를 바람에 건조시킨 것을 묽은 산 또는 알칼리로 처리하여 침강법, 공기부유법, 원심분리법 등에 의해 단백질, 섬유질 등의 불순물을 제거하고, 알코올을 사용하여 탈수, 건조시킨 후 분말로 만들어 직물풀, 수성도료, 에멀션화제로 사용하며, 섬유화하여 수술용 실로도 이용되며, 식품에서는 아이스크림, 잼, 마요네즈 등의 점성도를 증가시키는 데 이용한다.

더불어, 보통 포유동물에는 알긴산을 분해하는 효소가 없으므로 알긴산을 그 자체로 이용할 수 없기 때문에 알긴산은 생체 내에서 이용될 수 있도록 중합도를 낮추기 위해 저분자화되어야 하는 바, 이러한 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당은 지방축적 억제 및 지방대사 촉진에 의한 항비만 효과 및 IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인의 분비 촉진을 통한 면역기능강화의 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

알긴산은 콜레스테롤 농도를 감소시키고, 지방세포분화억제와 세포 내 지방세포유전인자 단백질인 렙틴(leptin)의 함량을 감소시키는 효과가 있는 것으로 보고되는 등 약학적 효능 또한 우수한 것으로 알려져 있다.

아울러, 화석연료 연소에 의한 환경오염과 원유 등 지하자원의 고갈로 인하여 재생 가능한 에너지에 대한 관심이 고조되고 있고, 최근 자연계의 식물을 이용한 바이오에너지 생산 관련 연구들이 주목받고 있다.

특히, 옥수수 등 식량자원을 이용한 바이오에너지 생산의 문제점을 극복하기 위한 대안으로 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산과 관련된 연구가 주목을 받고 있지만, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산을 위해서는 해조류의 세포벽을 구성하는 알긴산을 쉽게 분해하는 분해능이 우수한 알긴산 분해효소에 대한 개발이 요구된다.

그 동안 여러 연구자들의 연구에 의하여 만뉴론산과 글루론산의 중합으로 되어 있는 거대분자 알긴산을 폴리만뉴론산(polymannuronate)과 폴리글루론산(polyguluronate)으로 저분자화하면 그 기능이 월등히 높게 나타나는 것으로 보고되었고, 그 방법으로서 첫째 고온고압, 고압 혹은 방사선으로 연화시킨 뒤 분리하는 방법과, 둘째 산과 알칼리 처리를 이용하는 방법이 있으나, 해조류에서 유래하는 탄수화물 대부분이 산이나 알칼리에 비교적 안정하여 알긴산의 분해가 쉽지 않고, 공정상 과도한 산 처리로 인하여 내산성 장치가 요구되며, 또한 중화시켜 배출시켜야 하므로 다량의 약품이 소모되어 과다한 비용 및 환경 오염 등의 문제가 있으므로, 알긴산을 물리·화학적으로 분해하는 방법보다는 효소를 이용한 효소적 분해 방법에 대한 관심이 증대되고 있다.

알긴산을 분해하는 알긴산 분해효소(alginate lyase)는 그 분해 기전이 명확하게 밝혀져 있지는 아니하나, β-elimination 반응에 의한 알긴산 분해반응을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 알긴산 분해효소는 pM-block 또는 pG-block에 작용하여 주로 어떤 위치를 분해하느냐에 따라 분류되고, 한 종류는 만뉴로네이트와 만뉴로네이트 사이의 β-1,4 당결합을 분해하는 알긴산 분해효소이고, 다른 한 종류는 글루로네이트와 글루로네이트 사이의 α-1,4 당결합을 분해하는 알긴산 분해효소이다.

현재 이러한 알긴산 분해효소를 생산하는 것으로 알려진 미생물로는 Pseudomonas aeruginosa(Franklin et al., J. Bacteriol., 186: 4759-4773; 2004), Streptomyces sp.(Cao et al., J. Agric. Food Chem., 55: 5113-5117; 2007), Bacillus sp. ATB-1015(Nakagawa et al., J. Appl. Microbiol., 84: 328-335), Alteromonas sp. strain no. 272(Iwamoto et al., Biosci Biotechnol Biochem., 65: 133-142; 2001)이 알려져 있다.

이와 같이, 최근에 알긴산 분해효소를 이용한 분해 방법으로서 미생물 및 효소를 이용하는 방법이 알려져 있으나, 알긴산 분해효소를 경제적으로 대량 생산해서 알긴산을 저분자화하여 식품이나 의약품 등의 제조에 보다 효율적으로 이용할 수 있는 미생물 및 알긴산 분해효소에 대한 요구가 지속적으로 존재하고 있다.

본 발명은 상술한 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로, 기존에 보고된 알긴산 분해능을 갖는 여타 미생물에 비하여 현저히 우수한 알긴산 분해능이 인정될 뿐만 아니라, 알긴산 올리고당을 경제적으로 대량 생산할 수 있으며, 알긴산을 저분자화하여 건강식품이나 의약품 등의 제조에 보다 효율적으로 이용할 수 있어 인류의 건강 및 질병 치료와 관련된 다양한 기능성을 갖는 고부가가치의 알긴산 올리고당을 제조할 수 있음은 물론, 해조류의 세포벽을 분해하여 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산 효율을 증대시킬 수 있어 다양한 산업분야에 응용될 수 있는 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)의 제공을 그 목적을 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)를 제공한다.

그리고, 본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양배지에서 배양한 배양물 또는 상기 배양물의 농축물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 알긴산 분해용 생촉매를 제공한다.

이때, 상기 배양물은 균체가 제거된 것에도 그 특징이 있다.

게다가, 상기 배양물의 배양은 배양배지에 질소원으로서 효모추출물과 펩톤 중 1개 이상을 선택하여 첨가하는 것에도 그 특징이 있다.

뿐만 아니라, 상기 효모추출물은 균주의 증식을 위해 먼저 배양배지에 첨가되고, 상기 펩톤은 균주의 증식 이후에 생촉매로 이용될 배양배지에 첨가하는 것에도 그 특징이 있다.

더불어, 상기 배양물의 배양은 배양배지에 알긴산 나트륨이 0.1%(w/v) 내지 1.5%(w/v)의 범위로 첨가되고, NaCl이 2.0%(w/v) 이하(0을 제외함)로 첨가되는 것에도 그 특징이 있다.

나아가, 상기 배양물의 배양은 반응온도가 20℃ 내지 60℃의 범위이고, 배양시간은 36시간 이상이며, 반응 pH는 4 내지 8의 범위에서 수행되는 것에도 그 특징이 있다.

그리고, 본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양배지에서 배양하는 배양 단계; 상기 배양 후 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물을 해조류 또는 알긴산과 반응시켜 알긴산 올리고당을 제조하는 단계;를 포함하는 알긴산 올리고당의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양배지에서 배양하는 배양 단계; 상기 배양 후 배양물을 수득하는 수득 단계; 상기 배양물로부터 균체를 제거하여 알긴산 분해효소를 추출한 후 정제하는 추출 및 정제 단계; 및 상기 알긴산 분해효소를 해조류 또는 알긴산과 반응시켜 알긴산 올리고당을 제조하는 단계;를 포함하는 알긴산 올리고당의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)는 기존에 보고된 알긴산 분해능을 갖는 여타 미생물에 비하여 현저히 우수한 알긴산 분해능이 인정될 뿐만 아니라, 알긴산 올리고당을 경제적으로 대량 생산할 수 있으며, 알긴산을 저분자화하여 건강식품이나 의약품 등의 제조에 보다 효율적으로 이용할 수 있어 인류의 건강 및 질병 치료와 관련된 다양한 기능성을 갖는 고부가가치의 알긴산 올리고당을 제조할 수 있음은 물론, 해조류의 세포벽을 분해하여 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산 효율을 증대시킬 수 있어 다양한 산업분야에 응용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 알긴산의 구조식.
도 2는 알긴산 분해능이 우수한 균주로 최종 선정된 균주 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양 콜로니 사진.
도 3은 본 발명의 페니바실러스 라우투스 ＧＤ－Ａ2(기탁번호 KFCC 11538P)의 16S rRNA 유전자 전염기서열 1,368 bp 분석결과.
도 4a 및 도 4b는 바실러스 서브틸리스 DSM10(T) AJ276351과 GDYA-1의 유전자의 상동성을 비교한 도면.
도 5는 본 발명의 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 ＧＤ－Ａ2(기탁번호 KFCC 11538P)의 계통학적 위치를 나타낸 계통도.
도 6은 페니바실러스 라우투스 ＧＤ－Ａ2(기탁번호 KFCC 11538P)의 균체 지방산 조성 분석 결과를 나타낸 도면.
도 7은 배양배지의 질소원에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 증식능을 나타낸 그래프.
도 8은 배양배지의 질소원에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 9는 배양배지의 질소원의 혼합 배양에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 증식능을 나타낸 그래프.
도 10은 배양배지의 배양시간에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 11은 배양배지의 알긴산 함유농도에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 증식능을 나타낸 그래프.
도 12는 배양배지의 알긴산 함유농도에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 13은 배양배지의 NaCl 함유농도에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 증식능을 나타낸 그래프.
도 14는 배양배지의 NaCl 함유농도에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 15는 배양배지의 반응온도에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 16은 배양배지의 반응 pH에 따른 페니바실러스 라우투스 GD-A2 균주의 알긴산 분해효소 상대 활성을 나타낸 그래프.
도 17은 식첨용 알긴산 나트륨 수용액에 페니바실러스 라우투스 GD-A2 배양액의 원심분리 후 수득된 상등액을 처리한 후 알긴산 올리고당의 생성을 확인하는 TLC 사진.

본 발명자들은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물을 분리 및 동정하고, 이러한 신규 미생물을 이용하여 알긴산을 저분자화하기 위하여 연구와 노력을 거듭한 결과, 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2(기탁번호 KFCC 11538P)를 분리하였고, 상기 신규 미생물이 생산하는 알긴산 분해효소를 이용하면 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 가수분해함으로써 알긴산 저분자화물을 경제적으로 대량 생산할 수 있으며, 알긴산을 저분자화하여 식품이나 의약품 등의 제조에 보다 효율적으로 이용할 수 있는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명에 대하여 실시예를 중심으로 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재 범위에 한정되는 것은 아니며, 본 발명은 다양한 형태로 구현될 수 있다.

본 발명에 따른 알긴산 분해 신규 미생물에 관한 균주 탐색은 2단계로 진행되었는 바, 1차로 전남 광양군의 갯벌에서 채취한 시료로부터 알긴산 분해능을 갖는 균주를 분리하고, 2차로 1차 선별된 각 균주의 알긴산 분해능을 검토 및 분석하여 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하는 방법으로 수행하였다.

또한, 상기 탐색 과정을 통하여, 알긴산 분해능이 가장 우수한 것으로 선별된 균주는 16S rDNA 염기서열 분석결과, 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus GD-A2)로 동정되었고, 2012년 8월 21일자로 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections) 부설 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 KFCC 11538P의 기탁번호로 기탁하였다.

그리고, 동정된 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양 조건에 따른 생육 정도인 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하기 위하여, 페니바실러스 라우투스 GD-A2을 배양하였고, 배양을 통해 확인하고자 하는 것에 따라 질소원(효모추출물(yeast extract), 펩톤, 분리대두단백, 요소(urea) 및 (NH₄)₂SO₄), 알긴산 나트륨 및 NaCl의 첨가 여부 또는 함량을 조절하였다.

여기서, 상기 효모추출물은 천연 첨가물로서 효모 세포의 성분인 아미노산, 펩타이드, 탄수화물 및 염류와 같은 수용성 성분으로 이루어져 있고, 식용 효모에 식용이 가능한 효소류를 첨가하여 식용 효모의 폴레펩타이드를 가수분해하는 방법으로 제조하며, 추가로 염류를 첨가할 수 있다.

상기 펩톤은 산·알칼리 또는 단백질 분해효소나 펩티다아제에 의해 분해된 분해산물인 유도단백질로서 단백질의 펩신에 의한 분해산물을 포함하고, 단백질 분해산물 중 프로테오스보다 저분자이며, 수용성이고 열에 응고되지 않는 성질을 갖는다.

즉, 균주의 배양배지와 관련하여 질소원에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 배지 조성을 확인하고, 배양시간에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 배양시간을 확인하였으며, 알긴산 농도 및 NaCl 농도에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 알긴산 함량 및 최적 NaCl 함량을 확인하였다. 또한, 반응온도 및 반응 pH에 따른 효소 활성을 확인하여 최적으로 반응하는 반응 온도 및 반응 pH를 확인하였다.

더불어, 본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2 또는 그의 배양물 또는 상기 배양물의 농축물 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 알긴산 분해용 생촉매(biocatalyst)를 포함한다.

이때, 상기 배양물은 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양하여 얻어진 배양배지를 의미하고, 이는 균주가 포함되어 있는 배양배지 또는 균체를 제거한 무세포 배양배지일 수 있으며, 주로 액상의 배양배지에 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양한 후 얻어진 배양배지일 수 있으나, 그 성상이 액상에 한정되는 것은 아니다.

여기서, 상기 배양배지는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위한 통상의 배지일 수 있고, 바람직하게는 효모추출물이나 펩톤이 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 효모추출물과 펩톤이 함께 포함될 수 있다.

더불어, 상기 배양배지에는 알긴산이 첨가될 수 있고, 상기 알긴산의 함량은 전체 배지 부피 대비 함량을 기준으로 0.1%(w/v) 내지 1.25%(w/v), 바람직하게는 0.3%(w/v) 내지 1.15%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.5%(w/v) 내지 1.0%(w/v)일 수 있다.

아울러, 상기 배양배지의 NaCl의 함량은 전체 배지 부피 대비 함량을 기준으로 0.75%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 바람직하게는 0.75%(w/v) 내지 1.75%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.75%(w/v) 내지 1.0%(w/v)일 수 있다.

또한, 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양하여 얻어진 배양물을 농축한 농축물을 유효성분으로 포함할 수도 있다.

그리고, 이러한 유효성분은 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 알긴산 올리고당의 제조 방법은 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양배지에서 배양하는 배양 단계(S10)를 수행한다.

그리고, 상기 S10 단계의 수행 후에 상기 배양 후 배양물을 수득하는 수득 단계(S20)를 수행하고, 상기 배양물로부터 균체를 제거하여 알긴산 분해효소를 추출한 후 정제하는 추출 및 정제 단계(S30)를 수행한다.

이때, 상기 S30 단계는 상기 배양물로부터 균체를 파괴하여 제거하고, 무세포 추출액인 알긴산 분해효소를 추출하는 바, 알긴산 분해효소의 실활 및 변성을 방지하기 위하여 저온에서 실시하는 것이 바람직하다.

그 방법으로는 기계적 마쇄법, 초음파 마쇄법, 자기 소화법, Lysozyme 처리법 및 동결융해법 등이 있다.

그리고, 상기 배양물로부터 균체가 제거된 무세포 추출액에는 균체의 핵산이 함유되어 있으므로 정제 과정을 통하여 핵산을 제거한다.

그 방법으로는 염석과 투석, 유기 용매에 의한 침전, 흡착, 이온교환 크로마토그래피, 겔여과, 결정화 등이 있다.

나아가, 상기 S20 단계 및 S30 단계의 수행 후에 상기 알긴산 분해효소를 해조류 또는 알긴산과 반응시켜 알긴산 올리고당을 제조하는 단계를 수행하여 최종적으로 알긴산 저분자화물인 알긴산 올리고당을 제조하는 것이다.

[ 실시예 1] 알긴산 분해 신규 미생물의 분리

먼저 알긴산을 분해할 수 있는 미생물을 분리하기 위하여 전라남도 영광군의 해안에서 갯벌을 시료로 채취하였고, 채취한 시료는 멸균된 희석액(NaCl 2.5g, KH₂PO₄ 0.1g, FeSO₄·7H₂O 0.05g, KCl 0.05g, NH₄Cl 0.1g, 증류수 1L, pH 6.5)을 이용하여 연속 희석하는 방법으로 1,000배 희석하여 희석액을 제조하였는데, 상기 희석액 0.1mL를 다층평판배지 위에 도말하여 알긴산 분해능을 확인하는 방법으로 수행하였다.

이때, 상기 다층평판배지는 하층배지와 상층배지의 2층으로 구성되고, 상기 하층배지는 전체 배지 조성물 부피 대비 각 성분이 NaCl 2.5%(w/v), KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NH₄Cl 0.1%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v), pH 7이었고, 상기 상층배지는 전체 배지 조성물 부피 대비 알긴산 나트륨(sodium alginate) 1.0%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v), pH 6.5로 하였다.

여기서, 연속 희석으로 1,000배 희석된 시료 0.1mL를 상기 다층평판배지 위에 도말한 후 25℃에서 3일간 배양하였고, 형성된 세균 균체(colony)들 중에서 군체 크기가 1mm 이상인 균주들을 백금이를 이용하여 채취하였으며, 새로운 다층평판배지 위에 도말하는 것을 수 차례 반복하여 분리하는 방법으로 균주를 순수 분리하였다.

[ 실시예 2] 분리 균주의 알긴산 분해능 확인

순수 분리된 균주들로부터 알긴산 분해능이 가장 우수한 균주를 분리하였는데, 알긴산 분해능의 확인은 plate assay법과 DNS법으로 수행하였다.

즉, 순수 분리된 각 균주를 PYS 배지(peptone 0.5%(w/v), 효모추출물 0.3%(w/v), 알긴산 나트륨 0.5%(w/v), NaCl 1.0%(w/v), pH 6.5)에 접종하고, 30℃에서 180rpm의 조건으로 48시간 동안 진탕 배양한 후에 알긴산 분해능의 1차적 확인은 plate assay로 하였다.

Plate assay는 PS 한천배지(peptone 0.5%(w/v), 알긴산 나트륨 1.0%(w/v), agar 1.5%(w/v))에 진탕 배양한 균주 30μL를 점적하고, 25℃에서 2일간 정치 배양한 후 균주가 성장한 배지에 10% CPC(cetylpyridinium chloride monohydrate)를 배지가 잠길 정도로 투여하였고, 10분 후 알긴산 분해효소의 활성을 확인하였으며, 그 결과로 균체로부터 분리된 15종의 균주가 1차 우수 균주로 선정되었다.

[ 실시예 3] 분리 균주의 알긴산 분해능 측정

알긴산 분해효소의 활성이 확인되어 선정된 1차 우수 균주를 PYS 배지(peptone 0.5%(w/v), 효모추출물 0.3%(w/v), 알긴산 나트륨 0.5%(w/v), NaCl 1.0%(w/v), pH 6.5)에 접종하여 30℃에서 180rpm의 조건으로 진탕 배양하면서 시간대별로 환원당 생성능을 측정하여 분석하였다.

효소 반응의 산물인 환원당 측정에는 DNS 법을 이용하였고, 그 실험방법은 다음과 같이 수행하였다.

먼저, 진탕 배양한 배양액을 14,000×g와 4℃의 조건에서 5분간 원심분리한 후 분리된 상등액을 수득하였고, 수득된 상등액을 조효소액으로 사용하였으며, 알긴산 나트륨 1.0%가 포함된 기질용액 1.0mL에 상기 조효소액 500μL를 혼합한 후, 항온조에서 30℃에서 180rpm의 조건으로 30분 동안 반응시킨 다음, 그 반응액을 14,000×g와 4℃의 조건에서 5분간 원심분리하였고, 분리된 상등액 500μL에 DNS 용액 2mL를 가한 후 10분간 가열하였으며, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

Mannuronic acid를 이용하여 작성한 표준 검량선을 이용하여 생성된 환원당을 정량하였고, 환원당 생성능을 알긴산 분해효소 활성에 비례하는 것으로 간주하였다.

확인 결과, 가장 환원당 생성능이 우수한 균주 즉, 알긴산 분해능이 우수한 균주로 GD-A2 균주가 최종적으로 선정되었고, 이를 도 2에 나타내었다.

[ 실시예 4] 알긴산 분해 신규 미생물 GD -A2의 동정

(1)선별된 길항 미생물의 염기서열 분석

선별된 길항 미생물에 대한 균주 동정을 16S rDNA 염기서열 분석법 (sequencing)을 이용하여 실시하였다. 분리된 균주의 16S 염색체 DNA 서열분석 (ribosomal DNA sequencing)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

먼저 분리된 균주를 Nutrient Broth Aga r(Difco) 배지에 접종하고 28℃에서 2일간 배양한 후에 Benzyl chloride법을 변형한 방법을 이용하여 염색체 DNA를 추출하였고, 16S rRNA 서열분석(sequencing)에 사용되는 프라이머 (primer)인 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 사용하여 아래의 조건으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하였다.

PCR 조건

그리고, 증폭된 16S rDNA의 PCR Product Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하고, 정제된 1368 bp의 16S 염색체 DNA를 Genetic analyzer 310A (Applied Biosystems)을 사용하여 염기서열을 분석하였으며, 16S rDNA 전염기서열 (1368 bp)의 분석 결과는 도 3에 나타내었다.

또한, BLASTIN 프로그램을 이용하여 GENEBANK와 RDPⅡ (Ribosomal Database Project Ⅱ)의 염색체 RNA 서열 (ribosome RNA sequencing)과 비교하여 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이 상동성 검색을 수행하였다.

(2) 선별된 길항 미생물의 지방산 조성 분석

고등생물의 경우에는 균체 지방산 조성이 단순하고 동일한 성분을 갖기 때문에 분류지표로 활용하기 어렵지만, 미생물의 경우에는 균체 지방산 조성이 다양하여 화학 분류학적인 측면에서 유용한 정보로 사용되고 있다.

먼저 분리된 균주를 TSA (Trypticase Soy Broth Agar, Difco) 배지에 접종한 후에 28℃에서 3일간 배양하였고, 균체 50mg (wet weight)을 Ikemoto & Miyagawa 방법에 의하여 균체 지방산 methyl ester화 및 추출을 수행하였다.

그리고, Microbial Identification System(MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA)을 이용하여 6890N Gas Chromatograph(Agilent Technologies)로 분석하였고, 그 분석결과는 도 6에 나타내었다.

(3) 선별된 길항 미생물의 균주 동정 결과

선별된 길항 미생물의 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통학적인 분석결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 페니바실러스(Paenibacillus) 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서, Paenibacillus lautus JCM 9073^T(AB073188)와 99.56%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다.

따라서, 선별된 균주는 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus)로 동정되었고, 본 발명의 알긴산 분해 신규 미생물을 페니바실러스 라우투스 GD-A2 (Paenibacillus lautus GD-A2)로 명명하였으며, 2012년 8월 21일자로 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections) 부설 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 KFCC 11538P의 기탁번호로 기탁하였다.

[ 실시예 5] 페니바실러스 라우투스 GD -A2 생산 알긴산 분해효소의 특성

(1) 실험조건

동정된 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양 조건에 따른 생육 정도, 즉 균주 증식능 및 페니바실러스 라우투스 GD-A2가 생산하는 알긴산 분해효소의 배양 조건에 따른 효소 활성을 확인하기 위하여, 페니바실러스 라우투스 GD-A2을 배양하였다. 배양을 위한 배양배지의 조성은 기본적으로 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v)의 함량으로 구성되고, 배양을 통해 확인하고자 하는 것에 따라 질소원(효모추출물, 펩톤, 분리대두단백, 요소(urea) 및 (NH₄)₂SO₄), 알긴산 나트륨 및 NaCl의 첨가 여부 또는 함량을 조절하였다.

구체적으로, 균주의 배양배지와 관련하여 질소원에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 배지 조성을 확인하고, 배양시간에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 배양시간을 확인하였으며, 알긴산 농도 및 NaCl 농도에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여 최적 알긴산 함량 및 최적 NaCl 함량을 확인하였다. 또한, 반응 온도 및 반응 pH에 따른 효소 활성을 확인하여 최적의 반응 온도 및 반응 pH를 확인하였다. 하기 실험은 모두 각각 3번씩 수행하여, 각 결과의 평균값을 이용하였다.

(2) 배양배지의 질소원에 따른 페니바실러스 라우투스 GD -A2의 균주 증식능 및 알긴산 분해능의 확인

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v) 및 KCl 0.05%(w/v)의 함량으로 구성된 기본 배지 조성에 NaCl 1.5%(w/v) 및 알긴산 나트륨 1.0%(w/v)와 질소원이 첨가된 배지(pH 6.5)에 각각 접종하고 배양하였다.

질소원으로는 각각 효모추출물 0.3%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v), 분리대두단백 0.5%(w/v), 요소 0.5%(w/v) 및 (NH₄)₂SO₄ 0.5%(w/v)를 첨가하였다.

그리고, 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양은 항온조를 이용하여 30℃에서 180 rpm의 조건으로 2일간 진탕 배양하는 방법으로 수행하였다.

균주 증식능의 측정은 600nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하여 도 7에 나타내었고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100%로 하여 상대 활성(Relative activity(%))으로 도 8에 나타내었다.

그 결과, 균주의 증식능은 효모추출물이 현저하게 우수하였고, 따라서 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양을 위한 최적 질소원은 효모추출물인 것으로 확인되었다.

또한, 효소 활성과 관련된 알긴산 분해능의 경우, 펩톤이 가장 우수하였고, 효모추출물도 펩톤에 비하여 다소 낮으나 펩톤과 유사한 정도의 효소 활성이 확인되었으며, 다른 무기물 질소원들의 경우에는 분해활성이 상대적으로 낮은 것으로 확인되었다.

그렇다면, 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 이용한 반응액 즉, 생촉매를 제조하는 과정에서, 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 균주 증식을 위해서는 배양배지에 질소원으로 효모추출물을 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 균주 증식 이후에 최종적인 생촉매로 이용될 배양배지에는 질소원으로 펩톤을 첨가하는 것이 바람직한 것으로 평가되었다.

(3) 배양시간에 따른 페니바실러스 라우투스 GD -A2의 균주 증식능 및 알긴산 분해능의 확인

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NaCl 1.5%(w/v) 및 알긴산 나트륨 1.0%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에, 질소원으로 펩톤 0.5%(w/v) 및 펩톤 0.5%(w/v)과 효모추출물 0.3%(w/v)를 각각 첨가한 배지(pH 6.5)에 접종하여 배양하였다.

페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양은 항온조를 이용하여 30℃에서 180 rpm의 조건으로 2일간 진탕 배양하는 방법으로 수행하였다.

균주 증식능의 측정은 600nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하여 도 9에 나타내었고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100 %로 하여 상대 활성(Relative activity(%))으로 도 10에 나타내었다.

균주의 증식능 및 알긴산 분해능과 관련하여, 펩톤과 알긴산 나트륨만을 첨가한 군(PS)에 비하여, 펩톤과 효모추출물 모두를 첨가한 군(PSY)이 우수한 것으로 확인되어, 배지에 질소원으로 펩톤 및 효모추출물을 함께 첨가하는 것이 바람직한 것으로 평가되었다. 이러한 결과는 미생물의 증식단계에서 효모추출물이 첨가에 의해 미생물의 증식이 원활하게 이루어지기 때문인 것으로 해석되었다.

또한, 배양시간과 관련하여, 균주의 증식은 접종 후 2일까지는 현저하게 상승하였으나, 3일째에는 다소 감소하는 것으로 확인되어, 최적 배양시간은 2일인 것으로 확인되었다. 또한, 알긴산 분해능과 관련하여, 2일째에 최고의 활성을 나타내었고, 그 이후에도 활성 변화는 많이 일어나지 않고 유지되었다. 또한, 펩톤만을 첨가한 군에서는 배양 1일째에 비하여 배양 2일째 균체수는 감소하였으나, 활성은 현저하게 상승되는 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터, 기존 보고된 다른 균주의 경우 알긴산 분해 활성의 최대치가 144시간 배양한 시점이었던 반면에, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2는 짧은 시간 배양한 경우에도 균체 증식 및 알긴산 분해능의 향상이 이루어져 그 활성이 유지되므로, 다양한 산업분야에 응용할 수 있을 것으로 예상되었다.

더불어, 상기 결과로부터 균체 증식율 및 알긴산 분해능의 측면에서 펩톤과 효모추출물 모두를 첨가한 군(PSY)에서 2일까지 배양하는 것이 가장 바람직할 것으로 예상되었다.

(4) 알긴산 함량에 따른 페니바실러스 라우투스 GD -A2의 균주 증식능 및 알긴산 분해능의 확인

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NaCl 1.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에 알긴산 나트륨의 함량을 조절하여 첨가한 배지(pH 6.5)에 접종하여 배양하였다.

균주 증식능의 측정은 600nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하여 도 11에 나타내었고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100%로 하여, 상대 활성(Relative activity(%))로 도 12에 나타내었다.

상기에 나타낸 바와 같이, 균체의 증식능 및 알긴산 분해능과 관련하여, 알긴산 나트륨의 농도가 0.1%(w/v) 이상인 경우에 균체 증식이 원활한 것으로 확인되었다. 또한, 알긴산 분해능과 관련하여 알긴산 농도가 1.0%(w/v)인 경우에까지 점진적으로 증가하여, 알긴산 농도가 0.5%(w/v)인 것이 최적인 것으로 확인되었고, 알긴산 농도가 1.5%(w/v)를 초과하는 경우에는 오히려 활성이 감소되는 것으로 확인되었다.

더불어, 알긴산이 전혀 첨가되지 않은 경우에도 일정 정도의 활성을 보여, 알긴산이 첨가되지 않은 배지에서 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 배양하는 경우에도 일정 정도의 알긴산 분해효소는 발현되는 것으로 확인되었다. 또한, 효소 활성을 균체 성장 정도로 나누어 단위 균체당 효소 활성을 비교한 경우에도 상기 알긴산 농도가 0.5%(w/v)인 경우에 효소 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

(5) NaCl 함량에 따른 페니바실러스 라우투스 GD -A2의 균주 증식능 및 알긴산 분해능의 확인

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), 알긴산 나트륨 1.0%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모추출물0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에 NaCl의 함량을 0%(w/v)에서 3%(w/v)까지 조절하여 첨가한 배지(pH 6.5)에 접종하여 배양하였다.

균주 증식능의 측정은 600nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하여 도 13에 나타내었고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였으며, 최적 조건의 활성을 100%로 하여, 상대 활성(Relative activity(%))로 도 14에 나타내었다.

또한, 균체당 알긴산 분해능을 확인하기 위하여, 상기 측정된 환원당 생성량을 OD600값으로 나누었다.

균체의 증식능과 관련하여, NaCl 함량이 1.0%(w/v)일 때 최적인 것으로 확인되었고, 0.5(w/v) 및 1.5%(w/v) 일 때도 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 알긴산 분해능과 관련하여, NaCl 함량이 1.0%(w/v)인 경우에 생성된 환원당 량 및 단위 균체당 효소 활성(Reduced sugar per Biomass)이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양을 통한 생촉매의 제조를 위한 최적 NaCl함량은 1.0%(w/v)인 것으로 확인되었다.

(6) 페니바실러스 라우투스 GD -A2이 생산하는 알긴산 분해효소의 온도에 따른 알긴산 분해능 측정

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), 알긴산 나트륨 0.5%(w/v), NaCl 1.0%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다.

페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양은 항온조를 이용하여 25℃에서 150 rpm의 조건으로 2일간 진탕 배양하는 방법으로 수행하였다.

상기 반응온도를 20℃ 내지 60℃로 조절하면서 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였고, 최적 조건의 활성을 100%로 하여 상대 활성(Relative activity(%))로 도 15에 나타내었다.

상기 생촉매액의 알긴산 분해능은 40℃에서 최고치를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 이용하여 제조한 생촉매의 최적 반응온도는 40℃인 것으로 확인되었다.

(7) 페니바실러스 라우투스 GD -A2이 생산하는 알긴산 분해효소의 pH 에 따른 알긴산 분해능 측정

그리고, 상기 반응 pH를 3 내지 10으로 조절하면서 상기 실시예 3의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였고, 최적 조건의 활성을 100%로 하여 상대 활성(Relative activity(%))로 도 16에 나타내었다.

구체적으로, 상기 pH의 조절은 상기 반응액에 200mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 3 내지 pH 6), 40mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액(pH 6 내지 pH 8) 및 100 mM glycine-NaOH 완충용액(pH 8내지 pH 11)을 이용하였다.

상기 pH에 따른 알긴산 분해능은 pH 6.5에서 최고치를 나타내어 페니바실러스 라우투스 GD-A2이 생산하는 알긴산 분해효소의 최적 pH는 6.5인 것으로 확인되었다.

완충용액 종류에 따른 오차를 확인하기 위해, 재차 300 mM GTA 완충용액(3,3-dimehtylglutarid acid, Tris(hydrosymethyl) aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, pH 3 내지 pH 10)을 이용하여 측정한 결과에서도 동일한 결과가 확인되었다. 최적 pH인 pH 6.5를 기준으로 이보다 산성 또는 알카리성인 조건에서는 산성 또는 알카리성이 강해질수록 알긴산 분해능이 저하되는 것으로 확인되었다.

따라서, 페니바실러스 라우투스 GD-A2를 이용하여 제조한 생촉매의 최적 반응 pH는 pH 6.5인 것으로 확인되었다.

추가적으로, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2의 배양액으로부터 제조된 생촉매(배양액에서 균체를 제거한 상징액)를 이용하여, 전분, 카라기난, 펙틴 및 한천 등의 다당류에 대한 분해활성을 측정한 결과, 다른 다당류에 대해서는 분해활성이 나타나지 않고, 알긴산에 대해서만 분해활성이 나타나, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2가 생산하는 효소는 알긴산 분해효소인 것이 확인되었다.

[ 실시예 6] 페니바실러스 라우투스 GD -A2 배양물을 이용한 알긴산 올리고당의 제조

페니바실러스 라우투스 GD-A2를 KH₂PO₄ 0.1%(w/v), FeSO₄·7H₂O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), 알긴산 나트륨 0.5%(w/v), NaCl 1.0%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지에서 pH 7 및 30℃의 온도(배양조건은 30℃, 효소활성 최적 조건은 40℃)에서 180 rpm의 조건으로 2일간 진탕 배양하였고, 진탕 배양된 배양액을 8,000 rpm의 조건으로 30분간 원심 분리한 후 분리된 상등액을 수득하였다.

그리고, 0.1%로 희석시킨 식첨용 알긴산 나트륨 수용액에 분리된 상등액을 첨가하고, 40℃에서 인큐베이션하면서 시간대별로 생성된 알긴산 올리고당을 TLC에서 확인하였다.

이때, TLC의 표준 마커로 수크로오스 및 말토덱스트린을 사용하였고, 전개용매는 1-프로판올, 니트로메탄 및 물의 혼합액(5:3:2, v/v/v)이었다.

도 17은 식첨용 알긴산 나트륨 수용액에 페니바실러스 라우투스 GD-A2 배양액의 원심분리 후 수득된 상등액을 처리한 후 알긴산 올리고당의 생성을 확인하는 TLC 사진이고, 사진의 가장 좌측은 크기 마커이며, 그로부터 순서대로 분해 반응시간이 오래된 시료들로서 반응시간에 따라 다양한 형태의 알긴산 올리고당의 우수한 생성을 보여준다.

결국, 상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명인 페니바실러스 라우투스 GD-A2는 알긴산을 분해하여 알긴산 올리고당를 생산할 수 있는 알긴산 분해효소를 제조할 수 있으며, 페니바실러스 라우투스 GD-A2로부터 알긴산 분해효소를 생산하는 최적 조건 및 상기 알긴산 분해효소의 반응 최적 조건이 확인되었으므로, 상기 페니바실러스 라우투스 GD-A2는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업 및 바이오에너지 관련 산업을 포함한 다양한 산업분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) GD-A2 (기탁번호 KFCC 11538P).
알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) GD-A2 (기탁번호 KFCC 11538P)를 배양배지에서 배양한 배양물 또는 상기 배양물의 농축물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 알긴산 분해용 생촉매.
제 2항에 있어서,
상기 배양물은 균체가 제거된 것을 특징으로 하는 알긴산 분해용 생촉매.
제 2항에 있어서,
상기 배양물의 배양은 배양배지에 질소원으로서 효모추출물과 펩톤 중 1개 이상을 선택하여 첨가하는 것을 특징으로 하는 알긴산 분해용 생촉매.
제 4항에 있어서,
상기 효모추출물은 균주의 증식을 위해 먼저 배양배지에 첨가되고, 상기 펩톤은 균주의 증식 이후에 생촉매로 이용될 배양배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 알긴산 분해용 생촉매.
제 2항에 있어서,
상기 배양물의 배양은 배양배지에 알긴산 나트륨이 0.1%(w/v) 내지 1.5%(w/v)의 범위로 첨가되고, NaCl이 2.0%(w/v) 이하(0을 제외함)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 알긴산 분해용 생촉매.
제 2항에 있어서,
상기 배양물의 배양은 반응온도가 20℃ 내지 60℃의 범위이고, 배양시간은 36시간 이상이며, 반응 pH는 4 내지 8의 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 알긴산 분해용 생촉매.
알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) GD-A2 (기탁번호 KFCC 11538P)를 배양배지에서 배양하는 배양 단계;
상기 배양 후 배양물을 수득하는 단계; 및
상기 배양물을 해조류 또는 알긴산과 반응시켜 알긴산 올리고당을 제조하는 단계;를 포함하는 알긴산 올리고당의 제조 방법.
알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) GD-A2 (기탁번호 KFCC 11538P)를 배양배지에서 배양하는 배양 단계;
상기 배양 후 배양물을 수득하는 수득 단계;
상기 배양물로부터 균체를 제거하여 알긴산 분해효소를 추출한 후 정제하는 추출 및 정제 단계; 및
상기 알긴산 분해효소를 해조류 또는 알긴산과 반응시켜 알긴산 올리고당을 제조하는 단계;를 포함하는 알긴산 올리고당의 제조 방법.