CN102172498B - 一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用。其制备方法即将壳聚糖和明胶B混合后经过高压脉冲微胶囊成型仪滴入液氮快速冷冻成球，一次冻干后的微球用饱和的三聚磷酸盐-85%乙醇溶液交联固化后进行二次冻干，再将二次冻干所得的微球充分水化，加入交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰，用明胶A对微球进行修饰，水浴，避光反应后，洗去未反应的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰和明胶A，再进行三次冻干后即得到直径在300-800um,表面孔径50-200um的三维多孔壳聚糖/明胶微球,且微球表面与内部孔径相连通。本发明所得的三维多孔壳聚糖/明胶微球可用于体外培养出高密度、高活性的肝细胞。

Description

一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用

技术领域

   本发明涉及一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用。更具体的涉及利用明胶的大孔特性及明胶作为良好的细胞外基质的特性，结合微囊发生器-静电法、离子凝聚法和三次冻干法制备出一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及在肝细胞培养中的应用。

背景技术

壳聚糖是由甲壳素经过脱乙酰化反应得到的一种生物高分子，是迄今为止发现的自然界唯一带正电的碱性多糖，无毒，具有良好的生物相容性和生物可降解型，在食品、环保、农业、医药等方面都有广泛的应用。胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，明胶作为胶原的水解产物，主要由独特的氨基酸序列甘氨酸-脯氨酸-羧基脯氨酸组成，这些序列使得明胶可固定水分子形成螺旋结构。壳聚糖和明胶借助分子间氢键可以按照任意比例共混。利用明胶的大孔特性及明胶作为良好细胞外基质的特性，微囊发生器-静电法、离子凝聚法和冻干法相结合可制得符合要求的三维多孔壳聚糖/明胶微球，用于肝细胞的体外大量扩增，模拟肝细胞在体内的三维环境，重建肝细胞的极性，保持肝细胞的高活性，生物合成代谢功能。

用壳聚糖、明胶按照上述方法制备出了一种三维多孔壳聚糖/明胶微球，并且将其用于肝细胞培养。尽管国内外已有制备出微球的文章发表，但是所用的材料、制备微球的方法以及制得的微球与本发明都有很大的不同。首先是材料选择上，选择了壳聚糖和明胶作为制备微球的主要材料，尽管也有用壳聚糖或（和）明胶制备出微球的文章发表，但是采用的方法主要是乳化交联法（利用液体石蜡或者食用油作为油相，壳聚糖或（和）明胶或海藻酸钠等作为水相，搅拌，控制液体液滴的大小形成水包油或油包水悬浮液，加入戊二醛为主的交联剂反应成球、洗涤、干燥后得到微球，得到的微球多为实心微球，加入致孔剂后得到的微球也不是真正的多孔结构，而是内部独立的孔隙，不与外界相通，且乳化法得到的微球易粘连，而交联剂戊二醛本身有毒，也增加了一定的风险系数，目前乳化法制备出的微球主要用于微球药物缓释方面的研究）和凝聚/沉淀法（利用壳聚糖不溶于碱性溶液的特点或（和）明胶的两性特性，将壳聚糖或壳聚糖/明胶溶液滴入碱性溶液中，如NaOH、NaOH-甲醇等，通过离心、过滤对微球进行分离纯化，洗涤后得到微球，但是这种方法得到的微球表面只是皱缩形成凹槽，表面与内部不相通，即封闭孔）。尽管也有冻干法的文献报道，但是多为直接将溶液混合后倒入模具中直接冷冻冻干后制备膜状或圆柱状支架；或是将冻干的支架用NaOH、戊二醛等交联，但是由于冻干后的壳聚糖或（和）明胶材料空间结构发生改变，极易溶于水，交联后不能很好的保持原来的形状，故一般用于制备膜状支架用于皮肤组织工程或制备模具支架用于骨组织工程，未见有球形、直径在300-800um、表面孔径在50-200um、表面与内部孔径相通的、且越靠近微球内部孔径越大的三维多孔微球的报道。

本发明将壳聚糖/明胶B微球通过高压脉冲微胶囊成型仪直接滴入液氮中快速冷冻成球，通过调整壳聚糖、明胶的浓度及混合配比、注射器针孔的大小、注射器针尖与金属导线环距离、金属导线环与液氮罐口距离、高压脉冲微胶囊成型仪电压、频率、脉宽、便携式微量注射泵速度等控制壳聚糖/明胶B溶液液滴的大小来控制微球的初始大小，并在后续步骤中通过调整交联剂三聚磷酸盐、碳二亚胺/N-羟基琥珀酰的浓度及pH值，交联时间，冷冻的温度，三次冻干方式得到能保持球状形态的、扩大了孔径的、表面与内部孔径相通的、透明的，利于细胞黏附的微球。因此，在材料的选择、材料的浓度及配比、制备微球使用的方法（即控制微球大小的因素）、制备过程中两种交联剂的使用、交联剂的浓度、交联时间、冷冻的温度、冻干方式、三维多孔微球的应用方面等等均应是本发明所要保护的内容。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种三维多孔壳聚糖/明胶微球。

本发明的目的之二是提供上述的一种三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备方法。

本发明的目的之三是提供上述的一种三维多孔壳聚糖/明胶微球在肝细胞培养中的应用方法。

即本发明根据肝脏小叶的三维微观结构和肝细胞外基质的组成，依据仿生学原理，以生物相容性材料制备一种三维多孔微球，微球表面与内部相连通，使得肝细胞能均匀地黏附在微球表面及内部孔隙，模拟体内三维环境，重建细胞极性，达到体外大量扩增肝细胞的目的，制备高活性的肝细胞，发挥肝细胞功能，对生物人工肝(BAL)和肝细胞移植中细胞高密度、高活性、大规模培养提供一定的理论基础和实验依据，促进其在BAL的临床应用和发展。

本发明的技术方案

    通过微囊发生器-静电法、离子凝聚法和三次冻干法制得三维多孔壳聚糖/明胶微球。

上述的三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备方法，其制备过程的工艺流程示意图如图2所示，其具体包括以下步骤：

（1）、一次冻干微球的制备

将1.5%壳聚糖乙酸溶液和2%明胶B(取自牛皮肤，sigma公司)水溶液按体积比即1.5%壳聚糖乙酸溶液：2%明胶B水溶液为5:1相混合，吸入针孔大小为0.7mm的注射器中，注射器安装在便携式微量注射泵上，注射器针头末端连接高压脉冲微胶囊成型仪的正极，针头下方的金属导线环连接高压脉冲微胶囊成型仪的负极，导线环下方为液氮罐，依次打开高压脉冲微胶囊成型仪、便携式微量注射泵开关，在高压静电作用下使得形成的液滴滴入液氮中快速冷冻成球，如图1-1所示；

冷冻成球过程中控制注射器针尖与金属导线环距离0mm-5mm，金属导线环与液氮罐口距离5mm-10mm，设置高压脉冲微胶囊成型仪电压60，频率90，脉宽6，便携式微量注射泵速度为90mm/h；

成球后再进行冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24-48h后得到一次冻干的壳聚糖/明胶微球1；

上述的一次冻干后的微球1由于空间结构的改变，易溶于水，且明胶不溶于乙醇，故用85%乙醇振荡溶解三聚磷酸盐，形成饱和三聚磷酸盐（TPP）85%乙醇溶液对微球1进行交联（离子凝聚法），可以保持球状形态；交联时间控制在24-72小时，交联时间太短微球固化不完全，不易保持球状，溶胀率大，而交联时间太长，微球较坚硬，孔径会缩小，脆性大，溶胀率、吸水性均变小；

所述的明胶B取自牛皮肤,通过即碱法获得，且所述的明胶B分子链上具有更多的羧基，其等电点在pH=4.7～5;

（2）、二次冻干微球的制备

将步骤（1）制得的微球1用含有饱和三聚磷酸盐（TPP）85%的乙醇溶液，控制体系pH值在5-6，再交联固化24-72h后，终止交联反应，入-20℃冰箱过夜，次日上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24～48h后得到二次冻干的微球2，即利用明胶吸水强的特性制备出孔径较一次冻干后扩大了的大孔壳聚糖/明胶微球2；

一次冻干的壳聚糖/明胶微球1的量与饱和三聚磷酸盐（TPP）85%乙醇溶液的配比按微球1的量：与饱和三聚磷酸盐（TPP）85%乙醇溶液为0.01g：50ml；

（3）、三次冻干三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备

将步骤（2）制得的微球2充分水化，加入2%水溶性交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC/NHS）和2%明胶A(取自猪皮肤，sigma公司)，在38℃水浴、避光反应24～48h后，洗去未反应的EDC/NHS和明胶A，入-20℃冰箱过夜，次日进行第三次冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃冻干24-48h后即得到本发明的三维多孔壳聚糖/明胶微球3;

微球2充分水化即微球沉至试管底，所用的水量与微球的量无相关性；

微球2、碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC：NHS质量比=4:1）和明胶的配比，即按微球2的量：碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC：NHS质量比=4:1）水溶液体积：2%明胶A水溶液体积为0.01g：40ml：10ml;

所述的明胶A取自猪皮肤,通过酸法获得，所述的明胶A分子链含有较多的氨基，等电点在pH=7～9。

本发明的有益效果

本发明制得的三维多孔壳聚糖/明胶微球直径在300-800um,平均直径642.49um,表面孔径50-200um,微球表面与内部孔径相连通。利用明胶的大孔特性在不改变微球直径的前提下制备出了大孔微球，用明胶这种良好的细胞外基质修饰后的微球为肝细胞提供了高效的结合位点，可促进和指导肝细胞的黏附及黏附方向。通过调节注射器针孔的大小、注射器针尖与金属导线环距离、金属导线环与液氮罐口距离、高压脉冲微胶囊成型仪的参数（如电压、频率、脉宽）、便携式微量注射泵的速度、交联剂三聚磷酸盐及碳二亚胺/N-羟基琥珀酰的浓度、pH值、交联的时间，冷冻的温度，冻干的方式等可控制微球的大小和孔径。

另外，本发明所得的三维多孔壳聚糖/明胶微球，由于增加了比表面积，提高了细胞培养的密度，从而改善细胞的供氧和代谢产物的交换；细胞生长在多孔结构的微球表面孔隙内，减少了悬浮培养时剪切力对细胞的损伤；三维多孔的特性，使得肝细胞通过孔间隔模拟体内肝小叶的三维立体生长环境，重建细胞极性，维持肝细胞在体内时的形态及特异性功能，达到在体外培养出高密度、高活性的肝细胞。可用于对细胞数量及质量有高度要求的生物人工肝、肝细胞移植。

附图说明

图1是本发明在高压静电作用下制备微球的结构示意图（图中：1为便携式微量注射泵、2为注射器、3为壳聚糖/明胶混合液、4为注射器针头、5为金属导线环、6为液氮罐、7为高压脉冲微胶囊成型仪、8为高压脉冲微胶囊成型仪的正极、9为高压脉冲微胶囊成型仪的负极）；

图2是三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备过程的工艺流程示意图；

图3是一次冻干后的壳聚糖/明胶微球的扫描电镜图；

图4-1是三次冻干后的三维多孔壳聚糖/明胶微球的扫描电镜图；

图4-2是三次冻干后的三维多孔壳聚糖/明胶微球的扫描电镜图；

图5为光学显微镜下观察人肝癌细胞株HepG2在三维多孔壳聚糖/明胶微球上的生长状态图；

图6是荧光倒置显微镜下观察人肝癌细胞株HepG2在三维多孔壳聚糖/明胶微球上的生长状态图；

图7是人肝癌细胞株HepG2和三维多孔壳聚糖/明胶微球混合悬浮培养后的扫描电镜图；

图8是人肝癌细胞株HepG2和三维多孔壳聚糖/明胶微球混合悬浮培养后的透射电镜图；

图9、图10分别是人肝癌细胞株HepG2和三维多孔壳聚糖/明胶微球HE染色后在光学显微镜下40倍及100倍放大图；

图11是对照组（平面培养组k）与实验组（混合培养组g）实时荧光定量PCR白蛋白基因表达水平结果。

具体实施方式

    下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但并不限制本发明。

本发明所用的人肝癌细胞株HepG2取自上海中科院。

中黏度壳聚糖（取自蟹壳；分子量：40万；脱乙酰度：84%～89%）、明胶A (A型明胶，取自猪皮肤，粉末状，细胞培养级)、明胶B（B型明胶，取自牛皮肤）、碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC/NHS）购于sigma；

三聚磷酸盐（Alfa Aesar）；

含10%小牛血清的完全培养基（RP-1640）(Gibco)；

多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly (2-hydroxyethyl Methacrylate)，poly-HEMA）(sigma)；

吖啶橙（sigma)；

乙酸（冰醋酸，分析纯AR）; 

本发明所用的设备：

高压脉冲微胶囊成型仪（上海理工大学）；

便携式微量注射泵（Angel 5805型，上海安洁电子）；

真空冷冻干燥机（VIRTIS,BT3.3EL）；

纯水仪（Mili-Q50型）（Millipore）；

手术显微镜（TOPCON,MS-XY03）；

光学显微镜（配荧光）（OLYMPUS,IX71）；

不锈钢网（200目）（鼎国生物）；

扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM，PHILIPS XL30 FEG)；全自动生化分析仪（BECKMAN- UniCel DxC 800）；

TS-92万向脱色摇床(QILINBEIER,TS-92)。

实施例1

    一种三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备

（1）、一次冻干微球的制备

分别配制1.5%壳聚糖（用1%乙酸配制）和2%明胶B(用双蒸水配制)，混匀后，按体积比即1.5%壳聚糖乙酸溶液：2%明胶B水溶液为5:1相混合，去除气泡后吸入针头内径为0.7mm的5ml注射器中，接好微囊发生器-静电装置（如图1示），在高压静电环境下（电压U=60、频率F=90、脉宽PW=6:高压脉冲微胶囊成型仪，上海理工大学）滴入液氮中，待微球沉至液氮罐底后，将微球移出放入经液氮浸泡过的铁筛网上，上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，24-48小时后关闭冻干机取出，得到一次冻干后的壳聚糖/明胶微球1；

（2）、二次冻干微球的制备

将步骤（1）制得的微球用含有三聚磷酸盐（TPP）的85%乙醇溶液交联固化24-72小时后,控制pH值为5-6，去除上层的交联剂，加水充分洗涤，将微球移入培养皿中，尽可能地吸走多余水分，入-20℃冰箱过夜，次日上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，24-48小时后得到二次冻干后的微球2；

（3）、三次冻干新型三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备

将步骤（2）制得的微球充分水化，尽量吸净上层的液体，加入2%水溶性交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC/NHS）和2%明胶A（2%EDC/NHS:2%明胶A=4:1（v/v）），避光，38℃水浴中反应24-48小时后，加水洗去未反应的EDC/NHS和明胶A，移入培养皿中，尽量吸走多余水分，入-20℃冰箱过夜，次日上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，24-48小时后得到本发明的三维多孔壳聚糖/明胶微球。

图1是步骤（1）中在高压静电作用下制备微球的结构示意图。

图3是步骤（1）所得的一次冻干后的壳聚糖/明胶微球1的扫描电镜图，

微球直径在300-500um,其孔径为10um-45um。

图4-1是步骤（3）所得的三次冻干后的三维多孔壳聚糖/明胶微球的扫描

电镜图，微球直径在300-800um,其孔径为50um-200um。

图4-2是三次冻干后的三维多孔壳聚糖/明胶微球的扫描电镜图（图4-1放大图），孔径为151um。

从图3、图4-1、图4-2中可以看出三次冻干后微球的孔径较一次冻干后有

明显的扩大，即其孔径为一次冻干后的4.4倍～5倍。

应用实施例1

    一种三维多孔壳聚糖/明胶微球与人肝癌细胞株HepG2混合培养

（1）、人肝癌细胞株HepG2的复苏

从液氮罐中取出冻存管后，放入38℃水浴箱振荡，1分钟解冻，立即加入1ml 含10%小牛血清的完全培养基（RP-1640）（GIBCO）混匀，再缓慢加入9ml培养液，混合吹打后，离心（1000rpm/min,5min），弃去上清后，pellet中加入适量培养液，混匀后，接种至培养皿中。隔天换液除去未贴壁的细胞及代谢产物，传至2-3代后用于后续实验；

（2）、三维多孔壳聚糖/明胶微球的准备

将上述经三次冻干后所得的三维多孔壳聚糖/明胶微球充分水化(即微球沉至试管底提示水化完成)后，吸去水，加入75%乙醇消毒30min，用无菌双蒸水洗去乙醇，无菌微球中加培养液RP-1640浸泡备用；

培养液RP-1640的用量，即按三维多孔壳聚糖/明胶微球置于试管中所占体积：RP-1640培养液体积为1:5计算；

（3）、三维多孔壳聚糖/明胶微球与人肝癌细胞株HepG2混合培养

胰酶消化人肝癌细胞株HepG2，收集细胞，离心（1000rpm/min,5min），弃上清，pellet中加入5mlRP-1640培养液,计数，调整细胞浓度1×10⁵个/ml；在防贴壁处理过的12孔板（被覆poly-HEMA）中加入培养液浸泡后的三维多孔壳聚糖/明胶微球，铺满培养皿底部50%，尽量吸净培养液，每孔中加入细胞悬液1ml(细胞浓度1×10⁵个/ml，即细胞总数为1×10⁵个),于摇床上悬浮培养1小时，静止培养1小时，摇床上悬浮培养1小时（如此重复3次），每孔续加1ml新鲜培养液后低速（30-40rpm/min）悬浮培养，培养24小时后更换培养液，此后维持低速（30-40rpm/min）悬浮培养，每24小时换液，低速（30-40rpm/min）悬浮培养，7天时细胞密度为4.2×10⁵个，13天时细胞密度为2.8×10⁶个（而在平面培养条件下，12孔板贴壁培养，细胞起始浓度与实验悬浮培养组相同，第5天时细胞因生长空间不足，细胞开始堆积漂浮，继而细胞死亡）。

图5为光学显微镜下观察人肝癌细胞株HepG2在三维多孔壳聚糖/明胶微球上的生长状态图，从图中可以看出三维多孔壳聚糖/明胶微球呈透明球状，可见细胞在三维多孔壳聚糖/明胶微球上生长，细胞透亮呈球状，胞膜完整。

图6是荧光倒置显微镜下观察人肝癌细胞株HepG2在三维多孔壳聚糖/明胶微球上的生长状态图，从图中可以看出细胞经吖啶橙染色后呈球状，同时细胞染色后可间接显示出三维多孔壳聚糖/明胶微球的轮廓，微球呈球状，局部细胞形成球形聚集体。

图7（图7-1、7-2）是人肝癌细胞株HepG2和三维多孔壳聚糖/明胶微球混合悬浮培养后的扫描电镜图，从图中可以看出三维多孔壳聚糖/明胶微球的球形轮廓，局部可见微球的表面孔洞，细胞在微球表面聚集现象明显，细胞保持球状分布，向孔隙内部生长，细胞与细胞之间可见丰富的微绒毛（图7-2示）。

图8是人肝癌细胞株HepG2和三维多孔壳聚糖/明胶微球混合悬浮培养后的透射电镜图，图中可见与培养液接触的表面出现许多不规则的微绒毛，数量丰富，类似体内的肝窦面。肝细胞膜完整，细胞核呈类圆形，位于中央或略偏向某侧，核质较均匀，核膜清晰。胞质中线粒体多为卵圆形，有的呈长杆形，嵴较丰富。可见内质网较均匀地分布于胞质中。

图9及图10中光学显微镜下观察：HE染色下显示壳聚糖/明胶微球表面及内部呈网孔状结构，结构疏松，纤维束细小，排列较规则，内部腔隙可见相连通。HE染色结果提示：细胞可以在微球表面生长，并可进入内部生长。再次验证了我们所构建的三维多孔壳聚糖/明胶微球表面及内部相连通。

图11中对照组即平面培养组k，即不含三维多孔壳聚糖/明胶微球，单纯的人肝癌细胞株HepG2在培养皿底部贴壁生长；实验组即混合培养组g，即含有三维多孔壳聚糖/明胶微球，在经过防贴壁处理过的培养皿中与人肝癌细胞株HepG2混合悬浮培养。

分别进行三维多孔壳聚糖/明胶微球与人肝癌细胞株HepG2混合悬浮培养与平面培养，在不同时间段分别收集细胞，提取细胞RNA，实时荧光定量PCR对白蛋白（ALB）基因表达水平进行分析，发现培养24小时后，实验组（g-alb）ALB表达是对照组(k-alb)的3.36倍；混合培养72小时后，实验组ALB表达是对照组的1260.69倍；之后逐渐下降，但仍维持在较高水平，第6天时实验组ALB表达仍为对照组的36倍，且差异均有统计学意义。其结果见图9所示，说明三维多孔壳聚糖/明胶微球与人肝癌细胞株HepG2混合悬浮培养能重建肝细胞的极性，维持肝细胞在体内的三维环境，发挥肝细胞功能。

分别将所得培养细胞上清中ALT,LDH,尿素水平送全自动生化分析仪检测，结果显示对照组和实验组未有统计学差异，上清白蛋白（alb）ELISA结果也未显示两者有显著差异，究其原因，是因为三维多孔壳聚糖/明胶微球经过培养液浸泡后本身含水量就比较丰富，所以在后续的过程中难以精确控制培养液的总体积，因而造成从上清中检测ALT、LDH、尿素、alb不能准确反映实验组与对照组的差异；同时混合悬浮培养的优势在后期7-14天才表现出来，而平面培养条件下由于培养空间的限制只能进行7天以内的观察。

    以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）、一次冻干微球的制备

将1.5%壳聚糖乙酸溶液和2%明胶B水溶液按体积比，即1.5%壳聚糖乙酸溶液：2%明胶B水溶液为5:1相混合，吸入针孔大小为0.7mm的注射器中，利用高压静电原理经过高压脉冲微胶囊成型仪滴入液氮中快速冷冻成球；冷冻成球过程中控制针尖与金属导线环距离0mm-5mm，金属导线环与液氮罐口距5mm-10mm,设置高压脉冲微胶囊成型仪电压60，频率90，脉宽6，便携式微量注射泵速度为90mm/h；成球后再进行冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24-48h后得到一次冻干的壳聚糖/明胶微球1；所述的明胶B取自牛皮肤,通过即碱法获得，且所述的明胶B分子链上具有更多的羧基，其等电点在pH=4.7～5;

（2）、二次冻干微球的制备

将步骤（1）制得的微球1用含有饱和三聚磷酸盐（TPP）85%的乙醇溶液，控制体系pH为5-6，再交联固化24-72h后，终止交联反应，入-20℃冰箱过夜，次日上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24～48h后得到二次冻干的微球2；

（3）、三次冻干三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备

将步骤（2）制得的微球2充分水化，加入2%水溶性交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC/NHS）水溶液和2%明胶A水溶液，在38℃水浴、避光反应24-48h后，洗去未反应的EDC/NHS和明胶A，入-20℃冰箱过夜，次日进行第三次冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃冻干24-48h后即得到三维多孔壳聚糖/明胶微球3；所述的明胶A取自猪皮肤,通过酸法获得，所述的明胶A分子链含有较多的氨基，等电点在pH=7～9。

2.如权利要求1所述的一种多孔壳聚糖/明胶微球的制备方法，其特征在于步骤（2）中一次冻干的壳聚糖/明胶B微球1的量与饱和三聚磷酸盐（TPP）85%乙醇溶液的配比按微球1的量：饱和三聚磷酸盐（TPP）85%乙醇溶液为0.01g：50mL。

3.如权利要求1所述的一种三维多孔壳聚糖/明胶微球的制备方法，其特征在于步骤（3）中的微球2、碳二亚胺/N-羟基琥珀酰和明胶的配比，即按微球2的量：2%碳二亚胺/N-羟基琥珀酰水溶液体积：2%明胶A水溶液体积为0.01g：40mL：10mL；其中碳二亚胺/N-羟基琥珀酰水溶液中，碳二亚胺：N-羟基琥珀酰质量比为4：1。

4.如权利要求1、2或3任一权利要求所述的制备方法所得的三维多孔壳聚糖/明胶微球，其特征在于微球直径在300-800um,表面孔径50-200um,且所述微球表面与内部孔径相连通，越靠近微球内部，孔径越大。

5.如权利要求4所述的三维多孔壳聚糖/明胶微球作为肝细胞培养的应用。

6.如权利要求4所述的三维多孔壳聚糖/明胶微球作为人肝癌细胞株HepG2培养的应用。

7.用如权利要求4所述的三维多孔壳聚糖/明胶微球进行肝细胞培养的方法，其特征在于：

在进行肝细胞培养时，将三维多孔壳聚糖/明胶微球与肝细胞混合接种培养，培养温度为37～38℃，95%O₂,5%CO₂于摇床上控制转速为30-40rpm/min,悬浮培养1小时，静止培养1小时，摇床上再悬浮培养1小时，重复3次后，续加适量新鲜培养液后以30-40rpm/min低速悬浮培养；每培养24小时后更换培养液，并继续维持30-40rpm/min低速悬浮培养，一周后收集细胞；所述的肝细胞与多孔壳聚糖/明胶微球的用量关系为细胞浓度1×10⁵个/mL培养液，多孔壳聚糖/明胶微球铺满12孔板底部50%面积。

8.如权利要求7所述的三维多孔壳聚糖/明胶微球进行肝细胞培养的方法，其特征在于培养温度为37℃。

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