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CN102053160A - 一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片 - Google Patents

一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术检测领域,具体涉及一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片,包括微流细胞芯片载体和不同的生物分子抗体溶液,所述的不同的生物分子抗体溶液固定在芯片载体的不同特定区域。所述生物分子抗体可与特异性的靶细胞进行反应。本发明的芯片多种生物分子抗体的固定一次完成,模具可重复使用,能实现一次样品进样可同时捕获分选出多种癌细胞,具有较高的灵敏度和特异性,减少了上下游交叉污染的可能,且无需复杂的表面修饰过程,且制备快速,成本低,价格低廉,具有广泛应用前景。

Description

一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片
技术领域
本发明属生物技术检测领域,涉及微流控细胞芯片领域,具体涉及一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片。
背景技术
肿瘤细胞从原位脱落进入血管形成血循环癌细胞,及早捕获分选出这些细胞对癌症转移的早期诊断及预后监测有着重大的临床意义。但由于血循环中充满了大量正常血细胞,平均十亿个血细胞中只有一个循环癌细胞,因此,捕获及分选这些极微量的循环癌细胞是极具挑战的。传统的细胞分选方法是利用流式细胞仪,对待测样品进行特定的荧光标记,然后利用复杂的光学检测系统进行鉴定分选。然而,流式细胞仪设备昂贵,需要专业操作人员,大多只能在大型医疗机构的中心实验室进行,很难普及到广大边远及落后地区。因此,开发一种小型、廉价、操作简单、甚至是一次性使用的循环癌细胞检测器件是非常有必要的。
微流控芯片技术由于其制造成本低廉、检测速度快、试剂消耗少等诸多优点正被越来越多的研究者所关注,已发展出多种微流控细胞捕获分选技术,如利用细胞直径进行物理分选,利用荧光或磁性标记进行分选等。由于芯片制备技术的局限,目前大多数研究仍停留在单种细胞的捕获,对于多种细胞的并行捕获仍然缺乏良好的手段。Sunitha Nagrath等在Nature上公开了(Sunitha Nagrath,Lecia V.Sequist,Shyamala Maheswaran et al Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology Vol 450|20/27 December 2007),在流道内设置微柱阵列,在微柱表面固定上皮细胞粘附因子抗体(EpCAM),以此来捕获多种上皮来源的癌细胞。由于不同类型的癌细胞上皮粘附因子的表达量相差很大,细胞捕获的灵敏度及效率极大依赖于细胞的类型,因此固定EpCAM抗体对于表达量小的癌细胞就很难获得满意的捕获效率。Xuanhong Cheng等(Xuanhong Cheng,Amit Gupta,Chihchen Chen etal Enhancing the performance of a point-of-care CD4+T-cellcounting microchip through monocyte depletion for HIV/AIDSdiagnostics Lab on a Chip First published as an Advance Article on the web 4th February 2009)公开了将芯片上的抗体分子固定分成两个区域,前段预先在PEG-水凝胶玻片上点样CD14抗体进行单核细胞捕获,后端在流道内固定CD4抗体进行CD4阳性T细胞的捕获。该方法把点样芯片与流道芯片简单相加,操作过程比较复杂,且分步制造的方法破坏了芯片设计的整体性,不利于芯片进一步的集成。Ye Xu等在Analytical Chemistry发表文章(Ye Xu,JosephA.Phillips,Jilin Yan etal Aptamer-Based Micro□uidic Device for Enrichment,Sorting,and Detection of Multiple Cancer CellsAnal.Chem.2009,81,74367442),设计蛇形管道划定不同检测区域,在每个检测区域的上下游设置进出样开孔,利用开孔的交替开放与封闭在不同区域固定上各自不同的核酸适体,以此来达到在同一管道中并行捕获多种癌细胞的目的。该方法设计较上两种巧妙,但多次重复的流道固定使芯片制备过程时间长、步骤多,又由于在同一管道内进行流动固定,容易产生上下游的交叉污染,使假阳性增高,而为了控制假阳性率,必须加长各区域的长度,这又对芯片的进一步集成造成了障碍。
因此,临床实践中需要开发一种新的细胞捕获分选芯片,期望其具备能够同步完成多种生物分子的固定,通过一次样品进样就能对多种癌细胞进行捕获分选,同时还具有操作简便、集成度高的特点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足,提供一种新的细胞捕获分选芯片,具体涉及一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片。本发明在微流控芯片内通过一次进样能同时捕获多种癌细胞。
本发明的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片包括微流细胞芯片载体和不同的生物分子抗体溶液,不同的生物分子抗体溶液固定在芯片载体的不同特定区域。
本发明中,所述生物分子可与特异性的靶细胞进行反应,选自蛋白质、核酸、脂类、糖类中的一种或多种。
本发明的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片通过下述方法制备,首先制作微流细胞芯片模具,在模具表面涂覆防粘涂层,例如Teflon层,再将不同的生物分子抗体溶液铺展于芯片模具表面特定的位置,随后浇铸PDMS,热烘后脱模,生物抗体分子在脱模过程中转移到PDMS芯片上,从而使细胞捕获芯片的不同位置固定上不同的抗体,且相互独立,不会交叉污染。
本发明的制备方法包括如下步骤:
第一步,首先制作芯片模具,可采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具,或在基底片上旋涂光刻胶,通过光刻显影后形成光刻胶模具;也可通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具等。
第二步,在阳版模具表面均匀滴加Teflon溶液,甩涂机适当转速进行甩涂。
第三步,表面甩涂Teflon的芯片模具进行热烘,自然冷却。
第四步,在芯片特定位置铺展不同的生物分子抗体溶液。
第五步,将PDMS的预聚体与固化剂混合,经超声、搅拌、真空脱气等步骤后浇铸在阳版模具上,适当温度热烘,自然冷却。
第六步,PDMS芯片从模具上脱模同时抗体分子随之转移至PDMS芯片表面,适当键合后形成多种细胞捕获芯片。
本发明方法制得的细胞捕获芯片可用于从含有复杂细胞成份的样本,如全血或组织中,通过一次样品进样进行多种细胞尤其是癌细胞的捕获和分选。同时还具有操作简便、集成度高的特点。
本发明中,所述的癌细胞包括宫颈癌、乳腺癌及结肠癌循环癌细胞及其他癌细胞。
本发明的芯片制备方法与现有技术方法相比较,具有下述特点:制备快速,多种生物分子抗体的固定一次完成,无须重复固定,检测灵敏度高,能根据不同的待检细胞涂布针对性的抗体,特异性好,极大减少了上下游交叉污染的可能,制备成本低,模具可重复使用,且无需复杂的表面修饰过程,具有广泛的应用前景。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1本发明的工艺路线示意图,其中显示了根据本发明的方法制备的微流控芯片在各个步骤中的剖面结构。
具体实施方式
实施例1:如图1所示,根据本发明的方法主要包括如下步骤:
第一步,首先是制作模具,可采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具,或在基底片上旋涂光刻胶,通过光刻显影后形成光刻胶模具;也可通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具等。
第二步,在模具表面均匀滴加Teflon溶液,甩涂机适当转速进行甩涂。
第三步,表面甩涂Teflon的芯片模具进行热烘,自然冷却。
第四步,在芯片特定位置铺展不同的抗体溶液。
第五步,将PDMS的预聚体与固化剂混合,经超声、搅拌、真空脱气等步骤后浇铸在阳版模具上,适当温度热烘,自然冷却。
第六步,PDMS芯片从模具上脱模同时抗体分子随之转移至PDMS芯片表面,适当键合后形成多种细胞捕获芯片。
本实施例以制得的宫颈癌、乳腺癌及结肠癌循环癌细胞捕获分选微流控芯片为例:
(1)制备光刻胶模板
采用SU-8负性光刻胶(美国Micro Chem公司),以3000r/min的转速在单面抛光的硅片上甩胶,获得厚度为50μm的光刻胶;前烘条件为10min从室温升至65℃,保温10min,然后10min升至95℃,并保温35min,随炉冷;曝光采用德国Karl Suss公司MA6型光刻机,曝光时间为60s;后烘条件为10min从室温升至90℃,并保温10min,随炉冷;采用Micro Chem公司专用的SU-8显影液,显影时间为6min,显影后用异丙醇清洗,氮气吹干,获得所需的光刻胶模板。
(2)模板表面Teflon处理
将光刻胶模板置于甩涂机上(美国Micro Chem公司),均匀滴加Teflon溶液,200rpm预转10s,500rpm转30s。
(3)Teflon处理后热烘
将Teflon处理后的光刻胶模板置于烘箱内,180℃热烘2小时,自然冷却。
(4)涂布细胞表面标志物特异性抗体
将人乳腺癌细胞特异性结合物(雌二醇复合物)、人宫颈癌细胞特异性抗体(抗人a6整合素受体抗体)、人结肠癌细胞特异性抗体(抗人CEA抗体)用PBS适当稀释,涂布于芯片流道的不同区域,37℃适当干燥。
(5)PDMS浇铸
PDMS前体与固化剂(牌号:sygard 184,美国道康宁公司的产品)按10∶1质量比进行物理混合,充分搅拌,真空脱气20min后浇铸在阳版模具上,90℃热烘20min,自然冷却。
(6)PDMS芯片脱模与键合
将PDMS芯片从模具上小心揭下,与洁净玻片加压键合。
(7)多种癌细胞的捕获分选
取适量全血,注入芯片,37℃湿盒内孵育30min,PBST(含Tween-20 0.1%)冲洗15min后在荧光显微镜下进行不同区段的检测和计数。
结果显示,本发明芯片检测灵敏度高,能检测出不同的待检细胞,且特异性好,上下游交叉污染少,模具可重复使用,无需复杂的表面修饰过程。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

Claims (11)

1.一种同时多细胞捕获的微流控细胞芯片,其特征在于,其包括微流细胞芯片载体和不同的生物分子抗体溶液,所述的不同的生物分子抗体溶液固定在芯片载体的不同特定区域。
2.按权利要求1所述的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片,其特征在于,所述生物分子选自蛋白质、核酸、脂类、糖类中的一种或多种。
3.按权利要求1所述的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片,其特征在于,所述生物分子抗体可与特异性的靶细胞进行反应。
4.按权利要求3所述的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片,其特征在于所述的靶细胞包括宫颈癌、乳腺癌及结肠癌循环癌细胞及其他癌细胞。
5.权利要求1的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片的制备方法,包括在芯片模具表面不同区域固定不同的生物分子的步骤,其特征在于,在所述定点固定步骤中,首先利用防粘涂料涂覆在芯片模具表面;再将不同的生物分子溶液涂布于于特定区域;然后浇铸PDMS;待PDMS浇注层固化后进行脱模,同时揭下所固定的生物分子。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,其中芯片模具采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具,或在基底片上旋涂光刻胶,通过光刻显影后形成光刻胶模具;或通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述防粘涂料为Teflon材料。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述生物分子选自蛋白质、核酸、脂类、糖类中的一种或多种,可与特异性的靶细胞进行反应。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,其中经过防粘处理的芯片模具表面点样生物分子采用手工点样,或机械点样;所述点样类型为接触式点样,半接触式点样或非接触点样。
10.权利要求1所述的同时多细胞捕获的微流控细胞芯片在从含有复杂细胞成份的样本中通过一次样品进样进行多种细胞的捕获和分选中的用途。
11.按权利要求10所述的用途,其中所述的含有复杂细胞成份的样本是全血样本或组织样本。
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