CN101966335B - 一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗的制备方案。它包括1.构建携带HER2/neu基因片段的慢病毒载体；2.利用上述载体制备携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒；3.用上述重组慢病毒感染树突状细胞并最终获得疫苗。动物实验证明这种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗能有效预防和治疗HER2/neu阳性肿瘤。

Description

一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗的制备。本发明可应用于HER2/neu阳性肿瘤的预防和治疗。

背景技术

HER2/neu是一种癌基因，属于表皮生长因子受体家族。HER2/neu基因的过表达频繁发生于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和胃肠道肿瘤，其在乳腺癌的过表达是预后不良的相关因素。针对HER2/neu的单抗药物Herceptin能有效降低HER2阳性乳腺癌的复发风险。最新的研究表明HER2/neu的过表达能促进肿瘤干细胞的增殖并增强其侵袭性。以上事实说明HER2/neu是治疗HER2/neu阳性肿瘤的一个理想标靶。

树突细胞(DC)是迄今发现的功能最强大的抗原递呈细胞，能刺激机体免疫系统产生针对特异抗原的免疫反应，这些反应包括抗体对特异抗原的中和作用，T细胞对携带特异抗原细胞的直接和间接的杀伤作用等。因此，将HER2/neu基因导入树突细胞后对人体进行免疫可以抑制HER2蛋白的信号转导活性，杀伤过表达HER2抗原的肿瘤细胞，达到预防和治疗HER2阳性肿瘤的目的。

目前，已经有几种基因导入方法被用于制备HER2/neu基因改造的树突细胞(简写为DC_HER2)，主要包括重组腺病毒，重组逆转录病毒和mRNA电穿孔。Sakai等用携带neu基因片段的重组腺病毒感染小鼠骨髓来源的树突细胞，然后对小鼠进行免疫注射，发现这种腺病毒改造的DC_HER2疫苗能显著阻止或延迟转基因小鼠乳腺肿瘤的发生，另外两个研究发现腺病毒改造的DC_HER2疫苗能部分或全部阻止小鼠neu阳性移植肿瘤的发生。Nabekura等用携带HER2基因片段的逆转录病毒感染小鼠骨髓来源的树突细胞制备DC_HER2疫苗，发现后者能部分阻止小鼠HER2阳性移植肿瘤的发生，此外还能部分延迟转基因小鼠乳腺肿瘤的发生。此外国内有研究者采用mRNA电穿孔的方法制备DC_HER2疫苗，体外实验表明这种疫苗能激发T细胞对neu阳性肿瘤细胞的杀伤。

上述提到的三种基因导入方法虽然都能制备有效的DC_HER2疫苗，但各自都有一些不足：腺病毒感染DC后转基因的表达时间较短，后者可能导致免疫效应的持久性和强度不够；逆转录病毒只能感染分裂期的细胞，而临床上多采用病人外周血单个核细胞分化诱导成DC，这一过程很少伴有细胞增殖，因此部分限制了其可能的临床应用；mRNA电穿孔同样存在递呈抗原的半衰期较短的问题，此外，有研究表明mRNA电穿孔会削弱DC刺激免疫的功能。

实际上，重组慢病毒也能高效感染树突细胞，同时不会削弱DC的功能。另外，重组慢病毒感染的一个重要特点是转基因的长期表达，这一特点对于DC则有可能刺激免疫系统产生持久和增强的免疫反应，但另一方面也有可能导致免疫耐受，也就是说用它制备的疫苗可能没有效果。目前并没有使用重组慢病毒制备DC_HER2疫苗的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗。

本发明提供的疫苗是是通过将HER2/neu重组到慢病毒载体上，再转染树突细胞来制备的。

在任意一个商业化或私人开发的慢病毒转运载体上构建一个HER2/neu基因片段的表达序列。这里的慢病毒转运载体指慢病毒包装系统中提供目的基因的载体，通常是一个质粒，此外它还提供病毒所携带核酸的转录表达所需的顺式作用元件。HER2/neu基因片段的表达序列包括5’端的启动子，可选用广谱的强启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子和延长因子2(EF2)启动子等或者树突细胞特异的启动子如CD11c启动子等，3’端的多聚腺苷酸加尾信号，以及位于启动子和加尾信号之间的HER2/neu基因片段(通常去除其具有酪氨酸激酶活性的胞内段)。构建中可能遇到的具体情况包括：如果转运载体没有其它的目的基因，直接在适当位置插入HER2/neu基因片段。如果转运载体已具备了目的基因，则需用HER2/neu基因片段替换原有的目的基因。如果载体没有提供启动子，则需要在适当的位置插入目的启动子。如果这一转运载体已具备目的启动子，则只需在启动子下游插入HER2/neu基因片段，转运载体通常会提供加尾信号。所要用到的分子生物学技术可参考已出版的相关书籍，如《分子克隆》。

1.利用上述构建的载体包装制备携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒，说明如下：

采用任意一个商业化或私人开发的慢病毒包装系统包装制备携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒。完整的慢病毒包装系统通常包含数个质粒和一个包装细胞系，前者用于提供慢病毒包装所需的病毒结构基因和病毒所携带核酸的转录表达所需的顺式作用元件，后者提供病毒包装所需的反式作用因子。包装制备过程可遵循生产商的说明书以及发表的文献或相关书籍。包装所得的携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒可进一步纯化和/或浓缩，相关操作可参考试剂盒生产商的说明书以及相关文献或书籍。2.利用2中提到的重组慢病毒感染树突细胞来制备新的DC_HER2疫苗，说明如下：

树突细胞来源可包括小鼠骨髓细胞，人类外周血单个核细胞或CD14阳性细胞群，造血干细胞及其亚群，人类胚胎干细胞。通常经过数天的培养，在细胞因子的作用下这些具有分化潜能的细胞将大部分分化为树突细胞。从不同的前体细胞诱导培养树突细胞所花费的时间不太一样，除人类胚胎干细胞外通常需6-10天，也有3天的快速诱导方法。在树突细胞的诱导培养过程中，将制备好的携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒在适当时机对培养体系中的细胞进行感染，感染方式可包括多种，简单的共培养感染，或者将病毒和细胞一起离心的共离心感染，或者重复甚至多次感染，或者这些方法的组合。在培养后期可向培养体系中加入刺激树突细胞成熟的因子如肿瘤坏死因子α，磷酸脂多糖等以刺激树突细胞成熟，原因是未成熟的树突细胞有可能会导致免疫耐受。最终可得到这种新的DC_HER2疫苗。相关操作可参考已发表的关于树突细胞培养诱导以及慢病毒感染树突细胞的文献，本说明书中的具体实施方式将提供从小鼠骨髓细胞中制备这种新的DC_HER2疫苗的操作方法。

根据本发明的研究，上述用携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒对来源于骨髓细胞诱导培养的第4天所获得的DC进行感染。按照常规的方法，一般应在第2天进行感染。本发明人发现，在第4天感染获得了更好的出乎意料的效果。

有益效果

在基于小鼠的体内实验中发现，这种新的DC_HER2疫苗只需一次低剂量(1.5×10⁵)的免疫接种就可以完全预防HER2/neu阳性移植肿瘤在小鼠体内的生长，保护时间至少超过100天。而采用其他方法制备得到的DC_HER2疫苗通常需要大剂量(5×10⁵-1×10⁶)，并且经过2-3次免疫接种才能达到甚至还达不到类似效果(表1)。说明这种慢病毒制备的DC_HER2疫苗比用其他方法制备的DC_HER2疫苗更有效。另一个支持上述结论的依据是，用这种新DC_HER2疫苗低剂量单次免疫后，即可在小鼠体内检测到足够水平的抗HER2/neu抗体，而在此前的两个采用腺病毒和逆转录病毒制备DC_HER2疫苗的研究中，单次较高剂量的免疫只能在小鼠体内诱导产生少量或者根本无法产生抗体，而体内相关抗体的产生是评价疫苗效果的一个重要指标。

这种新的DC_HER2疫苗的预防效应被进一步证明是长效的：免疫后100天小鼠血浆中的HER2/neu抗体仍然维持在较高的水平(平均7倍于未接种DC_HER2疫苗的小鼠)，对这些免疫后100天的小鼠进行第二次HER2/neu阳性肿瘤细胞接种，50天后发现小鼠仍未发生肿瘤。除预防效应外，这种新的DC_HER2疫苗对小鼠已发生的HER2/neu阳性移植肿瘤还具有治疗效果，一次低剂量(2×10⁵)的皮下注射即能显著抑制肿瘤的生长。

在这个发明中，包含了一系列本领域技术人员已知的操作。但本发明的创造性在于成功地运用已知的慢病毒载体将HER2/neu基因转染到树突细胞上，实现了稳定高效表达，并能是动物体产生相应的免疫反应。

表1慢病毒制备的DC_HER2疫苗与其他方法制备的DC_HER2疫苗预防效果比较

·显示为观察持续时间(肿瘤细胞接种计为第0天)和最后一次观察时健康无瘤小鼠的百分比。

附图说明

图1为实施例中pSin-EF2-neuET-Pur阳性克隆的PCR筛选；其中预期阳性克隆应扩增出大小为2100bp的片段，可见4个菌落都扩增出了这一条带，说明可能均为阳性克隆。neg为阴性对照，一个无关质粒，pos为阳性对照pMMTV-neu；

图2为pSin-EF2-neu-Pur的酶切鉴定图；其中预期单酶切片段为8500bp，双酶切片段为6400bp，2100bp。酶切结果与预测一致。E+S表示EcoR I和Spe I双酶切；

图3为预防实验中各组小鼠的无瘤生存曲线图；其中小鼠经过DPBS或DC免疫(1.5×10⁵/只，5只/组)后7天，用B16neu细胞(2×10⁵/只)进行皮下接种，持续观察各组小鼠的肿瘤发生情况。可见DC_neu免疫组的所有小鼠在肿瘤细胞接种后第100天仍未发生肿瘤，而DPBS组和DC_ctrl组分别在第24和31天全部发生了肿瘤；

图4为治疗实验中各组小鼠的肿瘤生长曲线图；首先用2×10⁵B16neu对每只小鼠进行肿瘤接种，然后在7天或15天后用DPBS或DC进行治疗。DC剂量为2×10⁵/只，之后每周对小鼠肿瘤进行两次观察和测量，小鼠肿瘤体积使用椭圆体积公式进行计算：a×b²×0.5236，其中a和b分别代表肿瘤的长短径，0.5236为计算椭圆体积的一个常数。左图和右图分别为小鼠在肿瘤接种后第7天和第15天接受治疗的肿瘤生长曲线。图中数据显示为均数±标准误的均值，箭头下数字表示免疫治疗的时间。第7天治疗实验每组5只小鼠，其中DPBS治疗组有一只荷瘤小鼠在第17天不明原因死亡，DC_neu治疗组有一只无瘤小鼠在第25天不明原因死亡，这两只小鼠从死亡时间开始均不参与统计，在观察期最后一天(肿瘤接种后25天)的各组小鼠肿瘤平均体积分别为2627mm³(DPBS)，2359mm³(DC_ctrl)，374mm³(DC_neu)；第15天治疗实验中，DBPS，DC_ctrl和DC_neu三组小鼠数目分别为4只，4只和6只。治疗观察期间没有小鼠死亡，在观察期最后一天(肿瘤接种后21天)各组小鼠肿瘤平均体积分别为1052mm³，2306mm³and 472.6mm³。对两次实验观察期结束时各组小鼠肿瘤平均体积进行统计学分析发现，相比DC_ctrl(P＝0.023)和DPBS(P＝0.03)，DC_neu能显著抑制小鼠肿瘤生长，而DPBS组和DC_ctrl组的小鼠肿瘤平均体积没有显著性差异(P＝0.587)。

具体实施方式

实施例1携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒载体的构建

1.Neu基因片段的PCR扩增和纯化

引物序列上游5’-ggaattccagcctggtccagcctgag-3’；下游5’-gactagttcactgtctccttcgtttgatt-3’。反应模板为携带neu全长cDNA的质粒pMMTV-neu，系本单位按现有技术中的方法构建。扩增反应使用NEB公司的Phusion超保真PCR试剂盒。反应体系如下(体积单位均为μl)：

共扩增两管。程序设定如下：98度30s→95度10s→62度30s→72度40s→72度5min→4度，重复30个循环。PCR仪为eppendorf公司产品。

对PCR产物进行跑胶，用TaKaRa公司的胶回收纯化试剂盒对产物进行纯化。

2.分别酶切PCR产物和pSin-EF2-SOX2-Pur(慢病毒转运载体，购自Addgene网站)反应体系如下(体积单位均为μl)：

分别在37度酶切过夜和3hr。对酶切产物进行跑胶，分别回收带有粘性末端的neu片段和去除了SOX2基因的pSin-EF2-SOX2-Pur载体大片段。

3.连接和转化

连接反应体系如下(体积单位均为μl)：

片段混合后在65度孵育3min，再迅速转移到冰上。16度反应30min。将连接产物转化入stbl3超级感受态细胞(Invitrogen公司产品)，菌液涂布在含氨苄的LB琼脂平板上，37度培养。待克隆长出后进行阳性克隆的筛选。

4.筛选阳性克隆和重组载体的酶切鉴定

首先用PCR对菌落进行初步筛选。从平皿上挑取一共4个菌落，每个菌落都重悬在10μl双蒸水中，作为模板，PCR反应体系如下(体积单位均为μl)：

反应程序设定如下：95度2min→95度30s→62度30s→72度2min→72度5min→4度，重复30个循环。跑胶鉴定阳性克隆，结果见图1。将阳性克隆的菌液接种至3-4ml LB培养基，37度摇床中250rpm振摇8hr。用Takara公司的质粒小量抽提试剂盒制备重组载体。对重组载体进行酶切鉴定，反应体系如下(体积单位均为μl)：

37度反应30min。跑胶鉴定结果见图2。重组载体被命名为pSin-EF2-neu-Pur。

实施例2携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒(rLVneu)的包装制备和浓缩

1.质粒的准备

包括pSin-EF2-neuET-Pur，pCMV8.91和pMD.G共3种质粒。将含有质粒的细菌大规模培养后使用Invitrogen公司的大量抽提试剂盒制备质粒。

2.转染试剂的配制

0.3M CaCl ₂ ：11.025g CaCl₂·2H₂O溶入240ml Milli-Q water，定容至250ml，0.22μm过滤除菌，4度贮存。

2×HBS：200ml Milli-Q water中加入14ml 5M NaCl溶液、12.5ml 1M HEPES缓冲液和250μl 1.5M Na₂HPO₄溶液，用NaOH或HCl调整PH值至7.10，定容至250ml，0.22μm过滤除菌，4度贮存。

3.rLVneu的制备(10个100mm细胞培养皿的制备规模)

(1)从液氮罐解冻1管293FT细胞(Invitrogen公司产品)至100mm皿，培养过夜。

(2)加Geneticin，继续培养。

(3)在密度超过80％之前传代至4个100mm皿，加Geneticin，继续培养。

(4)在密度超过80％之前传代至10个100mm皿，不加Geneticin，继续培养。

(5)监控细胞密度，70-80％开始转染。

(6)将10ml 0.3M CaCl₂加入50ml离心管，加入pSin-EF2-EGFP-Pur，pCMV8.91和pMD.G分别为90，120和30μg。

(7)10ml 2×HBS加入50ml离心管。

(8)将CaCl₂和DNA混合液逐滴加入2×HBS中。颠倒或轻轻吸打混匀。

(9)迅速将DNA/CaCl₂/HBS悬液逐滴加入100mm皿，同时轻轻旋转摇晃培养皿使悬液均匀分散在培养基中。

(10)细胞返回培养箱培养6hr。

(11)换液。

(12)返回培养箱继续培养48hr。

(13)收集上清，2500g，10min。

(14)0.45μm Durapore膜(超低蛋白吸附)过滤。

(15)将含病毒的上清等分装于3个无菌50ml Beckman离心管，每管用DMEM培养基加满，用带有密封圈的盖子盖紧。

(16)20000g，4度离心90min沉淀病毒。离心机为Beckman低温高速离心机。

(17)弃上清，可见白色沉淀，在沉淀处滴加150-200μl无菌DPBS，4度溶解过夜。

(18)收集病毒，分装，-80度贮存备用。

实施例3使用rLVneu感染小鼠骨髓来源的树突细胞以制备新的DC_HER2疫苗(1个6孔板的培养规模)

DC的完全培养基为含10％ FBS，2mM L-glutamine，50μm β-巯基乙醇和20ng/mlGM-CSF的RPMI1640培养基。GM-CSF为粉剂，重新水化后以100ng/μl，10μl/管分装冻存在-20度，避免反复冻融，临用前加入。加入GM-CSF的培养基贮存在4度，必须在7天内用完。

除分离骨头外，其余都严格遵循无菌操作。DC培养最好使用细菌学或未经组织培养处理的皿/板。

(1)取小鼠的股骨和胫骨，酒精浸泡消毒，带入超净台内操作。

(2)RPMI1640浸泡洗涤骨头，剪去骨骺端，注射器抽吸10ml RPMI1640后用0.45mm注射针将骨髓细胞从骨髓腔中冲出。

(3)15ml离心管收集骨髓细胞，300g离心10min。

(4)离心期间，在皿/板内加入新鲜完全培养基，准备细胞计数。

(5)离心完成后，弃上清，1ml完全培养基重悬，取样计数。

(6)按2×10⁶/100mm皿，4×10⁵/6孔板孔种入。置培养箱中培养，记为第0天。

(7)培养第3天，加入等体积新鲜完全培养基。

(8)300g离心10min收集第4天DC。

(9)准备感染复合物：120μl浓缩rLVneu，480μl RPMI1640，终浓度为4μg/ml的polybrene。

(10)离心结束后，收集上清，用新鲜培养基补足(4ml/孔)后返回原孔。

(11)用配制好的感染复合物重悬细胞，轻轻混匀，置培养箱中感染3hr。期间每30min-1hr振摇混匀。

(12)感染结束后，100μl/孔返回6孔板。

(13)收集第5天DC和培养基，一起加入离心管，800g室温离心90min。

(14)离心期间，每孔加入1ml新鲜培养基保持湿润。准备感染复合物，同前。

(15)离心结束后，3ml上清返回每孔，其余丢弃，用配制好的感染复合物重悬细胞，轻轻混匀，置培养箱中感染3hr。期间每30min-1hr振摇混匀。

(16)感染结束后，100μl/孔返回6孔板。

(17)收集第6天DC和培养基，一起加入离心管，800g室温离心90min。

(18)离心期间，每孔加入2ml新鲜培养基保持湿润，顺便完成半量换液操作。

(19)离心结束后，留12ml上清重悬细胞，2ml上清/孔返回6孔板。

(20)培养第9天晚，收集所有培养基，300g离心10min，弃上清，完全培养基对倍稀释后重悬细胞，加入20ng/ml LPS刺激过夜。

(21)第10天收集悬浮和疏松贴壁的细胞，用无菌DPBS缓冲液洗涤3次，以1.5-2×10⁶/ml重悬于DPBS中，则得到DC_HER2疫苗。将操作第9和14步中的rLVneu换做DPBS，则最终获得DCctrl，在后续的实施例中作为一个阴性对照。

实施例4使用本发明制备的DC_HER2疫苗用于预防和治疗HER2阳性肿瘤

B16neu为一个neu阳性肿瘤细胞系，用rLVneu稳定转导B16-F1后得到。B16-F1为一株C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞。

1.neu阳性肿瘤预防实验

(1)取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠，随机分成3组，每组5只小鼠，以DPBS，DCctrl和DC_HER2分别对各组小鼠进行免疫。免疫方式为皮下注射，部位为小鼠左下腹，DC剂量为1.5×10⁵，注射体积为100μl。此时记为第0天。

(2)第7天，胰酶消化收集肿瘤细胞B16neu。

(3)10ml DPBS洗3次，每次离心条件为200g5min，以充分去除血清成分。

(4)去上清，DPBS重悬计数，调整浓度为2×10⁶/ml。

(5)2×10⁵肿瘤细胞在各组免疫小鼠的右下腹进行皮下注射，注射体积为100μl。

(6)此后每周观察小鼠两次，记录小鼠肿瘤发生情况，绘制无瘤生存曲线，见图3。

2.neu阳性肿瘤治疗实验

(1)首先用2×10⁵B16neu细胞对小鼠进行皮下接种。

(2)7天或15天后用DPBS，DCctrl和DC_HER2分别对小鼠进行免疫，剂量为2×10⁵。

(3)此后每周观察小鼠两次，用游标卡尺测量肿瘤长短径，绘制小鼠肿瘤生长曲线，见图4。

Claims (2)

1.一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗，其特征在于是通过将HER2/neu重组到慢病毒载体上，再转染树突细胞来制备的，其中，所述的转染树突细胞是使用rLVneu感染小鼠骨髓来源的树突细胞以制备新的DC_HER2疫苗，具体步骤如下：

(1)取小鼠的股骨和胫骨，酒精浸泡消毒，带入超净台内操作；

(2)RPMI1640浸泡洗涤骨头，剪去骨骺端，注射器抽吸10ml RPMI1640后用0.45mm注射针将骨髓细胞从骨髓腔中冲出；

(3)15ml离心管收集骨髓细胞，300g离心10min；

(4)离心期间，在皿/板内加入新鲜完全培养基，准备细胞计数；

(5)离心完成后，弃上清，1ml完全培养基重悬，取样计数；

(6)按2×10⁶/100mm皿，4×10⁵/6孔板孔种入，置培养箱中培养，记为第0天；

(7)培养第3天，加入等体积新鲜完全培养基；

(8)300g离心10min收集第4天DC；

(9)准备感染复合物：120μl浓缩rLVneu，480μl RPMI1640，终浓度为4μg/ml的polybrene；

(10)离心结束后，收集上清，用新鲜培养基补足(4ml/孔)后返回原孔；

(11)用配制好的感染复合物重悬细胞，轻轻混匀，置培养箱中感染3hr，期间每30min-1hr振摇混匀；

(12)感染结束后，100μl/孔返回6孔板；

(13)收集第5天DC和培养基，一起加入离心管，800g室温离心90min；

(14)离心期间，每孔加入1ml新鲜培养基保持湿润，准备感染复合物，同前；

(15)离心结束后，3ml上清返回每孔，其余丢弃，用配制好的感染复合物重悬细胞，轻轻混匀，置培养箱中感染3hr，期间每30min-1hr振摇混匀；

(16)感染结束后，100μl/孔返回6孔板；

(17)收集第6天DC和培养基，一起加入离心管，800g室温离心90min；

(18)离心期间，每孔加入2ml新鲜培养基保持湿润，顺便完成半量换液操作；

(19)离心结束后，留12ml上清重悬细胞，2ml上清/孔返回6孔板；

(20)培养第9天晚，收集所有培养基，300g离心10min，弃上清，完全培养基对倍稀释后重悬细胞，加入20ng/ml LPS刺激过夜，第10天收集悬浮和疏松贴壁的细胞，用无菌DPBS缓冲液洗涤3次，以1.5-2×10⁶/ml重悬于DPBS中，则得到DC_HER2疫苗。

2.权利要求1所说的疫苗在制备治疗或预防HER2/neu阳性肿瘤药物中的应用。 

Images