CN101954124B - 含基底膜的组织工程皮肤的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域。目前以聚乳酸、聚羟基乙酸、胶原、透明质酸等材料作为真皮支架构建的活性皮肤替代物，一方面基质材料提取困难，制作工艺复杂，费用昂贵，难以在临床广泛推广应用，另一方面其不具备皮肤的基底膜结构，导致愈合皮肤不耐压和耐磨，表皮粘附不牢，容易脱落破损或形成水疱，且影响正常表皮结构、形态的发育。而异体脱细胞真皮取自尸体皮，来源有限，价格昂贵，限制了临床应用。本发明目的在于提供以一种以表面修饰改性的羊膜为基底膜，血浆为基质的皮肤替代物，其材料来源广泛、成本低廉、制备方法简单，经动物实验证明可在体内移植中保持完整的基底膜和半桥粒，加速并促进表皮结构形态的形成。

Description

含基底膜的组织工程皮肤的构建方法

技术领域

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，具体涉及一种将羊膜表面修饰改性后作为基底膜，复合血浆为基质，经体外培养构建含基底膜的组织工程皮肤(即活性皮肤替代物)，特别适用于烧伤、创伤的皮肤缺损修复及瘢痕整形。 

背景技术

目前，以聚乳酸、聚羟基乙酸、胶原、透明质酸等生物可降解材料构建真皮支架，在此基础上构建活性皮肤替代物，已初步应用于深度皮肤缺损创面的修复及疤痕整形等。但由此构建的皮肤替代物一方面基质材料提取困难，制作工艺复杂，费用昂贵，难以在临床广泛推广应用，另一方面其不具备皮肤的基底膜结构，导致愈合皮肤不耐压和耐磨，表皮粘附不牢，容易脱落破损或形成水疱，且影响正常表皮结构、形态的发育。而异体脱细胞真皮取自尸体皮，来源有限，价格昂贵，限制了其临床推广应用。 

人羊膜组织为含单层上皮细胞的半透明组织，无血管、神经、淋巴管，厚度为0.02-0.5mm，其基底膜的形态与皮肤基底膜非常相似，且主要由层粘连蛋白和IV型胶原组成(赵敏，鲁静，张琪，等.HGF、bFGF、ColIV、LN在保存羊膜中的表达.眼科研究，2006，24(5)：514-517.)。此外人羊膜是医疗废弃组织，来源广泛，取材方便，其作为一种生物敷料较早用于烧伤创面的覆盖，不仅可以降低创面的炎症促进上皮化而且可以抑制瘢痕的形成。目前已有商品化的羊膜产品如江西瑞济生物工程技术有限公司的冷冻干燥生物羊膜。 

国内外尚无文献报道将羊膜作为基底膜，复合血浆为基质，经体外培养构建含基底膜的组织工程皮肤。 

发明内容

本发明目的在于提供一种以表面修饰改性的羊膜为基底膜，，以自体/异体血浆为基质的皮肤替代物，及其构建方法。本发明材料来源广泛，制备方法简 单，成本低廉，可在体内移植中保持完整的基底膜和半桥粒，加速并促进表皮结构形态的形成。 

本发明的以表面修饰改性的羊膜为基底膜，血浆为基质的含基底膜的组织工程皮肤的构建方法，包括如下步骤： 

A)分离、培养角朊细胞、成纤维细胞(参考：刘德伍，李国辉，邹萍，刘德明.表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤.中国临床康复，2004，8(8)：1439-1441.)。 

B)表面修饰改性羊膜： 

去除绒毛膜后的羊膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液37℃消化2小时，超声振荡洗涤彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡20至50分钟。 

C)构建组织工程皮肤； 

将B)步骤制备的羊膜与含成纤维细胞的血浆基质复合，再将角朊细胞以1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜表皮面，体外培养2-3周。 

本发明的构建方法具体步骤如下： 

1、分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞 

利用包皮环切术后废弃包皮组织或者整形术后多余皮肤组织，分别采用酶消化法及组织块贴壁法分离、培养角朊细胞和成纤维细胞。分别制备成单细胞悬液，按2-3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养，成纤维细胞以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增。 

2、表面修饰改性羊膜 

无菌条件下剥离新鲜羊膜(取自肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的剖腹产妇的胎盘组织)，钝性分离绒毛膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小时，随后放入高频超声清洗器中超声振荡洗涤2小时，彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，然后经蒸馏水反复浸泡清洗后，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡30min制备表面修饰改性的羊膜。 

3、构建组织工程皮肤 

首先将制备的羊膜基底面向上铺于培养板上，待其完全干燥贴壁。取患者 或异体全血后离心获取血浆，经微孔过滤器除去细胞碎片，将成纤维细胞加入制备的血浆中配制浓度为5×10⁵个/ml，充分混匀后加入上述铺有羊膜的培养皿中。随后以1∶40的体积比加入1M的氯化钙溶液，促进其聚合，待其聚合成凝胶后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于体外培养3-5天。随后将角朊细胞按1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜上，待细胞融合后，进行气-液界面培养2-3周，每2～3天换液一次，形成以羊膜为基底膜，血浆凝胶为基质的活性皮肤替代物。 

本发明还提供了根据上述方法构建的组织工程皮肤。 

本发明还提供了根据上述方法构建的组织工程皮肤作为创面修复移植材料的应用。 

本发明以羊膜为基底膜，血浆凝胶为基质的活性皮肤替代物，主要用途是修复全层皮肤缺损创面，为严重的大面积深度烧伤患者提供皮源。另一方面，也可应用于慢性深度皮肤溃疡、皮肤撕脱伤等皮肤缺损创面及瘢痕整形。本发明制备的活性皮肤替代物方法简单，取材方便，成本低廉，此外体外培养中发现较不含羊膜的传统的组织工程皮肤，表皮生长更为迅速，结构形态更趋近正常皮肤，具备完善的基底膜，同时半桥粒发育更为成熟牢固。经动物(裸鼠)移植实验表明，将活性皮肤替代物植入全层皮肤缺损创面，存活率达88％，新生皮肤可见完整的基底膜及发育良好的表皮层形态及半桥粒。 

因此，本发明将羊膜进行表面修饰改性后作为基底膜，复合含成纤维细胞的血浆凝胶为基质，表面种植角朊细胞，经体外培养构建含基底膜的活性皮肤替代物。本发明制作方法简单，材料来源广泛，成本低廉，同时排除了异种来源可能导致的感染、排斥等影响。 

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。 

实施例1.制备含基底膜的活性皮肤替代物 

1、分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞 

利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细胞。分别制备成单细胞悬液，按2-3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养(DK-SFM，Gibco，美国)，成纤维细胞以完全型DMEM培养液(Gibco，美国)进行培养，当细胞达70 ％-80％融合时进行传代、扩增。 

2、表面修饰改性羊膜 

无菌条件下剥离新鲜羊膜(取自肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的剖腹产妇的胎盘组织)，钝性分离绒毛膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中(Gibco，美国)，37℃消化2小时，随后放入高频(59KHz)超声清洗器中(SK8200H，科导，上海)，超声振荡洗涤2小时，彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，然后经蒸馏水反复浸泡清洗后，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡30min备用。 

3、构建组织工程皮肤： 

首先将制备的羊膜基底面向上铺于培养板上，待其完全干燥贴壁。取患者或异体全血置于含枸橼酸钠抗凝剂的抗凝管中，600g离心5min，收集血浆，经20um孔径的过滤器消毒除去细胞碎片，将成纤维细胞加入制备的血浆中配制浓度为5×10⁵个/ml，充分混匀后，以1∶6的体积(ml)与培养板面积(cm²)比将含成纤维细胞的血浆加入上述铺有羊膜的培养皿中。随后以1∶40的体积比加入1M的氯化钙溶液，促进其聚合，待其聚合成凝胶后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于体外培养3-5天。随后将角朊细胞按1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜上，待细胞融合后，进行气-液界面培养2-3周，每2～3天换液一次，形成以羊膜为基底膜，血浆凝胶为基质的活性皮肤替代物。 

实施例2.本发明组织工程皮肤的动物移植试验 

雄性Balb/c-nu小鼠(裸鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，体重18±2克，16只，共分为二组，分别为本发明含羊膜的组织工程皮肤的A组和不含羊膜的传统活性皮肤替代物B组：单纯以纤维蛋白为基质构建(详见A.L.Mazlyzama，B.S.Aminuddinb，et al.Reconstruction of living bilayer human skin equivalent utilizing human fibrin as a scaffold.Burns，2007，33(3)：355-363)。 

裸鼠经氯胺酮腹腔麻醉后，剃除背部皮肤毛发，切除脊柱偏腹侧部全层皮肤及深筋膜达肌肉层。A组：将实施例1中所述的经体外培养2-3周的组织工程皮肤移植于创面。B组：将不含羊膜的传统活性皮肤替代物移植于创面。为防止创周皮肤收缩及表皮爬行，影响移植结果的观察，采用隔离圈将创面与周边皮肤隔离。复合皮上覆盖油砂，定期更换敷料并观察创面愈合情况。复合皮 移植后2周打开创面观察存活率。并取材，制成厚约5μm的石蜡切片，行常规组织切片HE染色观察及透射电镜观察。 

结果表明，本发明的组织工程皮肤与传统组相比存活率无明显差异。组织学HE染色观察可见，本发明组织工程皮肤移植后4周的表皮结构发育良好，形态更趋近正常皮肤，透射电镜观察见具备完善的基底膜，同时半桥粒发育更为成熟，而对照组未见连续的基底膜形成，且半桥粒发育缺陷。此外本发明制备的活性皮肤替代物，所形成的复层表皮细胞与真皮替代物粘附更加紧密牢固，不易脱离。 

Claims (1)

1.一种含基底膜的组织工程皮肤的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

A)分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞：

利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细胞，分别制备成单细胞悬液，按2-3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养，成纤维细胞以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增；

B)表面修饰改性羊膜：

无菌条件下剥离新鲜羊膜，钝性分离绒毛膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小时，随后放入高频超声清洗器中超声振荡洗涤2小时，彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，然后经蒸馏水反复浸泡清洗后，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡30min备用；

C)构建组织工程皮肤：

将步骤B)制备的羊膜基底面向上铺于培养板上，待其完全干燥贴壁，取患者或异体全血置于含枸橼酸钠抗凝剂的抗凝管中，600g离心5min，收集血浆，经20um孔径的过滤器消毒除去细胞碎片，将成纤维细胞加入制备的血浆中配制浓度为5×10⁵个/ml，充分混匀后，以1∶6的体积ml与培养板面积cm²比将含成纤维细胞的血浆加入上述铺有羊膜的培养皿中；随后以1∶40的体积比加入1M的氯化钙溶液，待其聚合成凝胶后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于体外培养3-5天；随后将角朊细胞按1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜上，待细胞融合后，进行气-液界面培养2-3周，每2～3天换液一次。