CN105497983A - 一种简单高效的干细胞贴片制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种简单高效的干细胞贴片制备方法，利用自配的羊膜上皮细胞消化液，解决了目前羊膜上皮细胞消化过程复杂，羊膜结构保持不完整的技术难点，该消化液能简单快速的去除羊膜上皮层细胞，不仅可以缩短去羊膜上皮细胞时间，提高上皮细胞消化效率，同时能保持羊膜的完整性及原有的细胞外基质成分，维持其生物学活性，以去上皮细胞的羊膜作为生物支架材料，将脐带来源的间充质干细胞负载在去上皮细胞的羊膜上，制成干细胞贴片，用于临床外敷治疗糖尿病足，起到很好的治疗效果。

Description

一种简单高效的干细胞贴片制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，以羊膜作为生物支架材料，用于干细胞的贴壁生长，用于临床糖尿病足创面的修复，具体是一种简单高效的干细胞贴片制备方法。

背景技术

组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，其研究内容主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用，核心是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，因此，支架材料的选择是组织工程中的重要环节，也是限制组织工程临床应用的重要因素。理想的支架材料应具有：1.具有良好的生物相容性，使细胞可黏附和增殖，且无明显的细胞毒性和炎症反应，不影响新组织的功能；2.可降解性，其降解吸收速率与细胞、组织的生长速率相匹配；3.合适的孔径，以利于大量细胞的贴壁和细胞外基质的形成；4.合适的机械强度；5.无抗原性及致瘤性。

研究显示，在人羊膜细胞外基质上负载培养的角膜细胞、结膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞等均能良好生长，并保持原有的细胞形态及功能。羊膜从细胞滋养层衍化而来，为无血管、神经及淋巴，具有一定韧性和弹性的半透明膜。Bourne扫描电镜下，羊膜可分为上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层、海绵层五层结构，其中，羊膜的基底膜含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原，纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，丰富的胶原纤维增强了羊膜的抗拉能力，为细胞生长提供了足够的三维空间结构，有利于细胞在羊膜上黏附和生长，且人羊膜细胞不表达人白细胞A、B、C或DR抗原，具有抗原性极低，免疫排斥反应小的特点。此外，羊膜具有良好的生物相容性，同时也是一种易得的生物材料，易于加工、处理和运输，为组织工程学的研究提供了便利的条件，目前广泛用于眼科、临床烧伤外科及骨科等皮肤、黏膜、神经重建移植的研究中。

间充质干细胞具有多能分化潜能，能够被募集在皮肤损伤缺血区和创伤组织中，同时能

够分泌多种细胞因子及炎性因子，促进血管的再生和细胞外基质的重建，为创面局部创造一个良好的修复环境，促进创面的修复。目前，临床上主要通过静脉或肌肉注射干细胞治疗糖尿病足，取得了较好的效果，干细胞疗法最为新兴的治疗手段，在糖尿病足的治疗中已经发挥了其独特的优势及潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的干细胞贴片制备方法，利用本发明配制的上皮细胞消化液，使上皮细胞的去除过程方便、快捷，大大缩短整个操作过程所需的时间。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种简单高效的干细胞贴片制备方法，步骤如下：

一、羊膜组织的获取及前处理；

二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；

三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；

四、制备干细胞贴片。

2、根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：

⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；

⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；

⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中

⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；

⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；

⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；

⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体

⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块

而且，所述刮除羊膜上皮细胞的消化和刮除具体步骤如下：

⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；

⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面

⑶将培养皿置于5％CO₂培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；

⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；

⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动羊膜-硝酸纤维素膜，彻底刮除羊膜上皮细胞；

⑹将刮除羊膜上皮细胞的羊膜-硝酸纤维素膜复合体用PBS缓冲液清洗羊膜上皮面3次，以彻底清除残留的上皮细胞；

而且，所述羊膜上皮细胞消化后鉴定的具体步骤如下：

⑴用无菌眼科剪剪取羊膜-硝酸纤维素膜复合体的一角，去除硝酸纤维素膜，将羊膜直接平铺于盖玻片上，使羊膜上皮面朝上，且羊膜完全展开，置于培养皿中；

⑵在羊膜上皮面上滴加苏木精，使苏木精完全覆盖羊膜上皮面，室温浸染5分钟后，向培养皿中加入自来水清洗苏木精，反复清洗3次，清洗完成后吸尽培养皿中的自来水；

⑶在羊膜上皮面上滴加分化液进行分化，使之完全覆盖羊膜上皮面，分化15秒；向培养皿中加入自来水，使整张盖玻片完全浸泡在自来水中，浸泡15分钟；用移液管吸尽自来水，将伊红滴加至羊膜上皮面上，浸染2分钟；

⑷向培养皿中加入自来水，清洗羊膜上皮面，镜下观察着色情况，观察镜下是否还能观察到清晰完整的羊膜上皮细胞；镜下观察不到清晰完整上皮细胞的羊膜可用于羊膜爬片的制备；

而且，所述制备干细胞贴片的制备步骤如下：

⑴用眼用镊子小心的将去上皮细胞羊膜一端掀起，并将无菌石英片缓缓插入到羊膜下表面，待石英片完全深入到羊膜下方后，用镊子轻轻将羊膜包裹在石英片的四周，并使石英片表面上的羊膜完全伸展；

⑵将羊膜爬片置于6cm无菌培养皿中，放入CO2培养箱中干燥60min，使羊膜爬片与孔底结合牢固；

⑶取1mL细胞悬液，缓慢加入到装有羊膜爬片的6cm无菌平皿中；

⑷再添加4mL含10％FBS的DF-12培养基，轻轻摇匀，不能使羊膜爬片飘起，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；

⑸24h后观察培养基颜色的变化及细胞贴壁情况；

⑸48h后将培养皿取出，用微量移液枪吸去孔中的培养基，向培养皿中加入3mLPBS，重复冲洗3次；

⑺吸尽PBS，加入5mL新鲜的含10％FBS的DF-12培养基继续培养；

⑻羊膜负载的脐带MSC约需培养5-7d，每两天换一次液；

⑼待脐带MSC在羊膜上皮面生长至90％融合时，可用于糖尿病足的临床治疗。

本发明的有益效果是：

1、本发明利用自配的羊膜上皮细胞消化液，解决了目前羊膜上皮细胞消化过程复杂，羊膜结构保持不完整的技术难点，该消化液能简单快速的去除羊膜上皮层细胞，不仅可以缩短去羊膜上皮细胞时间，提高上皮细胞消化效率，同时能保持羊膜的完整性及原有的细胞外基质成分，维持其生物学活性，以去上皮细胞的羊膜作为生物支架材料，将脐带来源的间充质干细胞负载在去上皮细胞的羊膜上，制成干细胞贴片，用于临床外敷治疗糖尿病足，起到很好的治疗效果。

2、本发明利用硝酸纤维素膜作为羊膜上皮细胞消化过程中的支架材料，可以最大限度的使羊膜充分伸展，提高羊膜上皮细胞消化效率。利用本发明配制的上皮细胞消化液，使上皮细胞的去除过程方便、快捷，大大缩短整个操作过程所需的时间。利用本发明配制的上皮细胞消化液，使羊膜上皮细胞去除更彻底，同时在消化液中添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，在消化的过程中起到保护羊膜的基质成分的作用，使消化液对羊膜的损害到达最小。

3、利用本发明配制的上皮细胞消化液去除上皮细胞后，羊膜的上皮面更有利于间充质干细胞的贴壁生长，且在羊膜上贴壁生长的间充质干细胞具有很好的细胞形态及生长扩增曲线。利用定制的圆形石英玻片作为去上皮细胞羊膜负载间充质干细胞的支架材料，为间充质干细胞在羊膜上贴壁提供平整的环境，可以有效的促进间充质干细胞在羊膜上的贴壁及生长。

4、本发明制备的干细胞贴片适合于糖尿病足患者的外敷使用，一方面避免了静脉注射干细胞可能引起的免疫排斥反应，另一方面，干细胞贴片直接作用于糖尿病足患处，可以分泌大量细胞因子，促进糖尿病足溃烂的愈合。

附图说明

图1为用羊膜上皮细胞消化液处理前镜下观察到的羊膜上皮细胞，图中染成紫色的为上皮细胞的细胞核结构，表明镜下可见完整的羊膜上皮细胞，羊膜上皮细胞消化前10x；

图2为用羊膜上皮细胞消化液处理后羊膜上皮面的结构，镜下观察不到完整的上皮细胞形态，说明该发明配制的羊膜上皮细胞消化液能够很好的去除上皮细胞，羊膜上皮细胞消化后10x；

图3为脐带间充质干细胞接种至去上皮细胞羊膜上，培养不同时间的细胞形态；图3-1至图3-4分别1天、2天、4天、5天的照片。

图4为负载在去上皮细胞羊膜上的间充质干细胞的生长曲线，说明间充质干细胞可以在去上皮细胞的羊膜上正常贴壁生长，即通过该发明可以制备有生物学功能的的干细胞贴片。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种简单高效的干细胞贴片制备方法，步骤如下：

一、羊膜组织的获取及前处理

⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；

⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；

⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中

⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；

⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；

⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；

⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体

⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块

二、羊膜上皮细胞的消化和刮除

⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；

⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面

⑶将培养皿置于5％CO₂培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；

⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；

⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动羊膜-硝酸纤维素膜，彻底刮除羊膜上皮细胞；

⑹将刮除羊膜上皮细胞的羊膜-硝酸纤维素膜复合体用PBS缓冲液清洗羊膜上皮面3次，以彻底清除残留的上皮细胞；

三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定

⑴用无菌眼科剪剪取羊膜-硝酸纤维素膜复合体的一角，去除硝酸纤维素膜，将羊膜直接平铺于盖玻片上，使羊膜上皮面朝上，且羊膜完全展开，置于培养皿中；

⑵在羊膜上皮面上滴加苏木精，使苏木精完全覆盖羊膜上皮面，室温浸染5分钟后，向培养皿中加入自来水清洗苏木精，反复清洗3次，清洗完成后吸尽培养皿中的自来水；

⑶在羊膜上皮面上滴加分化液进行分化，使之完全覆盖羊膜上皮面，分化15秒；向培养皿中加入自来水，使整张盖玻片完全浸泡在自来水中，浸泡15分钟；用移液管吸尽自来水，将伊红滴加至羊膜上皮面上，浸染2分钟；

⑷向培养皿中加入自来水，清洗羊膜上皮面，镜下观察着色情况，观察镜下是否还能观察到清晰完整的羊膜上皮细胞；镜下观察不到清晰完整上皮细胞的羊膜可用于羊膜爬片的制备；

四、制备干细胞贴片

⑴用眼用镊子小心的将去上皮细胞羊膜一端掀起，并将无菌石英片缓缓插入到羊膜下表面，待石英片完全深入到羊膜下方后，用镊子轻轻将羊膜包裹在石英片的四周，并使石英片表面上的羊膜完全伸展；

⑵将羊膜爬片置于6cm无菌培养皿中，放入CO2培养箱中干燥60min，使羊膜爬片与孔底结合牢固；

⑶取1mL细胞悬液，缓慢加入到装有羊膜爬片的6cm无菌平皿中；

⑷再添加4mL含10％FBS的DF-12培养基，轻轻摇匀，不能使羊膜爬片飘起，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；

⑸24h后观察培养基颜色的变化及细胞贴壁情况；

⑸48h后将培养皿取出，用微量移液枪吸去孔中的培养基，向培养皿中加入3mLPBS，重复冲洗3次；

⑺吸尽PBS，加入5mL新鲜的含10％FBS的DF-12培养基继续培养；

⑻羊膜负载的脐带MSC约需培养5-7d，每两天换一次液；

⑼待脐带MSC在羊膜上皮面生长至90％融合时，可用于糖尿病足的临床治疗。

Claims (5)

1.一种简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：步骤如下：

一、羊膜组织的获取及前处理；

二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；

三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；

四、制备干细胞贴片。

2.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：

⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；

⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；

⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中；

⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；

⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；

⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；

⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体

⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块。

3.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜上皮细胞的消化与刮除的具体步骤如下：

⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；

⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面

⑶将培养皿置于5％CO₂培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；

⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；

⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动羊膜-硝酸纤维素膜，彻底刮除羊膜上皮细胞；

⑹将刮除羊膜上皮细胞的羊膜-硝酸纤维素膜复合体用PBS缓冲液清洗羊膜上皮面3次，以彻底清除残留的上皮细胞。

4.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜上皮细胞消化后的鉴定的具体步骤如下：

⑴用无菌眼科剪剪取羊膜-硝酸纤维素膜复合体的一角，去除硝酸纤维素膜，将羊膜直接平铺于盖玻片上，使羊膜上皮面朝上，且羊膜完全展开，置于培养皿中；

⑵在羊膜上皮面上滴加苏木精，使苏木精完全覆盖羊膜上皮面，室温浸染5分钟后，向培养皿中加入自来水清洗苏木精，反复清洗3次，清洗完成后吸尽培养皿中的自来水；

⑶在羊膜上皮面上滴加分化液进行分化，使之完全覆盖羊膜上皮面，分化15秒；向培养皿中加入自来水，使整张盖玻片完全浸泡在自来水中，浸泡15分钟；用移液管吸尽自来水，将伊红滴加至羊膜上皮面上，浸染2分钟；

⑷向培养皿中加入自来水，清洗羊膜上皮面，镜下观察着色情况，观察镜下是否还能观察到清晰完整的羊膜上皮细胞；镜下观察不到清晰完整上皮细胞的羊膜可用于羊膜爬片的制备。

5.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述制备干细胞贴片的步骤如下：

⑴用眼用镊子小心的将去上皮细胞羊膜一端掀起，并将无菌石英片缓缓插入到羊膜下表面，待石英片完全深入到羊膜下方后，用镊子轻轻将羊膜包裹在石英片的四周，并使石英片表面上的羊膜完全伸展；

⑵将羊膜爬片置于6cm无菌培养皿中，放入CO2培养箱中干燥60min，使羊膜爬片与孔底结合牢固；

⑶取1mL细胞悬液，缓慢加入到装有羊膜爬片的6cm无菌平皿中；

⑷再添加4mL含10％FBS的DF-12培养基，轻轻摇匀，不能使羊膜爬片飘起，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；

⑸24h后观察培养基颜色的变化及细胞贴壁情况；

⑸48h后将培养皿取出，用微量移液枪吸去孔中的培养基，向培养皿中加入3mLPBS，重复冲洗3次；

⑺吸尽PBS，加入5mL新鲜的含10％FBS的DF-12培养基继续培养；

⑻羊膜负载的脐带MSC约需培养5-7d，每两天换一次液；

⑼待脐带MSC在羊膜上皮面生长至90％融合时，可用于糖尿病足的临床治疗。